CN107760788A

CN107760788A - 一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用

Info

Publication number: CN107760788A
Application number: CN201711280578.7A
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 姚希辉; 董兰兰
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN107760788B

Abstract

一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，属于生物医学检验技术领域。本发明提供的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合能特异地检测出宫颈癌相关基因的甲基化，利用该核酸组合制备检测细胞基因甲基化的试剂盒，有效提高检测的精度，能方便快捷的应用于检测宫颈癌相关基因的甲基化水平，具有较高的灵敏度和特异性；应用该试剂盒可以方便检测，提高检测效率和检测的精度，方便进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。

Description

一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及生物医学检验技术领域，且特别涉及一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用。

背景技术

目前应用最广泛的宫颈癌筛查方法遵循三阶梯式诊断方法，主要内容为：初筛，细胞学(液基)、VIA/VILI检查、高危型HPV检测(HR-HPV)或16/18分型；阴道镜：宫颈管诊断性刮宫或锥切，多点活检；以及病理学诊断(即金标准)。然而，这些方法均存在自身的局限性，影响了筛查的效果。液基细胞学检查的局限性表现在。(1)敏感性较低，有研究显示，细胞学检查在初筛过程中遗漏了约有一半的CIN2、CIN3及宫颈癌患者，常造成对患者的漏诊漏治；(2)细胞学涂片的取材、制片、阅片水平参差不齐，缺乏规范化的质量控制，主观依赖性强。高危型HPV检测的局限性表现在：(1)高危型HPV的终生感染风险为80％，HPV检测虽能提高灵敏度，但无法区分一过性HPV感染和致病性持续感染；(2)育龄期妇女，尤其是年龄小于30岁的女性HPV的感染率高，临床提示意义较弱。单一依赖HPV筛查，其较低的特异性易造成有限的社会、医疗资源的浪费及对患者的过度治疗。

发明内容

本发明的第一目的在于提供检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，该核酸组合能特异的、高灵敏度检测细胞基因甲基化。

本发明的第二目的在于提供上述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合在制备检测细胞基因甲基化的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，可以方便的应用到基因甲基化的检测中。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，核酸组合包括检测引物对和检测探针；检测引物对包括用于检测SOX1基因甲基化的第一引物对和用于检测PAX1基因甲基化第二引物对；第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示；第二引物对的碱基序列如SEQ IDNO.3-4所示；检测探针5'端标记有荧光基团，检测探针的3'端标记有淬灭基团；检测探针包括检测SOX1基因的第一探针和PAX1基因检测的第二探针，第一探针的碱基序列如SEQ IDNO.5所示；第二探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

提供上述的检测细胞基因甲基化的核酸组合在制备检测细胞基因甲基化的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，包括上述的检测细胞基因甲基化的核酸组合。

本发明的有益效果是：本发明提供的检测细胞基因甲基化的核酸组合能特异地检测出相关基因的甲基化，利用该核酸组合制备检测细胞基因甲基化的试剂盒，有效提高检测的精度，能方便快捷的应用于检测相关基因的甲基化水平，具有较高的灵敏度和特异性；应用该试剂盒可以方便检测，提高检测效率和检测的精度，方便进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的检测灵敏度结果图；

图2为本发明实验例2提供的ROC曲线图；

图3为本发明实验例3提供的SOX1基因扩增线性图；

图4为本发明实验例3提供的PAX1基因扩增线性图；

图5为本发明实验例3提供的ADCYAP1基因扩增线性图；

图6为本发明实验例3提供的SOX1基因扩增精密度图；

图7为本发明实验例3提供的PAX1基因扩增精密度图；

图8为本发明实验例3提供的ADCYAP1基因扩增精密度图；

图9为本发明实验例3提供的mir124-1基因扩增精密度图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

上述核酸组合在赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))公司合成。

Taq酶、dNTPs和Mg²⁺购自TAKARA；其余常规试剂均购自国药集团。

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在女性肿瘤中均居第四位；在女性生殖系统肿瘤中仅次于乳腺癌，居第二位。

在宫颈癌筛查的应用中，一些肿瘤抑制基因的甲基化检测呈现潜在的临床应用价值，伴随高通量测序方法的应用，越来越多的甲基化位点也在不断被发现。但多数研究仅针对单个或几个基因进行研究，缺乏对多个甲基化位点的大样本的系统性分析。

通过文献检索和分析癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中关于宫颈癌甲基化研究的芯片数据，确定10个候选基因SOX1、PAX1、DLX1、DAPK1、ADCYAP1、ITGA4、mir124a、RXFP3、SOX17、FAM19A4的启动子区域甲基化位点，通过实时定量MSP(Quantitative MSP，QMSP)检测宫颈脱落细胞的候选基因的甲基化水平。(methylationspecial PCR，MSP)。

下面实施例对本发明提供的一种检测细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用进行具体说明。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，还包括检测DLX1基因甲基化的第三引物对和第三探针、检测DAPK1基因甲基化的第四引物对和第四探针、检测ADCYAP1基因甲基化的第五引物对和第五探针、检测ITGA4基因甲基化的第六引物对和第六探针、检测mir124a基因甲基化的第七引物对和第七探针、检测RXFP3基因甲基化的第八引物对和第八探针、检测SOX17基因甲基化的第九引物对和第九探针以及检测FAM19A4基因甲基化的第十引物对和第十探针；第三引物对至第十引物对的碱基序列如SEQ ID 7-22所示，第三探针至第十探针的碱基序列如SEQ ID 23-30所示。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。

第一引物对专门针对应检测SOX1的启动子区域，第一引物对的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1的碱基序列为：5’-GGAGTAGAGAAGGCGTCGTC-3’；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2的碱基序列为：5’-AAAACAAAAAAAAAAACGAACG-3’；

第一探针专门针对SOX1的启动子区域设计，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5的碱基序列为：5’-GCGGTTTTTATAAAGGCGGGTTA-3’；

第二引物对专门针对应检测PAX1的启动子区域，第二引物对的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3的碱基序列为：5’-GCGAATTTTAGTGTACGTCCC-3’；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4的碱基序列为：5’-CAAATTCTCTACAAAAATCAAATGA-3’；

第二探针专门针对PAX1的启动子区域设计，第二探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6的碱基序列为：5’-TAGGGCGGGGGATGGTTGA-3’；

检测宫颈癌相关基因DLX1、DAPK1、ADCYAP1、ITGA4、mir124a、RXFP3、SOX17、FAM19A4的第三引物对至第十引物对碱基序列如SEQ ID NO.7-22所示：

第三引物对上游引物SEQ ID NO.7：

5’-GGATCGTGTTTTTTTCGTATTATC-3’；

第三引物对下游引物SEQ ID NO.8：

5’-CGTTGGACGTTTATTTTGATATT-3’；

第四引物对上游引物SEQ ID NO.9：

5’-GGTGGGGGAGGTTGTATC-3’；

第四引物对下游引物SEQ ID NO.10：

5’-CGGTTCGCGGAAATTTTA-3’；

第五引物对上游引物SEQ ID NO.11：

5’-GCGTGAGATTTTAGGAGGTC-3’；

第五引物对下游引物SEQ ID NO.12：

5’-AAAGTGCGACTCGACGTAA-3’；

第六引物对上游引物SEQ ID NO.13：

5’-TAGTTTGTTGCCGTATGTAGTTCTC-3’；

第六引物对下游引物SEQ ID NO.14：

5’-CTATTCTCTTCAAAACCCACAT-3’；

第七引物对上游引物SEQ ID NO.15：

5’-GTCGATACGGTGAAATGTC-3’；

第七引物对下游引物SEQ ID NO.16：

5’-CGACCTCCCCAATAACTA-3’；

第八引物对上游引物SEQ ID NO.17：

5’-ATTGGACGGTTTTTCGTC-3’；

第八引物对下游引物SEQ ID NO.18：

5’-CCCAAACTACCCGCC-3’；

第九引物对上游引物SEQ ID NO.19：

5’-CGGTTGGGTTTAGTATTTC-3’；

第九引物对下游引物SEQ ID NO.20：

5’-GACTCTCACCAATGACGATA-3’；

第十引物对上游引物SEQ ID NO.21：

5’-CGGCGTTAGAGTTTAGTTTC-3’；

第十引物对下游引物SEQ ID NO.22：

5’-AAACCCACGCTCAAACCGTA-3’；

第三探针至第十探针的碱基序列如SEQ ID NO.23-30所示：

第三探针SEQ ID NO.23：

FAM-5’-TTTTGATAGGAGTTTTGTAT-3’-6-TAMRA；

第四探针SEQ ID NO.24：

FAM-5’-CGTAGTTTTCGGTAGTTTTAA-3’-6-TAMRA；

第五探针SEQ ID NO.25：

FAM-5’-GCGGTTTTATAAAGCGGGTTA-3’-6-TAMRA；

第六探针SEQ ID NO.26：

FAM-5’-TATGGTGACGCGCGATTGTA-3’-6-TAMRA；

第七探针SEQ ID NO.27：

FAM-5’-GGAGGTCGAGGTAGGAGAAT-3’-6-TAMRA；

第八探针SEQ ID NO.28：

FAM-5’-GGTTTACGTTTGTAATTTTAG-3’-6-TAMRA；

第九探针SEQ ID NO.29：

FAM-5’-ACGAGGTTAAGAGTGGATTA-3’-6-TAMRA；

第十探针SEQ ID NO.30：

FAM-5’-TAGTTTGGCGAGAGTGATTTC-3’-6-TAMRA；

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’到3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

上述的检测细胞基因甲基化的核酸组合在制备检测细胞基因甲基化的试剂盒中的应用。

一种检测细胞基因甲基化的试剂盒，包括上述的检测细胞基因甲基化的核酸组合。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，试剂盒还包括核酸提取液、PCR反应缓冲液、PCR反应液中的一种或多种。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，核酸提取液包括80-150mmol/L的EDTA、蛋白酶K、8-14mmol/L的Tris饱和酚和12％-15％SDS溶液。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，PCR反应液为Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺的一种或多种

合适浓度的EDTA能够有效的抑制酶的作用，从而防止基因被酶切降解，避免因为样本的问题，导致检测失败，或者导致检测结果出现问题或者误差。

蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶，是一种高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。蛋白酶K能够降解细菌菌体中的蛋白质，避免蛋白质对实验的影响。

进一步地，在本发明的较佳的实施例中，还包括重亚硫酸盐。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测细胞基因甲基化的核酸组合，核酸组合包括检测引物组合和检测探针；检测引物组合包括检测SOX1基因甲基化第一引物对和检测PAX1基因甲基化第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ IDNO.3-4所示；检测探针包括第一探针和第二探针；第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，第二探针的序列如SEQ ID NO.6所示；第一探针和第二探针的5'端均标记有作为荧光基团的FAM，第一探针和第二探针的3'端标记有作为淬灭基团的6-TAMRA。

第一引物对的序列如下：

上游引物SEQ ID NO.1：

5’-GGAGTAGAGAAGGCGTCGTC-3’；

下游引物SEQ ID NO.2：

5’-AAAACAAAAAAAAAAACGAACG-3’；

第二引物对的序列如下；

上游引物SEQ ID NO.3：

5’-GCGAATTTTAGTGTACGTCCC-3’；

下游引物SEQ ID NO.4：

5’-CAAATTCTCTACAAAAATCAAATGA-3’；

检测探针包括第一探针和第二探针，第一探针的序列如SEQ ID NO.5所示，第二探针的序列如SEQ ID NO.6所示；第一探针和第二探针的5'端标记有作为荧光基团的FAM，探针3'端标记有作为淬灭基团的6-TAMRA。

检测探针的序列如下：

第一探针SEQ ID NO.5：

FAM-5’-GCGGTTTTTATAAAGGCGGGTTA-3’-6-TAMRA；

第二探针SEQ ID NO.6：

FAM-5’-TAGGGCGGGGGATGGTTGA-3’-6-TAMRA；

在本发明的其他的实施例中，荧光基团还可以是VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，淬灭基团还可以是BHQ-1～3和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher，MGBNFQ)中的一种。

在使用的时候，第一探针与第一引物对配合使用，第二探针与第二引物对配合使用。

实施例2

本实施例提供一种检测细胞基因甲基化的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的检测细胞基因甲基化的核酸组合；还包括检测DLX1基因甲基化的第三引物对和第三探针、检测DAPK1基因甲基化的第四引物对和第四探针、检测ADCYAP1基因甲基化的第五引物对和第五探针、检测ITGA4基因甲基化的第六引物对和第六探针、检测mir124a基因甲基化的第七引物对和第七探针、检测RXFP3基因甲基化的第八引物对和第八探针、检测SOX17基因甲基化的第九引物对和第九探针以及检测FAM19A4基因甲基化的第十引物对和第十探针；第三引物对至第十引物对的碱基序列如SEQ ID 7-22所示，第三探针至第十探针的碱基序列如SEQ ID 23-30所示。

当然，本试剂盒包括核酸提取液和PCR反应缓冲液，还包括可以直接进行PCR反应的试剂，PCR反应的试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的一种或多种。

核酸提取液包括80-150mmol/L的EDTA、蛋白酶K、8-14mmol/L的Tris饱和酚和12％-15％SDS溶液。

实施例3

本实施例提供本实施例提供一种检测细胞基因甲基化的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的检测细胞基因甲基化的核酸组合。

核酸提取液包括80mmol/L的EDTA、蛋白酶K、14mmol/L的Tris饱和酚和15％SDS溶液。还包括重亚硫酸盐。

试剂盒的使用方法，参考如下步骤：

1.1粪便收集将患者的粪便收集到样品保存液中，常温或4℃保存2周，-20℃保存6个月；向200mg(或200uL稀便)收集的粪便样本中，加入100μL蛋白酶K，0.5mL的核酸裂解液，充分混匀；

1.2在70℃条件下孵育10min；

1.3加入100mg的PVPP进行粗提，去除粗提液中的如色素或蛋白质等杂质；

1.4再加入RNA酶100μL，37℃水浴1小时，完全去除溶液中的RNA杂质；

1.5将样品加入到带吸附膜的离心柱中，13000rpm离心1min，弃收集管中的废液；

1.6加入500μL的DNA漂洗液1，13000rpm离心1min，弃废液；

1.7加入漂洗液2洗涤，13000rpm离心1min，弃废液，重复操作一次；

1.8将吸附柱放到新的收集管中，加入50μL的DNA洗脱液(也可以根据实际的DNA浓度适当调整DNA洗脱液的加入量)，然后13000rpm离心1min，得到基因组。

试剂盒的PCR扩增方法，参考实施例1提供的PCR扩增反应体系以及PCR反应程序。

实施例4

核酸提取液包括150mmol/L的EDTA、蛋白酶K、8mmol/L的Tris饱和酚和12％SDS溶液。还包括重亚硫酸盐。

实施例5

核酸提取液包括120mmol/L的EDTA、蛋白酶K、12mmol/L的Tris饱和酚和13％SDS溶液。还包括重亚硫酸盐。

实验例1

本实验例提供实施例5提供的试剂盒的使用；本试剂盒采用的技术原理是甲基化特异性PCR荧光-探针法。研究发现，宫颈脱落细胞中SOX1、PAX1、DLX1、DAPK1、ADCYAP1、ITGA4、mir124a、RXFP3、SOX17、FAM19A4十个基因的启动子区域CpG岛的胞嘧啶发生甲基化，而正常组织中不发生甲基化，可作为早期诊断宫颈癌的生物标志物，越多基因被甲基化，则诊断或预后的确定性越高。具体使用如下：

样本基因组提取方法：

前准备工作，包括将EDTA溶液和SDS溶液制成裂解细胞的缓冲液LB，异丙醇溶液制成结合液I，将TE溶液制成结合液II，将Tris饱和酚制成漂洗液W1，氯仿异戊醇溶液制成漂洗液W2。

1.1取待检样本液成分振荡混匀，制成细胞悬液，避免出现组织团块；

1.2吸取1.8mL的细胞悬液，加入到EP管中，12000rpm离心2min；

1.3弃上清，收集细胞加入200μL的缓冲液LB，且加入2μL的蛋白酶K溶液，振荡混匀；

1.4于70℃消化10min，简短离心，将纯化柱置于收集管中待用；

1.5加入200μL的结合液I，再加入200μL的结合液II，颠倒混匀，溶液转移至纯化柱内；

1.6静置2min，12000rpm离心30s，弃收集管中的废液，并将纯化柱放回收集管；

1.7向纯化柱中加入600μL的漂洗液W1，12000rpm离心30s，弃废液；

1.8向纯化柱中加入600μL的漂洗液W2，12000rpm离心30s，弃废液；

1.9向纯化柱中加入600μL的漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃废液；

1.10将纯化柱转移至新的RNase-free的EP管中，室温放置3-5min；

1.11向纯化柱中悬空加入50的洗脱液TE，静置2min，12000rpm离心2min，收集离心得到的DNA溶液待用。

重亚硫酸盐处理DNA溶液

2.1在200μL的离心管中配制DNA溶液，DNA的量为500-1000ng，加水补足至15μL；

2.2向离心管中加入135μL的重亚硫酸盐转化溶液，振荡混匀，进行反应；

2.3在98℃处理10min，64℃处理60min，4℃处理3min；

2.4将溶液加入到纯化柱中，并加入600μL的结合液GH，颠倒混匀，静置2min；

2.5用12000rpm离心30s，弃废液；

2.6向纯化柱加入600μL的漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液；

2.7向纯化柱中加入600μL的漂洗液PB，12000rpm离心30s，弃废液，重复一次；

2.8用12000rpm离心2min，除去残液，将纯化柱装入新的RNase-free的EP管中，静置3-5min；

2.9向纯化柱中悬空加入50的洗脱液TE，静置2min，12000rpm离心2min，收集离心得到的DNA溶液待用。

以转化得到的DNA溶液作为模板，以β-actin作为内参基因；检测核酸组合进行PCR反应；PCR反应体系为25μL；模板DNA0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs(10mM each)1μL、MgSO₄1μL以及ddH₂O 17.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL。上述PCR反应程序包括：95℃预变性2min；95℃变性10s，58-65℃退火延伸30s，40个循环。

实验例2

本实验例提供对实施例5提供的检测试剂盒检测准确性进行检验。

将目前已检测的255例临床样本与宫颈癌金标方法-阴道镜联合病理检测结果进行对比分析，病理诊断的宫颈浸润癌样本共34例，原位癌CIS样本共42例，CIN3期样本有102例，CIN2及以下样本35例，正常样本42例；采用实施例5提供的实施方法进行检测。具体不同分期的比较结果见表1。

表1宫颈癌多基因联合检测技术对宫颈癌和癌前病变不同分期的样本的检测结果对比

宫颈脱落细胞多基因(SOX1、PAX1、DLX1、DAPK1、ADCYAP1、ITGA4、mir124a、RXFP3、SOX17、FAM19A4)DNA检测结果表明，实施例5提供的试剂盒对宫颈癌前病变CIN3和CIS的检测灵敏性分别为94.1％和97.6％；而对于宫颈浸润癌的灵敏性则为100％。

CIN3、CIS以及浸润癌的阳性符合率(灵敏性)：171/178＝96.07％

阴性符合率(特异性)：39/42＝92.85％

CIN3、CIS以及浸润癌的总体符合率：210/220＝95.45％

CIN3、CIS以及浸润癌的阳性预测值：189/192＝98.43％

CIN3、CIS以及浸润癌的阴性预测值：39/46＝84.78％

如图1所示，178例病理检测为CIN3、CIS或浸润癌的宫颈癌及癌前病变阳性病例中，宫颈癌多基因联合检测技术可以检出171例，灵敏性为96.07％，其中对于CIS期的检出灵敏性高达到97.6％，而对于宫颈癌均可检出，灵敏性达100％。

实验例3

本实验例提供脱落细胞DNA多靶点检测技术检测癌前病变与宫颈癌的ROC曲线。

本实验例通过利用实施例5提供的试剂盒和实验方法对癌前病变与宫颈癌进行实验检测。

结果如图2所示，宫颈脱落细胞DNA多靶点检测技术可以明显的区分宫颈癌前病变和宫颈癌与正常对照，在对检测CIN3和CIS的ROC曲线的面积(AUC)为0.96(0.94-0.99，95％CI；P<0.0001)。

实验例4

本实验例提供一种利用实施例5提供的试剂盒和试验方法对样本进行逻辑回归分析的方法。

本实验通过实验得到宫颈癌和癌前病变情况进行判断的逻辑回归方程：y＝a0+a1·x1+a2·x2+a3·x3+a4·x4；其中a0、a1、a2、a3、a4为临床系数，临床系数结果见表2；SOX1、PAX1、ADCYAP1、miR124-1基因与内参基因β-actin扩增循环数的差值分别为x1、x2、x3、x4。

表2临床系数的权重关系

SOX1、PAX1和ADCYAP1扩增的线性关系如图3-5所示，SOX1、PAX1、ADCYAP1和miR124-1扩增的精密度如图6-9所示。

通过分析四个基因的甲基化拟合回归分析对宫颈癌和癌前病变的联合检测，灵敏度和特异度远高于SOX1、PAX1、ADCYAP1和miR124-1单个基因的检测分析结果。

综上所述，本发明实施例提供的检测细胞基因甲基化的核酸组合能灵敏的检测到基因的甲基化，结果准确可靠；应用该核酸组合制备的试剂盒，能方便快捷的帮助检测样本并沟通过新的计算方法，准确的判断出检测结果，使检测结果准确，使用方便，有利于实际应用和推广。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgaatttta gtgtacgtcc c 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaattctct acaaaaatca aatga 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcgtgtt tttttcgtat tatc 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgttggacgt ttattttgat att 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagggcgggg gatggttga 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttgatagg agttttgtat 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatcgtgtt tttttcgtat tatc 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgttggacgt ttattttgat att 23

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtgggggag gttgtatc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggttcgcgg aaatttta 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgtgagatt ttaggaggtc 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaagtgcgac tcgacgtaa 19

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tagtttgttg ccgtatgtag ttctc 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctattctctt caaaacccac at 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtcgatacgg tgaaatgtc 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgacctcccc aataacta 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

attggacggt ttttcgtc 18

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccaaactac ccgcc 15

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cggttgggtt tagtatttc 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gactctcacc aatgacgata 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cggcgttaga gtttagtttc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaacccacgc tcaaaccgta 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttttgatagg agttttgtat 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgtagttttc ggtagtttta a 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcggttttat aaagcgggtt a 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tatggtgacg cgcgattgta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaggtcgag gtaggagaat 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggtttacgtt tgtaatttta g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgaggttaa gagtggatta 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tagtttggcg agagtgattt c 21

Claims

1.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对包括用于检测SOX1基因甲基化的第一引物对和用于检测PAX1基因甲基化第二引物对；所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示；所述检测探针5'端标记有荧光基团，所述检测探针的3'端标记有淬灭基团；所述检测探针包括检测SOX1基因的第一探针和PAX1基因检测的第二探针，所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；所述第二探针的碱基序列如SEQID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于，还包括检测DLX1基因甲基化的第三引物对和第三探针、检测DAPK1基因甲基化的第四引物对和第四探针、检测ADCYAP1基因甲基化的第五引物对和第五探针、检测ITGA4基因甲基化的第六引物对和第六探针、检测mir124a基因甲基化的第七引物对和第七探针、检测RXFP3基因甲基化的第八引物对和第八探针、检测SOX17基因甲基化的第九引物对和第九探针以及检测FAM19A4基因甲基化的第十引物对和第十探针；所述第三引物对至第十引物对的碱基序列如SEQ ID 7-22所示，所述第三探针至第十探针的碱基序列如SEQ ID 23-30所示。

3.根据权利要求1所述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种。

4.根据权利要求3所述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。

5.如权利要求1-4任一项所述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合在制备检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒中的应用。

6.一种检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合。

7.根据权利要求6所述的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取液、PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液包括80-150mmol/L的EDTA、蛋白酶K、8-14mmol/L的Tris饱和酚和12％-15％SDS溶液。

9.根据权利要求7所述的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺的一种或多种。

10.根据权利要求6所述的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括重亚硫酸盐。