CN115807087A - 一种用于宫颈癌pax1-sox1-sfrp1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌PAX1‑SOX1‑SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用，所述用于宫颈癌PAX1‑SOX1‑SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合，包括检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针。本发明引物探针组合采用PAX1‑SOX1‑SFRP1基因甲基化检测，取得受试者宫颈脱落细胞后，首先进行高危型HPV检测，若结果为阳性，先不做病理活检，而是做PAX1‑SOX1‑SFRP1基因甲基化检测，高危型HPV检测为阴性，不做病理活检，继续观察随访；如果采用本发明引物探针组合进行的PAX1‑SOX1‑SFRP1基因甲基化检测结果为阳性，宫颈癌的风险极大，需要尽快做病理活检确诊。可见，采用本发明的引物探针组合在宫颈癌筛查中，能够避免不必要的病理活检。

Description

一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探 针组合及其应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，尤其涉及一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用。

背景技术

DNA甲基化异常是肿瘤发生发展过程中的标志性事件之一。在宫颈癌患者中，在宫颈癌患者中，PAX1基因的启动子区域的胞嘧啶会发生甲基化，而正常人中不发生甲化。PAX1是一个宫颈癌的抑癌基因，PAX1启动子的甲基化，导致抑癌功能丧失，癌细胞恶性增殖，可作为宫颈癌早期诊断的生物标志物。细胞中PAX1基因发生的甲基化可以通过DNA的特异扩增而被检测到。在针对多名宫颈癌病人经阴道镜确诊的宫颈癌病例和阴性对照的研究报道中，都表明可以在宫颈癌病人的样本中通过检测PAX1基因的甲基化而查到癌细胞的DNA。本试剂盒对宫颈癌的早期诊断提供参考，使病人多了一种非创性宫颈癌诊断方法的选择。

宫颈癌的常规筛查方法包括高危型HPV检测和液基细胞学检查，一旦发现阳性，下一步进行宫颈活检和病理切片染色检查。但是，在大量高危型HPV阳性的情况下，宫颈并无癌变或有意义的病理变化，不适宜于下一步的病理活检，否则会造成过度检查，造成受试者痛苦及医疗资源浪费。液基细胞学染色检查，也受限于检查的复杂性，需要专业病理医生看片，受病理医生的资源和精力限制。

因此在宫颈癌筛查过程中，怎样避免不必要的病理活检成为人们亟待解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例的第一方面，提供一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合，包括检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针；

其中，检测所述PAX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，检测所述PAX1基因的探针序列如SEQ ID NO.3所示；

检测所述SOX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测所述SOX1基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示；

检测所述SFRP1基因的引物对序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测所述SFRP1基因的探针序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明实施例的第二方面，提供一种上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合在制备检测宫颈癌相关基因甲基化产品中的应用。所述检测宫颈癌相关基因甲基化产品包括检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒。

本发明实施例的第三方面，提供一种包括上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合的试剂盒，还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。

本发明实施例的第四方面，提供一种宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，包括：

S1、收集宫颈脱落细胞，提取其中的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段，备用；

S2、将提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计包含上述引物探针组合的荧光PCR反应体系，利用所述荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化后的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行基因扩增；

S3、对步骤S2获取的基因扩增结果CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的宫颈脱落细胞中含有甲基化的PAX1基因、SOX1基因、SFRP1基因中的至少一种。

进一步的，所述引物探针组合包括分别检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针。

进一步的，所述步骤S1包括采集宫颈脱落细胞保存液，之后采用商用核酸提取试剂盒提取和纯化，获得所述游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段。

进一步的，所述步骤S1包括使用宫颈刷在宫颈口收取宫颈脱落细胞。

进一步的，步骤S1中提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段保存温度为15-25℃。

进一步的，当PAX1基因CT值≤32时，PAX1基因甲基化阳性；当SOX1基因CT值≤32时，SOX1基因甲基化阳性；当SFRP1基因CT值≤32时，SFRP1基因甲基化阳性。

本发明实施例的第五方面，提供一种上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合应用于非诊断用途，例如在检测宫颈癌相关基因甲基化科研中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

本发明设计合成了一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用，本发明的引物探针组合采用PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测，在取得受试者宫颈脱落细胞后，首先进行高危型HPV检测，如果结果为阳性，先不做病理活检，而是做本发明的PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测，高危型HPV检测为阴性，不做病理活检，继续观察随访；如果采用本发明引物探针组合进行的PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测结果为阳性，宫颈癌的风险极大，需要尽快做病理活检确诊。可见，采用本发明的引物探针组合在宫颈癌筛查过程中，能够避免不必要的病理活检，既降低了费用，也避免了患者的痛苦和医疗资源浪费。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例的一个方面提供了一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合，包括检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针；

其中，检测所述PAX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，检测所述PAX1基因的探针序列如SEQ ID NO.3所示；

检测所述SOX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测所述SOX1基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示；

检测所述SFRP1基因的引物对序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测所述SFRP1基因的探针序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明实施例的第二方面，提供一种上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合在制备检测宫颈癌相关基因甲基化产品中的应用。所述检测宫颈癌相关基因甲基化产品包括检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒。

本发明实施例的第三方面，提供一种包括上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合的试剂盒，还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。

本试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞中PAX1-SOX1-SFRP1基因的甲基化。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展过程中的标志性事件之一。在宫颈癌患者中，PAX1基因的启动子区域的胞嘧啶会发生过度甲基化，而正常人中不发生。PAX1是一个宫颈癌的抑癌基因，PAX1启动子的甲基化，导致抑癌功能失常或丧失，癌细胞恶性增殖，可作为宫颈癌早期诊断的生物标志物。细胞中PAX1基因发生的甲基化可以通过DNA的特异扩增而被检测到。在针对经病理确诊的宫颈癌病例和阴性对照案例的研究报道中，都表明可以在宫颈癌病人的样本中通过检测PAX1基因的甲基化而检测到癌细胞的DNA。

性 别 决 定 区 域 Y1 （sexdeterming region Y-box1，SOX1）是编码 SOX 家族转录因子中的一个成员，具有参与胚胎发育的调节以及决定细胞存亡的功能。Wnt通路中分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled related protein 1,sFRP1) 异常表达与肿瘤的形成密切相关。 sFRP1 在宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌组织的表达及其与宫颈癌形成有关。研究表明，SOX1 、sFRP1基因基因启动子区域甲基化普遍存在于中国女性宫颈癌患者中，在宫颈癌前病变阶段，该基因启动子甲基化是早期事件，宫颈癌组织中的甲基化显著的高于正常组织。

PAX1-SOX1-SFRP1基因的甲基化联合检测，能够将进展为癌前病变的高危人群和正常人群加以区分，可作为宫颈癌早期诊断的特异性甲基化分子标志物。

本发明实施例的第四方面，提供一种宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，包括：

S1、使用宫颈刷在宫颈口收取宫颈脱落细胞，之后采用商用核酸提取试剂盒提取和纯化，获得所述游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段，备用；

S2、将提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计包含引物探针组合的荧光PCR反应体系，利用所述荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化后的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行基因扩增；所述引物探针组合包括分别检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针；

S3、对步骤S2获取的基因扩增结果CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的宫颈脱落细胞中含有甲基化的PAX1基因、SOX1基因、SFRP1基因中的至少一种。

优选的，步骤S1中提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段保存温度为15-25℃。

优选的，当PAX1基因CT值≤32时，PAX1基因甲基化阳性；当SOX1基因CT值≤32时，SOX1基因甲基化阳性；当SFRP1基因CT值≤32时，SFRP1基因甲基化阳性。

本发明实施例的第五方面，提供一种上述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合应用于非诊断用途，例如在检测宫颈癌相关基因甲基化科研中的应用。

在采用本发明的引物探针组合采用PAX1基因甲基化检测，在取得受试者宫颈脱落细胞后，首先进行高危型HPV检测，如果结果为阳性，先不做病理活检，而是做本发明的PAX1基因甲基化检测，高危型HPV检测为阴性，不做病理活检，继续观察随访；如果采用本发明引物探针组合进行的PAX1基因甲基化检测结果为阳性，宫颈癌的风险极大，需要尽快做病理活检确诊。可见，采用本发明的引物探针组合在宫颈癌筛查过程中，能够避免不必要的病理活检，既降低了费用，也避免了患者的痛苦和医疗资源浪费。

以下集合若干典型实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

首先收集5mL宫颈脱落细胞保存液，提取血浆中的游离癌基因判断，本发明提取PAX1基因片段，首先进行亚硫酸盐转化，再分别设计特异性Tagman探针和特异性引物，配以必要的其他组分，组成荧光PCR反应体系，对亚硫酸盐转化化后的DNA分别进行Septin9和NDRG4基因扩增。对扩增结果的CT值进行比较分析，CT值小于临界值为阳性，提示宫颈癌高风险。

本方案实验样本采用已知临床信息的样本测试，如下表：

一、主要组成成份

注：不同批次的试剂不可混合使用。

二、储存条件及有效期

试剂盒在-20±5℃存储，有效期为12个月；开封后有效期为6个月；反复冻融3次有效。

三、适用仪器

ABI 7500荧光PCR仪

四、样本要求

1.样本类型：宫颈脱落细胞。

2.样本的采集：

使用宫颈刷在宫颈口取宫颈脱落细胞，样本应该立即放入细胞保存液。

3.样本的保存：

样本可以保存在15-25℃，不超过2个月，或冷冻保存一年。

4．样本用量：5mL。

五、检验方法

1.试剂准备

1.1 从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并作短暂离心，放置于冰上或2-8℃冰箱备用。

1.2 根据待检样本数（n），计算需要的反应数为n，每个反应分装PCR反应液各20μl。

2.样本处理

2.1 细胞收集

将样本放入离心机进行离心，转速1350±150rcf，离心12分钟；从离心机中取出样本管，去除上清，收集细胞沉淀。

2.2 核酸提取及亚硫酸盐转化

参考所购买的商用试剂盒说明书进行操作。

如果处理后的DNA不能立即使用，2到8度可以储存24小时，-25°C 到-15 °C可以储存72小时。

3.加样（样本处理区）

加样：在准备好试剂的PCR反应管中加入待测样本DNA。每个PCR反应中各加30μLDNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。注意：密封后的PCR板可在2-8°C最多放置4小时。

4. PCR扩增（扩增区）

4.1 样品设置：根据样本类型设置样本编号。

4.2 荧光通道选择：每个样本选择FAM和JOE共2个通道。参比荧光（PassiveReference）设置为none。

4.3 反应条件设定（反应体积设定为50μL）：

4.4 保存文件，运行程序。

5.结果分析

反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End 值可设在10～20，荧光阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为undet），点击Analysis自动获得分析结果。

6.结果判定

PCR反应结果解释根据表1所示。如果内参ACTB显示单个中加入DNA的量足够的话（ACTB Ct值见表2中），那么PAX1结果视为本次PCR反应结果。如果ACTB的Ct值大于表2中所设的阈值，那么定义该PCR反应为“无效”。

表1：对单个PCR反应结果的解释

六、阳性判断值或者参考区间

利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考值为Ct值等于32。

七、检验结果的解释

如果PCR反应结果阳性，则表明样本中含有甲基化的PAX1基因，病人样本的测试结果为“阳性”，如果PCR反应结果为阴性，则表明样本中不含有甲基化的PAX1基因，病人样本的测试结果为阴性。如果结果为其它情况，视为无效。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于：包括检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针；

其中，检测所述PAX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，检测所述PAX1基因的探针序列如SEQ ID NO.3所示；

检测所述SOX1基因的引物对序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测所述SOX1基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示；

检测所述SFRP1基因的引物对序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测所述SFRP1基因的探针序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种如权利要求1所述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合在制备检测宫颈癌相关基因甲基化产品中的应用。

3. 一种包括权利要求1所述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合的试剂盒，其特征在于：还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。

4.一种宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于，包括：

S1、收集宫颈脱落细胞，提取其中的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段，备用；

S2、将提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计包含权利要求1所述引物探针组合的荧光PCR反应体系，利用所述荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化后的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段进行基因扩增；

S3、对步骤S2获取的基因扩增结果CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的宫颈脱落细胞中含有甲基化的PAX1基因、SOX1基因、SFRP1基因中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于：所述引物探针组合包括分别检测PAX1基因、SOX1基因和SFRP1基因甲基化的引物对和探针。

6.根据权利要求4所述的宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤S1包括采集宫颈脱落细胞保存液，之后采用商用核酸提取试剂盒提取和纯化，获得所述游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段。

7.根据权利要求6所述的宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤S1包括使用宫颈刷在宫颈口收取宫颈脱落细胞。

8.根据权利要求4所述的宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于：步骤S1中提取的游离PAX1-SOX1-SFRP1癌基因片段保存温度为15-25℃。

9.根据权利要求4所述的宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测方法，其特征在于：当PAX1基因CT值≤32时，PAX1基因甲基化阳性；当SOX1基因CT值≤32时，SOX1基因甲基化阳性；当SFRP1基因CT值≤32时，SFRP1基因甲基化阳性。

10.一种如权利要求1所述用于宫颈癌PAX1-SOX1-SFRP1基因甲基化检测的引物探针组合在检测宫颈癌相关基因甲基化科研中的应用。