KR101530498B1 - 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
시편의 표적 유전자의 메틸화율을 검출하며, 암을 가지는 위험을 결정하기 위한 검사 지수로서 상기 메틸화율을 사용하는 암 검사 방법에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함하며, 단계 1에서, 시편을 제공하고; 단계 2에서, 상기 시편의 적어도 하나의 표적 유전자에서 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하되, 상기 표적 유전자는 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R), ZNF582(Zinc Finger Protein 582), PDE8B(phosphodiesterase 8B) 및 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하며; 단계 3에서, 상기 표적 유전자에서의 메틸화율에 의존하여 상기 시편에 암 또는 전암의 병리학적 변화가 있는지 또는 없는지의 여부를 결정하거나, 또는 예후 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 사용한다.
Description
본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법에 관한 것이다.
자궁경부암(cervical cancer)은 전세계적으로 그리고 대만에서 여성들에 있어서의 사망의 주요 원인들 중의 하나가 되었다. 2002년 국제보건기구에 의한 통계 조사에 의하면, 자궁경부암은 유방암에 이어 전세계 여성의 사망에 대하여 책임이 있는 두 번째의 주요 질병이었다. 규칙적인 자궁경부암 검사가 자궁경부암을 예방하는 가장 좋은 방법이다. 통상의 자궁경부암 검사에는 두 가지의 접근법들, 즉 가장 통상적으로 사용되는 세포진 검사(Pap smear) 및 인간 파필로마 바이러스 시험(human papilloma virus testing ; HPV testing)을 포함한다. 세포진 검사는 자궁경(cervix uteri)으로부터의 분비물을 채취(sampling)하고, 현미경 하에서 박리된 상피세포 내에서 암의 병리학적 변화(cancerous pathological change)가 있는 지의 여부를 검사하여 조기에 자궁경부암을 검출하도록 하는 것으로 이루어진다. 반면에, 인간 파필로마 바이러스 시험은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction ; PCR) 또는 하이브리드캡쳐(Hybrid Capture)를 사용하는 것에 의하여 시표 내에서 인간 파필로마 바이러스(HPV)가 존재하는 지의 여부를 검사하는 것으로 이루어진다.
그러나, 세포진 검사에는 많은 바람직하지 못한 특성들이 있다. 그 하나로, 이는 내과의에 의한 채취 및 법의관(medical examiner)/병리학자(pathologist)에 의한 분석을 필요로 하며, 이는 많은 개발도상국가들에서 이 시험을 촉진하는 데 어려움을 부과하는 인력의 고비용을 요구한다. 또한, 세포진 검사는 높은 위음성율(false negative rate)을 가지며 이는 암의 병리학적 변화에 앞서 진단 및 적절한 치료를 지연시킨다. 인간 파필로마 바이러스 시험에 대해서는, 비록 이것이 고도로 민감하기는 하나, 이는 높은 위양성율(false positive rate)을 생성하는 경향이 있으며, 이는 환자에게 헛된 근심을 남길 뿐만 아니라 이러한 위양성의 환자들의 시험 후속조치들에 있어서 많은 의료자원들을 낭비한다. 따라서, 자궁경부암 검사를 촉진함에 있어서 가장 중요한 주제들 중의 하나는 자궁경부암 검사 방법의 정확도와 편의성을 증가시키는 것을 필요로 한다.
유전체 결실(genomic deletions)들이 오랫동안 종양형성(tumorigenesis)의 중요한 인자로 고려되었다. 오랜 기간 동안, 유전체의 해독 가능성(coding potential)이 A, T, G, C의 4개의 염기들의 배열에 놓여 있다는 생각에 익숙해져 왔다. 1970년대 초기에 제안된 투-히트 이론(two-hit theory)은 일부 상동 종양 억제 유전자(homologous tumor suppressor genes)들의 수반 돌연변이들 또는 결실들이 암의 발달을 야기하거나 또는 잘 걸리게 한다는 것을 나타내고 있다. 그러나, 표현형(phenotype)에 영향을 주는 별도의 정보가 변성된 염기 5-메틸시토신(modified base 5-methylcytosine) 내에 저장될 수 있다. 5-메틸시토신은 회문식 시퀀스(palindromic sequence) 5'-CpG-3'의 문맥 내에서 포유동물들에서 발견된다. 대부분의 CpG 디뉴클레오티드 쌍들은 "CpG섬(CpG island)"이라고 불리는 일부 영역들을 제외한 포유동물 세포들 내에서 메틸화되어 있다. CpG섬들은 대개는 유전자들의 부근에 위치되는 대략 1kb의 GC- 및CpG-풍부 영역들에 존재하며, 또한 광범위하게 발현되는 유전자들의 프로모터(promoter) 근처에서 발견된다. 시토신 메틸화는 DNA 합성 이후에 메틸 공여자(methyl donor) S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine)으로부터 시토신의 탄소-5 위치(carbon-5 position)에로의 메틸기의 효소적 전달에 의해 일어난다. 상기 효소적 반응은 DNA 메틸기 전달효소(DNA methyltransferases ; DNMTs)들에 의해 수행된다. DNMT1은 포유동물들에서의 주요 메틸기 전달효소이며, 영속성 메틸화(maintenance methylation)로 언급되는 부분-메틸화 사이트(hemi-methylated sites)들의 완전메틸화로의 복제-후 복구(post-replicative restoration)를 담당하고 있는 반면에, DNMT3A 및 DNMT3B들은 단리된 메틸화(isolated methylation)라 불리는 과정인 새로운 사이트들의 메틸화에 일차적으로 포함되는 것으로 여겨지고 있다.
CpG 디뉴클레오티드들에서의 메틸화의 손실, 즉 일반적인 저메틸화(hypomethylation)는 암 세포들에서 동정되는 첫 번째의 후생적 이상(epigenetic abnormalities)들이다. 그러나, 지난 몇 년간, 사이트-특이적 과메틸화(site-specific hypermethylation), 예를 들면 일부 종양 억제 유전자(tumor suppressor genes)들이 발암현상(carcinogenesis) 동안에 선택적인 잇점들을 제공할 수 있다는 것이 점점 명백해지고 있다. 프로모터 영역들에서의 CpG섬들의 과밀한 메틸화(dense methylation)는 후속하는 유전자 침묵(gene silencing)을 수반하는 히스톤 변성(histone modifications)들을 통한 염색질 개조(chromatin remodeling)를 촉발할 수 있다. 따라서, 염색체 결실(chromosomal deletions)들 또는 유전적 돌연변이(genetic mutations)들에 더해, 프로모터 과메틸화에 의한 종양 억제 유전자들의 후생적 침묵은 통상적으로 인간 암에서 나타난다.
최근 역학조사에서는 메틸기의 주요 원천(major source)인 혈청 엽산 수준(serum folate level)과 인간 파필로마 바이러스의 감염 및 정화(clearance)의 상관관계가 밝혀졌다. 메틸회로(methyl cycle)의 대사에서의 효소들의 유전적 다형성(Genetic polymorphisms)들이 또한 자궁상피내병변(cervical intraepithelial lesions)들의 발달과 연관되는 것으로 보고되었다. 후생학들의 개념이 발달함에 따라, DNA 메틸화와 자궁경부암 사이의 연관을 탐구하는 연구들이 또한 급속한 발전을 이루었다. 자궁경부암에서의 DNA 메틸화의 연구가 축적되고 있으며, 이는 자궁의 검사에서 지표들로서 메틸화의 사용 가능성을 나타내었다. 유전학과 환경 사이의 접점의 속성에 대하여는, 종양 억제 유전자들에서의 메틸화의 출현율(prevalence)은 서로 다른 유전자들에서 그리고 서로 다른 분포들로 변화한다. 서로 다른 질병 거동(disease behaviors)들을 갖는 메틸레이터 표현형(methylator phenotypes)들의 개념은 논쟁거리로 제안되었다. 자궁경부암의 메틸레이터 표현형 및 그의 인간 파필로마 바이러스 유전자형(HPV genotypes)들과의 상호작용은 여전히 알려지지 않은 채로 남아 있다. 어떤 유전자들이 자궁경부암에서 특이적으로 메틸화되고 그리고 임상 응용(clinical application)을 달성하기 위하여 얼마나 많은 유전자들이 요구되는 지는 다가오는 미래의 과제로 남을 것이다.
본 출원의 발명자는 대만(대만 공개특허공보 제200831900호), 중국(중국 특허출원 제200810094659.2호), 말레이지아(제UI20085354호) 및 미합중국(미합중국 공개특허공보 제20080311570호)(이하에서는 '선행출원들'이라 언급함)들에 관련 특허출원들을 출원하였다. 선행출원들과 비교하여 보면, 본 발명자는 일부 신규한 암 검사 생체지표 및 이를 사용하는 암 검사 방법을 발견하였다.
본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 하고 있는 것으로서, 특히, 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 1차 자궁경부암 검사(first line cervical cancer screening)로서의 자궁경부암 검사 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 1차 자궁경부암 검사에서 뿐만 아니라 보다 정확한 자궁경부암 검사 효과를 달성하기 위하여 인간 파필로마 바이러스 시험 또는 불확실한 세포진 검사 결과를 보조하기 위한 2차 자궁경부암 검사에서도 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 검사 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자궁경부암의 검사와 마찬가지로 비정상적인 시편(abnormal specimen)의 진단을 보조하기 위한 다른 암(예를 들면 : 난소암, 결장암(colon cancer) 등)의 검사에서 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 암 검사 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 검사 생체지표 또는 암을 가지는 위험을 검사하기 위한 상기 생체지표를 포함하는 키트(kit)를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 언급된 목적들을 달성하기 위하여, 시편의 표적 유전자의 메틸화율을 검출하며, 암을 가지는 위험을 결정하기 위한 검사 지수로서 상기 메틸화율을 사용하는 암 검사 방법에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함하며, 단계 1에서, 시편을 제공하고; 단계 2에서, 상기 시편의 적어도 하나의 표적 유전자에서 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하되, 상기 표적 유전자는 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R), ZNF582(Zinc Finger Protein 582), PDE8B(phosphodiesterase 8B) 및 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하며; 단계 3에서, 상기 표적 유전자에서의 메틸화율에 의존하여 상기 시편에 암 또는 전암의 병리학적 변화가 있는지 또는 없는지의 여부를 결정하거나, 또는 예후 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 사용한다.
바람직한 실시예에서, 상기 시편은 자궁경부찰과도말(cervical smear), 복수, 혈액, 소변, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 경부상피세포, 및 수술후 암 조직으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 단리된 시편일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 표적 유전자의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태에 대한 시험 방법은, 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP; methylation-specific polymerase chain reaction), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP; quantitative methylation-specific polymerase chain reaction), 바이설파이트 시퀀싱(BS; bisulfite sequencing ), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC; denaturing high-performance liquid chromatography), 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고, 상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고, 상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며, 상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 가진다.
바람직한 실시예에서, 상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)의 메틸화된 바이설파이트 시퀀싱은 서열 번호 13, 14의 프라이머에 의해 인지되고, 상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)는 서열 번호 15, 16의 프라이머에 의해 인지되고, 상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 17, 18의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며, 상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 19, 20의 뉴클레오티드 시퀀스를 가진다.
바람직한 실시예에서, 상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)는 서열 번호 5, 6의 프라이머에 의해 인지되고, 상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)는 서열 번호 7, 8의 프라이머에 의해 인지되고, 상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 9, 10의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며, 상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 11, 12의 뉴클레오티드 시퀀스를 가진다.
상기 암은 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
용어 "시편(test specimen)"는 본 명세서에서는 단리된 시험 시편을 의미하며, 상기 단리된 시험 시편은 앞서 기술한 자궁경부 부스러기, 복수, 혈액, 소변, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 경부상피세포, 수술후 암 조직 또는 다른 적절한 시편을 포함한다. 본 발명의 암 검사 방법은 상기 시편들 내의 표적 유전자들의 메틸화 상태를 시험하는 데 유용하며, 생체지표의 메틸화 상태를 여러 형태의 암의 검사 지수로 사용한다. 본 발명에 의해 제공되는 상기 암 검사 방법 및 생체지표의 검사 지수는 연구자들에 의해 실험실에서 상기 시험을 수행하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "암을 가지는 위험(the risk of having cancer)"은 암을 앓는 백분율, 장래에 암을 앓게 될 위험 또는 암의 존재 또는 부재를 의미한다.
상기 메틸화 상태가 표적 유전자(생체지표)의 적절한 대조에 비해 더 높은 경우, 암을 가지는 위험은 보다 높을 수 있다.
상기 검사 방법에 따르면, 본 발명은 또한 암 검사 생체마커 또는 상기 생체마커를 포함하며, 암을 가지는 위험을 결정하기 위하여 단리된 시편 내의 표적 유전자(생체지표)의 상기 메틸화 상태를 검사하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 이들 특징들 및 잇점들은 이하의 첨부된 도면들의 상세한 설명으로부터 충분히 이해되고 인식될 수 있을 것이다.
본 발명은 암을 검사(screening)하는 방법, 암을 검사하는 생체지표(biomarker) 및 그의 용도를 제공하는 효과를 제공하며, 특히, 생체지표로서 메틸화된 DNA(methylated DNA)를 사용하는 암을 검사하기 위한 방법을 제공하는 효과를 제공한다.
도 1a는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 PTPRR을 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득된 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 ZNF582를 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1c는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 PDE8B를 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1d는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 DBC1을 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 ZNF582를 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1c는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 PDE8B를 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 1d는 본 발명의 암 검사 방법에서 표적 유전자 DBC1을 사용하는 여러 자궁경부 시편들에 대한 바이설파이트 시퀀싱(BS)을 수행하는 것에 의하여 수득되는 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 이하의 실시예들을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 그러나 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1 재료들 및 방법들
1. 재료들
시험 재료들에는 편평세포암종(squamous cell carcinoma ; SCC, n = 20), 선암종(adenocarcinoma ; AC, n = 20) 및 정상 자궁경부 시편(n = 10)를 포함하여 일련의 완전한 자궁경부 병변 시편들이 포함된다. 이들 자궁경부 시편, 난소 시편 및 결장암 시편들 모두는 대만 타이페이 소재 트리-서비스 제네럴 호스피탈(Tri-service General Hospital)로부터 수득되었다. 각 시편은 퀴아앰프 디엔에이 키트(QIAamp DNA Kit ; 퀴아젠(QIAGEN)사)의 수단들에 의하여 유전체 DNA 추출(genomic DNA extraction)에 적용시켰으며, 유전체-전장(genome-wide) DNA 메틸화 내에서의 DNA 메틸화 조건의 대조 및 분석에서 사용되었다. 분석에 앞서, 바이오분석기(Bioanalyzer ; 애질런트(Agilent)사)에 의해 유전체 DNA의 질을 체크하였다. 이 실시예에 있어서, 단편화된 DNA 10㎍을 메디프(MeDIP ; 메틸 DNA IP) 분석에 적용시켰다.
2. 메디프 및 CpG 섬-플러스-프로모터 어레이( CpG island - Plus - Promoter arrays)들에 의한 DNA 메틸화 분석
바이오럽터 유씨에스-200(Bioruptor™ UCS-200 ; 다이아게노드(Diagenode)사)으로 유전체 DNA를 300 내지 1,000bp의 범위의 크기로 단편화시켰다. 본 발명자들은 이를 100㎕ IP 완충제(0.15% SDS(도데실황산나트륨), 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5mM EGTA, 10mM 트리스(Tris) 및 0.1% BSA(우혈청알부민))의 최종 농도 내에서 폴리클로날 항-5'-메틸 시토신 항체(애브켐(Abcam)사) 30㎕와 함께 4℃에서 밤새 동안 이를 면역침전(immunoprecipitated) 시켰다. 본 발명자들은 프로테인 지 세파로스(Protein G Sepharose ; 아메르샴(Amersham)사) 120㎕와의 혼합물을 2시간 동안 4℃에서 배양시키고 이를 1㎖의 낮은 농도의 염, 높은 농도의 염 완충제, 염화리튬 및 TE 완충제들로 2회 세척하였다. 계속해서 본 발명자들은 상기 프로테인 지를 용리 완충제(elution buffer ; 1% SDS, 0.1M NaHCO3)로 15분간 실온에서 2회 처리하고 페놀-클로로포름 추출(phenol-chloroform extraction)과 후속하는 에탄올 침전에 의하여 메틸화된 DNA를 회수하였다. 풍부화된, 메틸화된 DNA 및 입력 DNA(input DNA)를 전유전자 증폭 키트(Whole Genome Amplification Kit ; 시그마(Sigma)사)로 증폭시켰다. 풍부화된 총 DNA를 각각 Cy5 및 Cy3로 말단-마커화(end-labeled) 시키고, 님블젠 시스템즈 인코포레이티드(NimbleGen Systems, Inc.)에 의해 설계되고 합성된 CpG섬-플러스-프로모터 어레이들에 공-잡종화(co-hybridized) 시켰다. 이 어레이는 이중으로 존재하는 24,659 HG18 RefSeq 프로모터들(800bp의 업스트림 내지 200bp의 다운스트림) 및 28,226 CpG섬들을 가로지르는 매 100bp에 타일로 붙여진 385,000 50 내지 75bp 올리고뉴클레오티드들을 포함하였다.
상기 어레이 상의 각 특성은 대응하는 척도화된(scaled) log2-비(log2-ration)를 갖는다. 상기 log2-비는 0의 부근에서 상기 비율 데이터의 중심에 대한 정규화(normalization)이다. 상기 척도화된 log2-비 데이터로부터, 고정-길이창(fixed-length window ; 500bp)이 각 연속되는 탐침 주위에 위치되고 일방형 콜모고로프-스미르노프(one-sided Kolmogorov-Smirnov ; KS) 시험을 적용하여 상기 탐침들이 상기 어레이의 나머지들 내의 탐침들보다 뚜렷하게 보다 양성적인 분포로부터 취해졌는 지의 여부를 결정하였다. 각 탐침에 대한 그 결과의 스코어(score)는 그 탐침 주위의 창이 있는 KS 시험으로부터의 -log10 p-값이다(문헌 스카체리(Scacheri)와 그의 동료들의 2006을 참조). 본 발명자들은 2의 p-값 최소 컷오프(p-value minimum cutoff ; -log10) 이상인 적어도 2개의 탐침들에 대한 검색에 의하여 풍부화된 피크들을 검출하였다. 300bp 내의 서로 다른 피크들을 병합시켰다. 전사 스타 사이트(transcription star sites)들의 2500bp 업스트림 내에서의 SCC/AC와 정상 자궁 경관(normal cervix) 사이의 차등 메틸화 영역(differential methylation regions)들을 장래의 확인을 위하여 선택하였다. 마지막으로, 시그널맵(SignalMap ; 님블젠(NimbleGen)사)을 사용하여 p-값 데이터를 관측하였다.
3. 바이설파이트 변성, 메틸 -특이적 중합효소 연쇄반응( MSP ) 및 바이설파이트 시퀀싱(BS)
메틸화된 시토신들을 보존하기 위하여 유전체 DNA의 1㎍ 분획(aliquots)들을 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)으로 전환시키기 위하여 제조업자의 추천사항들에 따라 DNA 변성 키트(DNA modification kit ; 미합중국 캘리포니아주 테메큘라(Ternecula, CA) 소재의 케미콘(Chemicon)사)를 사용하였다. 최종 침전을 MSP용의 70㎕의 예열된(pre-warmed ; 55℃) TE 완충제로 용리시켰다.
인간 말초혈액의 정상 DNA를 취하고 바이설파이트 변성에 적용시켰으며, 이를 메틸화되지 않은 프로모터 시퀀스를 갖는 대조군으로 사용하였다.
선행 기술에 따라 MSP를 수행하였다. 요약하면, 바이설파이트-전환된 DNA(bisulfite-converted DNAP 내에 존재하는 메틸화된 유전자 시퀀스들을 특이적으로 인식하는 MSP 프라이머(MSP primers ; 표 1)들을 사용하여 1㎕의 변성된 DNA를 증폭시켰다. 1㎕의 변성된 템플레이트 DNA(templated DNA), 1.5pmol의 각 프라이머, 0.2mmol/ℓ 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트들 및 1단위(unit)의 골드 태그 디엔에이 중합효소(Gold Taq DNA polymerase ; 미합중국 캘리포니아주 포스터시 소재 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)를 포함하는 25㎕의 총 용적 내에서 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. MSP 반응들을 95℃에서 5분간 초기 배양에 적용시켰으며, 후속하여 95℃에서 30초간 35 사이클을 수행하였으며, 적절한 온도에서 30초간 72℃에서 30초간 열처리(annealing) 하였다. 72℃에서 5분간 최종 확장(final extension)을 수행하였다. 증폭 생성물들을 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 포함하는 2.5% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 가시화시켰으며, 자외광(UV light) 하에서 조명하였다.
표 1은 MSP 프라이머들의 시퀀스들이다.
모든 MSP 데이터들은 DNA의 적어도 2개의 독립적인 변형들로부터 얻어졌다. 이중의 실험들에서 신호가 없는 것은 음성 메틸화(negative methylation)로 기록하였다. 메틸화 유전자 시퀀스를 특이적으로 인식할 수 있는 MSP 프라이머(M)를사용하는 것에 의하여 얻어진 PCR 생성물을 pCR4-TOPO 벡터(미합중국 캘리포니아주 칼스배드 소재, 인비트로젠(Invitrogen)사) 내로 구축하였다. 5개의 독립한 복제(clones)들을 선택하고 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켰다. 바이설파이트 시퀀싱(BS)에서 사용된 프라이머들을 표 2에 기재하였다. 377 오토-시퀀서(377 Auto-sequencer ; 미합중국 캘리포니아주 포스터 소재, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)를 사용하여 수행하였다. 시퀀싱된 결과들을 시퀀스 목록에 나타내었다. 바이설파이트 시퀀싱에서 시퀀스 번호들은 각각 DBC1_BS(서열 번호: 21), PDE8B_BS(서열 번호: 22), PTPRR_BS(서열 번호: 23) 및 ZNF582_BS(서열 번호: 24)들이었다.
표 2는 바이설파이트 시퀀싱 프라이머들의 시퀀스들이다.
실시예
2 자궁경부암 내의 메틸화된 표적 유전자의 검사
CpG섬-플러스-프로모터 어레이들에 의하여 검사한 이후, 자궁경부암 세포 내에서 고도로 메틸화되었을 4개의 표적 유전자들, 즉 각각 DBC1(서열 번호: 1), PDE8B(서열 번호: 2), PTPRR(서열 번호: 3) 및 ZNF582(서열 번호: 4)들을 검사하였다. 그들의 상세한 정보를 표 3에 나타내었다. 표 3으로부터, 이들 4개의 유전자들 중에서 방광암(bladder cancer)과 연관된 것으로 알려진 DBC1을 제외하고는 자궁경부암에 대한 이들 유전자들의 상관관계를 나타낸 연구가 현재까지 거의 없었다.
표 3은 CpG섬-플러스-프로모터 마이크로어레이를 사용하여 동정된 자궁경부암 내의 메틸화된 유전자들의 특성들을 나타낸다.
실시예 3 바이설파이트 시퀀싱( BS )에 의한 자궁경부 병변 시편 내의 표적 유전자의 메틸화 상태의 분석
표적 유전자 :
PTPRR
시편 군들:
1. HeLa_0: HeLa 자궁경부암 세포주;
2. HeLa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);
3. HeLa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA(미합중국 미주리주 세인트루이스 소재, 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)사) 둘 다로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);
4. AC: 자궁경부선암 시편;
5. SCC: 자궁경부편평세포암종 시편;
6. 대조군(정상): 메틸화가 없는 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA.
앞서 기술된 이들 시편들 각각을 바이설파이트 변성에 계속해서 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시편 내의 상기 표적 유전자(PTPRR)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 검은색은 메틸화 영역(methylation region)을 나타내고 흰색은 비-메틸화 영역(un-methylation region)을 나타내었다. 상기 표적 유전자 PTPRR은 대조군 및 상기 선암에서 메틸화되지 않은 반면에 상기 표적 유전자 PTPRR은 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0) 및 자궁경부 편평세포암종 시편(SCC)에서는 과메틸화되었다. 따라서, PTPRR의 메틸화율은 자궁경부암이 존재하는지 그렇지 않은 지의 여부를 검사하기 위한 생체지표로서 사용될 수 있다.
게다가, 자궁경부암 시편 내의 상기 표적 유전자의 메틸화율이 DNA 메틸화를 통하여 조절될 수 있는 지의 여부를 확인하기 위하여, HeLa 자궁경부암 세포주를 10mM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC ; 시그마 케미칼 컴퍼니)으로 처리하였다. 상기 세포로부터 추출된 상기 DNA 시편을 바이설파이트 변성에 계속해서 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켰다. 도 1a에 나타난 결과는, 상기 자궁경부 편평세포암종 시편(SCC)와 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0)에 비하여, 상기 AZC-처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_10D) 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 탈-메틸화(de-methylated)된 영역의 일부를 갖는다는 것을 나타내었다.
트리코스타틴 에이(trichostatin A ;TSA)는 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase ; HDAC) 억제제들이며, 메틸화율을 낮추거나(lower) 또는 저하(degrade) 시키는 데 사용될 수 있다. HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_DT)는 AZC 및 TSA 둘 다로 처리되었다. 도 1에 나타난 결과는, 상기 자궁경부 편평세포암종 시편(SCC)와 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0)에 비하여, 상기 AZC- 및 TSA-처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_DT) 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 고도로 탈-메틸화되었다는 것을 나타내었다.
요약하면, 상기 기술된 결과들은 자궁경부암 시편 내의 상기 표적 유전자 PTPRR이 DNA 메틸화를 통하여 메틸화되었음을 확인하고 있다.
표적 유전자 :
ZNF582
시편 그룹들:
1. HeLa_0: HeLa 자궁경부암 세포주;
2. HeLa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);
3. HeLa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA 둘 다로 처리된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0);
4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시편 1;
5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시편 2;
6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA.
상기 자궁경부편평세포암종 시편 1 및 시편 2들은 서로 다른 환자들로부터 수득된 시편들이다.
앞서 언급된 이들 시편들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시편 내의 상기 표적 유전자(ZNF582)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1b에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시편 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시편 2(SCC) 및 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa_0) 내의 상기 표적 유전자 ZNF582가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시편들 내의 상기 표적 유전자 ZNF582는 고도로 메틸화되었다.
표적 유전자 :
PDE8B
시편 그룹들:
1. SiHa_0: SiHa 자궁경부암 세포주;
2. SiHa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);
3. SiHa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA 둘 다로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);
4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시편 1;
5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시편 2;
6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 사용된 정상 자궁경부혈액 DNA;
상기 자궁경부편평세포암종 시편 1 및 시편 2들은 서로 다른 환자들로부터 수득된 시편들이다.
앞서 언급된 이들 시편들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시편 내의 상기 표적 유전자(PDE8B)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1c에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시편 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시편 2(SCC) 및 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0) 내의 상기 표적 유전자 PDE8B가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시편들 내의 상기 표적 유전자 PDE8B는 고도로 메틸화되었다.
표적 유전자
DBC1
시편 그룹들:
1. SiHa_0: SiHa 자궁경부암 세포주;
2. SiHa_10D: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC)으로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);
3. SiHa_DT: 10μM DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제 5'-aza-2'-디옥시시티딘(AZC) 및 0.33μM TSA 둘 다로 처리된 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0);
4. SCC1: 자궁경부편평세포암종 시편 1;
5. SCC2: 자궁경부편평세포암종 시편 2;
6. 대조군(정상): 비-메틸화 대조군으로서 정상 자궁경부혈액 DNA;
상기 자궁경부편평세포암종 시편 1 및 시편 2들은 서로 다른 환자들로부터 수득된 시편들이다.
앞서 언급된 이들 시편들을 바이설파이트 시퀀싱(BS)에 적용시켜 각 시편 내의 상기 표적 유전자(DBC1)가 과메틸화 되었는지 아닌지의 여부를 분석하였다. 도 1d에 나타난 결과는, 상기 대조군에 비하여, 자궁경부 편평세포암종 시편 1(SCC)과 자궁경부 편평세포암종 시편 2(SCC) 및 SiHa 자궁경부암 세포주(SiHa_0) 내의 상기 표적 유전자 DBC1가 과메틸화되었음을 나타내었다. 따라서, 자궁경부암 시편들 내의 상기 표적 유전자 DBC1는 고도로 메틸화되었다.
실시예
4 자궁경부암 시편들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석
메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 자궁경부 편평세포암종(SCC) 시편들 내의 상기 4가지 표적 유전자들의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 4에 나타난 상기 메틸화 상태 분석 결과는 정상 자궁경부 시편에 있어서는 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화 빈도(methylation frequency)가 각각 11%, 0%, 9% 및 6%이었으며; 자궁경부 편평세포암종 시편에 있어서는 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화 빈도가 각각 100%, 47%, 100% 및 97%이었음을 나타내었다. 이들 결과들로부터 자궁경부 편평세포암종 시편들에 있어서는 상기 4가지 유전자들이 고도로 메틸화되었다는 것을 알 수 있다. 따라서, 결국 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582의 메틸화율이 자궁경부암의 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.
표 4는 자궁경부 편평세포암종 시편들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태 분석이다.
실시예
5 난소암 시편 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석
메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 난소암 시편들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 5의 메틸화 상태 분석 결과들은 난소 악성 종양(ovarian malignant tumor) 시편 및 난소 양성 종양(ovarian benign tumor) 시편 내의 3개의 유전자들 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 상태들의 분석을 보고하고 있다. 상기 결과들은 난소 악성 종양 시편 내의 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도가 각각 50.3%, 50.0% 및 56.3%들이었고, 난소 양성 종양 시편 내의 DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도가 각각 2.5%, 0.0% 및 12.5%들이었다는 것을 나타내었다. 차등 메틸화 수준은 각각 53.8%, 50.0% 및 43.8%들이었다. 따라서, 난소 양성 종양 시편에 비하여, 난소 악성 종양 시편 내의 상기 3개의 유전자들의 메틸화 수준들은 뚜렷하게 더 높았다. 따라서, DBC1, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화율은 결국 난소암 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.
표 5는 난소암 시편들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화율 분석이다.
실시예
6 결장암 시편 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 분석
메틸화-특이적 PCR(MSP)을 사용하여 결장암 시편 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 분석하였다. 표 6의 메틸화 상태 분석 결과는 결장암 시편 내의 4개의 유전자들 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 상태를 보고하고 있다. 상기 결과는 결장암 시편 내의 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도들이 각각 100.0%, 100.0, 100.0% 및 100.0%들인 반면에, 정상 결장 조직 시편 내의 DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화 빈도들은 각각 25.0%, 25.0%, 25.0% 및 25.0%들이었음을 나타내었다. 따라서, 정상 결장 조직 시편에 비하여, 결장암 시편 내의 상기 4개의 유전자들의 메틸화 수준들은 뚜렷하게 더 높았다. 따라서, DBC1, PDE8B, PTPRR 및 ZNF582들의 메틸화율은 결국 결장암 검사에 있어서 검사 지수로서 사용될 수 있다.
표 6은 결장암 시편들 내의 상기 표적 유전자의 메틸화 상태 분석이다.
본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법은 앞서 기술된 통상의 기술들에 비하여 하기의 잇점들을 갖는다:
1. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 단리된 시편 내의 특정의 유전자의 메틸화율을 암을 가지는 위험을 결정하기 위한 생체지표로서 사용하고, 자궁 경부 도말(cervical scraping) 및 인간 파필로마 바이러스 시험(HPV 시험) 등과 같은 통상의 방법들에 비하여, 본 발명의 암 검사 방법의 민감성(sensitivity) 및 특이성(specificity) 둘 다 상기 2개의 기술된 방법들의 그것들 보다 더 높다.
2. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 1차 자궁경부암 검사에서 뿐만 아니라 2차 자궁경부암 검사로서 인간 파필로마 바이러스 시험과 함께 또는 이를 보조하여 보다 정확한 자궁경부암 검사 효과를 달성하도록 할 수 있다.
3. 본 발명에 의하여 제공되는 상기 암 검사 방법, 생체지표 및 그의 용도는 자궁경부암의 검사 뿐만 아니라 다른 암(예를 들면 : 난소암, 결장암 등)의 검사검사에 적용되어 비정상적인 시편의 진단을 보조할 수 있다.
물론 본 발명의 앞서 기술된 실시예들에 있어서 많은 변화들 및 변경들이 그의 관점으로부터 벗어남이 없이 실행될 수 있다. 따라서, 과학 및 실용기술(useful arts)들의 발전을 촉진하기 위하여, 본 발명이 기술되었으며, 단지 첨부된 특허청구범위들에 의하여서만 제한되는 것으로 의도된다.
<110> National Defense Medical Center
<120> Cancer Screening Method
<130>
<140>
<141>
<160> 24
<210> 1
<211> 5000
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggtcttcacc tgaagttgcc tgactacgtt gtctcagatt gatttcagaa ctgcattatc 60
agcagggcag ctgttgccta ctaacagtca tggaagtaga tctcagctgg gggatgatgg 120
ggaaacaaag agaaagatag ggacgaataa aggaaggaat ggggcacaga cagaaagaga 180
gagagagaaa agaaagaaag gaggagaggc aagagatagt gacctggggt ttcataccgc 240
ggtgggtggg agaaggagtg tgtgtggtgg gcgtatttct tcgtggtcag aatcaaagtc 300
agaactgacc tggggaacct gtgttcaaga cctgaacctg gaccagaagc caagggaaag 360
agaaagttgc ccaagaaaaa agggagaaat ttccaccagg cgaaaataga aatcgctgac 420
tgggtttgtg gctggagagc tgtccgtggt gctgactcct cctcattggg attccagtga 480
aggctgagaa gctctgcact ggctgctcct cctctccctt tcctctcccc tcagtcctga 540
ccttctgaga cccaggatca ttctggctag ctcgatgtct tctcctctct ttctcccttt 600
ctctttgtcg attaaataat ttttcccgag ttcccagttc atcactcaaa catttctctt 660
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gcctccctgg tggtcacatc tctctcttat catcctttga attaaaaaac aaacaaaaaa 780
catacaatgg caatcataaa agcagacaac atgcactgag cactcactag gtgtcaggga 840
gcagtctaag tgcctttgca tacattaact catgagcagt ctaagtgcct ttgcatatat 900
taactcatta caattccaca tcaaccctat tagatgggta gatatattat tattctatta 960
aacagacaag gaattgaggc ttaaggggta agtgatttca ccaagaccag acagctacag 1020
gactccaacc tctctggagc ctgcacttct actgaatctg gctcttttac atattccaac 1080
accttttcct atgacttcct gcccctccat ctggtagcct taatgctttc tattcttgcc 1140
taatcttcag gggactaggg atctgcattg ctgatttggt ttaaatcaga agggaagcaa 1200
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acactcaggt actcgcgaca cacacagtac agtcacgctt aagggcacca ggattccggg 1680
tttgcgcgta tgcgcggtcc ctttggatgc tcgtgcgcat agacacaaca ccctacacgc 1740
cccagaccca cgaaactccc tacggctcag ccccagccca cccgggccgc ccttccctcg 1800
aggcggcctc ccgtctctcc tcctctcgct tctcctcctc ctccgcctaa agatgtacaa 1860
aacactcctc ggaagcaacc ccggcgttca gctcctccct ccccgccccc cggccgccgc 1920
tcccccattc attttcggcc gtcgccggct aagtccctcc cccggcgtag cccggcctcc 1980
gccgctcccc gcccggagac cgcggcgcac ttggacttcc ctctccattc gccagccgcc 2040
tcgctcccgg accccacggc tgcaaactga tctggcgcgc ggggaggagg agagcgcagg 2100
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agccgggagg cagagggagt agtgaccgcc ttccggagcc gggattcatg cctgtcctcg 2220
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tccttcgaaa ccttctggta aaactgttgt tccacggaaa tgggaacgta acggatgagg 1560
caatcttcca cagccgcaca cagttgtgta tccaccgcta aacggtccca gtcatacatt 1620
caacgaccca cgcggagtca gaagctacca ccacacactg tcaaaatcac gcacacacag 1680
tgacggcccc ttgcccactc ggtcactcgc ccacaatctc tcgctagaga atcacacgca 1740
gatagcacac ccagcaccac agaccccagg aagcaaccca gggactcgaa cacacgaaca 1800
gcactcctcc gcgcactgcg caggcacgcc tgcgtccggc tcaccctgaa acatcgcgag 1860
atccggcttc aaggccgggc tgctgccttt acgcctaaag actatgtttc ccggaagaca 1920
ctgcggcgcc ggccctatca tggcgcagca tcggtgtgct ttgtgcgtct gcgccatctt 1980
ccggctgcgc acggcgaatc caccggtacc gtggtggaag cgcgccctgg gctgccgggg 2040
gcgcggccgc ggtggcactt ggacccgagg aggcggcagg tgagaggttc cggagctttc 2100
caggcgctct ggggtccagc aggagctggt gcccgggccg gttgggtctc aggcctgaga 2160
agaacgcaga cgtctcgcct catcgtcgct ctgtggcttt accggcgtga gactacattt 2220
cccgccggcc ctcgcggcgt gcgctttctg gcgccccctt tctgcttcca gcctcatagc 2280
ccaggtgcat ggacccctta ggtgggtgcg caggggtctc cgaccccctg aaattgcgga 2340
tgttttgcat tcactgttat gcgtgccttt tttttttttt aatctgagag gaaatcttgt 2400
ttcatgaggt tctcagagag ttacaagacc ccagaagact tagaaccgct agtttagaaa 2460
aacttatact tgggaacatt ttatatgttc aaattctatg tccagcaatg gggaaacact 2520
tgagtggatc acaggccatc ctttgtaaat aggatatcgt gcagttaata caaataatgc 2580
ttataaaagt ggtcataata aggaaaagct gcctattaca tcatattaag caacattcat 2640
aattatttca cttacacgtt acttagaacc aaatgtttgt aatgcagtag gcaccttata 2700
tactccttta cagagtactt cttgtttaac agtgagctca agaactggtt aaatgacaac 2760
actgcgaata cttgggtgtt ttttcttcca atttttttgt tttgttttgt ttttagcctg 2820
tgtgttagtg agtttgactt ctttttgctg aatgttctca aaggattcag tagttaatat 2880
ctttgcttgt cagtttttga tagtcatttt tgatagtcac ttggcatccc attatatggc 2940
tgtgccaaaa atgattcaac ctcttggcta cttgtggact tgcctactta cgtactaatt 3000
ttcagttctc ctatttagca aatattattg gacatgcagc tttgtgcact gctgtgtctc 3060
tatggaagga cacatttatg tgctgataat ggagcactgg gcgtgctgtg tgtaatttgt 3120
ctcttactgt tccttccaac tctatcccat ttgttgatgc aaggcatgct ccatgaagtg 3180
gcatgcacaa agcctcagtt tgggctgtag agctttttgt atatttggcg gttgggaaaa 3240
gagccaggta gactttcaaa ggtgttatat ttgctgcagg agagagttaa atggcctagt 3300
cctggaaagg ctttattcta ggctggggct atgcaaatga tgcaggcctt ctatgctccc 3360
tggcttgagg gaagccctcc ttgtccttga ggtaacatgt gggtctcagt cactagaaca 3420
gccctcagca tccctgtctt agacttgcat ttgcagcaaa acagaaccac tggatgttta 3480
ggggaaatgg gagggaaagg accactggtt cccctttgcc ttgcagcagc taaagctggt 3540
ttcctggggt tgggtgagga tccctttgcc tccccctcct tctcattttc ttggtgggca 3600
gagggcaagc aggtggggac ttgtaacttg gcattctagg aactgtgagg caagcctagc 3660
ctctcatgtt tgctctttcc tcccccagct ctaccgtcgc aggactctgc ccttccccaa 3720
gagaggaacc agaaggagga cctatcagcc cttgaaattc taaaagtcat gtcccttgtg 3780
agtttttaaa tcccataaat atttgctttc cttatcttga aactttccac ctgggttcca 3840
tccagaaatt tggttctcag actttcccat tttagggaat aaaaggacca ggcaggagtc 3900
tcctctccca ttgtcctctc ccctctgaca aatgcccaca gatttattct ctatagcatt 3960
ctgcatctcc tgatggtttt cgtctgctag gaggagaaac tcatttccct gtatgaaatg 4020
agagcatcct ttgtaagaac tgaagtttga agagatggaa tgaatgctta ggagcaatca 4080
catatagaaa agcaggggag gtggtgttgg ttggtttcag tttcagcgca tggtacagtg 4140
tcctgctttg ggaatgatta atgattggat atgtaattga ggtttggctg ggaatccatc 4200
aaaaatttga tgccagaatt aaagtctagt ttgacgttgg acagagcatt tgaatctggg 4260
acatcctcca ttagtttctt tagcttaaga ggaagaaaag tacagagctg aggatggtga 4320
gcgatgtagc aagtgagatg atcatctagg tgggtgagtg gtcagggctt ggaaaagcct 4380
tagagatctg atccaacctc gggatccaaa ataagaggat gtttgagtca gttgtttcac 4440
ttgatagaaa attgtgcact caataaaagt tatctccatg gtttttccca tgaagaaaaa 4500
tgcttgtgtt atgttccaac ataatgatga actttcatct ccaagaaatt cttgacttac 4560
atgaaaatcc tgtatctaag atagaaaaca tgtttccata attttaaaaa ataaaatatt 4620
tggggaaaat ccatcagaaa tattttttgt tgttattgtt attccaaaag atagaagtga 4680
taggtctcac cttgagaatt tattgtatgc caagtataga gtgggcagtg tgctttatta 4740
cactgtttct taacaataag gaaaactcca tttagcttga ttttaatttt catcccagac 4800
ctgtacacag agcattgatt tgcagttaaa aggaatgttt gagaacaatt tgatcattct 4860
gttttactca tccccatttc ttctgtcacc tttcacattc agtcccaccc ttcttgttca 4920
acaaaacaac cccccctccc gcaaagacct gccccatctc ctttcatccc actgtgaacc 4980
attgaaatac atatatatca 5000
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 5
gttttcgtcg tttttcgttc ggagatc 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 6
gctctcgctc tcgctattac tcgct 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
tgtgtatgcg cgttttttcg ttc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
acctatatat ccgccgctcc gtc 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 9
cggcgttggg tatgtttagt agtc 24
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 10
aattacgaat aaaaaaaaca aaaacgctc 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 11
tgacggtttt ttgtttattc ggttattc 28
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 12
cgaacgcaaa cgtacctacg c 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 13
ggttaagttt ttttttyggy gtagtt 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 14
tactccctct acctcccrac tctctc 26
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 15
ttgtggygta gaggattatt agtttggt 28
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 16
ctaaaaacrc aacccatccc tc 22
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 17
ggaattttat tttgaaattt ttttgtt 27
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 18
ccccacttca aataaaatac tattaaaaaa aac 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 19
tagtgayggt tttttgttta ttyggttatt 30
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 20
taaacrtaaa aacaacaacc cracct 26
<210> 21
<211> 5000
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> bisulfite sequencing of DBC1
<400> 21
ggtttttatt tgaagttgtt tgattaygtt gttttagatt gattttagaa ttgtattatt 60
agtagggtag ttgttgttta ttaatagtta tggaagtaga ttttagttgg gggatgatgg 120
ggaaataaag agaaagatag ggaygaataa aggaaggaat ggggtataga tagaaagaga 180
gagagagaaa agaaagaaag gaggagaggt aagagatagt gatttggggt tttatatygy 240
ggtgggtggg agaaggagtg tgtgtggtgg gygtattttt tygtggttag aattaaagtt 300
agaattgatt tggggaattt gtgtttaaga tttgaatttg gattagaagt taagggaaag 360
agaaagttgt ttaagaaaaa agggagaaat ttttattagg ygaaaataga aatygttgat 420
tgggtttgtg gttggagagt tgttygtggt gttgattttt ttttattggg attttagtga 480
aggttgagaa gttttgtatt ggttgttttt tttttttttt tttttttttt ttagttttga 540
ttttttgaga tttaggatta ttttggttag ttygatgttt tttttttttt tttttttttt 600
ttttttgtyg attaaataat ttttttygag tttttagttt attatttaaa tatttttttt 660
ttattttgtt ttaagatttt ttttttttta attagtttat tggtttttag attgttttag 720
gtttttttgg tggttatatt ttttttttat tattttttga attaaaaaat aaataaaaaa 780
tatataatgg taattataaa agtagataat atgtattgag tatttattag gtgttaggga 840
gtagtttaag tgtttttgta tatattaatt tatgagtagt ttaagtgttt ttgtatatat 900
taatttatta taattttata ttaattttat tagatgggta gatatattat tattttatta 960
aatagataag gaattgaggt ttaaggggta agtgatttta ttaagattag atagttatag 1020
gattttaatt tttttggagt ttgtattttt attgaatttg gtttttttat atattttaat 1080
attttttttt atgatttttt gtttttttat ttggtagttt taatgttttt tatttttgtt 1140
taatttttag gggattaggg atttgtattg ttgatttggt ttaaattaga agggaagtaa 1200
agtaaataaa tatattaaat gtgygttgtg tgggaattat tataygaggg ttttattttt 1260
tgttttagga agaggtttta tgttagtagt tttagtttgt atttaggttg attgtagagt 1320
attttgtttt ttatttttat gttttagttt ttgtatttty gttttttttt ygtttttggt 1380
ggtttttaga gaatttygtg tttttttagt tttttttttt tatattttgt ttaygtagag 1440
aagtttttgt tttattttgg gaggttaygt gggttttygt ttatatatyg agagaaataa 1500
atagtgttaa atatttatag agagaygygt agatataaay ggatttatay gggtaatttt 1560
ygagataaaa tttatattyg atggatttay gyggtygtgg aaatatttgt ygttttagaa 1620
atatttaggt attygygata tatatagtat agttaygttt aagggtatta ggatttyggg 1680
tttgygygta tgygyggttt ttttggatgt tygtgygtat agatataata ttttataygt 1740
tttagattta ygaaattttt tayggtttag ttttagttta ttygggtygt ttttttttyg 1800
aggyggtttt tygttttttt ttttttygtt tttttttttt tttygtttaa agatgtataa 1860
aatattttty ggaagtaatt tyggygttta gttttttttt tttygttttt yggtygtygt 1920
ttttttattt attttyggty gtygtyggtt aagttttttt ttyggygtag ttyggtttty 1980
gtygttttty gttyggagat ygyggygtat ttggattttt ttttttatty gttagtygtt 2040
tygttttygg attttayggt tgtaaattga tttggygygy ggggaggagg agagygtagg 2100
ygagygaatt ygygagagag ggagagagyg agygagtaat agygagagyg agagygagag 2160
agtygggagg tagagggagt agtgatygtt tttyggagty gggatttatg tttgttttyg 2220
ggattagyga aggggatttt ayggttgagt atgagttagg ttgttaggag ttaggtattt 2280
ttaygtttgt agttttygyg tygtgttygg aatgygagtt gtaygtaggg tttttttaag 2340
tttttatyga gtygaataaa aagygttttt tygtagtttt tygttaaaga yggatattga 2400
ttttaggtaa ggyggygtyg ggtgtagygt ttygtagttt ygttgttttt ggattyggtt 2460
tygggtygta ttyggggygt tttygygttt ttttgttttt ttttttatyg gtatttttgt 2520
tygtttttta tttggtygtt tygtygtttt taagtttttt ttagttttag ggagggggtt 2580
tttgtgtttg gggtttaaag ggttaattgy gggtttgagt gagtggygtg tgtgttttyg 2640
ygygttttyg aygtgtgtat tatggtggga atttgatgtg gtgttagtgt gtttgygtgt 2700
gyggygtygt ttgygtttga tgygtgtgtt ygtggtgtgt gtgtgtgtty gtgtgtgtaa 2760
gggaggggtg aagagagaga ggttttataa tttatttayg gygygatgtg tgtgtgtatg 2820
tttgtaygta tgtgtttgta tgtgtgtttt ygtgtgtttt tttaattagg tttttttagt 2880
ttatayggaa tgggattttt attataggat taygtagtta tygggaaatt ygttgtggat 2940
ttttttttgg ggttttgggt ttggggtttg gggaggatta tggggttgta gatggtattt 3000
tatttagttt aatgttggta ygtttgaagg aaaatttttt taaayggtgg aattttgtta 3060
tattgggatt tatagtttaa tatgaaagag atatggttaa ttttygaggt aaatgagayg 3120
ttgttatttt aaattttata ttgggtagat tttaagattt tgatgggaat ttggagatat 3180
tggatagtgg gtgatagaga aagggggaag ttagyggtgg gttttttatt tggggtttgg 3240
aaagtttggg atagggattt attttgtatt ttygtttgta attaatagag ttttttyggt 3300
ttttgttggt tttggggagg atttggtaag tttgtatgga ttttttttag gggaaaggag 3360
aaagygtttt yggggatttg tttatttatt atagttgtaa agggttttag aggaaatttt 3420
atttggggyg gttgtggatg atatggaagg agatggatgg ggtatttttt taagatagat 3480
tygttttttt ttttttattt taggygggga agtttttaga gagttttttt ttaaatatgt 3540
ttttttatgg tttttttgga gttaggggga tattgagaga aggtagagag gtggagaggg 3600
agagagagag agtaagagyg agagagaggg agatagagag agagagtgtt ttagtattga 3660
gggagattta taatttgaaa aggggttgtg agtgtggaat ttatgataga atgtggtagt 3720
aattgattta aattgttgty ggtttgtatt tygygttttt tatttggttt taaaatattg 3780
ttaagggtag gggggyggtg gaggaatttt agttaggaag gtagtttggg ttaaggtttt 3840
tttttttttt ttttttattt tttgggaggt tttttaggta ggttttttgg ttattttggt 3900
ttggtattgt tgggtttggg ttttggggtt agttattgat ttgattttta gttgtttttt 3960
aaaggtttgt tttatttagt aaaaatgttg agttttattg ttgttagtat ggtttttaga 4020
ttyggtagtt gttatttttt taaggtaagy ggtagtygtt ttgtttttag gtagggaggt 4080
taggagaaga taagggttgt gaygttggga tatagttttt tgtttagttt agtayggagg 4140
ggtygttgaa aagttttttt aggggaaaaa agtagaaata tatttggttt aaaaaatgta 4200
tatatatatt ttaggaagat atatatatat atatatatat taattatata tatatatata 4260
tatatatatg tgtttatatt ttggggagag ataaaagtaa atatgtattt gtaggaattt 4320
gttttagtgg gtgggtttta tttgtaggta tttgtagata tattattttt tgtttagagg 4380
ttgatatttt aggttgaagt ttttatatag ttatagagaa ttttttttag gaaatttatg 4440
ttagggtaga gttttttgga ttattttggg tagggggtat tagggttaag gaggagattt 4500
atttttggga attgttttat tttttttttt ttttaattta tagaygatyg aaattggaag 4560
gaatattaaa gagtagaaag gtaggatttt gtggtttaaa gagggaatga gaatttttta 4620
atatttagta gtgggttagt ggtatgttta ggattagaat ttaggtttat taattagtta 4680
gattaatatt ttttttattt tttttagtaa tatatatttt aggattgtat attgttttta 4740
tttttatttt gttaatttgt tattatgatt tttattaaga taatygtttg ttttttttta 4800
ttaaatttta tatttttaga gatgtatttt agggtttttt tatttggaaa tatggttttg 4860
aagagaaaag atttaatgtt ttaattatta ttttygaaag atatatatat atatatatat 4920
atatatatat atatatatat atatatatat atatataygg tggtgggggg aggattgaga 4980
gagagataga gagagaatat 5000
<210> 22
<211> 5000
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> bisulfite sequencing of PDE8B
<400> 22
agaataattt tgaagtatta ttttattttt agaatttttt ttgtagggat gtttgaggtt 60
tggttaattt ttttttttgt ttaagtttgt ttttttttat tttttttttt tatttttttt 120
tataaatgtt gattataaga gtatttttta aaaagttttt ttttgtttgt taaatattat 180
tttagaattt gtttttagga ggatttaatt tgtgtagaaa ttttatgagt aatttgtttg 240
tttattaaaa aatatagtat agattttttt taggttagtt ggagatggag tttttttgta 300
ttaaaaaaag agagttaaat tgagaagaga agtaaaggta gaagaataag gttagatttt 360
ttttgtataa ttgaatttgg gattgggaat gatattttgt ttttttatga aatttagaaa 420
ttgttttttg aagtttttat ttagttatat ttaagagtgg tttaggaaga aaaaggaaaa 480
taagaatgaa aaaaaaataa aaaataaatt ttaaaattgg atattttttt gtgttttgta 540
ttaagttttt atgttattgt ttttgttygt ataagtaatt ttagataaaa ttttttttta 600
gattatttaa tttatttttt ygtgttattg tgaaaatygg gtaggaatta ttgygggaat 660
tagtgattga atgggtagtg gtgtttygta gttgtaattt agagtttata agggaaggat 720
gaatagtagt tattttttta aaggtatttt tttttttttt tagtatagtt tagtttgtgt 780
atgttttatt aaggagaatg agggaaggtt ttgttgattg tttagtttag agtgtgagga 840
atagtagttg atatgggygg ttggayggga tagaaattag tatgaatatt tagtgatatt 900
taaggaagag gtgaaaatgg gggagaaagt taagaattat tagatagttt ttttttgttt 960
ttgttttgga ttttagggga aygtatgtgt ttaagggtgt tttttttygt agggtttttt 1020
attttttggt ataaattttt aaaygatgag tagatatgga atgggttttt tttgaagatt 1080
gggttattat ttaatttagt tttyggagta ggyggtgggg ttgggggaag aggayggaat 1140
tatgaggttt ttttattatt tttygggtgt gttgagaggt aagtaaatgy ggtgggtggg 1200
tttgggttgt agggtttttg ttatttyggg aggggttttt tggtgtttag ttttgggatg 1260
tgtgaaaatg tgttggtgaa aagygagagg tttatatagt tttttagggg aagaggggtt 1320
ggggygttgg gggyggygty gggatgagtg tagaagagay gaggtttttg gatagyggag 1380
gaggagggga gggygtygag gygyggtgtt agttgtygyg tataggggtt tygyggygga 1440
gtygagtygy gggtaygttt tgttttgtyg ggagagttty gggagyggyg ggaggggygg 1500
aggggygtag tggggttygg gyggttgygg tygyggagty ggggtatttg aggaggaagg 1560
agggtgggag ygagggaggg aggggayggg ygtagatyga aagtggggaa agaaggtgta 1620
ggtaggyggg taggygggyg ggygttttgg tttagggtyg ygggtgyggg agttyggyga 1680
ggtygagttg ggyggyggyg ggggtygygt ygagggagga ggggaaggyg gaggygyggg 1740
gagygtgttt ggggygtygy ggyggggagg gtggyggtyg ttggtgygyg yggggygttg 1800
tgtatgygyg ttttttygtt yggggaggaa gatggtttaa aagggaaagt tggggtgayg 1860
ygygyggttt tyggaggtty ggyggggggt atygyggtta gttygaygga gyggyggata 1920
tataggtygg ggggygygta gttygggygt ygtygyggty gtttttttat tgtaggtggt 1980
agygggtgyg ttgggtttyg gyggtygygg gygygggygg gygygygggg gagttyggty 2040
gagggatggg ttgygttttt agtatttatg tttygtagag yggygtgatt tattgtyggg 2100
attyggayga gtttagttyg tttygttaga ttattagygt gtygtagggt tyggyggtat 2160
ttttgttygg ttttttygtt tagatygayg tygtygaygt tattttttyg agtygygygt 2220
ygggattttt tagygtagtt ygygttygta gggttygtat ygagttgggt agyggtagta 2280
gygygggttt ygtagtttty gtygygatta ttagtagggg tyggaggygt tattgttgta 2340
gtagygtyga ggtygagatt tagatttgtt atattagygt gaaggtaaat gtttygygtt 2400
ggtataygty gtgggggtyg ttygtttygt yggyggggtt ygtaygggta gggggtttyg 2460
gyggagttgg gtgatygtga ggyggttggt ttggagaggt tgttattaag gaggagttta 2520
ttttttattt gtggagatga tgggagttta ggaaatgtgg ttagaaaaag gtttttggag 2580
gggttttgga agygttttta gttggttttg ggggattggg yggggaaggg agygtagaag 2640
gaagtaggtg ggttggtttg tttttttttg agggtaggaa ggttgtggtt tggtttatgt 2700
aggaagaggg gtggggatta ttgagagtat tyggtggtta gttttgttga atgaaatttg 2760
agtattgagt tggatttgyg tgttttgtag gtgattggtg tagttgtagt attaggatag 2820
atagtgtttt atatttygat ttttatttgg gattattagt taggttggag ttttagtata 2880
ggaatygagy gtagggattt gtgaatgaat gagtgttygt gttttaagag atgtgggaay 2940
ggagtagagt ggaatttgtt gtttgttatt gtaaygtttt tttgggttgg ttgtatttta 3000
gatagaattg agagaatygg gttatgagtt yggagtgtta gtagagttat ygtgagggga 3060
ygtggttttt agtgtagtat agttgtttga ggatgatttt gtatatataa ttgatttttt 3120
tagagagtgg gattttgagg aagtggaaaa aattgtttag atggttaaag tagtygttaa 3180
atatttattt tttaaagata gaagaaaaat aattatttaa atagtgtttt ttygtatgtt 3240
tttaaagtat ygttaaattt aagaggtttt ttattgtgta aatttgggta ttgggttttt 3300
ttttttttta gtaaataaga taataatggt atattttatt gtatagagag aaaaaaatat 3360
ttttaatgtt agatagaatt atagttttta tttggttaat aggttattaa gaattatttt 3420
atggattatt tgttaaagat atatttgtat ttttaatagt taaaaatttg gtttttattg 3480
gatgaaggta gtttatagtg gaggagtgag gagaaggata atatgttttg gttttaattt 3540
ggaagtttaa aagtttttta atgaatttat ttttttttta atagtatttg attgtttaat 3600
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gttatatttt gtttttgtta agtttttttt tttttttttt ttttgtttat ataaagttag 3900
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tttgtttagt agaagaaaga atattgaatg aatttatttt gtatattttt aatatttttt 4200
ttaagaggtt gtttagagat taaatgaagt aaaaattgaa gggataatga gttttaatta 4260
ttagtagttt gtataaattt gtattaattt tattgttatt tggtttaagt attaaaaggt 4320
ttgatttggg taggagttta atttattttg ttttattaag aagattttta aataagagtt 4380
taatttattt taatttatta ttgggaatgt tggaaatgaa atttttggtt tattgattta 4440
atattatttt gtattgtgtg gattttagaa agtatatatt tgaagtgaaa tttgagatta 4500
gagttattta tgtaaatttt atagaattat tattatagaa ttgttttaat atatttaata 4560
gtattttttt aggtttgtga ttyggtgttg tattgttttt ttttaatygt aaagtttata 4620
tgttttgtgt ttttttgttg ttgagataat tttataaaaa ttttatattt atttttttgt 4680
agattaagta tttttttttt gtygtaagag tttgagatag ttgttaggta ygtggtggtg 4740
ttttattttt ttttaaagta tataggtgga aaaataaaat ttttattatt tggttttgtt 4800
tatagtggtg gaaggttgta atagttttta tttttttttt ttggttattt tatattaatt 4860
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gtttgatttt tttttttttt ttttttagta ataatttatt ttattaagtt tttagaatga 4980
tgaggtatta tgatgttaaa 5000
<210> 23
<211> 5000
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> bisulfite sequencing of PTPRR
<400> 23
aagaaaaata gatttattgt aagtgggata taattatttt tttttaattt ttagttttgt 60
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tatttaattt aagttttggt ggatagttta ttttttatta gttgttttaa tttatagagg 780
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gattagtagt aattagttat gattaataag gttttttata ttttaaagat ttagatggag 1260
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gttattagtt tttttttttg atttttgtgg tygtgttttt atttattttt atttagttat 1860
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tygtattttt ttttttttta tttttatttt tatttttaat tattatttta gygatggagt 1980
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ttaatgtaaa tattatgygg agagtagttt gtttttttgy gttgtgtttg ttttttaatt 2460
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gtaaaatagg atagtatttg atagggaagg ggtgagggag tygtgtattt gttggaaaat 2640
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tattttgtta gatgtaattt tttttattgt agyggttatt atatttataa ggttttttgg 2880
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gtttttttta gtatygtggt tagygttygt tggtatatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
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tgaattattt ygttattata tataattttt taatgttgaa atgtgggatg aaaatatata 3960
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Claims (13)
- 암 검사에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함하며,
단계 1에서, 시편을 제공하고;
단계 2에서, 상기 시편의 적어도 하나의 표적 유전자에서 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하되, 상기 표적 유전자는 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R), ZNF582(Zinc Finger Protein 582), 및 PDE8B(phosphodiesterase 8B)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하며;
단계 3에서, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 사용하는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 시편은 자궁경부찰과도말(cervical smear), 복수, 혈액, 소변, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 경부상피세포, 및 수술후 암 조직으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 단리된 시편인, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 유전자의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태에 대한 시험 방법은,
메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP; methylation-specific polymerase chain reaction), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP; quantitative methylation-specific polymerase chain reaction), 바이설파이트 시퀀싱(BS; bisulfite sequencing ), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC; denaturing high-performance liquid chromatography), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고,
상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)의 메틸화된 바이설파이트 시퀀싱은 서열 번호 15, 16의 프라이머에 의해 인지되고,
상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 17, 18의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 19, 20의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 유전자 PDE8B(phosphodiesterase 8B)는 서열 번호 7, 8의 프라이머에 의해 인지되고,
상기 표적 유전자 PTPRR(protein tyrosine phosphatase, receptor type, R)는 서열 번호 9, 10의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며,
상기 표적 유전자 ZNF582(Zinc Finger Protein 582)는 서열 번호 11, 12의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
상기 암은 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 암 검사에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함하며,
단계 1에서, 시편을 제공하고;
단계 2에서, 상기 시편의 적어도 하나의 표적 유전자에서 CpG 시퀀스의 메틸화율을 검출하되, 상기 표적 유전자는 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)를 포함하며;
단계 3에서, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 사용하고,
상기 암은 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 시편은 자궁경부찰과도말(cervical smear), 복수, 혈액, 소변, 배설물, 객담, 구강점막세포, 위액, 담즙, 경부상피세포, 및 수술후 암 조직으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 단리된 시편인, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 표적 유전자의 CpG 시퀀스의 메틸화 상태에 대한 시험 방법은,
메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP; methylation-specific polymerase chain reaction), 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP; quantitative methylation-specific polymerase chain reaction), 바이설파이트 시퀀싱(BS; bisulfite sequencing ), 마이크로어레이, 질량분석법, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC; denaturing high-performance liquid chromatography), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 시퀀스를 가지는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)의 메틸화된 바이설파이트 시퀀싱은 서열 번호 13, 14의 프라이머에 의해 인지되는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 표적 유전자 DBC1(deleted in bladder cancer protein 1)는 서열 번호 5, 6의 프라이머에 의해 인지되는, 검사 마커로서 표적 유전자의 메틸화율을 검출하는 방법.
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