KR101636596B1

KR101636596B1 - 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR101636596B1
Application number: KR1020117024476A
Authority: KR
Inventors: 흥 쳉 라이
Original assignee: 내셔널 디펜스 메디컬 센터
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2016-07-11
Also published as: EP2420578B1; DK2420578T3; CA2758437C; IL215669A0; AU2009344468A1; WO2010118559A1; EP2420578A1; EP2420578A4; CA2758437A1; SG175183A1; ES2638294T3; KR101530498B1; JP2012523822A; NZ595640A; KR20140017704A; JP6043185B2; AU2009344468B2; KR20120016201A; BRPI0924013A2

Abstract

(1) 시험 시료를 제공하고; (2) 상기 시험 시료의 유전체 DNA 내의 적어도 하나의 표적 유전자 내의 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하고, 상기 표적 유전자는 PTPRR, ZNF582, PDE8B 및 DBC1로 이루어지고; (3) 적어도 하나의 표적 유전자 내에서의 상기 메틸화 상태의 존재 또는 부재에 기초하여 상기 시료 내에 암(cancer) 또는 암성(cancerous)의 병리학적 변화를 판단하고, 상기 메틸화 상태를 검출하기 위한 방법은 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP), 바이설파이트 시퀀싱(BS), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체크로마토그래피(DHPLC) 등인 암을 검사하기 위한 방법이 개시된다.

Description

검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법{A METHOD FOR DETECTING THE METHYLATION RATE OF TARGET GENE AS SCREENING MARKER}

본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법에 관한 것이다.

자궁경부암(cervical cancer)은 전세계적으로 그리고 대만에서 여성들에 있어서의 사망의 주요 원인들 중의 하나가 되었다. 2002년 국제보건기구에 의한 통계 조사에 의하면, 자궁경부암은 유방암에 이어 전세계 여성의 사망에 대하여 책임이 있는 두 번째의 주요 질병이었다. 규칙적인 자궁경부암 검사가 자궁경부암을 예방하는 가장 좋은 방법이다. 통상의 자궁경부암 검사에는 두 가지의 접근법들, 즉 가장 통상적으로 사용되는 세포진 검사(Pap smear) 및 인간 파필로마 바이러스 시험(human papilloma virus testing ; HPV testing)을 포함한다. 세포진 검사는 자궁경(cervix uteri)으로부터의 분비물을 채취(sampling)하고, 현미경 하에서 박리된 상피세포 내에서 암의 병리학적 변화(cancerous pathological change)가 있는 지의 여부를 검사하여 조기에 자궁경부암을 검출하도록 하는 것으로 이루어진다. 반면에, 인간 파필로마 바이러스 시험은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction ; PCR) 또는 하이브리드캡쳐(Hybrid Capture)를 사용하는 것에 의하여 시표 내에서 인간 파필로마 바이러스(HPV)가 존재하는 지의 여부를 검사하는 것으로 이루어진다.

그러나, 세포진 검사에는 많은 바람직하지 못한 특성들이 있다. 그 하나로, 이는 내과의에 의한 채취 및 법의관(medical examiner)/병리학자(pathologist)에 의한 분석을 필요로 하며, 이는 많은 개발도상국가들에서 이 시험을 촉진하는 데 어려움을 부과하는 인력의 고비용을 요구한다. 또한, 세포진 검사는 높은 위음성율(false negative rate)을 가지며 이는 암의 병리학적 변화에 앞서 진단 및 적절한 치료를 지연시킨다. 인간 파필로마 바이러스 시험에 대해서는, 비록 이것이 고도로 민감하기는 하나, 이는 높은 위양성율(false positive rate)을 생성하는 경향이 있으며, 이는 환자에게 헛된 근심을 남길 뿐만 아니라 이러한 위양성의 환자들의 시험 후속조치들에 있어서 많은 의료자원들을 낭비한다. 따라서, 자궁경부암 검사를 촉진함에 있어서 가장 중요한 주제들 중의 하나는 자궁경부암 검사 방법의 정확도와 편의성을 증가시키는 것을 필요로 한다.

유전체 결실(genomic deletions)들이 오랫동안 종양형성(tumorigenesis)의 중요한 인자로 고려되었다. 오랜 기간 동안, 유전체의 해독 가능성(coding potential)이 A, T, G, C의 4개의 염기들의 배열에 놓여 있다는 생각에 익숙해져 왔다. 1970년대 초기에 제안된 투-히트 이론(two-hit theory)은 일부 상동 종양 억제 유전자(homologous tumor suppressor genes)들의 수반 돌연변이들 또는 결실들이 암의 발달을 야기하거나 또는 잘 걸리게 한다는 것을 나타내고 있다. 그러나, 표현형(phenotype)에 영향을 주는 별도의 정보가 변성된 염기 5-메틸시토신(modified base 5-methylcytosine) 내에 저장될 수 있다. 5-메틸시토신은 회문식 시퀀스(palindromic sequence) 5'-CpG-3'의 문맥 내에서 포유동물들에서 발견된다. 대부분의 CpG 디뉴클레오티드 쌍들은 "CpG섬(CpG island)"이라고 불리우는 일부 영역들을 제외한 포유동물 세포들 내에서 메틸화되어 있다. CpG섬들은 대개는 유전자들의 부근에 위치되는 대략 1kb의 GC- 및CpG-풍부 영역들에 존재하며, 또한 광범위하게 발현되는 유전자들의 프로모터(promoter) 근처에서 발견된다. 시토신 메틸화는 DNA 합성 이후에 메틸 공여자(methyl donor) S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine)으로부터 시토신의 탄소-5 위치(carbon-5 position)에로의 메틸기의 효소적 전달에 의해 일어난다. 상기 효소적 반응은 DNA 메틸기 전달효소(DNA methyltransferases ; DNMTs)들에 의해 수행된다. DNMT1은 포유동물들에서의 주요 메틸기 전달효소이며, 영속성 메틸화(maintenance methylation)로 언급되는 부분-메틸화 사이트(hemi-methylated sites)들의 완전메틸화로의 복제-후 복구(post-replicative restoration)를 담당하고 있는 반면에, DNMT3A 및 DNMT3B들은 단리된 메틸화(isolated methylation)라 불리우는 과정인 새로운 사이트들의 메틸화에 일차적으로 포함되는 것으로 여겨지고 있다.

CpG 디뉴클레오티드들에서의 메틸화의 손실, 즉 일반적인 저메틸화(hypomethylation)는 암 세포들에서 동정되는 첫 번째의 후생적 이상(epigenetic abnormalities)들이다. 그러나, 지난 몇 년간, 사이트-특이적 과메틸화(site-specific hypermethylation), 예를 들면 일부 종양 억제 유전자(tumor suppressor genes)들이 발암현상(carcinogenesis) 동안에 선택적인 잇점들을 제공할 수 있다는 것이 점점 명백해지고 있다. 프로모터 영역들에서의 CpG섬들의 과밀한 메틸화(dense methylation)는 후속하는 유전자 침묵(gene silencing)을 수반하는 히스톤 변성(histone modifications)들을 통한 염색질 개조(chromatin remodeling)를 촉발할 수 있다. 따라서, 염색체 결실(chromosomal deletions)들 또는 유전적 돌연변이(genetic mutations)들에 더해, 프로모터 과메틸화에 의한 종양 억제 유전자들의 후생적 침묵은 통상적으로 인간 암에서 나타난다.

최근 역학조사에서는 메틸기의 주요 원천(major source)인 혈청 엽산 수준(serum folate level)과 인간 파필로마 바이러스의 감염 및 정화(clearance)의 상관관계가 밝혀졌다. 메틸회로(methyl cycle)의 대사에서의 효소들의 유전적 다형성(Genetic polymorphisms)들이 또한 자궁상피내병변(cervical intraepithelial lesions)들의 발달과 연관되는 것으로 보고되었다. 후생학들의 개념이 발달함에 따라, DNA 메틸화와 자궁경부암 사이의 연관을 탐구하는 연구들이 또한 급속한 발전을 이루었다. 자궁경부암에서의 DNA 메틸화의 연구가 축적되고 있으며, 이는 자궁의 검사에서 지표들로서 메틸화의 사용 가능성을 나타내었다. 유전학과 환경 사이의 접점의 속성에 대하여는, 종양 억제 유전자들에서의 메틸화의 출현율(prevalence)은 서로 다른 유전자들에서 그리고 서로 다른 분포들로 변화한다. 서로 다른 질병 거동(disease behaviors)들을 갖는 메틸레이터 표현형(methylator phenotypes)들의 개념은 논쟁거리로 제안되었다. 자궁경부암의 메틸레이터 표현형 및 그의 인간 파필로마 바이러스 유전자형(HPV genotypes)들과의 상호작용은 여전히 알려지지 않은 채로 남아 있다. 어떤 유전자들이 자궁경부암에서 특이적으로 메틸화되고 그리고 임상 응용(clinical application)을 달성하기 위하여 얼마나 많은 유전자들이 요구되는 지는 다가오는 미래의 과제로 남을 것이다.

본 출원의 발명자는 대만(대만 공개특허공보 제200831900호), 중국(중국 특허출원 제200810094659.2호), 말레이지아(제UI20085354호) 및 미합중국(미합중국 공개특허공보 제20080311570호)(이하에서는 '선행출원들'이라 언급함)들에 관련 특허출원들을 출원하였다. 선행출원들과 비교하여 보면, 본 발명자는 일부 신규한 암 검사 생체지표 및 이를 사용하는 암 검사 방법을 발견하였다.

본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 하고 있는 것으로서, 특히, 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있는 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 1차 자궁경부암 검사(first line cervical cancer screening)로서의 자궁경부암 검사 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 1차 자궁경부암 검사에서 뿐만 아니라 보다 정확한 자궁경부암 검사 효과를 달성하기 위하여 인간 파필로마 바이러스 시험 또는 불확실한 세포진 검사 결과를 보조하기 위한 2차 자궁경부암 검사에서도 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 검사 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자궁경부암의 검사와 마찬가지로 비정상적인 시료(abnormal specimen)의 진단을 보조하기 위한 다른 암(예를 들면 : 난소암, 결장암(colon cancer) 등)의 검사에서 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 암 검사 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 검사 생체지표 또는 암을 앓는 위험을 검사하기 위한 상기 생체지표를 포함하는 키트(kit)를 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 언급된 목적들을 달성할 수 있는 암 검사 방법은 시험 시료의 표적 유전자(target gene ; 생체지표)의 메틸화율(methylation rate)을 검출하고 시험 결과를 암을 앓는 위험을 나타내는 검사 지수(screening index)로 사용하는 것을 포함하며, 상기 방법은

단계 1 : 단리된 시험 시료를 제공하고;

단계 2 : 상기 시험 시료의 유전체 DNA 내의 적어도 하나의 표적 유전자 내의 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하고, 상기 표적 유전자는 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들을 포함하고; 및

단계 3 : 상기 표적 유전자 내에서의 상기 메틸화율에 기초하여 상기 시료 내에 암 또는 전암병변(precancer)의 병리학적 변화(pre-cancerous pathological change)를 판단하거나 또는 예후 표지(prognosis marker)로서 표적 유전자의 상기 메틸화율을 사용하는

것을 포함하며;

상기 시험 시료는 자궁경부 부스러기(cervical scraping), 난소암 조직, 복수(ascites), 혈액, 뇨, 배설물(feces), 객담(sputum), 구강점막세포(oral mucous membrane cell), 위액(gastric juices), 담즙(bile), 자궁경부상피세포(cervical epithelial cell) 및 수술-후 암 조직(post-surgery cancer tissue)을 포함하며;

상기 표적 유전자에서의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태(methylation state)에 대한 시험 방법들이 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(methylation-specific polymerase chain reaction ; MSP), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(quantitative methylation-specific polymerase chain reaction ; QMSP), 바이설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing ; BS), 마이크로어레이(microarrays), 질량분석법(mass spectrometry), 변성 고성능 액체크로마토그래피(denaturing high-performance liquid chromatography ; DHPLC)들을 포함하며;

상기 표적 유전자 DBC1은 시퀀스 확인 번호 1(SEQ ID No: 1)의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고;

상기 표적 유전자 PDE8B는 시퀀스 확인 번호 2의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고;

상기 표적 유전자 PTPRR은 시퀀스 확인 번호 3의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고;

상기 표적 유전자 ZNF582는 시퀀스 확인 번호 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다.

게다가, 앞서 기술된 검사 지수 및 검사 방법은 더욱이 자궁경부암 및 결장암의 검사에서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 난소암 검사 방법을 제공하는 것을 특징으로 하며, 이 방법은 상기 시험 시료의 상기 표적 유전자의 상기 메틸화 상태를 시험하고 상기 메틸화 상태를 난소암을 앓는 위험을 결정하는 검사 지수로 사용하며, 상기 방법은

단계 1 : 단리된 시험 시료를 제공하고;

단계 2 : 상기 시험 시료의 유전체 DNA 내의 적어도 하나의 표적 유전자 내의 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하고, 상기 표적 유전자는 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들을 포함하고; 및

단계 3 : 상기 표적 유전자 내에서의 상기 메틸화율에 기초하여 상기 시료 내에 난소암 또는 암의 병리학적 변화를 판단하거나 또는 예후 표지로서 표적 유전자의 상기 메틸화율을 사용하는

것을 포함하며;

상기 시험 시료는 난소암 조직, 복수, 혈액, 뇨 및 수술-후 암 조직을 포함하며;

상기 표적 유전자에서의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태에 대한 시험 방법들이 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP), 바이설파이트 시퀀싱(BS), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체크로마토그래피(DHPLC) 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)

들을 포함하며;

상기 표적 유전자 DBC1은 시퀀스 확인 번호 1의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고;

용어 "시험 시료(test specimen)"는 본 명세서에서는 단리된 시험 시편을 의미하며 상기 단리된 시험 시편은 앞서 기술한 자궁경부 부스러기, 복수, 혈액, 뇨, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 자궁경부상피세포, 수술-후 암 조직 또는 다른 적절한 시료를 포함한다. 본 발명의 암 검사 방법은 상기 시험 시료들 내의 표적 유전자들의 메틸화 상태를 시험하는 데 유용하며, 생체지표의 메틸화 상태를 여러 형태의 암의 검사 지수로 사용한다. 본 발명에 의해 제공되는 상기 암 검사 방법 및 생체지표의 검사 지수는 연구자들에 의해 실험실에서 상기 시험을 수행하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "암을 앓는 위험(the risk of having cancer)"은 암을 앓는 백분율, 장래에 암을 앓게 될 위험 또는 암의 존재 또는 부재를 의미한다.

상기 메틸화 상태가 표적 유전자(생체지표)의 적절한 대조에 비해 더 높은 경우, 암을 앓는 위험은 보다 높을 수 있다.

상기 검사 방법에 따르면, 본 발명은 또한 암 검사 생체표지 또는 상기 생체표지를 포함하며, 암을 앓는 위험을 결정하기 위하여 단리된 시험 시료 내의 표적 유전자(생체지표)의 상기 메틸화 상태를 검사하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 이들 특징들 및 잇점들은 이하의 첨부된 도면들의 상세한 설명으로부터 충분히 이해되고 인식될 수 있을 것이다.

본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도를 제공하는 효과를 제공하며, 특히, 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법을 제공하는 효과를 제공한다.

도 1a는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 PTPRR을 사용하는 여러 자궁경부 시료들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득된 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 ZNF582를 사용하는 여러 자궁경부 시료들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1c는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 PDE8B를 사용하는 여러 자궁경부 시료들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1d는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 DBC1을 사용하는 여러 자궁경부 시료들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 이하의 실시예들을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 그러나 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 재료들 및 방법들

1. 재료들

시험 재료들에는 편평세포암종(squamous cell carcinoma ; SCC, n = 20), 선암종(adenocarcinoma ; AC, n = 20) 및 정상 자궁경부 시료(n = 10)를 포함하여 일련의 완전한 자궁경부 병변 시료들이 포함된다. 이들 자궁경부 시료, 난소 시료 및 결장암 시료들 모두는 대만 타이페이 소재 트리-서비스 제네럴 호스피탈(Tri-service General Hospital)로부터 수득되었다. 각 시료는 퀴아앰프 디엔에이 키트(QIAamp DNA Kit ; 퀴아젠(QIAGEN)사)의 수단들에 의하여 유전체 DNA 추출(genomic DNA extraction)에 적용시켰으며, 유전체-전장(genome-wide) DNA 메틸화 내에서의 DNA 메틸화 조건의 대조 및 분석에서 사용되었다. 분석에 앞서, 바이오분석기(Bioanalyzer ; 애질런트(Agilent)사)에 의해 유전체 DNA의 질을 체크하였다. 이 실시예에 있어서, 단편화된 DNA 10㎍을 메디프(MeDIP ; 메틸 DNA IP) 분석에 적용시켰다.

2. 메디프 및 CpG 섬-플러스-프로모터 어레이( CpG island - Plus - Promoter arrays)들에 의한 DNA 메틸화 분석

바이오럽터 유씨에스-200(Bioruptor™ UCS-200 ; 다이아게노드(Diagenode)사)으로 유전체 DNA를 300 내지 1,000bp의 범위의 크기로 단편화시켰다. 본 발명자들은 이를 100㎕ IP 완충제(0.15% SDS(도데실황산나트륨), 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5mM EGTA, 10mM 트리스(Tris) 및 0.1% BSA(우혈청알부민))의 최종 농도 내에서 폴리클로날 항-5'-메틸 시토신 항체(애브켐(Abcam)사) 30㎕와 함께 4℃에서 밤새 동안 이를 면역침전(immunoprecipitated) 시켰다. 본 발명자들은 프로테인 지 세파로스(Protein G Sepharose ; 아메르샴(Amersham)사) 120㎕와의 혼합물을 2시간 동안 4℃에서 배양시키고 이를 1㎖의 낮은 농도의 염, 높은 농도의 염 완충제, 염화리튬 및 TE 완충제들로 2회 세척하였다. 계속해서 본 발명자들은 상기 프로테인 지를 용리 완충제(elution buffer ; 1% SDS, 0.1M NaHCO₃)로 15분간 실온에서 2회 처리하고 페놀-클로로포름 추출(phenol-chloroform extraction)과 후속하는 에탄올 침전에 의하여 메틸화된 DNA를 회수하였다. 풍부화된, 메틸화된 DNA 및 입력 DNA(input DNA)를 전유전자 증폭 키트(Whole Genome Amplification Kit ; 시그마(Sigma)사)로 증폭시켰다. 풍부화된 총 DNA를 각각 Cy5 및 Cy3로 말단-표지화(end-labeled) 시키고, 님블젠 시스템즈 인코포레이티드(NimbleGen Systems, Inc.)에 의해 설계되고 합성된 CpG섬-플러스-프로모터 어레이들에 공-잡종화(co-hybridized) 시켰다. 이 어레이는 이중으로 존재하는 24,659 HG18 RefSeq 프로모터들(800bp의 업스트림 내지 200bp의 다운스트림) 및 28,226 CpG섬들을 가로지르는 매 100bp에 타일로 붙여진 385,000 50 내지 75bp 올리고뉴클레오티드들을 포함하였다.

상기 어레이 상의 각 특성은 대응하는 척도화된(scaled) log2-비(log2-ration)를 갖는다. 상기 log2-비는 0의 부근에서 상기 비율 데이터의 중심에 대한 정규화(normalization)이다. 상기 척도화된 log2-비 데이터로부터, 고정-길이창(fixed-length window ; 500bp)이 각 연속되는 탐침 주위에 위치되고 일방형 콜모고로프-스미르노프(one-sided Kolmogorov-Smirnov ; KS) 시험을 적용하여 상기 탐침들이 상기 어레이의 나머지들 내의 탐침들보다 뚜렷하게 보다 양성적인 분포로부터 취해졌는 지의 여부를 결정하였다. 각 탐침에 대한 그 결과의 스코어(score)는 그 탐침 주위의 창이 있는 KS 시험으로부터의 -log10 p-값이다(문헌 스카체리(Scacheri)와 그의 동료들의 2006을 참조). 본 발명자들은 2의 p-값 최소 컷오프(p-value minimum cutoff ; -log10) 이상인 적어도 2개의 탐침들에 대한 검색에 의하여 풍부화된 피크들을 검출하였다. 300bp 내의 서로 다른 피크들을 병합시켰다. 전사 스타 사이트(transcription star sites)들의 2500bp 업스트림 내에서의 SCC/AC와 정상 자궁 경관(normal cervix) 사이의 차등 메틸화 영역(differential methylation regions)들을 장래의 확인을 위하여 선택하였다. 마지막으로, 시그널맵(SignalMap ; 님블젠(NimbleGen)사)을 사용하여 p-값 데이터를 관측하였다.

3. 바이설파이트 변성, 메틸 -특이적 중합효소 연쇄반응( MSP ) 및 바이설파이 트 시퀀싱( BS )

메틸화된 시토신들을 보존하기 위하여 유전체 DNA의 1㎍ 분획(aliquots)들을 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)으로 전환시키기 위하여 제조업자의 추천사항들에 따라 DNA 변성 키트(DNA modification kit ; 미합중국 캘리포니아주 테메큘라(Ternecula, CA) 소재의 케미콘(Chemicon)사)를 사용하였다. 최종 침전을 MSP용의 70㎕의 예열된(pre-warmed ; 55℃) TE 완충제로 용리시켰다.

인간 말초혈액의 정상 DNA를 취하고 바이설파이트 변성에 적용시켰으며, 이를 메틸화되지 않은 프로모터 시퀀스를 갖는 대조군으로 사용하였다.

선행 기술에 따라 MSP를 수행하였다. 요약하면, 바이설파이트-전환된 DNA(bisulfite-converted DNAP 내에 존재하는 메틸화된 유전자 시퀀스들을 특이적으로 인식하는 MSP 프라이머(MSP primers ; 표 1)들을 사용하여 1㎕의 변성된 DNA를 증폭시켰다. 1㎕의 변성된 템플레이트 DNA(templated DNA), 1.5pmol의 각 프라이머, 0.2mmol/ℓ 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트들 및 1단위(unit)의 골드 태그 디엔에이 중합효소(Gold Taq DNA polymerase ; 미합중국 캘리포니아주 포스터시 소재 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)를 포함하는 25㎕의 총 용적 내에서 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. MSP 반응들을 95℃에서 5분간 초기 배양에 적용시켰으며, 후속하여 95℃에서 30초간 35 사이클을 수행하였으며, 적절한 온도에서 30초간 72℃에서 30초간 열처리(annealing) 하였다. 72℃에서 5분간 최종 확장(final extension)을 수행하였다. 증폭 생성물들을 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 포함하는 2.5% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 가시화시켰으며, 자외광(UV light) 하에서 조명하였다.

표 1은 MSP 프라이머들의 시퀀스들이다.

모든 MSP 데이터들은 DNA의 적어도 2개의 독립적인 변형들로부터 얻어졌다. 이중의 실험들에서 신호가 없는 것은 음성 메틸화(negative methylation)로 기록하였다. 메틸화 유전자 시퀀스를 특이적으로 인식할 수 있는 MSP 프라이머(M)를사용하는 것에 의하여 얻어진 PCR 생성물을 pCR4-TOPO 벡터(미합중국 캘리포니아주 칼스배드 소재, 인비트로젠(Invitrogen)사) 내로 구축하였다. 5개의 독립한 복제(clones)들을 선택하고 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켰다. 바이설파이트 시퀀싱(BS)에서 사용된 프라이머들을 표 2에 기재하였다. 377 오토-시퀀서(377 Auto-sequencer ; 미합중국 캘리포니아주 포스터 소재, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)를 사용하여 수행하였다. 시퀀싱된 결과들을 시퀀스 목록에 나타내었다. 바이설파이트 시퀀싱에서 시퀀스 번호들은 각각 DBC1_BS(시퀀스 확인 번호: 21), PDE8B_BS(시퀀스 확인 번호: 22), PTPRR_BS(시퀀스 확인 번호: 23) 및 ZNF582_BS(시퀀스 확인 번호: 24)들이었다.

표 2는 바이설파이트 시퀀싱 프라이머들의 시퀀스들이다.

실시예 2 자궁경부암 내의 메틸화된 표적 유전자의 검사

CpG섬-플러스-프로모터 어레이들에 의하여 검사한 이후, 자궁경부암 세포 내에서 고도로 메틸화되었을 4개의 표적 유전자들, 즉 각각 DBC1(시퀀스 확인 번호: 1), PDE8B(시퀀스 확인 번호: 2), PTPRR(시퀀스 확인 번호: 3) 및 ZNF582(시퀀스 확인 번호: 4)들을 검사하였다. 그들의 상세한 정보를 표 3에 나타내었다. 표 3으로부터, 이들 4개의 유전자들 중에서 방광암(bladder cancer)과 연관된 것으로 알려진 DBC1을 제외하고는 자궁경부암에 대한 이들 유전자들의 상관관계를 나타낸 연구가 현재까지 거의 없었다.

표 3은 CpG섬-플러스-프로모터 마이크로어레이를 사용하여 동정된 자궁경부암 내의 메틸화된 유전자들의 특성들을 나타낸다.

실시예 3 바이설파이트 시퀀싱( BS )에 의한 자궁경부 병변 시료 내의 표적 유전자의 메틸화 상태의 분석

표적 유전자 : PTPRR

시험 시료 군들:

1. HeLa_0: HeLa 자궁경부암 세포주;

2. HeLa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);

3. HeLa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA(미합중국 미주리주 세인트루이스 소재, 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)사) 둘 다로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);

4. AC: 자궁경부선암 시료;

5. SCC: 자궁경부편평세포암종 시료;

6. 대조군(정상): 메틸화가 없는 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA.

앞서 기술된 이들 시험 시료들 각각을 바이설파이트 변성에 계속해서 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시험 시료 내의 상기 표적 유전자(PTPRR)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 검은색은 메틸화 영역(methylation region)을 나타내고 흰색은 비-메틸화 영역(un-methylation region)을 나타내었다. 상기 표적 유전자 PTPRR은 대조군 및 상기 선암에서 메틸화되지 않은 반면에 상기 표적 유전자 PTPRR은 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0) 및 자궁경부 편평세포암종 시료(SCC)에서는 과메틸화되었다. 따라서, PTPRR의 메틸화율은 자궁경부암이 존재하는지 그렇지 않은 지의 여부를 검사하기 위한 생체지표로서 사용될 수 있다.

게다가, 자궁경부암 시료 내의 상기 표적 유전자의 메틸화율이 DNA 메틸화를 통하여 조절될 수 있는 지의 여부를 확인하기 위하여, HeLa 자궁경부암 세포주를 10mM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC ; 시그마 케미칼 컴퍼니)으로 처리하였다. 상기 세포로부터 추출된 상기 DNA 시료를 바이설파이트 변성에 계속해서 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켰다. 도 1a에 나타난 결과는, 상기 자궁경부 편평세포암종 시료(SCC)와 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0)에 비하여, 상기 AZC-처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_10D) 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 탈-메틸화(de-methylated)된 영역의 일부를 갖는다는 것을 나타내었다.

트리코스타틴 에이(trichostatin A ;TSA)는 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase ; HDAC) 억제제들이며, 메틸화율을 낮추거나(lower) 또는 저하(degrade) 시키는 데 사용될 수 있다. HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_DT)는 AZC 및 TSA 둘 다로 처리되었다. 도 1에 나타난 결과는, 상기 자궁경부 편평세포암종 시료(SCC)와 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0)에 비하여, 상기 AZC- 및 TSA-처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_DT) 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 고도로 탈-메틸화되었다는 것을 나타내었다.

요약하면, 상기 기술된 결과들은 자궁경부암 시료 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 DNA 메틸화를 통하여 메틸화되었음을 확인하고 있다.

표적 유전자 : ZNF582

시험 시료 그룹들:

1. HeLa_0: HeLa 자궁경부암 세포주;

3. HeLa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA 둘 다로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);

4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시료 1;

5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시료 2;

6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA.

상기 자궁경부편평세포암종 시료 1 및 시료 2들은 서로 다른 환자들로부터 수득된 시료들이다.

앞서 언급된 이들 시험 시료들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시험 시료 내의 상기 표적 유전자(ZNF582)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1b에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시료 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시료 2(SCC) 및 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0) 내의 상기 표적 유전자 ZNF582가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시료들 내의 상기 표적 유전자 ZNF582는 고도로 메틸화되었다.

표적 유전자 : PDE8B

시험 시료 그룹들:

1. SiHa_0: SiHa 자궁경부암 세포주;

2. SiHa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);

3. SiHa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA 둘 다로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);

4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시료 1;

5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시료 2;

6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 사용된 정상 자궁경부혈액 DNA;

앞서 언급된 이들 시험 시료들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시험 시료 내의 상기 표적 유전자(PDE8B)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1c에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시료 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시료 2(SCC) 및 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0) 내의 상기 표적 유전자 PDE8B가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시료들 내의 상기 표적 유전자 PDE8B는 고도로 메틸화되었다.

표적 유전자 DBC1

시험 시료 그룹들:

1. SiHa_0: SiHa 자궁경부암 세포주;

4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시료 1;

5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시료 2;

6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA;

앞서 언급된 이들 시험 시료들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시험 시료 내의 상기 표적 유전자(DBC1)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1d에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시료 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시료 2(SCC) 및 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0) 내의 상기 표적 유전자 DBC1가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시료들 내의 상기 표적 유전자 DBC1는 고도로 메틸화되었다.

실시예 4 자궁경부암 시료들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석

메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 자궁경부 편평세포암종(SCC) 시료들 내의 상기 4가지 표적 유전자들의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 4에 나타난 상기 메틸화 상태 분석 결과는 정상 자궁경부 시료에 있어서는 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화 빈도(methylation frequency)가 각각 11%, 0%, 9% 및 6%이었으며; 자궁경부 편평세포암종 시료에 있어서는 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화 빈도가 각각 100%, 47%, 100% 및 97%이었음을 나타내었다. 이들 결과들로부터 자궁경부 편평세포암종 시료들에 있어서는 상기 4가지 유전자들이 고도로 메틸화되었다는 것을 알 수 있다. 따라서, 결국 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화율이 자궁경부암의 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.

표 4는 자궁경부 편평세포암종 시료들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태 분석이다.

실시예 5 난소암 시료 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석

메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 난소암 시료들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 5의 메틸화 상태 분석 결과들은 난소 악성 종양(ovarian malignant tumor) 시료 및 난소 양성 종양(ovarian benign tumor) 시료 내의 3개의 유전자들 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 상태들의 분석을 보고하고 있다. 상기 결과들은 난소 악성 종양 시료 내의 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도가 각각 50.3%, 50.0% 및 56.3%들이었고, 난소 양성 종양 시료 내의 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도가 각각 2.5%, 0.0% 및 12.5%들이었다는 것을 나타내었다. 차등 메틸화 수준은 각각 53.8%, 50.0% 및 43.8%들이었다. 따라서, 난소 양성 종양 시료에 비하여, 난소 악성 종양 시료 내의 상기 3개의 유전자들의 메틸화 수준들은 뚜렷하게 더 높았다. 따라서, DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화율은 결국 난소암 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.

표 5는 난소암 시료들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화율 분석이다.

실시예 6 결장암 시료 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석

메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 결장암 시료 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 6의 메틸화 상태 분석 결과는 결장암 시료 내의 4개의 유전자들 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 상태를 보고하고 있다. 상기 결과는 결장암 시료 내의 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도들이 각각 100.0%, 100.0, 100.0% 및 100.0%들인 반면에, 정상 결장 조직 시료 내의 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도들은 각각 25.0%, 25.0%, 25.0% 및 25.0%들이었음을 나타내었다. 따라서, 정상 결장 조직 시료에 비하여, 결장암 시료 내의 상기 4개의 유전자들의 메틸화 수준들은 뚜렷하게 더 높았다. 따라서, DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화율은 결국 결장암 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.

표 6은 결장암 시료들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태 분석이다.

본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법은 앞서 기술된 통상의 기술들에 비하여 하기의 잇점들을 갖는다:

1. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 단리된 시료 내의 특정의 유전자의 메틸화율을 암을 앓는 위험을 결정하기 위한 생체지표로서 사용하고, 자궁 경부 도말(cervical scraping) 및 인간 파필로마 바이러스 시험(HPV 시험) 등과 같은 통상의 방법들에 비하여, 본 발명의 암 검사 방법의 민감성(sensitivity) 및 특이성(specificity) 둘 다 상기 2개의 기술된 방법들의 그것들 보다 더 높다.

2. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 1차 자궁경부암 검사에서 뿐만 아니라 2차 자궁경부암 검사로서 인간 파필로마 바이러스 시험과 함께 또는 이를 보조하여 보다 정확한 자궁경부암 검사 효과를 달성하도록 할 수 있다.

3. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 자궁경부암의 검사 뿐만 아니라 다른 암(예를 들면 : 난소암, 결장암 등)의 검사검사에 적용되어 비정상적인 시료의 진단을 보조할 수 있다.

물론 본 발명의 앞서 기술된 실시예들에 있어서 많은 변화들 및 변경들이 그의 관점으로부터 벗어남이 없이 실행될 수 있다. 따라서, 과학 및 실용기술(useful arts)들의 발전을 촉진하기 위하여, 본 발명이 기술되었으며, 단지 첨부된 특허청구범위들에 의하여서만 제한되는 것으로 의도된다.

(도면 부호 없음)

Claims

암 검사를 위한 정보를 제공하기 위하여, 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법에 있어서,
단계 1 : 단리된 시험 시료를 제공하고;
단계 2 : 상기 시험 시료의 적어도 하나의 표적 유전자 내의 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하고, 상기 표적 유전자는 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고; 및
단계 3 : 상기 표적 유전자 내에서의 상기 메틸화율에 근거하여 상기 시료 내에 암 또는 전암병변(precancer)의 병리학적 변화를 판단하거나 또는 예후 표지로서 표적 유전자의 상기 메틸화율을 사용하는 것을 포함하여 이루어지며,
ZNF582는 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer) 또는 결장암(colon cancer)의 표적 유전자로서 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 시험 시료가 자궁 경부 도말(cervical smear), 복수, 혈액, 뇨, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 자궁경부상피세포 및 수술-후 암 조직으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 단리된 시료임을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 유전자의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태에 대한 시험 방법이 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP), 바이설파이트 시퀀싱(BS), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체크로마토그래피(DHPLC) 및 파이로시퀀싱을 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 시퀀스 확인 번호 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 것을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
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제 4 항에 있어서,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 시퀀스 확인 번호 19, 20의 프라이머에 의해 바이설파이트 시퀀싱되는 것을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)의 메틸화율은 시퀀스 확인 번호 11, 12의 프라이머에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 검사 표지로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
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