KR20220156899A - 결장직장 신생물의 스크리닝을 위한 방법 및 키트 - Google Patents

결장직장 신생물의 스크리닝을 위한 방법 및 키트 Download PDF

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KR20220156899A
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루이 리우
후이 왕
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싱글레라 헬스 테크놀로지스 (상하이) 엘티디.
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Abstract

대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법, 및 상기 방법에서 사용하기 위한 키트가 제공된다.

Description

결장직장 신생물의 스크리닝을 위한 방법 및 키트
본 개시내용은 일반적으로 생물의학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법, 및 상기 방법에서 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
전암성 후기 선종 병기 또는 초기 암성 병기에서 결장직장 신생물의 조기 검출은 환자 사망률을 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 결장경검사 또는 배변/혈액 샘플에 대한 분자적 검사를 통한 현행 결장직장 신생물 스크리닝은 침습적이거나 또는 매우 소수의 마커만을 가져서, 암 스크리닝 및 검출 감도에 환자 순응성을 제한한다.
그러므로, 생물학적 샘플로부터 유래되는 제한적인 양의 세포-무함유 DNA로부터 후생유전학 정보를 효율적으로 판독할 수 있고 임상 실험실에서 쉽게 배치하여 견고하게 구현할 수 있는 방법 및/또는 키트의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 표적 마커는 셉틴9(Septin9), BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역(INTERGENIC REGION) 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화된 부위 및 메틸화된 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 적어도 2개의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 2개의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계.
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 표적 마커 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과의 표적 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단계 (II)는 하기를 포함한다:
(i) 단계 (I)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용해 사전-증폭하는 단계로서, 표적 마커 세트는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(ii) 상기 하위 단계 (i)로부터 획득된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 단계 (I) 이전에 대상체로부터 유래하는 생물학적 샘플로부터 DNA를 수득하는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화된 부위 및 메틸화된 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커(들)의 적어도 일부분은 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 표적 마커 중 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
일부 실시형태에서, 상기 방법의 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화된 부위 및 메틸화된 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분은 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 것인 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
일부 실시형태에서, 상기 방법의 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 바와 같은 Hg19 좌표에 의해 정의되는 각각의 영역: 및 각각의 출발 부위 상류의 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각 말단 부위 하류의 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트(bisulfite) 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시형태에서, 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA는 게놈 DNA 또는 세포-무함유 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA는 순환 종양 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 1 ng, 0.8 ng, 0.6 ng, 0.4 ng, 0.2 ng, 0.1 ng, 0.08 ng 이하 또는 0.04 ng 이하의 양으로 생물학적 샘플에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 표적 마커에 대한 검출 어세이의 감도 수준 미만의 농도로 생물학적 샘플에 존재한다.
일부 실시형태에서, 하위 단계 (i) 또는 단계 (c)로부터 수득된 DNA는 하위 단계 (ii) 또는 단계 (d) 전에 희석제로 희석된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 절편, 생검, 파라핀-포매 조직, 체액, 결장 삼출액, 수술 절제 샘플, 단리된 혈액 세포, 혈액 단리 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 체액은 전체 혈액, 혈액 혈청, 혈액 혈장, 소변, 점액, 타액, 복막액, 흉막액, 흉부액, 활액, 뇌척수액, 흉막천자액, 복수, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 대상체의 혈액 혈장으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 결장 삼출액은 분변 샘플 및 관장 세척 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은, CpG 부위(들)에서 비메틸화된 시토신 잔기(들)를 선택적으로 변형시켜서 변형된 잔기(들)를 생성시키지만, 메틸화된 시토신 잔기(들)를 유의하게 변형시키지 않는다. 일부 실시형태에서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은 바이술파이트 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은 비메틸화 경우에 잔기를 선택적으로 절단하지만 메틸화 경우에 잔기를 절단하지 않거나, 또는 메틸화 경우에 잔기를 선택적으로 절단하지만 비메틸화 경우에 잔기를 절단하지 않는다. 일부 실시형태에서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은 메틸화 감응성 제한 효소 (MSRE)이다. 일부 실시형태에서, MSRE는 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 사전-증폭 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 표적 마커(들) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 표적 마커(들) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpG 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 사전-증폭 프라이머 풀은 대조 마커의 증폭을 위한 대조 프라이머 쌍을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 하기 표 2에 표시된 바와 같이, 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 표적 마커는 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 증폭된다.
일부 실시형태에서, 정량화는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (예를 들어, 실시간 PCR, 디지탈 PCR), 핵산 시퀀싱, 질량-기반 분리 (예를 들어, 전기영동, 질량 분광법), 또는 표적 포획 (예를 들어, 혼성화, 마이크로어레이)에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 정량화는 실시간 PCR에 의해 수행되고, 임의로 실시간 PCR은 다중복합 실시간 PCR이다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용하여 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하고, 획득된 DNA의 적어도 일부분이 증폭된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용하여 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 증폭하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (c)로부터 획득된 DNA의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 적어도 하나의 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (c)의 사전-증폭 프라이머 풀 중 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍(들)과 동일하다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 내의 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 내의 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인된다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)는 검출제의 존재 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료 (예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표시되고 그의 3' 말단에서 소광제(quencher)(예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL 또는 TAMRA)로 표지된다.
일부 실시형태에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 표적 마커(들)의 Ct 값(들)을 기준 Ct 값과 비교하는 것을 포함하고, 적어도 하나의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 Ct 값에 비해서 동일하거나 더 낮은 Ct 값은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 높거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내거나; 또는 적어도 하나의 표적 마커의, 치료 전 그의 상응하는 Ct 값에 비해서 더 높은 Ct 값은, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체가 치료에 반응성이라는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 사전-증폭은 5 내지 30 사이클의 반응을 포함하고, 각 사이클은 40∼80℃에서 5초 내지 5분의 반응 이전에 85∼99℃에서 5초 내지 5분의 반응을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 (e)의 기준 수준은, 결장직장 신생물을 갖거나 또는 가질 위험성이 있는 개체의 그룹 및 결장직장 신생물을 갖지 않거나 또는 가질 위험성이 없는 개체의 그룹으로부터 수득된 임상 샘플을 기반으로 결정된다.
일부 실시형태에서, 결장직장 신생물은 결장직장암, 거대 결장직장 선종, 및/또는 무경성 톱니상 용종이다. 일부 실시형태에서, 결장직장 신생물은 전암성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한 키트를 제공하고, 다음을 포함한다:
(a) DNA를 처리하기 위한 제1 시약으로서, DNA에서 비메틸화된 부위 및 메틸화된 부위를 구별할 수 있는 것인 제1 시약;
(b) 임의로, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 제1 프라이머 풀로서, 적어도 하나의 프라이머 쌍은 제1 시약으로 처리된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 혼성화할 수 있고; 표적 서열은 적어도 하나의 CpG 부위를 포함하는 제1 프라이머 풀; 및
(c) 제2 시약으로서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 제1 프라이머 풀에 의해서 사전-증폭된 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이며, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인, 제2 시약.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제2 프라이머 풀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제3 프라이머 풀을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 프라이머 풀 중 적어도 하나의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인된다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 또는 제3 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀 및 제2 프라이머 풀은 단일 용기 또는 별개 용기에 포장된다. 일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 검출제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료 (예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표지되고 그의 3' 말단에서 소광제 (예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL, TAMRA 또는 lowa Black Dark Quenchers)로 표지된다.
일부 실시형태에서, 키트는 DNA 중합효소 및/또는 대상체로부터 유래되는 생물학적 샘플을 함유하기에 적합한 용기를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용 및/또는 키트 결과의 해석을 위한 설명서를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 시약은 바이술파이트 시약 또는 메틸화 감응성 제한 효소 (MSRE)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, MSRE는 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제1 프라이머 풀은 다수의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 다수의 프라이머 쌍을 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함하고, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀은 다수의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 쌍을 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함하고, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 바와 같이 Hg19 좌표로 정의되는 각각의 영역: 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함한다:
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제1 프라이머 풀은 하기 표 2에 표시된 바와 같이 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하고, 임의로 제2 프라이머 풀은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀은 하기 표 2에 표시된 바와 같은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀, 제2 프라이머 풀, 또는 임의로 제3 프라이머 풀은 대조 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 키트는 각각이 제2 프라이머 풀의 분획을 수용하기 위한 다수의 용기를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한, 또는 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응의 모니터링을 위한 진단 키트의 제조에서의 본 개시내용의 키트의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법에서 사용을 위한 키트의 제조에서 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 시약의 용도를 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 및 메틸화 CpG 부위(들)를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 (예를 들어, 각각) 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법에서 사용을 위한 키트의 제조에서 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 시약의 용도를 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 및 메틸화 CpG 부위(들)를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 것인 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 각각 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
도 1 은 표적 마커 PKNOX2 (도 1A) 및 대조 마커 ACTB (도 1B)에 대한 메틸화-특이적 프라이머의 검증을 예시한다. Y-축은 표시된 사이클에서 형광 강도로부터 기준점 형광 강도를 차감하여 결정된, ΔRn 값을 표시한다. X-축은 사이클의 수를 표시한다. 도 1A에 표시된 바와 같이, Ct 값은 전환된 메틸화 DNA의 백분율이 혼합된 DNA 조성물에서 증가됨에 따라서 감소하였고, PKNOX2를 사전-증폭하는데 사용된 프라이머가 메틸화-특이적이었음을 의미한다. 도 1B에 표시된 바와 같이, 각 DNA 조성물에 대한 곡선이 중복되어서, 전환된 메틸화 DNA의 백분율 증가에도 불구하고 Ct 값은 동일하게 유지되었음을 의미하고, 이것은 대조 마커 ACTB를 사전-증폭하는데 사용된 프라이머가 메틸화-비특이적이었다는 사실과 일관된다.
도 2 는 각각 백혈 세포 (WBC, 실선 원형 "●"으로 표시), 주변암성 조직 (주변-조직, 실선 박스 "■"로 표시), 후기 선종 조직 (AA-조직, 실선 정삼각형 "▲"으로 표시), 및 결장직장암 조직 (CRC-조직, 실선 역삼각형 "▼"으로 표시)에서 대조 마커 ACTB, 및 표적 마커 SALL1 및 PKNOX2의 메틸화 존재도를 예시한다. Y-축은 Ct 값을 표시하고, X-축은 대조 마커 및 표적 마커의 명칭을 표시한다. 더 높은 Ct 값은 마커의 더 낮은 메틸화 존재도를 의미한다. 그러므로, 백혈 세포 중 표적 마커의 메틸화 존재도는 조직 샘플에 비해서 유의하게 더 낮았다는 것을 도 2에서 확인할 수 있다. 특히, 표적 마커의 메틸화 존재도는 후기 선종 조직 및 결장직장암 조직에 비해서 주변암성 조직에서 더 낮았다.
도 3 은 각각 결장직장암을 갖는 개체군 (CRC 혈장, 실선 원형 "●"으로 표시) 및 음성 결장경검사 개체군 (건강한 혈장, 실선 정삼각형 "▲")에서 수득된 생물학적 샘플 중 대조 마커 ACTB 및 표적 마커 SALL1 및 BCAN의 분포를 예시한다. Y-축은 Ct 값을 표시하고, X-축은 대조 마커 및 표적 마커의 명칭을 표시한다. 더 낮은 Ct 값은 마커의 더 높은 메틸화 수준을 의미한다. 그러므로, 결장직장암을 갖는 개체군에서 각 표적 마커의 메틸화 수준은 음성 결장경검사 개체군에 비해서 유의하게 더 높았다는 것을 도 3에서 확인할 수 있다.
도 4 는 모든 검사된 13 표적 마커의 AUC 값을 예시한다. Y-축은 동일 범위의 AUC 값에서 발생수를 표시하고, X-축은 AUC 값을 표시한다. AUC 값은 0 내지 1이고, 더 큰 AUC 값은 더 나은 분류력을 나타낸다. 도면에 표시된 바와 같이 모든 검사된 마커 (즉, NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1)는 0.8 내지 0.9 범위의 AUC에서 CRC를 대조군으로부터 분리시키는 분류력을 가졌다.
도 5 는 마커 SALL1, BCAT1 및 셉틴9의 조합의 ROC 곡선을 예시한다. Y-축은 참 양성률 (즉, 감도)을 표시하고, X-축은 거짓 양성율 (즉, 1-특이성)을 표시한다. 실선은 ROC 곡선을 표시하고, 점선은 45도 대각선을 표시한다. 대각선 위의 점은 양호한 분류 결과 (즉, 무작위보다 우수)를 나타내고, 선 아래 점은 나쁜 결과 (즉, 무작위보다 나쁨)를 나타낸다. 그러므로, 표적 마커 SALL1, BCAT1 및 셉틴9의 조합은 결장직장 신생물의 분류에서 고감도 및 고특이성을 갖는다.
도 6 은 표적 마커의 예시적인 하위영역의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
본 개시내용의 다양한 양태 및 실시형태가 하기 기술될 것이지만, 당업자는 본 출원의 대상 주제의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 동등한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 실시형태는 오직 예시로 제공되고, 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니다. 본 출원의 실제 보호 범위는 청구항에 의해 한정된다. 달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 갖는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용에서 인용되는 모든 참조, 특허, 특허 출원은 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "일", "하나" 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않으면 그의 복수 형태를 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 시약"에 대한 언급은 다수의 시약을 포함한다.
문맥에서 달리 요구하지 않으면, 하기 명세서 및 청구항 전반에서, 단어 "포함하다", "함유하다" 또는 "포괄하다" 및 "포함한다", "포함하는", "함유한다", "함유하는", "포괄한다" 및 "포괄하는" 같은 별형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 암시하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 암시하는 것이 아님을 이해한다.
암 진단은 전통적으로 단일 마커 (예를 들어, 유전자 돌연변이)의 검출에 의존하였다. 안타깝게도, 암은 단일 마커가 전형적으로 많은 형태의 질환을 검출하거나 또는 구별하는데 실패한 질환 상태이다. 또한, 생물학적 샘플 중 단일 마커의 수준은 일반적으로 매우 제한적이어서, 암의 진단 특이성 및/또는 진단 감도를 더 감소시킨다. 따라서, 오직 단일 마커만을 인식하는 어세이는 제한적인 예측 가치인 것으로 확인되었다.
본 개시내용의 일 양태는 적어도 하나의 표적 마커(들)의 적어도 일부분이 사전-증폭으로 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 개별 메틸화 수준의 정량화 이전에 사전-증폭시키기 위해 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭시키는 것이다. 이러한 사전-증폭 단계는 표적 마커(들)의 양(들)/수준(들)을 증가시키는 것으로 여겨지고, 결장직장 신생물의 진단 특이성 및/또는 진단 감도를 유의하게 증가시키는 것으로 확인된다. 본 개시내용의 다른 양태는 결장직장 신생물의 진단 특이성 및/또는 진단 감도를 증가시키기 위해서 생물학적 샘플 내 다수의 표적 마커의 메틸화 수준을 동시에 정량화하는 것이다. 일정 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 정량화 전에 사전-증폭되지 않는다. 일정 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 정량화 전에 사전 증폭된다. 특히, 본 개시내용의 발명자는 생물학적 샘플 내 다수의 표적 마커의 메틸화 수준의 동시 정량화, 또는 사전-증폭 단계 및 정량화 단계의 조합이 결장직장 신생물의 진단 특이성 및/또는 진단 감도를 유의하게 증가시켜서, 예를 들어 전암성 선종 병기 또는 초기 암성 병기에서, 결장직장 신생물의 조기 검출을 가능하게 만든다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 진단 문맥에서 "감도"는 올바르게 확인된 양성 결과의 비율, 즉, 문제가 되는 질환을 갖는 것으로 올바르게 확인된 대상체의 백분율로 정의한다. 그러나, "특이성"은 올바르게 확인된 음성 결과의 비율, 즉 문제가 되는 질환을 갖지 않는 것으로 올바르게 확인된 대상체의 백분율을 정의한다.
방법
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교 하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 적어도 2개의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 2개의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (I) 및 단계 (II)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다:
(I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 적어도 2개의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 2개의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (I) 및 단계 (II)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준을 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 표적 마커 세트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과의 표적 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단계 (II)는 하기를 포함한다:
(i) 단계 (I)에서 수득된 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용해 사전-증폭하는 단계로서, 표적 마커 세트는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(ii) 상기 하위 단계 (i)에서 획득된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계.
일부 실시형태에서, 단계 (II)의 하위 단계 (i)이 존재한다. 일부 실시형태에서, 단계 (II)의 하위 단계 (i)은 부재한다. 일부 실시형태에서, 상기 기술된 방법은 단계 (I) 전에 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 DNA를 수득하는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용해 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에 대해 스크리닝하다", 및 "에 대해 스크리닝한다" 또는 "에 대해 스크리닝하는" 같은 별형은 병리학적 상태, 질환 또는 병태의 확인, 예컨대 결장직장 신생물의 확인을 의미하거나, 또는 특정 치료 용법으로 이득을 얻을 수 있는 결장직장 신생물을 갖는 대상체의 확인을 의미한다. 본 개시내용에서, 용어 "스크리닝", "에 대해 스크리닝", "진단" 및 "진단하는"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신생물"은 병변, 종양, 또는 다른 캡슐화 또는 비캡슐화 종괴 또는 신생물성 세포를 포함하는 다른 성장 형태에 대한 언급으로서 이해해야 한다. "신생물성 세포"는 비정상적인 성장을 보이는 세포에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 용어 "성장"은 이의 광역 의미로 이해해야 하고 증식에 대한 언급을 포함한다. 이와 관련하여, 비정상적인 세포 성장의 예는 세포의 비제어적인 증식이다. 다른 예는 세포의 실패한 아폽토시스에 따라, 이의 일반적인 생명 주기의 연장이다. 신생물성 세포는 양성 세포 또는 악성 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상 신생물은 선종 또는 선암종이다. 어느 하나의 이론 또는 작용 방식에 본 발명을 제한하지 않고, 선종은 일반적으로 상피 조직에서 유래되거나 또는 명확하게 정의된 상피 구조를 나타내는 상피 기원의 양성 종양이다. 이들 구조는 선상 외관을 취할 수 있다. 양성 선종 또는 양성 신생물성 병변의 악성 선암종으로의 진행에 따라 발생되는 바와 같은, 선종 내 악성 세포 개체군을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신생물은 악성, 예컨대 암종이다. 일부 실시형태에서, 신생물은 비악성, 예컨대 선종이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결장직장 신생물"은 결장, 직장, 및/또는 충수 돌기에서 발생되는 신생물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 결장직장 신생물은 결장직장암, 거대 결장직장 선종, 및/또는 무경성 톱니상 용종이다. 일부 실시형태에서, 결장직장 신생물은 전암성이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 전암성"은 암 발달의 높은 위험성와 연관된 조직학적 변화를 나타내는 신생물을 의미한다. 이러한 병태의 예는 결장직장 세포 증식 장애와 관련하여, 고도의 이형성을 수반하는 세포 증식성 장애, 예를 들어, 결장의 선종성 용종을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 신생물, 예컨대 선종 또는 선암종과 관련한 용어 "발생"은 이형성증을 나타내는 그 대상체의 하나 이상의 세포에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 이와 관련하여 선종 또는 선암종은 이형성 세포의 덩어리가 발달되었다는 점에서 잘 발달된 것일 수 있다. 대안적으로, 선종 또는 선암종은 단지 상대적으로 소수의 비정상적인 세포 분열이 진단 시점에 발생되었다는 점에서 최초기 병기일 수 있다. 본 개시내용은 또한 결장직장 신생물, 예컨대 결장직장암의 개시에 대한 대상체의 위험성의 평가까지 확장된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "평가하다" 또는 "평가"는 결장직장 신생물 발달로 영향받은 대상체 및 영향받지 않은 대상체 유래 샘플을 구별하는 능력 또는 결장직장 신생물 발달의 상이한 병기를 갖는 대상체 유래 샘플을 구별하는 능력을 의미한다. 일부 실시형태에서, 평가는 대상체의 종양이 발달 병기에 들어갔는지 여부 또는 대상체의 종양이 발달 병기로 들어갈 높은 확률이 존재하는지 여부의 결정에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 평가는 대상체 종양의 분류 (예를 들어, 병기 I, 병기 II, 병기 III, 병기 IV 등)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 평가는 대상체 종양의 발달이 줄었는지 또는 더 증증이 되었는지 여부의 결정에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 평가는 요법으로부터의 임상 이득의 가능성을 평가하는데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시형태에서,평가는 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제를 사용한 치료 이후에 개선되는지 여부 및/또는 개선될 확률에 관한 것이다. 본 개시내용의 평가 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하여 치료 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 평가 방법은 치료 용법, 예컨대, 예를 들어, 소정 치료제 또는 병용물의 투여, 외과적 중재술, 스테로이드 치료 등을 포함한, 소정 치료 용법 이후에, 환자의 장기간 생존이 가능한지 여부를 평가하는데 가치있는 도구일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이 판단 단계 또는 판단은 분석 샘플의 100%에서 정확한 것을 목표로 하지 않을 수 있다. 그러나, 분석된 샘플의 통계적으로 유의한 분량이 올바르게 분류되는 것을 요구한다. 통계적으로 유의한 분량은 상이한 통계적 도구의 사용에 의해서, 예를 들어, 제한없이, 신뢰 구간의 결정, p 값의 결정, 스튜던트 (Student) 검정 또는 피셔 (Fisher) 판별 함수에 의해서 당업자가 확립할 수 있다. 상세사항은 문헌 [Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983]을 참조한다. 일정 실시형태에서, 신뢰 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, p 값은 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001 미만이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발달"은 유전적으로 결정된 경로, 예를 들어, 이전, 하급 또는 초기 병기부터 이후에, 보다 복잡하거나 또는 진행된 병기로 물리적 성숙화의 천연 진행 과정에 따른 세포 형상 및 생리의 변경을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예후"는 예를 들어, 질환 (예를 들어, 암)의 재발, 발적, 및 약물 내성을 포함한 질환 증상의 결과 가능성의 예측을 의미한다. 이 용어는 또한 요법으로부터의 임상적 이득의 가능성의 예측을 의미한다. 일부 실시형태에서, 통계 알고리즘의 사용은 대상체에서 질환의 예후를 제공한다. 예를 들어, 예후는 수술, 암의 임상적 아형 (예를 들어, 고형 종양, 예컨대 결장직장암, 흑색종, 및 신장 세포 암종)의 발달, 하나 이상의 임상적 인자의 발달, 또는 질환으로부터의 회복일 수 있다. 예후는 불량한 예후 (예를 들어, 재발 또는 약물 내성 발생 가능성), 또는 양성 예후일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "반응성"은 치료에 대한 대상체의 유리한 반응을 의미한다. 치료에 대한 대상체의 반응도는 제한없이, (1) 어느 정도까지, 둔화 및 완전한 정지를 포함한, 질환 진행의 억제; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소; (3) 병변 크기의 감소; (4) 인접한 말초 장기 및/또는 조직으로 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (6) 어느 정도까지, 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 경감; (7) 치료 후 무질환 발현 기간의 증가; (8) 반드시는 아니지만, 질환 병변의 퇴행 또는 절제, 예를 들어, 무진행 생존을 야기시킬 수 있는, 자가면역 반응의 감소; (9) 증가된 전체 생존; (10) 더 높은 반응률; 및/또는 (11) 치료 후 소정 시점에 감소된 사망률을 포함한, 대상체에 대한 이득을 의미하는 임의 종료점을 사용해 평가될 수 있다. 용어 "이득" 또는 "유리한"은 가장 넓은 의미로 사용되고 임의의 바람직한 효과를 의미한다.
본 개시내용에서, 단계 (a), 단계 (b), 단계 (c) 및 단계 (d)의 상세한 설명은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법, 및 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법 둘 모두에 적용한다. 양쪽 방법에 대한 단계 (e)는 별도로 설명될 것이다. 또한, 본 개시내용에서, 본 개시내용의 단계 (I)은 본 개시내용의 단계 (b)와 동일하거나 또는 적어도 유사하다. 또한, 본 개시내용의 단계 (II)의 하위 단계 (i)은 본 개시내용의 단계 (c)와 동일하거나 또는 적어도 유사하고; 본 개시내용의 단계 (II)의 하위 단계 (ii)는 본 개시내용의 단계 (d)와 동일하거나 또는 적어도 유사하다. 또한, 본 개시내용의 단계 (III)은 본 개시내용의 단계 (e)와 동일하거나 또는 적어도 유사하다. 따라서, 단계 (I) 및 단계 (b)는 하기에서 "단계 (b)"로서 총칭하여 기술되고, 단계 (II) 및 단계 (c)의 하위 단계 (i)은 하기에서 "단계 (c)"로서 총칭하여 기술되고, 단계 (II) 및 단계 (d)의 하위 단계 (ii)는 하기에서 "단계 (d)"로서 총칭하여 기술되고, 단계 (III) 및 단계 (e)는 하기에서 "단계 (e)"로서 총칭하여 기술된다.
단계 (a)
본 개시내용에 따른 방법의 단계 (a)에서, 대상체 유래 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리적 특징을 기반으로, 특징규명 및/또는 확인하려는 세포 및/또는 다른 분자적 독립체 (예를 들어, DNA)를 함유하는 관심 대상체로부터 수득하거나 또는 유래된 생물학적 조성물을 의미한다. 생물학적 샘플은 제한없이, 당업자에게 공지된 임의의 방법을 통해서 수득된, 대상체의 세포, 조직, 장기 및/또는 생물학적 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 절편, 생검, 파라핀-포매 조직, 체액, 결장 삼출액, 수술 절제 샘플, 단리된 혈액 세포, 혈액 단리 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 체액은 전체 혈액, 혈액 혈청, 혈액 혈장, 소변, 점액, 타액, 복막액, 흉막액, 흉부액, 활액, 뇌척수액, 흉막천자액, 복수, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 결장 삼출액은 분변 샘플 및 관장 세척 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 검사에 가장 적합한 유형의 샘플의 선택은 상황의 특성에 의존하게 될 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 대상체의 전체 혈액으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 대상체의 혈액 혈장으로부터 수득된다. 당업자는 전체 혈액으로부터 혈액 혈장을 제조하기 위한 다양한 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 혈액 혈장은 대상체로부터 전체 혈액의 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 그 초과의 횟수의 원심분리를 통해서 수득된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. "대상체"는 또한 가축 예컨대 소, 돼지, 양, 가금류 및 말; 또는 설치류 예컨대 래트, 마우스; 또는 비-인간 영장류 예컨대 유인원, 원숭이, 레서스 원숭이; 또는 가축 예컨대 개 또는 고양이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "개체"는 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA는 생물학적 샘플로부터 단리된다. 생물학적 샘플로부터 DNA의 단리 및 정제는 상업적으로 입수가능한 키트의 사용을 포함하여, 당분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA는 부분적으로 단백질-분해 효소를 사용하여, 고도의 변성 및 환원 조건 하에서 출발 물질을 용해시키고, 페놀/클로로포름 추출 방법을 통해 수득된 핵산 분획을 정제하고 투석 또는 에탄올 침전을 통해 수층으로부터 핵산을 회수하여 세포 및 조직으로부터 단리된다 (참조: 예를 들어, Sambrook, J., Fritsch, E. F. in T. Maniatis, C S H, Molecular Cloning, 1989). 다른 예로서, 이제 특히 아가로스 겔로부터 DNA 단편을 정제하고, 박테리아 용해물로부터 플라스미드 DNA를 단리할뿐만 아니라, 혈액, 조직 또는 세포 배양물로부터 보다 긴 사슬의 핵산 (게놈 DNA, 전체 세포 RNA)을 단리하기 위한 다수의 시약 시스템이 존재한다. 많은 이들 상업적으로 입수가능한 정제 시스템은 상이한 카오트로픽 염의 용액의 존재 하에서 미네랄 담체에 핵산을 결합시키는 합리적으로 충분히 공지된 원리를 기반으로 한다. 이들 시스템에서, 미세하게 분쇄된 유리 분말, 규조토 또는 실리카 겔의 현탁액이 담체 재료로서 사용된다. 생물학적 샘플로부터 DNA를 단리하고 정제하기 위한 일부 다른 방법은 예를 들어, US7888006B2 및 EP1626085A1에 기술된다. 방법의 선택은 시간, 비용, 및 DNA의 필요 분량을 포함한 몇몇 인자에 의해 영향받을 것이다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플에 함유된 DNA는 게놈 DNA를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "게놈 DNA"는 세포 또는 유기체의 완전한 게놈, 및 이의 단편 또는 부분을 함유하는 DNA를 의미한다. 게놈 DNA는 대상체로부터 유래하는 DNA의 큰 조각 (예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 또는 300 kb 초과)이고, 천연 변형 예컨대 DNA 메틸화를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플에 함유하는 DNA는 세포 DNA를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 DNA"는 생체내에서 세포에 존재하는 DNA, 또는 생체내에서 세포로부터 수득되어, DNA가 생체내 세포로부터 제거되지 않았으면 시험관내에서 분리, 단리 또는 달리 조작된 DNA를 의미한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플에 함유하는 DNA는 세포-무함유 DNA를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포-무함유 DNA"는 생체내에서 세포 밖에 존재하는 DNA 단편을 의미한다. 이 용어는 또한 생체내 세포외 공급원으로부터 수득되어 시험관내에서 분리, 단리 또는 달리 조작된 DNA 단편을 의미하고자 사용할 수 있다. 세포-무함유 DNA 중 DNA 단편은 전형적으로 약 100 내지 200 bp 범위의 길이를 갖는데, 아마도 뉴클레오솜 주변을 감싼 DNA 스트레치의 길이와 관련된다. 세포-무함유 DNA는 예를 들어, 세포-무함유 태아 DNA 및 순환 종양 DNA를 포함한다. 세포-무함유 태아 DNA는 임산부의 체내에서, 예컨대 혈액에서 순환하고, 태아 게놈을 나타내는 반면, 순환 종양 DNA는 암 환자의 체내에서, 예컨대 혈액에서 순환한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA는 대상체의 세포 DNA가 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, 세포-무함유 DNA는 mL 당 약 1,000 ng 미만, mL 당 약 100 ng 미만, mL 당 약 10 ng 미만, 또는 mL 당 약 1 ng 미만의 세포 DNA를 함유할 수 있다.
세포-무함유 DNA는 당분야에 공지된 통상의 기술을 사용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플의 세포-무함유 DNA는 약 3-30분, 약 3-15분, 약 3-10분, 약 3-5분 동안, 약 200 - 20,000g, 약 200 - 10,000g, 약 200 - 5,000g, 약 300 - 4000g 등의 속도로, 혈액 샘플을 원심분리하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 혈액 샘플의 세포-무함유 DNA는 대상체로부터의 혈액 혈장 또는 혈청의 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 초과의 횟수의 원심분리를 통해서 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 가용성 DNA를 포함하는 세포-무함유 분획으로부터 세포 및 그들 단편을 분리하기 위해 미세여과를 통해 수득될 수 있다. 통상적으로, 미세여과는 필터, 예를 들어, 0.1 ㎛ ∼ 0.45 ㎛ 막 필터, 예컨대 0.22 ㎛ 막 필터를 사용해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분석을 위해서 전체 혈액, 혈액 혈청 또는 혈액 혈장으로부터 세포-무함유 DNA의 추출은 상업적으로 입수가능한 DNA 추출 생산물을 사용해 수행된다. 이러한 추출 방법은 순환 DNA의 높은 회수 (>50%)를 주장하고 일부 생산물 (예를 들어; QIAamp 순환 핵산 키트, Qiagen에서 제조)은 소형 크기의 DNA 단편을 추출한다고 주장한다. 사용되는 전형적은 샘플 부피는 1-5 mL 범위의 혈청 또는 혈장이다.
일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA는 순환 종양 DNA를 포함한다. 순환 종양 DNA ("ctDNA")는 세포와 회합되지 않은 체액 (예를 들어, 혈액, 소변, 타액, 가래, 분변, 흉막액, 뇌척수액 등) 중 종양-유래 단편화 DNA이다. 일반적으로, ctDNA는 대략 150 염기쌍의 평균 길이로, 고도로 단편화된다. ctDNA는 일반적으로 체액 (예를 들어, 혈장) 중 매우 작은 분획의 세포-무함유 DNA를 포함하고, 예를 들어, ctDNA는 약 10% 미만의 혈장 DNA를 구성할 수 있다. 일반적으로, 이러한 백분율은 약 1% 미만, 예를 들어, 약 0.5% 미만 또는 약 0.01 % 미만이다. 추가로, 혈장 DNA의 총량은 일반적으로 매우 낮은데, 예를 들어, 혈장 중 약 10 ng/mL이다. ctDNA의 분량은 개체마다 다양하고 종양의 유형, 이의 위치, 및 암성 종양 경우, 암 병기에 의존하게 된다. 그러나, ctDNA는 일반적으로 체액 중에 매우 드물고 극도로 민감하고 특이적인 기술을 통해서만 검출될 수 있다. ctDNA의 검출은 종양의 검출 및 진단, 종양-특이적 치료의 안내, 및 암의 관해 모니터링에서 도움이 될 수 있다.
단계 (b)
본 개시내용에 다른 방법의 단계 (b)에서, 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA는 DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리되어서, 처리된 DNA가 수득된다.
DNA 메틸화는 메틸기를 (예를 들어, DNA 메틸 트랜스퍼라제 효소의 작용에 의해) DNA 분자 (예를 들어, DNA 분자의 시토신 염기 또는 염기들)에 첨가하는 생물학적 과정이다. 포유동물에서, DNA 메틸화는 시토신-포스페이트-구아닌 (CpG) 디뉴클레오티드 (즉, "CpG 부위")의 5' 위치에서 거의 발견되며, 프로모터 내 또는 유전자의 제1 엑손에서 5'-CpG-3' 디뉴클레오티드에서 발견될 때 유전자의 후생적 불활성화를 초래한다. DNA 메틸화가 유전자 발현, 종양형성, 및 기타 유전 및 후생적 질환의 조절에서 중요한 역할을 한다는 것은 충분히 입증되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸화된 시토신 잔기"는 메틸기가 시토신 고리의 탄소 원자 (예를 들어, C5 원자)에 부착된 시토신 잔기의 유도체를 의미한다. 용어 "비메틸화된 시토신 잔기"는 "메틸화된 시토신 잔기"와 대조적으로 시토신 고리의 탄소 원자 (예를 들어, C5 원자)에 메틸기가 부착되지 않은 비유도체화된 시토신 잔기를 의미한다. 시토신 잔기가 메틸화된 CpG 부위는 메틸화된 CpG 부위인 한편, 시토신 잔기가 메틸화되지 않은 CpG 부위는 비메틸화된 CpG 부위이다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)에서 사용되는 시약은 DNA에서 비메틸화 및 메틸화 CpG 부위(들)를 구별할 수 있어서, 처리된 DNA를 수득한다. 시약은 비메틸화된 시토신 잔기(들)에서 선택적으로 작용할 수 있지만 메틸화된 시토신 잔기(들)에서는 유의하게 작용하지 않거나; 또는 시약은 메틸화된 시토신 잔기(들)에서 선택적으로 작용할 수 있지만 비메틸화된 시토신 잔기(들)에서 유의하게 작용할 수 없다. 결론적으로, 본래 DNA는 메틸화 의존적 방식으로 처리된 DNA로 전환되어서, 처리된 DNA는 이의 혼성화 거동을 통해서 본래 DNA와 구별할 수 있다.
예를 들어, 일부 시약은 비메틸화된 시토신 잔기(들)를 우라실, 티민, 또는 혼성화 관점에서 시토신과 유사하지 않은 다른 염기로 선택적으로 전환시킬 수 있는 반면, 메틸화된 시토신 잔기(들)는 비전환된 채로 남아있었다. 다른 예의 경우, 일부 시약은 메틸화된 경우에는 잔기를 선택적으로 절단할 수 있거나, 또는 비메틸화된 경우에는 잔기를 선택적으로 절단할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "처리된 DNA"는 DNA에서 비메틸화된 부위 및 메틸화된 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리된 DNA를 의미하고, 즉, DNA의 DNA 메틸화 상태가 변화되었다.
일정 실시형태에서, 단계 (b)의 시약은, CpG 부위(들)에서 비메틸화된 시토신 잔기(들)를 선택적으로 변형시켜서 변형된 잔기(들)를 생성시키지만, 메틸화된 시토신 잔기(들)를 유의하게 변형시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)의 시약은 바이술파이트 시약을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "바이술파이트 시약"은 메틸화 및 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 서열을 구별하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같이 유용한, 바이술파이트, 다이술파이트, 아황산수소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 시약을 의미한다. 본 개시내용에서, 바이술파이트 시약으로 DNA의 처리는 "바이술파이트 반응" 또는 "바이술파이트 처리"로서도 기술되는데, 바이술파이트 이온의 존재 하에서, 메틸화된 시토신 잔기는 유의하게 전환되지 않지만, 비메틸화된 시토신 잔기, 특히 핵산에서 비메틸화된 시토신 잔기를 우라실 염기(들), 티민 염기(들) 또는 혼성화 거동 관점에서 시토신(들)과 유사하지 않은 다른 염기(들)로 전환을 위한 반응을 의미한다. 달리 말해서, 바이술파이트 처리는 메틸화 및 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 구별하는데 유용하다.
메틸화된 시토신 잔기의 검출을 위한 바이술파이트 반응은 [Frommer, M., et al., Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 1827-31] 및 [Grigg, G., and Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-6]에 상세히 기술되어 있다. 바이술파이트 반응은 탈아민화 단계 및 탈술폰화 단계를 함유한다 (참조: Grigg and Clark, supra). 메틸화된 시토신 잔기가 유의하게 전환되지 않는다는 진술은 매우 적은 백분율 (예를 들어, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만)의 메틸화된 시토신 잔기가 우라실, 티민, 또는 혼성화 거동 관점에서 시토신과 유사하지 않은 다른 염기로 전환된다는 것을 배제할 수 없다는 사실만을 고려해야 하지만, 비메틸화된 시토신 잔기를 유일하게 독점적으로 전환시키는 것을 의도한다.
당업자는 예를 들어, 바이술파이트 처리의 주요 매개변수를 개시한 문헌 [Frommer M., et al. supra] 또는 [Grigg and Clark, supra]을 참조하여, 바이술파이트 처리, 특히 탈아민화 단계 및 탈술폰화 단계를 수행하는 방법을 알고있다. 탈아민화 효율에 대한 인큐베이션 시간 및 온도의 영향 및 DNA 분해에 영향을 미치는 매개변수가 개시된다.
일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 나트륨 바이술파이트이다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 상업적으로 입수가능한, 예를 들어, MethylCode™ 바이술파이트 전환 키트, EpiMark™ 바이술파이트 전환 키트, EpiJET™ 바이술파이트 전환 키트, EZ DNA 메틸화-Gold™ 키트 등이다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 반응은 키트의 사용 설명서에 따라서 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)의 시약은 비메틸화된 경우 잔기를 선택적으로 절단하지만 메틸화된 경우 잔기를 절단하지 않거나, 또는 메틸화된 경우에는 잔기를 선택적으로 절단하지만 비메틸화된 경우에는 잔기를 절단하지 않는다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)의 시약은 메틸화 감응성 제한 효소 (MSRE)이다.
용어 "메틸화 감응성 제한 효소"는 이의 인식 부위의 메틸화 상태에 의존하여 핵산을 선택적으로 분해하는 효소를 의미한다. 인식 부위가 메틸화되지 않거나 또는 반메틸화된 경우에 특이적으로 절단하는 이러한 제한 효소의 경우에, 절단은 일어나지 않거나 또는 인식 부위가 메틸화되면 효율이 유의하게 감소된다. 인식 부위가 메틸화된 경우에 특이적으로 절단하는 이러한 제한 효소의 경우에, 절단은 일어나지 않거나 또는 인식 부위가 메틸화되지 않으면 효율이 유의하게 감소된다. 일부 실시형태에서, 메틸화 감응성 제한 효소의 인식 서열은 CG 디뉴클레오티드 (예를 들어, cgcg 또는 cccggg)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 메틸화 감응성 제한 효소는 이러한 CG 디뉴클레오티드의 시토신 잔기가 탄소 원자 C5에서 메틸화되면 절단하지 않는다.
일부 실시형태에서, MSRE는 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
메틸화 감응성 제한 효소, 또는 표적 영역 내 메틸화 및 비-메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 구별하는 메틸화 감응성 제한 효소를 포함하는 일련의 제한 효소 시약이 메틸화 결정에 사용되는 방법, 예를 들어, 제한없이 차등 메틸화 혼성화 ("DMH")가 당분야에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (a)의 DNA는 메틸화 감응성 제한 효소로 처리 전에 절단될 수 있다. 이러한 방법은 당분야에 공지되어 있고 물리적 및 효소적 수단 둘 모두를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 메틸화 감응성이 아니고, 그의 인식 부위는 AT 풍부하고, CG 디뉴클레오티드를 포함하지 않는 하나 또는 다수의 제한 효소의 사용이다. 이러한 효소의 사용은 단편화된 DNA에서 CpG 부위 및 CpG 풍부 영역의 전환을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 제한 효소는 MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tru9I, MaeI. XspI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단계 (c)
본 개시내용에 따른 방법의 단계 (c)에서, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커는 사전-증폭 프라이머 풀을 사용해 사전-증폭되고, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭된다. 본 개시내용에서, 단계 (c)는 또한 사전-증폭 단계로서 지정될 수 있다. 임의 이론에 국한하고 싶지 않지만, 단계 (c)는 본 발명의 목적을 획득하기 위해 반드시 필요한 것은 아니라고 여겨진다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법의 단계 (c)가 존재한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법의 단계 (c)는 부재한다.
표적 마커(들)의 사전-증폭의 목적 중 하나는 처리된 DNA 내의 표적 마커(들)의 양(들)을, 예를 들어, 표적 마커(들)의 소량(들)으로부터 증가시키는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "증폭", 및 "증폭하는", "증폭된" 및 "증폭하다"같은 별형은 일반적으로 분자 또는 관련 분자 세트의 카피 수의 증가를 야기하는 임의 과정이다. 이것은 폴리뉴클레오티드 분자에 적용되므로, 증폭은 전형적으로 소량의 폴리뉴클레오티드로부터 출발하여, 다수 카피의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 폴리뉴클레오티드 분자의 일부분의 생산을 의미하고, 여기서 증폭된 물질 (앰플리콘, PCR 앰플리콘)은 전형적으로 검출가능하다. 폴리뉴클레오티드의 증폭은 다양한 화학적 및 효소적 과정을 포괄한다. 중합효소 연쇄 반응 (역전사 PCR, PCR), 가닥 치환 증폭 (SDA) 반응, 전사 매개 증폭 (TMA) 반응, 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA) 반응, 또는 리가제 연쇄 반응 (LCR) 동안 하나 또는 소수 카피의 주형 RNA 또는 DNA 분자로부터 다수의 DNA 카피의 생성이 증폭의 형태이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 마커"는 그의 메틸화 수준이 결장직장 신생물 (예를 들어, 결장직장암)을 의미하거나, 또는 결장직장 신생물 (예를 들어, 결장직장암)의 발생 또는 발생 위험성을 의미하거나, 또는 결장직장 신생물 (예를 들어, 결장직장암)의 발달 또는 예후를 의미하는, 관심 핵산, 또는 유전자 영역을 의미한다. 용어 "마커" 및 "유전자"는 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "마커" 또는 "유전자"는 모든 이의 전사물 변이체 (예를 들어, 용어 "셉틴9"는 예를 들어 이의 절두된 전사물 Q9HC74를 포함함) 및 이의 모든 프로모터 및 조절 구성요소를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 일부 유전자는 대상체 또는 단일 뉴클레오티드 다형성 ("SNP") 간에 대립유전자 변이를 나타내는 것으로 알려져 있다. SNP는 다양한 크기의 삽입 및 결실 및 단순 서열 반복, 예컨대 디뉴클레오티드 및 트리뉴클레오티드 반복을 포괄한다. 그러므로, 본 개시내용은 임의의 다른 돌연변이, 다형성 또는 대립유전자 변이로부터 발생된 모든 형태의 마커/유전자로 확장되는 것으로 이해해야 한다. 또한, 용어 "마커" 및 "유전자"는 마커 또는 유전자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두의 서열을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 마커"는 1) 생물학적 샘플 또는 게놈 DNA에서 발견되는 본래 마커 (특히 메틸화 상태), 및 2) 이의 처리된 서열 (예를 들어, 바이술파이트 전환된 대응물 또는 MSRE 처리된 대응물) 둘 모두를 포괄하는 것으로 광범위하게 이해된다. 바이술파이트 전환된 대응물은 하나 이상의 비메틸화된 시토신 잔기가 우라실 염기(들), 티민 염기(들) 또는 혼성화 거동 관점에서 시토신(들)과 유사하지 않은 다른 염기(들)로 전환된다는 점에서 게놈 서열의 표적 마커와 상이하다. MSRE 처리된 대응물은 서열이 하나 이상의 MSRE 절단 부위에서 절단된다는 점에서 게놈 서열의 표적 마커와 상이하다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 마커 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 마커)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 14개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 13개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, TMEFF2, 및 유전자간 영역 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 11개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, TMEFF2, 및 유전자간 영역 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 10개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, 및 TMEFF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 10개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, 및 TMEFF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 9 개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, 및 NDRG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 7개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, 및 NDRG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, 및 BCAN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, 및 BCAN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 SALL1, BCAT1, 및 셉틴9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 최대 하나의 표적 마커 (즉, 하나의 마커이지만 하나 이하의 마커)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAT1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IKZF1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 NDRG4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAN이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 PKNOX2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 VAV3이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IRF4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 POU4F2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 SALL1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 TMEFF2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 ASCL4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 FGF12이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 유전자간 영역 1이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 또는 3개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)의 추가 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 셉틴9, 및 BCAN, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, BCAT1, IKZF1, NDRG4, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAT1, 및 BCAN, 셉틴9, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, NDRG4, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IKZF1, 및 BCAN, 셉틴9, BCAT1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, BCAT1, PKNOX2, NDRG4, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 BCAT1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 VAV3, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, NDRG4, IRF4 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, NDRG4, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IRF4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, NDRG4, PKNOX2, VAV3 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 NDRG4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 PKNOX2, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 POU4F2, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 SALL1, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 TMEFF2, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, ASCL4, SALL1, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, NDRG4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 ASCL4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, NDRG4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 FGF12, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, ASCL4, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, NDRG4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 유전자간 영역 1, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, ASCL4, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, FGF12, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, NDRG4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 NDRG4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, ASCL4, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, FGF12, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, BCAN, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
본 개시내용에서, 제의 마커/유전자는 그들 명칭 및 그들 염색체 좌표 둘 모두를 참조하여 본 명세서에 기술된다는 것을 이해한다. 염색체 좌표는 2009년 2월에 공개된 인간 게놈 데이터베이스 버전 Hg19 (본 명세서에서 "Hg19 좌표"라고 함)와 일치한다.
본 개시내용에서 표적 마커는 "유전자간 영역 1", "유전자간 영역 2", "유전자간 영역 3", "유전자간 영역 4", "유전자간 영역 5"로서 명명되고, 그들 각각의 염색체 좌표에 의해 정의되는 유전자간 영역을 또한 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 개시내용에서, 유전자간 영역 1은 chr6:19679885-19693988로 정의되는 영역을 의미하고; 유전자간 영역 2는 chr10:130082033-130087148로 정의되는 영역을 의미하고; 유전자간 영역 3은 chr10:133107880-133113966으로 정의되는 영역을 의미하고; 유전자간 영역 4는 chr7:152620588-152624685로 정의되는 영역을 의미하고; 유전자간 영역 5은 chr8:70945014-70949177로 정의되는 영역을 의미한다.
일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 바와 같이 Hg19 좌표로 정의되는 각각의 영역, 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 열거된 바와 같은 Hg19 좌표의 특이적 뉴클레오티드 서열 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb는 공공 데이터베이스 예컨대 UCSC Genome Browser, Ensemble, 및 NCBI 웹사이트에서 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커는 또한 이의 모든 변이체를 포함한다. 변이체는 본 명세서에 기술된 마커/유전자 영역에 대해서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 공유하고, 즉 하나 이상의 결실, 부가, 치환, 반전 서열을 갖는 동일한 영역으로부터의 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 실제 핵산 서열 간 소수의 유전자 변이가 대상체 간에 존재할 수 있다는 사실에도 불구하고 동일한 결과를 획득하는 이러한 변이체로 확장시킨다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "백분율 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 최대 개수의 동일한 아미노산 (또는 핵산)을 획득하기 위해서, 필요하면, 갭을 도입시킨 후에, 기준 서열 중 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열 중 아미노산 (또는 핵산) 잔기의 백분율을 의미한다. 달리 말해서, 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 퍼센트 (%) 서열 동일성은 후보 서열 또는 기준 서열 중에서, 더 짧은 쪽의 아미노산 잔기 (또는 염기)의 총 개수로 비교되는 기준 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기 (또는 염기)의 개수를 나누어서 계산될 수 있다. 아미노산 잔기의 보존성 치환은 동일한 잔기로서 간주될 수 있거나 또는 간주되지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공공으로 입수가능한 도구 예컨대 BLASTN, BLASTp (미국 국립 생물공학 정보 센터 (U.S. National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 웹사이트에서 입수가능, 또한, [Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)]; [Stephen F. et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997)] 참조), ClustalW2 (유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute)의 웹사이트에서 입수가능, 또한, [Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)]; [Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007))] 참조), 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 획득할 수 있다. 당업자는 도구에 의해 제공되는 디폴트 매개변수를 사용할 수 있거나, 또는 정렬에 적절한 매개변수, 예컨대 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택하여 사용자 맞춤할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단계 (c)에서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭된다. 일정 실시형태에서, 표적 마커의 사전-증폭된 부분은 표적 마커의 하위영역 내에 있다.
어느 하나의 이론 또는 작용 방식에 본 개시내용을 제한하지 않지만, 결장직장 신생물, 예컨대 결장직장암에서 빈번하게 과메틸화되는 고밀도의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 하위영역 중 표적 마커의 메틸화 수준을 측정하는 것이 특히 유용한 것으로 여겨진다. 이러한 발견은 하위영역을 분석에 특히 유용한 표적이게 만드는데 분석을 요구하는 DNA의 더 짧고 보다 명확하게 정의된 영역 덕분에 스크리닝 과정을 단순화시키고, 또한 이들 영역으로부터의 결과가 분석이 전체로서 표적 마커의 Hg19 영역 전반에서 수행되는 경우 획득되는 것에 비해서 과메틸화의 존재 여부에 관하여 유의하게 더 한정적인 결과를 제공하게 되기 때문이다. 그러므로, 이러한 발견은 진단, 스크리닝/모니터링 과정을 단순화하고 결장직장 신생물 진단의 감도 및 특이성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커의 하위영역은 a) 하기 기재된 바와 같은 Hg19 좌표에 의해 정의되는 서열, 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함한다:
Figure pct00007
Figure pct00008
일정 실시형태에서, 각각의 표적 마커의 하위영역은 서열번호 86-112, 167로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 이의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함한다. 일정 실시형태에서, 표적 마커의 하위영역의 바이술파이트 전환된 대응물은 서열번호 113-166, 168, 169로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열이거나 또는 그를 포함한다. 각 표적 마커의 하위영역의 서열번호는 하기 표 1에 표시되고, 서열은 도 6에 제공된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
일정 실시형태에서, NDRG4의 하위영역은 서열번호 86, 113, 및 140으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; BCAT1의 하위영역은 서열번호 87, 114, 및 141로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; IKZF1의 하위영역은 서열번호 88, 115, 및 142로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 셉틴9의 하위영역은 서열번호 89, 116, 및 143으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; SDC2의 하위영역은 서열번호 90, 117, 및 144로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; VAV3의 하위영역은 서열번호 91, 118, 및 145로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; TMEFF2의 하위영역은 서열번호 92, 119, 및 146으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; SALL1의 하위영역은 서열번호 93, 120, 및 147로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; BCAN의 하위영역은 서열번호 94, 121, 및 148로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; POU4F2의 하위영역은 서열번호 95, 122, 및 149로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; PKNOX2의 하위영역은 서열번호 96, 123, 및 150으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; ASCL4의 하위영역은 서열번호 97, 124, 및 151로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; KCNA6의 하위영역은 서열번호 98, 125, 및 152로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; SOX1의 하위영역은 서열번호 99, 126, 및 153으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; HS3ST2의 하위영역은 서열번호 100, 127, 및 154로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; FGF12의 하위영역은 서열번호 101, 128, 및 155로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; KCTD8의 하위영역은 서열번호 102, 129, 및 156으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; HMX1의 하위영역은 서열번호 103, 130, 및 157로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; MARCH11의 하위영역은 서열번호 104, 131, 및 158로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; CRHBP의 하위영역은 서열번호 105, 132, 및 159로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; NKX2-6의 하위영역은 서열번호 106, 133, 및 160으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; SLC24A2의 하위영역은 서열번호 107, 134, 및 161로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 유전자간 영역 1의 하위영역은 서열번호 108, 135, 및 162로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 유전자간 영역 2의 하위영역은 서열번호 109, 136, 및 163으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 유전자간 영역 3의 하위영역은 서열번호 110, 137, 및 164로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 유전자간 영역 4의 하위영역은 서열번호 111, 138, 및 165로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; 유전자간 영역 5의 하위영역은 서열번호 112, 139, 및 166으로부터 선택되는 서열을 포함하고/하거나; IRF4의 하위영역은 서열번호 167, 168, 및 169로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 1 ng 이하, 0.9 ng 이하, 0.8 ng 이하, 0.7 ng 이하, 0.6 ng 이하, 0.5 ng 이하, 0.4 ng 이하, 0.3 ng 이하, 0.2 ng 이하, 0.1 ng 이하, 0.09 ng 이하, 0.08 ng 이하, 0.07 ng 이하, 0.06 ng 이하, 0.05 ng 이하, 0.04 ng 이하, 0.03 ng 이하, 0.02 ng 이하, 또는 0.01 ng 이하의 양으로 생물학적 샘플에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 0.1% 이하, 0.2% 이하, 0.3% 이하, 0.4% 이하, 0.5% 이하, 0.6% 이하, 0.7% 이하, 0.8% 이하, 0.9% 이하, 1% 이하의 비율로 생물학적 샘플에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 표적 마커에 대한 검출 어세이의 감도 수준 미만의 농도로 생물학적 샘플에 존재한다. "검출 어세이의 감도"는 분석물 농도/양의 작은 차이를 구별하는 검출 어세이의 능력의 측정치이다. 생물학적 샘플에 존재하는 세포-무함유 DNA 중 표적 마커가 검출 어세이의 감도 수준 미만이면, 통상의 방법을 사용하여 샘플 중 표적 마커의 각각 및 전부의 메틸화 수준의 정량화를 방해하게 된다. 대조적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플 중에서 매우 소량의 표적 마커를 검출하는데 유용하고 유리하다. 일부 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 0.08 ng 이하 또는 0.04 ng 이하의 양으로 생물학적 샘플에 존재한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)로부터 획득된 DNA는 다음 단계 (즉, 단계 (d)) 전에 희석제로 희석된다. 일부 실시형태에서, 희석제는 뉴클레아제 무함유 물, Tris-EDTA 완충제, 및 PCR 억제없는 임의의 다른 완충제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)의 사전-증폭된 DNA는 사전 희석없이 다음 단계 (즉, 단계 (d))에 직접 첨가된다.
처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커는 사전-증폭 프라이머 풀로 사전-증폭된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합제, 예컨대, 예를 들어, DNA 중합효소의 존재 하에서, 적합한 조건, 예를 들어, 완충제 및 온도 하에서 주형-지정 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 임의의 소정 경우에, 프라이머의 길이는 예를 들어, 프라이머의 의도하는 용도에 의존하며, 일반적으로 15 내지 30 뉴클레오티드 범위이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 이러한 주형과 혼성화하기에 충분히 상보성이어야만 한다. 프라이머 부위는 프라이머가 혼성화하는 주형의 영역이다. 프라이머 쌍은 증폭하려는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' 전방향 프라이머 및 증폭하려는 서열의 3' 말단의 상보체와 혼성화하는 3' 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이다. 당업자는 당분야의 통상의 지식을 기반으로 증폭하려는 마커(들)에 따라서 프라이머를 디자인할 수 있다 (참조, 예를 들어, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995). 더 나아가서, 몇몇 소프트웨어 패키지는 다양한 어세이를 위한 최적 프로브 및/또는 프라이머를 디자인하기 위해 공공으로 입수가능하고, 예를 들어, 게놈 연구 센터 (Center for Genome Research) (Cambridge, Mass., USA)에서 입수가능한 Primer 3이 있다. 분명하게, 프로브 또는 프라이머의 잠재적인 사용은 이의 디자인 동안 고려되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 디자인된 프라이머는 적어도 하나의 CpG 부위를 포함할 수 있거나, 또는 프라이머로부터 수득된 증폭 생산물은 적어도 하나의 CpG 부위를 포함할 수 있다. DNA 메틸화 상태를 검출하기 위한 프라이머를 디자인하기 위한 도구가 또한 당분야에서 입수가능한데, 예를 들어, MethPrimer (Li LC and Dahiya R. MethPrimer: designing primers for Methylation PCRs. Bioinformatics. 2002 Nov;18(11):1427-31)가 있다. 본 개시내용에서, 풀로서 사전-증폭 프라이머를 사용하여, 처리된 DNA 내의 임의의 표적 마커(들) (적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분 또는 적어도 하나의 표적 마커의 하위영역)가 사전-증폭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 바람직하게 적어도 5 뉴클레오티드, 보다 바람직하게 적어도 약 10-15 뉴클레오티드 및 보다 바람직하게 적어도 약 15 내지 30 뉴클레오티드, 또는 그 초과 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 200 잔기 미만의 길이 (예를 들어, 15 내지 100 뉴클레오티드)이지만, 본 명세서에서 사용되는 이 용어는 또한 보다 긴 폴리뉴클레오티드 사슬을 포괄하고자 함)를 포함하는 분자로서 정의된다. 정확한 크기는 많은 인자들에 의존하게 되고, 결국 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 의존한다. 올리고뉴클레오티드는 종종 그들 길이에 의해 지칭된다. 예를 들어, 24 잔기 올리고뉴클레오티드는 "24-량체"라고 한다. 올리고뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드와 혼성화하거나 또는 자가-혼성화하여 2차 및 3차 구조를 형성할 수 있다. 이러한 구조는 듀플렉스, 헤어핀, 십자형, 벤드 및 트리플렉스를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 올리고뉴클레오티드는 화학 합성, DNA 복제, 역전사, PCR, 또는 이의 조합을 포함하는, 임의 방식으로 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 뉴클레오티드 또는 핵산 간, 예컨대, 예를 들어, 이중 가닥 DNA 분자의 2개 가닥 간, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 시퀀싱 또는 증폭하려는 단일 가닥 핵산 상의 프라이머 결합 부위 간 혼성화 또는 염기 쌍형성을 의미한다. 상보적 뉴클레오티드는 일반적으로 A 및 T (또는 A 및 U), 또는 C 및 G이다. 2개 단일 가닥 RNA 또는 DNA 분자는 최적으로 정렬되고 비교되고 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 갖는 한 가닥의 뉴클레오티드가 다른 가닥의 뉴클레오티드의 적어도 약 80%, 일반적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게 약 98 내지 100%와 쌍형성할 때 상보적이라고 한다. 대안적으로, 상보성은 RNA 또는 DNA 가닥이 이의 상보체와 선택적 혼성화 조건 하에 혼성화되는 경우에 존재한다. 전형적으로, 선택적 혼성화는 적어도 14 내지 25 뉴클레오티드의 스트레치 상에서 적어도 약 65% 상보성, 바람직하게 적어도 약 75%, 보다 바람직하게 적어도 약 90% 상보성이 존재할 때 일어날 것이다. 참조로 본 명세서에 편입되는, 문헌 [M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 사전-증폭 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사전-증폭 프라이머 풀은 다수의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사전-증폭 단계는 메틸화-특이적 프라이머를 사용하는 PCR인, 메틸화-특이적 PCR ("MSP")에 의해 수행된다. 이러한 기술 (즉, MSP)은 [Herman et al., Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for Methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 September 3; 93 (18): 9821-6], 및 미국 특허 제6,265,171호에 기술되었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸화-특이적 프라이머 쌍"은 처리된 DNA 내의 특이적 표적 마커(들)를 증폭시키기 위해서 메틸화의 차이를 이용하도록 CpG 부위(들)를 인식하게 특이적으로 디자인된 프라이머 쌍을 의미한다. 프라이머는 특이적 메틸화 상황을 갖거나 또는 특이적 메틸화 상황을 갖지 않는 분자에 대해서만 작용한다. 예를 들어, 프라이머는 메틸화를 갖는 특이적 CpG 부위에 메틸화-특이적 방식으로 특이적으로 혼성화할 수 있지만, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 메틸화를 갖지 않는 특이적 CpG 부위에 혼성화할 수 없는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 그러므로 프라이머는 특이적 CpG 부위에 메틸화를 갖는 표적 마커를 특이적으로 증폭시키게 된다. 다른 예를 위해서, 프라이머는 메틸화없는 특이적 CpG 부위에 메틸화-특이적 방식으로 특이적으로 혼성화할 수 있지만, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 메틸화를 갖는 특이적 CpG 부위에 혼성화할 수 없는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 그러므로 프라이머는 특이적 CpG 부위에 메틸화가 없는 표적 마커를 특이적으로 증폭하게 된다. 그러므로, 본 개시내용에서, 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 사전-증폭을 위한 메틸화-특이적 프라이머 쌍(들)의 사용은 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 구분할 수 있게 한다. 본 개시내용의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 바이술파이트 처리된 CpG 디뉴클레오티드에 혼성화하는 적어도 하나의 프라이머를 함유한다. 그러므로, 메틸화된 DNA에 특이적인 상기 프라이머의 서열은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고, 비메틸화된 DNA에 특이적인 상기 프라이머의 서열은 CpG의 C 위치의 위치에 "T"를 함유하고/하거나, CpG의 G 위치의 위치에 "A"를 함유한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건 또는 고도 엄격 조건 하에서 표적 마커(들) (또는 표적 마커(들)의 하위영역) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 표적 마커(들) (또는 표적 마커(들)의 하위영역) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드는 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과)의 CpG 부위를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화하다", 및 "혼성화하는", "혼성화한다" 또는 "혼성화" 같은 별형은 2개 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 비공유적으로 결합하여 안정한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 과정을 의미할 수 있다. 일 양태에서, 최종 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 "하이브리드" 또는 "듀플렉스"일 수 있다. "혼성화 조건"은 전형적으로 1 M 미만, 종종 약 500 mM 미만의 염 농도를 포함하고, 약 200 mM 미만일 수 있다. "혼성화 완충액"은 완충 염 용액 예컨대 5% SSPE, 또는 다른 당분야에 공지된 이러한 완충제를 포함한다. 혼성화 온도는 5℃ 만큼 낮을 수 있지만, 전형적으로 22℃ 초과이고, 보다 전형적으로 약 30℃ 초과이고, 전형적으로 37℃ 초과이다. 혼성화는 종종 엄격 조건, 즉, 서열이 이의 표적 서열에 혼성화하게 되지만 다른, 비-상보적 서열에 혼성화하지 않는 조건 하에서 수행된다. 엄격 조건은 서열-의존적이고 상이한 환경에서 상이하다. 예를 들어, 더 긴 단편은 짧은 단편에 비해서 특이적 혼성화를 위해 더 높은 혼성화 온도를 요구할 수 있다. 염기 조성 및 상보성 가닥의 길이, 유기 용매의 존재, 및 염기 불일치 정도를 포함한, 다른 인자들이 혼성화의 엄격도에 영향을 미칠 수 있으므로, 매개변수의 조합은 어느 하나의 매개변수 단독의 절대 측정치보다 더 중요하다. 일반적으로, 엄격 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 용융 온도 (Tm)에 비해서 약 5℃ 더 낮게 선택된다.
Tm 은 이중 가닥 핵산 분자의 개체군이 단일 가닥으로 절단 해리되는 온도일 수 있다. 핵산의 Tm 을 계산하기 위한 몇몇 방정식이 당분야에 충분히 공지되어 있다. 표준 기준으로 표시된 바와 같이, Tm 값의 단순 추정치는, 핵산이 1 M NaCl의 수용액 중에 존재할 때, 방정식, Tm =81.5 + 0.41 (% G + C)에 의해 계산될 수 있다 (참조: 예를 들어, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). 다른 참조 (예를 들어, Allawi and SantaLucia, Jr., Biochemistry, 36:10581-94 (1997))는 Tm 의 계산에 서열 특징뿐만 아니라, 구조적 및 환경적 특징을 고려하는 대체 계산 방법을 포함한다.
일반적으로, 하이브리드의 안정성은 이온 농도 및 온도의 함수이다. 전형적으로, 혼성화 반응은 저 엄격도의 조건 하에서 수행된 이후에, 다양하지만, 더 높은 엄격도의 세척이 후속된다. 예시적인 엄격 조건은 약 7.0 내지 약 8.3의 pH 및 적어도 25℃의 온도에서 적어도 0.01 M 내지 1 M 이하의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 포함한다. 예를 들어, 5 x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 대략 30℃ 온도의 조건이 대립유전자-특이적 혼성화에 적합하지만, 적합한 온도는 혼성화되는 영역의 길이 및/또는 GC 함량에 의존한다. 일 양태에서, 불일치 백분율의 결정에서 "혼성화의 엄격도"는 다음과 같을 수 있다: 1) 고도 엄격: 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃; 2) 중등도 엄격: 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃ (중도 엄격이라고도 함); 및 3) 저 엄격: 1.0 x SSPE, 0.1 % SDS, 50℃. 동등한 엄격도는 대안적인 완충제, 염, 및 온도를 사용해 획득될 수 있다는 것을 이해한다. 예를 들어, 중등도 엄격 혼성화는 핵산 분자 예컨대 프로브가 상보적 핵산 분자에 결합하도록 허용하는 조건을 의미할 수 있다. 혼성화된 핵산 분자는 일반적으로 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성 중 적어도 어느 하나를 포함하여, 적어도 60% 동일성을 갖는다. 중등도 엄격 조건은 50% 포름 아미드, 5 x 덴하르트 용액, 5x SSPE, 0.2% SDS 중에 42℃에서 혼성화에 이어서, 0.2 x SSPE, 0.2% SDS 중에, 42℃에서 세척과 동등한 조건일 수 있다. 고도 엄격 조건은 예를 들어, 50% 포름 아미드, 5 x 덴하르트 용액, 5 x SSPE, 0.2% SDS 중에 42℃에서 혼성화에 이어서, 0.1 x SSPE, 및 0.1 % SDS 중에 65℃에서 세척으로 제공될 수 있다. 저 엄격 혼성화는 10% 포름 아미드, 5 x 덴하르트 용액, 6 x SSPE, 0.2% SDS 중에 22℃에서 혼성화에 이어서, 1x SSPE, 0.2% SDS 중에 37℃에서 세척과 동등한 조건을 의미할 수 있다. 덴하르트 용액은 1% 피콜, 1% 폴리비닐피롤리돈, 및 1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유한다. 20 x SSPE (염화나트륨, 인산나트륨, EDTA)는 3 M 염화나트륨, 0.2 M 인산나트륨, 및 0.025 M EDTA를 함유한다. 다른 적합한 중등도 엄격 및 고도 엄격 혼성화 완충액 및 조건은 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989)]; 및 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons (1999)]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 사전-증폭 프라이머 풀은 대조 마커를 증폭하기 위한 대조 프라이머 쌍을 더 포함한다. 일반적으로, 대조 마커는 실험 표적 (예를 들어, 미지 농도의 핵산)과 비교에서 사용을 위해, 기지 특성 (예를 들어, 기지 서열, 세포 당 기지 카피수)을 갖는 핵산이다. 대조군은 어세이에서 검사 또는 표적 핵산을 정규화할 수 있는 내생성, 바람직하게 불변 유전자일 수 있다. 예를 들어, 샘플 가공에서 발생될 수 있는 샘플 대 샘플 변동, 어세이 효율 등에 대한 이러한 정규화 대조군은 정확한 샘플 대 샘플 데이터 비교를 허용하고, 증폭 효율 및 편향성을 정량화한다.
일부 실시형태에서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대조군 프라이머 쌍의 서열은 하기 표 2의 서열번호 55 및 56으로 표시된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 하기 표 2에 표시된 바와 같은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 쌍을 포함한다. 본 개시내용에서 사용되는 프라이머 쌍(들)의 서열 번호는 "서열번호 n/m"의 형태로 표시된다. 예를 들어, 서열번호 1/2는 하기 표 2에 표시된 바와 같이 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로서 기재된 핵산 서열을 갖는 프라이머 쌍을 의미한다.
서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 기재된 바와 같은 프라이머 쌍은 각각 마커 NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, 유전자간 영역 1, ASCL4, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 4, NKX2-6, SLC24A2, 유전자간 영역 5, IRF4를 증폭시키기 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 표적 마커는 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 증폭된다. 이러한 차단제 올리고뉴클레오티드의 사용은 [Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997]에 기술된다. 차단제 서열은 사전-증폭 프라이머 쌍(들)으로 동시발생적으로 처리된 DNA에 혼성화된다. 표적 마커의 사전-증폭은 차단제 서열의 5' 위치에서 종료되어서, 표적 마커의 사전-증폭은 차단제 서열에 대한 상보적 서열이 존재하는 경우에 억제된다. 차단제 서열은 메틸화 상황 특이적 방식으로 처리된 DNA에 혼성화하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 비메틸화 핵산의 개체군 내 메틸화 핵산의 검출을 위해서, 문제 위치에서 비메틸화된 핵산 증폭의 억제는 메틸화 핵산 증폭의 억제가 바람직한 경우에 'CpG'와 반대로, 문제 위치에 'CpA' 또는 'TpA'를 포함하는 차단제 서열의 사용을 통해서 수행된다.
차단제 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 방법 경우에, 중합효소-매개 증폭의 효율적인 파괴는 차단제 올리고뉴클레오티드가 중합효소에 의해 연장되지 않는 것을 요구한다. 바람직하게, 이것은 3'-데옥시올리고뉴클레오티드, 또는 "유리" 히드록실 기 이외에 3' 위치에서 유도체화된 올리고뉴클레오니드인 차단제의 사용을 통해서 획득된다. 예를 들어, 3'-O-아세틸 올리고뉴클레오티드는 차단제 분자의 바람직한 부류를 대표한다.
추가로, 차단제 올리고뉴클레오티드의 중합효소-매개 분해는 배제되어야 한다. 바람직하게, 이러한 배제는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 중합효소의 사용, 또는 예를 들어 차단제 분자를 뉴클레아제-내성이게 만드는 그의 5'-말단에 티올레이트 브릿지를 갖는 변형된 차단제 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 특정 용도는 차단제의 이러한 5' 변형을 요구하지 않을 수 있다. 예를 들어, 차단제- 및 프라이머-결합 부위가 중복되어서, 프라이머의 결합을 배제하는 경우 (예를 들어, 과량의 차단제 사용), 차단제 올리고뉴클레오티드의 분해는 실질적으로 배제될 것이다. 이것은 프라이머를 차단제를 향해서, 그를 통해 서(5'-3' 방향으로) 확장하지 않기 때문이고, 이것은 보통 혼성화된 차단제 올리고뉴클레오티드의 분해를 일으키는 과정이다.
본 개시내용의 목적상, 본 명세서에서 구현되는 바와 같은, 특히 바람직한 차단제/PCR 실시형태는 차단 올리고뉴클레오티드로서 펩티드 핵산 (PNA) 올리고머의 사용을 포함한다. 이러한 PNA 차단제 올리고머는 그들이 중합효소에 의해 분해 또는 확장되지 않기 때문에 이상적으로 적합하다.
일정 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 DNA 중합효소를 사용해 사전-증폭된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "DNA 중합효소"는 모노-데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)로부터 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 합성을 촉매하고, DNA 복제, 복구, 및 일부 경우에, 세포 분화의 가장 기본적인 기능을 수행하는 효소를 의미한다.
원핵생물에서 DNA 중합효소의 예는 DNA 중합효소 I, DNA 중합효소 II, DNA 중합효소 III, DNA 중합효소 IV, 및 DNA 중합효소 V를 포함한다. DNA 중합효소 I, II, 및 III은 이. 콜라이에서 알려져 있다. DNA 중합효소 III은 게놈 복제에서 가장 중요한 것으로 보인다. DNA 중합효소 I은 성장하는 가닥의 말단에서 쌍 비형성된 염기를 편집하는 이의 능력에서 중요하다. 레트로바이러스는 DNA를 합성하기 위해 RNA 주형을 사용하는, 고유한 DNA 중합효소, 즉, 역전사효소를 보유한다. 진핵생물의 경우, DNA 중합효소의 예는 중합효소 α, β, λ, γ, σ, μ, δ, ε, η, ι, κ, ξ, θ 및 Rev1이다. 동물 세포는 핵 및 미토콘드리아에서 DNA의 복제를 담당하는 DNA 중합효소를 갖는다.
사전-증폭 단계에서 사용되는 PCR 시약은 처리된 DNA를 증폭하는데 사용될 수 있는 임의의 상업적으로 입수가능한 PCR 믹스 (예를 들어, KAPA2G Fast Multiplex PCR Kit, Luna® Universal Probe qPCR Master Mix, EpiTect MethyLight PCR Kit 등)일 수 있다. 대안적으로, 당업자는 실험실에서 Mg2+, dNTP, DNA 중합효소 등을 포함하는 PCR 시약을 제조할 수 있다. 당업자는 또한 그들 실제 요구에 따라서 적절한 PCR 반응 시스템 및 PCR 반응 조건을 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)의 사전-증폭은 5 내지 30 사이클의 반응을 포함하고, 각 사이클은 40∼80℃에서 5초 내지 5분의 반응 이전에 85∼99℃에서 5초 내지 5분 동안의 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)의 사전-증폭은 10 내지 20 사이클의 반응을 포함하고, 각 사이클은 45∼60℃에서 30초 내지 3분 동안의 반응 이전에 90∼99℃에서 15초 내지 2분 동안의 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)의 사전-증폭은 15 사이클의 반응을 포함하고, 각 사이클은 56℃에서 60초 동안의 반응 전에 95℃에서 30초의 반응을 포함한다.
단계 (d)
본 개시내용에 따른 방법의 단계 (d)에서, 단계 (c)가 존재하면, 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준은 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 개별적으로 정량화되고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준이 개별적으로 정량화된다. 본 개시내용에서, 단계 (d)는 또한 정량화 단계로서 지정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸화 상태" 또는 "메틸화 상황"은 DNA 영역 내, 특정 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드들에서 메틸화의 존재, 부재 및/또는 분량을 의미한다. 특정 DNA 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 마커)의 메틸화 상황은 서열 내 모든 염기의 메틸화 상태를 의미할 수 있거나 또는 서열 내 염기 쌍의 서브세트의 메틸화 상태 (예를 들어, 시토신 잔기의 것 또는 하나 이상의 특이적 제한 효소 인식 서열의 메틸화 상태)를 의미할 수 있거나, 또는 서열에서 메틸화가 발생되는 위치의 정확한 정보를 제공하지 않고 서열 내 국소 메틸화 밀도에 관한 정보를 의미할 수 있다. 메틸화 상황은 임의로 "메틸화 수준"으로 나타내거나 또는 표시될 수 있다. 메틸화 수준은 예를 들어, 메틸화 감응성 제한 효소로 제한효소 분해 이후에 존재하는 온전한 DNA의 양을 정량화하여 생성될 수 있다. 이러한 예에서, DNA 중 특정 서열이 정량화적 PCR을 사용해 정량화되면, 모의 처리된 대조군과 대략 동일한 주형 DNA의 양은 서열이 고도로 메틸화되지 않았다는 것을 나타내는 반면 모의 처리된 샘플에서 발생된 것에 비해서 실질적으로 적은 주형의 양은 서열에서 메틸화된 DNA의 존재를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 상기 기술된 예로부터의 메틸화 수준은 메틸화 상황을 나타내고, 따라서 메틸화 상황의 정량화적 지시자로서 사용될 수 있다. 이것은 샘플 중 서열의 메틸화 상황을 한계 수준과 비교하는 것이 바람직할 때 특히 유용하다.
DNA 서열 내 하나 이상의 특정 CpG 메틸화 부위 (각각은 2개의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 가짐)에서 메틸화 상태는 "비메틸화," "완전-메틸화" 및 "반-메틸화"를 포함한다. 용어 "반-메틸화" 또는 "반메틸화"는 그의 오직 한 가닥만이 메틸화된, 이중 가닥 DNA의 메틸화 상태를 의미한다. 용어 "과메틸화"는 정상 대조군 DNA 샘플 내 상응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견된 5-메틸시토신의 양에 비해서, 검사 DNA 샘플의 DNA 서열 내 하나 또는 다수의 CpG 디뉴클레오티드에서 5-메틸시토신의 증가된 존재에 상응하는 평균 메틸화 상태를 의미한다. 잔기에서 메틸화 상황은 예를 들어, 메틸화 수준으로서 표시되는, 정성적 또는 정량화적 판독치일 수 있다. 본 개시내용에서, 용어 "메틸화 상황" 및 "메틸화 수준"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따라서, 하나 초과의 상이한 메틸화 수준을 동시에 결정하는 것이 가능하다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 단계 (c)가 존재하면, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준은 단계 (c)에서 획득된 DNA를 기반으로 개별적으로 정량화되고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준이 개별적으로 정량화되며, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, 및 BCAN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, NDRG4, BCAN, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 마커를 포함한다. 상기 단계 (c) 하에서 "표적 마커"에 대한 상세한 설명 (표적 마커의 정의, 표적 마커의 특이적 조합 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)은 또한 단계 (d)에서 인용되는 "단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커"에서의 "표적 마커"에 적용된다 (단계 (c)가 부재하는 시나리오 경우). DNA 서열 (예를 들어, 표적 마커) 내 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 수준/상태는 당분야에 공지된 다양한 어세이를 통해서 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)의 정량화는 PCR (예를 들어, 실시간 PCR, 디지탈 PCR), 핵산 시퀀싱, 질량-기반 분리 (예를 들어, 전기영동, 질량 분광법), 또는 표적 포획 (예를 들어, 혼성화, 마이크로어레이)에 의해 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 적어도 하나의 표적 마커(들)의 메틸화 수준은 MSP (참조: Herman supra)를 사용하여 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 개별적으로 정량화된다. 예를 들어, 중간 및/또는 고도 엄격 조건 하에서 비전환된 서열과 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머를 사용하여서, 증폭 생산물은 주형이 CpG 부위에 메틸화된 시토신을 포함할 때만 생산된다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)의 정량화는 실시간 PCR을 통해서 수행된다. 실시간 PCR의 비제한적인 예는 [Cottrell et al., Nucl. Acids Res. 32: e10, 2003]에 기술된 HeavyMethyl™ PCR; [Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999]에 기술된 MethyLight™ PCR; [Rand et al., Nucl. Acids Res. 33:e 127, 2005]에 기술된 Headloop PCR을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "HeavyMethyl™ PCR"은 당분야에서 인식되는 실시간 PCR 기술을 의미하는데, 하나 이상의 비확장성 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 차단제가 메틸화 특이적 방식으로 바이술파이트-처리된 핵산에 결합한다 (즉, 차단제/들은 중간 내지 고도 엄격 조건 하에서 비돌연변이된 DNA에 특이적으로 결합함). 증폭 반응은 임의로 메틸화 특이적일 수 있지만 하나 이상의 차단제에 측접된 하나 이상의 프라이머를 사용해 수행된다. 비메틸화 핵산 (즉, 비-돌연변이된 DNA)의 존재 하에서, 차단제/들이 결합하고 PCR 생산물은 생산되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280, 1991]에 본질적으로 기술된 바와 같은 TaqMan™ 어세이를 사용하여, 샘플 중 핵산의 메틸화 수준을 결정한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "MethyLight™ PCR"은 당분야에서 인식되는 형광-기반 실시간 PCR 기술을 의미하고, TaqMan™ 프로브라고 하는 이중-표지된 형광 올리고뉴클레오티드 프로브가 적용되는데, 전방향 및 역방향 증폭 프라이머 사이에 위치된 CpG-풍부 서열에 혼성화하도록 디자인된다. TaqMan™ 프로브는 TaqMan™ 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드에 부착된 링커 모이어티 (예를 들어, 포스포르아미다이트)에 공유적으로 결합된 형광 "리포터 모이어티" 및 "소광제 모이어티"를 포함한다. PCR 증폭 동안, CpG-풍부 서열에 혼성화된 TaqMan™ 프로브는 Taq 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어서 PCR 반응 동안 실시간 방식으로 검출가능한 신호를 생산한다. 이러한 방법에서, 분자 비콘이 검출가능한 프로브로서 사용될 수 있고, 이 시스템은 사용되는 DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 독립적이다 (참조: Mhlanga and Malmberg, Methods 25:463-471, 2001).
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤드루프 PCR"은 표적 핵산을 선택적으로 증폭시키지만, 추가 증폭을 위한 주형을 더 이상 제공할 수 없는 헤어핀 구조를 형성하도록 3' 스템-루프의 확장을 통해서 비-증폭 표적 변이체의 증폭을 억제하는, 당분야에서 인식되는 실시간 PCR을 의미한다.
일정 실시형태에서, 실시간 PCR은 다중복합화 실시간 PCR이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다중복합" 또는 "다중복합화"는 다수의 표적, 예를 들어 다수의 핵산 서열의 존재 및/또는 양이, 그 각각이 적어도 하나의 상이한 검출 특징, 예를 들어, 형광 특징 (예를 들어, 여기 파장, 방출 파장, 방출 강도, FWHM (full width at half maximum peak height), 또는 형광 수명) 또는 고유한 핵산 또는 단백질 서열 특징을 갖는, 하나 초과의 마커를 사용하여 동시에 어세이될 수 있는 어세이 또는 다른 분석 방법을 의미할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)의 정량화는 핵산 시퀀싱에 의해 수행된다. 핵산 시퀀싱에 대한 예시적인 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992]; [lark et al., Nucl. Acids Res. 22:2990-2997, 1994]을 참조한다. 예를 들어, 바이술파이트로 처리되지 않은 샘플을 사용해 수득된 서열, 또는 관심 영역의 기지의 뉴클레오티드 서열을 바이술파이트-처리된 샘플을 사용해 수득된 서열과 비교하여, DNA 서열 내 메틸화된 시토신(들)의 확인을 용이하게 한다. 미처리된 샘플과 비교된 바이술파이트-처리된 샘플 중 시토신의 부위에서 검출된 임의의 티민 잔기는 바이술파이트 처리의 결과로서 돌연변이에 의해 초래되는 것으로 간주될 수 있고, 즉 이 부위에 메틸화된 시토신이 존재한다.
시퀀싱 DNA를 시퀀싱하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 디데옥시 사슬 종결 방법 또는 막삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 방법 (참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989), 파이로시퀀싱 (참조: Uhlmann et al., Electrophoresis, 23: 4072-4079, 2002), 고체상 파이로시퀀싱 (참조: Landegren et al., Genome Res., 8(8): 769-776, 1998), 고체상 미니시퀀싱 (참조: 예를 들어, Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992), FRET에 의한 미니시퀀싱 (참조: 예를 들어, Chen and Kwok, Nucleic Acids Res. 25:347-353, 1997), 결찰에 의한 시퀀싱, 및 초심층 시퀀싱 (참조: Marguiles et al., Nature 437 (7057): 376-80 (2005))을 포함한다.
일정 실시형태에서, 단계 (d)의 정량화는 질량-기반 분리 (예를 들어, 전기영동, 질량 분광법)에 의해 수행된다.
예를 들어, 메틸화된 시토신 잔기의 존재는 문헌 [Xiong and Laird, Nucl. Acids Res., 25:2532-2534, 2001]에 실질적으로 기술된 바와 같은 조합 바이술파이트 제한 분석 (COBRA)을 사용해 검출된다. 이 방법은 비-메틸화 시토신 잔기를 선택적으로 돌연변이시키는 화합물, 예를 들어, 바이술파이트로 처리 후 메틸화 및 비메틸화 핵산 간 제한 효소 인식 부위의 차이를 이용한다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 Taql은 서열 TCGA를 절단하는데, 서열 중 비메틸화 핵산의 바이술파이트 처리 이후에, 서열이 TTGA가 되어서, 그 결과로 절단되지 않는다. 그 다음에 분히 및/또는 비분해 핵산은 당분야에 공지된 검출 방식, 예컨대, 예를 들어, 전기영동 및/또는 질량 분광법을 사용해 검출된다.
다른 예의 경우에, 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 돌연변이시키는 화합물로 처리 후 뉴클레오티드 서열 및/또는 2차 구조의 차이를 기반으로 하는 증폭 생산물 중 핵산 차이를 검출하기 위한 상이한 기술이 사용되고, 예를 들어, 메틸화-특이적 단일 가닥 입체배열 분석 (MS-SSCA) (Bianco et al., Hum. Mutat., 14:289-293, 1999), 메틸화-특이적 변성 구배 겔 전기영동 (MS-DGGE) (Abrams and Stanton, Methods Enzymol., 212:71-74, 1992) 및 메틸화-특이적 변성 고성능 액상 크로마토그래피 (MS-DHPLC) (Deng et al., Chin. J. Cancer Res., 12:171-191, 2000)이다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)의 정량화는 표적 포획 (예를 들어, 혼성화, 마이크로어레이)에 의해 수행된다.
혼성화에 의한 적합한 검출 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예컨대 서던, 도트 블롯, 슬롯 블롯 또는 다른 핵산 혼성화 수단 (Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421 -7427, 1994; Gonzalgo et al., Cancer Res. 57:594-599, 197)이 있다. 일부 실시형태에서, 혼성화 어세이를 위한 프로브는 검출가능하게 표지된다. 일부 실시형태에서, 혼성화 어세이를 위한 핵산-기반 프로브는 미표지된다. 이러한 미표지된 프로브?z 고형 지지체 예컨대 마이크로어레이 상에 고정될 수 있고, 검출가능하게 표지된 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있다.
마이크로어레이의 예는 전환된 시토신 잔기(들)를 갖는 서열 및 비전환된 시토신 잔기(들)를 갖는 서열을 구별하는데 유용한 메틸화 특이적 마이크로어레이이다 (참조: Adorjan et al., Nucl. Acids Res., 30: e21, 2002). 혼성화 기반 어세이는 또한 메틸화-감응성 제한 효소로 처리 후 핵산에 대해 사용될 수 있다.
또 다른 예의 경우에, DNA 서열 내 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 상황은 PCR 증폭 프라이머로 동시발생적으로 바이술파이트 처리된 DNA에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 통해서 확인할 수 있다 (상기 프라이머는 메틸화 특이적일 수 있거나 표준일 수 있음).
일부 실시형태에서, 단계 (d)는 검출제의 존재 하에서 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "검출제"는 핵산의 존재, 부재 또는 양을 검출하기 위한 정량화 단계에서 사용되는 작용제이다.
당분야에 공지된 다양한 검출제가 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 형광 프로브는 하기 표 2에 표시된 바와 같은 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료 (예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표지되고, 그의 3' 말단에서 소광제 (예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL 또는 TAMRA)로 표시된다.
표지화는 직접 또는 간접 방법으로 수행될 수 있다. 직접 표지화는 시약에 직접적으로 (공유적으로 또는 비공유적으로) 표지의 커플링을 포함한다. 간접 표지화는 제1 시약에 제2 시약의 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합을 포함한다. 제2 시약은 제1 시약에 특이적으로 결합해야만 한다. 상기 제2 시약은 적합한 표지와 커플링될 수 있고/있거나 제2 시약에 결합하는 제3 시약의 표적 (수용체)일 수 있다. 제2, 제3, 또는 더 고차의 시약의 사용은 종종 신호 강도를 증가시키기 위한 것이다. 적합한 2차 및 보다 고차의 시약은 항체, 2차 항체, 및 충분히 공지된 스트렙타비딘-바이오틴 시스템 (Vector Laboratories, Inc.)을 포함할 수 있다. 시약 또는 기질은 또한 당분야에 공지된 바와 같은 하나 이상의 태그로 "태그화"될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용하여 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 증폭하는 것을 포함하고, 획득된 DNA의 적어도 일부분이 증폭된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용해 증폭시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정량화 프라이머 쌍(들)"은 정량화 단계에서 사용되는 프라이머 쌍(들)을 의미한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (c)로부터 획득된 DNA의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)의 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과)는 단계 (c)의 사전-증폭 프라이머 풀 중 메틸화-특이적 프라이머 쌍(들)의 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과)와 동일하다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 내의 적어도 일부분을 증폭시키도록 디자인된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 내의 적어도 일부분을 증폭시키도록 디자인되고, 다시 말해서, 단계 (c) 및 단계 (d)는 네스티드 PCR로서 디자인된다.
네스티드 PCR은 감도 및 특이성을 개선시키도록 디자인된 PCR의 변형이다. 네스티드 PCR은 2개 프라이머 세트 및 2회 연속 PCR 반응의 사용을 포함한다. 제1 라운드의 증폭을 수행하여 제1 앰플리콘을 생성시키고, 제2 라운드의 증폭은 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 초기 프라이머 쌍에 의해 한정되는 영역 내부 부위에 어닐링되는 프라이머 쌍을 사용해 수행되는데, 다시 말해서, 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍 내에 "내포된 (nested)"것으로 간주된다. 이러한 방식에서, 올바른 내부 서열을 함유하지 않는 제1 PCR 반응으로부터의 배경 증폭 생산물은 제2 PCR 반응에서 추가로 증폭되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중에서 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중에서 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중에서 하나 이상의 TpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중에서 하나 이상의 TpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중에서 하나 이상의 CpA 디뉴클레오티드의 존재를 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중에서 하나 이상의 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (c)가 존재하면, 정량화 단계는 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)가 부재하면, 정량화 단계는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 다수의 상이한 정량화 실험이 다수의 분획을 사용해 수행되며, 단계 (c)로부터 획득된 DNA (또는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커)의 상이한 세트는, 분획으로 존재하면, 다수의 분획 중 하나에서 정량화된다. 일부 실시형태에서, 대조 마커는 각각의 분획에서 정량화된다.
단계 (e)
대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법의 단계 (e)에서, 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준은 상응하는 기준 수준과 각각 비교되고, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타낸다.
결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법의 단계 (e)에서, 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준은 각각 치료 전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교되고, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 의미한다.
본 개시내용에 따른 방법의 단계 (e)는 또한 비교 단계라고 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비교하다", "비교하는", "비교되는", 또는 "비교"는 분석하려는 검사 생물학적 샘플에 포함된 정량화 단계로부터의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커(들)의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 이 용어는 상응하는 매개변수 또는 값의 비교를 의미하는 것으로 이해해야 하며, 예를 들어, 절대량은 기준 절대량과 비교되는 한편 농도는 기준 농도와 비교되거나 또는 검사 샘플에서 수득된 강도 신호는 기준 샘플의 동일 유형의 강도 신호와 비교된다. 비교는 수동으로 또는 컴퓨터 보조로 수행될 수 있다. 컴퓨터 보조 비교 경우에, 결정된 양의 값은 컴퓨터 프로그램에 의해서 데이터베이스에 저장된 적합한 기준에 상응하는 값과 비교될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 비교의 결과를 더 평가할 수 있고, 자동으로 적합한 출력 형식으로 바람직한 평가를 제공한다. 정량화 단계로부터의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커(들)의 메틸화 수준과 상응하는 기준 수준의 비교를 기반으로, 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는 대상체를 확인하는 것이 가능하고; 또한 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 것이 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기준 수준"은 결장직장 신생물, 또는 대상체에서 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성의 포함 또는 배제를 가능하게 하는 한계 수준, 또는 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응의 모니터링을 가능하게 하는 한계 수준을 의미한다.
예를 들어, 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법과 관련하여, 검사 샘플 중 하나 이상의 표적 마커(들)의 메틸화 수준이 그의 상응하는 기준 수준과 동일하거나 또는 그에 비해 더 높으면, 대상체는 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 또는 발생 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다고 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검사 샘플 중 하나 이상의 표적 마커(들)의 메틸화 수준은 그의 상응하는 기준 수준의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상이다. 본 개시내용에서, 대상체에서 결장직장 신생물을 진단하거나, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대해 스크리닝하거나 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후를 평가하기 위해서, 표적 마커의 각각 및 모두의 메틸화 수준이 그의 상응하는 기준 수준과 동일하거나 또는 그에 비해 높을 필요는 없다. 대신에, 정량화 단계에서 정량화된 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준이 그의 상응하는 기준 수준과 동일하거나 또는 그에 비해 높은 경우면 충분하다.
다른 예에서, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법에 대해서, 검사 샘플 중 하나 이상의 표적 마커(들)의 메틸화 수준이 결장직장 신생물의 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 낮으면, 대상체는 치료에 반응성으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결장직장 신생물의 치료 후 수득된 생물학적 샘플 중에서 하나 이상의 표적 마커(들)의 메틸화 수준은 결장직장 신생물의 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% 낮다. 본 개시내용에서, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체가 치료에 반응성임을 표시하기 위해서, 표적 마커의 각각 및 모두의 메틸화 수준이 결장직장 신생물의 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해 낮을 필요는 없다. 대신에, 결장직장 신생물의 치료 후 수득된 생물학적 샘플 중에서 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준이 결장직장 신생물의 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 낮은 경우면 충분하다.
표적 마커의 메틸화의 기준 수준은 하나 이상의 기준 샘플로부터 유래될 수 있고, 기준 수준은 관심 샘플을 검사하기 위한 실험과 동시에 수행되는 실험으로부터 수득된다. 대안적으로, 기준 수준은 하나 이상의 기준 샘플 또는 질환 기준 샘플로부터의 데이터, 표준, 또는 수준의 컬렉션을 포함하는, 데이터베이스에서 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 데이터, 표준 또는 수준의 컬렉션은 그들을 하나 이상의 샘플로부터의 데이터와 비교 목적을 위해 사용할 수 있도록 정규화된다. "정규화되다" 또는 "정규화"는 측정 원시 데이터를 다른 그렇게 정규화된 데이터와 직접 비교할 수 있는 데이터로 전환시키는 과정이다. 정규화는 어세이마다 가변적일 수 있는 요인들로 인해 초래된 어세이-특이적 오류, 예를 들어, 로딩 분량의 변동, 결합 효율, 검출 감도, 및 다른 다양한 오류를 극복하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 기준 데이터베이스는 표적 마커의 메틸화 수준 및/또는 하나 이상의 기준 샘플로부터의 다른 실험실 및 임상 데이터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 데이터는 기준 샘플과 동일한 조건 하에서 시험된 대조 마커의 메틸화 수준의 백분율로서 각각 정규화된 표적 마커의 메틸화 수준을 포함한다. 표적 마커의 이러한 정규화된 메틸화 수준과 비교를 위해서, 검사 샘플의 표적 마커의 메틸화 수준이 또한 측정되고 검사 샘플과 동일한 조건 하에서 검사된 대조 마커의 메틸화 수준의 백분율로서 계산된다.
일부 실시형태에서, 기준 데이터베이스는 건강한 대상체, 및/또는 비-신생물 대상체 (즉, 신생물을 갖지 않는다고 알려진 대상체)에서 수득된 기준 샘플로부터 기준 수준 데이터를 편집하여 확립된다. 일부 실시형태에서, 기준 데이터베이스는 결장직장 신생물에 대한 치료 하에 있는 개체로부터의 기준 샘플로부터 기준 수준 데이터를 편집하여 확립된다. 일부 실시형태에서, 기준 데이터베이스는 예를 들어, 표적 마커의 상이한 메틸화 수준에 의해 입증된 바와 같이 결장직장 신생물의 상이한 병기에 있는 개체로부터의 기준 샘플로부터의 데이터를 편집하여 확립된다.
기준 수준은 바람직한 감도 및 특이성에 따라서 당업자가 선택할 수 있다. 적합한 기준 수준을 결정하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 기준 수준은 임상 연구에서 수집된 데이터로부터 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (e)의 기준 수준은, 결장직장 신생물을 갖거나 또는 가질 위험성이 있는 개체의 그룹 및 결장직장 신생물을 갖지 않거나 또는 가질 위험성이 없는 개체의 그룹에서 수득된 임상 샘플을 기반으로 결정된다.
당업자는 다양한 인자, 예컨대 연령, 성별, 병력, 가족력, 증상 등을 기반으로 결장직장 신생물을 개체가 갖는지 여부 또는 가질 위험성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 마커의 메틸화 수준 및 기준 수준은 사이클 한계값 (즉, Ct 값)으로 표시된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Ct 값"은 PCR 생산물의 형광성이 배경 신호 초과에서 검출될 수 있을 때 사이클수를 의미한다. Ct 값은 샘플 중 표적 마커의 양에 반비례하고, 다시 말해서, Ct 값이 낮을수록, 샘플 중 표적 마커의 양은 더 크다.
예를 들어, 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법의 단계 (e)에서, 단계 (d)의 표적 마커(들)의 Ct 값(들)은 기준 Ct 값과 비교되고, 적어도 하나의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 Ct 값에 비해서 동일하거나 더 낮은 Ct 값은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단계 (d)의 다수의 표적 마커 중 적어도 하나의 Ct 값이 그의 상응하는 기준 Ct 값에 비해서 2-10 사이클 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 사이클)이 더 낮으면, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다고 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증가된 확률"은 기준 샘플이 수득된 대상체와 비교하여, 대상체가 결장직장 신생물이 발달되거나 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후일 가능성 수준에서, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 전체 증가를 의미한다.
다른 예에서, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법의 단계 (e)에서, 단계 (d)의 표적 마커(들)의 Ct 값(들)은 기준 Ct 값과 비교되고, 적어도 하나의 표적 마커의, 치료 전 그의 상응하는 Ct 값에 비해서 더 높은 Ct 값은, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체가 치료에 반응성임을 의미한다. 일부 실시형태에서, 단계 (d)의 다수의 표적 마커 중 적어도 하나의 Ct 값이 치료 전 그의 상응하는 기준 Ct 값에 비해서 2-10 사이클 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 사이클) 만큼 더 높으면, 대상체가 결장직장 신생물의 치료에 반응성이라고 결정된다.
키트
다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한 키트를 제공한다:
(a) DNA를 치료하기 위한 제1 시약으로서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 것인 제1 시약;
(b) 임의로, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 제1 프라이머 풀로서, 적어도 하나의 프라이머 쌍은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 표적 서열은 적어도 하나의 CpG 부위를 포함하는 것인, 제1 프라이머 풀; 및
(c) 제2 시약으로서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이며, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 제2 시약.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3개) 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제2 프라이머 풀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제3 프라이머 풀을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 프라이머 풀 중 적어도 하나의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인된다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 또는 제3 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀 및 제2 프라이머 풀은 단일 용기 또는 별개 용기에 포장된다. 일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 검출제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료 (예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표지되고, 그의 3' 말단에서 소광제 (예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL, TAMRA 또는 lowa Black Dark Quenchers)로 표지된다.
일부 실시형태에서, 키트는 DNA 중합효소 및/또는 대상체 유래의 생물학적 샘플을 함유하기에 적합한 용기를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용 및/또는 키트 결과의 해석을 위한 설명서를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 별개 용기에 포장된, 중합효소에 의해 매개되는 프라이머 연장, 예컨대 PCR에 최적화된 반응 완충제를 함유할 수 있다. 키트는, 대상체의 생물학적 샘플 중에서 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, NDRG4, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과)의 표적 마커의 메틸화를 결정하기 위한 수단을 함유하기에 적합한 용기를 더 포함하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 제1 시약은 바이술파이트 시약 또는 메틸화 감응성 제한 효소 (MSRE)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 나트륨 바이술파이트이다. 일부 실시형태에서, MSRE는 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀은 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 마커 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 마커)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 최대 하나의 표적 마커 (즉, 하나의 마커이지만 하나 이하의 마커)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAT1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IKZF1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 NDRG4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAN이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 PKNOX2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 VAV3이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IRF4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 POU4F2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 SALL1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 TMEFF2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 ASCL4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 FGF12이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 유전자간 영역 1이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)의 추가 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 셉틴9, 및 BCAN, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, BCAT1, IKZF1, NDRG4, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAT1, 및 BCAN, 셉틴9, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, NDRG4, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IKZF1, 및 BCAN, 셉틴9, BCAT1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, BCAT1, PKNOX2, NDRG4, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 BCAT1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 VAV3, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, NDRG4, IRF4 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, NDRG4, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IRF4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, NDRG4, PKNOX2, VAV3 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 NDRG4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 PKNOX2, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 NDRG4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, ASCL4, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, FGF12, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, BCAN, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 바와 같이 Hg19 좌표로 정의되는 각각의 영역, 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b)a)의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나, 또는 그를 포함한다:
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제1 프라이머 풀은 하기 표 2에 표시된 바와 같은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하고, 임의로 제2 프라이머 풀은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀은 하기 표 2에 표시된 바와 같은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 풀, 제2 프라이머 풀, 또는 임의로 제3 프라이머 풀은 대조 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 키트는 각각이 제2 프라이머 풀의 분획을 수용하기 위한, 다수의 용기를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 CpG 위치-특이적 메틸화 분석을 수행하기 위한 표준 시약을 더 포함하고, 상기 분석은 하기 기술 중 하나 이상을 포함한다: MS-SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl™, COBRA, 및 핵산 시퀀싱.
일부 실시형태에서, 키트는 완충제 (예를 들어, 제한 효소, PCR, 저장 또는 세척 완충제); DNA 회수 시약 또는 키트 (예를 들어, 침전, 한외여과, 친화성 컬럼) 및 DNA 회수 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 시약을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키트는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 바이술파이트 시약;
(b) 임의로, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, NDRG4, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 그 초과) 마커를 포함하는 다수의 표적 마커 중 적어도 2개의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 다수의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함하는 제1 프라이머 풀로서, 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 하기 표 2에 표시되는 바와 같은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 2개 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인, 제1 프라이머 풀;
(c) 제2 시약으로서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 다수의 표적 마커의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이고, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 다수의 표적 마커의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제2 프라이머 풀을 포함하고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제3 프라이머 풀을 포함하는 것인, 제2 시약.
본 개시내용의 키트는 또한 별개 용기에 포장된, 다른 성분 예컨대 차단, 세척 또는 코팅에 적합한 완충제 또는 용액을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 키트는 DNA 농축을 위한, 당분야에 공지된, 하기 성분 중 하나 또는 몇개를 더 포함할 수 있다: 단백질 성분으로서, 상기 단백질은 메틸화된 DNA에 선택적으로 결합함; 임의로, 적합한 용액 중, 삼중체-형성 핵산 성분, 하나 또는 다수의 링커; 결찰 수행을 위한 물질 또는 용액, 예를 들어, 리가제, 완충액; 컬럼 크로마토그래피 수행을 위한 물질 또는 용액; 면역학 기반 농축 (예를 들어, 면역침강)을 수행하기 위한 물질 또는 용액; 핵산 증폭, 예를 들어 PCR을 수행하기 위한 물질 또는 용액; 적용가능하면 커플링 시약과 함께, 적용가능하면 용액 중에, 하나의 염료 또는 몇개 염료; 혼성화를 수행하기 위한 물질 또는 용액; 및/또는 세척 단계를 수행하기 위한 물질 또는 용액.
용도
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가, 또는 결장직장 신생물의 치료를 받는 대상체에서 치료 반응의 모니터링을 위한 진단 키트의 제조에서 본 개시내용의 키트의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법에서 사용을 위한 키트의 제조에서 표적 마커의 메틸화 수준의 정량화를 위한 시약의 용도를 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 및 메틸화 CpG 부위(들)를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면,단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계.
다른 양태에서, 본 개시내용은 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법에서 사용을 위한 키트의 제조에서 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 시약의 용도를 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 및 메틸화 CpG 부위(들)를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용해 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커 (들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 단계 (d)의 적어도 하나 (예를 들어, 각각)의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 치료전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준는 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
일부 실시형태에서, 상기 단계 (c)의 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 마커 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 마커)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 단계 (c)의 적어도 하나의 표적 마커는 최대 하나의 표적 마커 (즉, 하나의 마커이지만 하나 이하의 마커)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAT1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IKZF1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 BCAN이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 PKNOX2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 VAV3이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 IRF4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 NDRG4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 POU4F2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 SALL1이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 TMEFF2이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 ASCL4이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 FGF12이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적 마커는 유전자간 영역 1이다.
일부 실시형태에서, 상기 단계 (c)의 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 추가 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)의 추가 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 셉틴9, 및 BCAN, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, BCAT1, IKZF1, NDRG4, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAT1, 및 BCAN, 셉틴9, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, NDRG4, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IKZF1, 및 BCAN, 셉틴9, BCAT1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 BCAN, 셉틴9, BCAT1, PKNOX2, NDRG4, VAV3, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 NDRG4, 셉틴9, 및/또는 BCAT1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 BCAN, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, NDRG4, IRF4, PKNOX2, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 VAV3, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 IRF4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, NDRG4, PKNOX2, VAV3 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 PKNOX2, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, NDRG4, IRF4, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다수의 표적 마커는 NDRG4, 및 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, IRF4, BCAN, POU4F2, PKNOX2, SDC2, TMEFF2, SALL1, SLC24A2, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, ASCL4, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, FGF12, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27)의 추가적 표적 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, PKNOX2, VAV3, IRF4, BCAN, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및/또는 IKZF1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1, 2, 또는 3)의 추가적 표적 마커는 BCAN, VAV3, 및/또는 IRF4를 포함한다.
실시형태
모든 실시예에서 사용되는 생물학적 재료, 다양한 클론 및 발현 플라스미드, 배지 효소, 완충 용액, 및 다양한 배양 방법, 단백질 추출 및 정제 방법, 및 다른 분자 생물학적 작업 방법은 모두 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 보다 상세하게는, 하기 문헌들을 참조한다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" edited by Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor, 1989) 및 "Short Protocols in Molecular Biology" (Frederick M. Ausubel, et al., translated by Yan Ziying et al., Science Press (Beijing), 1998).
실시예 1: 메틸화-특이적 프라이머의 검증
초기 개념 증명을 위해서, 본 발명자는 프라이머/프로브 특이성을 평가하기 위해 바이술파이트-전환된 기준 DNA를 선택하였다. 사용자 맞춤 프라이머/프로브 세트가 28개 표적 마커 (즉, NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, IRF4, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, ASCL4, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, NKX2-6, SLC24A2, 및 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5를 포함한, 5개 유전자가 영역)에 대해 디자인되었다. 개념 증명 실험에서, 본 발명자는 4 ng의 총 투입량으로 완전히 비메틸화된 DNA 중에 모든 CpG 부위에서 완전히 메틸화된 DNA의 혼합물 (10%, 25%, 50%, 100%)을 생성하였다. 표 2에 표시된 서열을 갖는 프라이머 및 프로브를 사용하여, 28개 표적 마커를 삼중으로 이들 혼합물에 대해 평가하였다.
바이술파이트 전환된 완전 메틸화된 DNA 및 바이술파이트 전환된 완전 비메틸화된 DNA는 Qiagen company (EpiTect Control DNA)에서 구입하였고, 혼합하여서 각각 완전 비메틸화된 DNA 중 100%, 50%, 25%, 및 10%의 완전 메틸화된 DNA를 함유하는 혼합된 DNA 조성물을 제공하였고, 여기서 DNA의 총량은 각 혼합된 DNA 조성물 중 4 ng이었다.
혼합된 DNA 조성물은 28개 표적 마커 (즉, NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, IRF4, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, ASCL4, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, NKX2-6, SLC24A2, 및 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5을 포함한, 5개 유전자간 영역)에 특이적인 메틸화-특이적 프라이머 쌍 (표 2 참조) 및 검출 프로브 (표 2 참조)의 존재 하에서 PCR 반응을 통해 증폭시켰다. 대조 마커 ACTB를 또한 메틸화-비특이적 프라이머 (표 2 참조), 및 검출 프로브 (표 2 참조)를 사용한 PCR 반응에서 증폭시켰다. 각각의 28개 표적 마커 및 하나의 대조 마커가 별개 검출 어세이에서 각각 증폭되었다. 상이한 마커에 대한 검출 프로브는 상이한 형광제 (FAM, HEX, VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5) 및 상응하는 소광제 (BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL 또는 TAMRA)로 표지되었다. PCR 반응 시스템에서, 각각의 프라이머는 500 nM의 최종 농도였고, 각각의 검출 프로브는 200 nM의 최종 농도였다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
PCR 반응 시스템은 10 ㎕의 혼합된 DNA 조성물 (4 ng DNA), 상기 기재된 프라이머, 및 프로브를 함유하는 2.5 ㎕의 사전혼합 용액; 및 12.5 ㎕의 PCR 시약 믹스 (Luna® 유니버설 프로브 qPCR 마스터 믹스 (NEB))를 함유하는 것을 제조하였다.
PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분에 이어서, 95℃에서 15초 및 56℃에서 40초의 50 사이클 (이 동안 형광이 검출됨). ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여 상응하는 형광 채널에서 상이한 형광을 검출하였다.
결과
Ct (사이클 한계) 값은 각각의 PCR 반응에 대해 계산되었고 상이한 혼합 DNA 조성물에 의한 각 마커에 대한 PCR 반응의 Ct 값을 분석하였다. 검사된 각 마커에 대해서, PCR 반응에서 사용된 메틸화-특이적 프라이머의 쌍은 혼합 DNA 조성물에서 전환된 메틸화된 DNA의 백분율이 증가함에 따라서 비례적으로 감소되는 Ct 값을 제공한 것으로 확인되었다. 모든 검사된 마커에 대해서, 메틸화된 주형의 백분율은 예상 Ct 값과 높은 상관성 (모든 검사된 마커에 대해서 상관 계수 R>0.9) 및 선형성을 가져서, 표적 마커를 사전-증폭하는데 사용된 프라이머가 메틸화-특이적이었음을 의미한다. 상관성은 도 1B (대조 마커 ACTB에 대해 메틸화-비특이적 프라이머로 수득)에 도시된 중복된 곡선과 비교하여, 도 1A (PKNOX2에 대한 메틸화-특이적 프라이머로 수득)에 도시된 바와 같은 곡선의 수평 이동으로부터 확인할 수 있다. PKNOX2 이외의 다른 마커에 대해 검사된 다른 메틸화-특이적 프라이머의 결과는 도 1A와 유사하였고, 여기에 도시하지는 않았다.
실시예 2: 상이한 조직에서 표적 마커의 메틸화 존재도의 비교
종양 샘플에 대한 선택된 표적 마커의 실현가능성 및 특이성을 검증하기 위해서, 우리는 결장직장암 환자로부터의 결장직장암 조직 (CRC-조직), 후기 선종 조직 (AA-조직), 주변암성 조직 (주변-조직), 및 대조군으로서 결장경검사 음성자의 백혈 세포 (WBC)에서 28개 마커를 검사하였다. 실험 방법은 하기에 상술한다.
표적 마커의 메틸화 존재도는 결장직장 신생물에 대한 진단 또는 스크리닝에서 이들 표적 마커의 잠재성을 조사하기 위해, 상이한 세포 및 조직 유래의 DNA 샘플에서 검출하였다. 이 실시예에서 검사된 표적 마커는 NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, IRF4, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, ASCL4, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, NKX2-6, SLC24A2, 및 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5를 포함한, 5개 유전자간 영역을 포함하였다.
절차는 하기 단계를 포함한다:
1. DNA 샘플은 각각 백혈 세포, 주변암성 조직, 후기 선종 조직, 및 결장직장암 조직에서 수득하였고, 각 유형의 샘플에 대해 10개 생물학적 샘플이었다 (즉, 총 40개 샘플). 백혈 세포 DNA는 Qiagen QIAamp DNA Mini 키트로 추출하였고, 조직 DNA는 공급사의 설명서에 따라 Qiagen QIAamp DNA FFPE 조직 키트로 추출하였다.
2. 상기 단계 1에서 수득된 DNA 샘플은 바이술파이트 시약 (MethylCode™ 바이술파이트 전환 키트)을 처리하여 전환된 DNA를 수득하였다.
3. 형광 PCR을 전환된 DNA에 대해 수행하였다. 간략하게, 단계 2에서 수득된 전환된 DNA는 NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, IRF4, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, ASCL4, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, NKX2-6, SLC24A2, 및 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5을 포함한, 5개 유전자간 영역에 특이적인 메틸화-특이적 프라이머 쌍 (표 2 참조), 및 검출 프로브 (표 2 참조)의 존재 하에서 PCR 반응으로 증폭하였다. 대조 마커 ACTB는 또한 메틸화-비특이적 프라이머 (표 2 참조), 및 검출 프로브 (표 2 참조)를 사용한 PCR 반응으로 증폭하였다. 상이한 마커에 대한 검출 프로브는 상이한 형광으로 표지하였다. PCR 반응 시스템에서, 각 프라이머는 500 nM의 최종 농도였고, 각각의 검출 프로브는 200 nM의 최종 농도였다.
PCR 반응 시스템은 10 ㎕의 전환된 DNA, 상기 기재된 프라이머 및 프로브를 함유하는 2.5 ㎕의 사전혼합된 용액; 및 12.5 ㎕의 PCR 시약 믹스 (Luna® 유니버설 프로브 qPCR 마스터 믹스 (NEB))를 함유하는 것을 제조하였다.
PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분에 이어서, 95℃에서 30초 및 56℃에서 60초의 10 사이클 (이 동안 형광이 검출됨). ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여, 상응하는 형광 채널에서 상이한 형광이 검출되었다.
4. 백혈 세포, 주변암성 조직, 후기 선종 조직, 및 결장직장암 조직에서 수득된 샘플에 대해 Ct 값을 계산, 통합하고, 비교하였다. 미결정된 웰의 Ct 값은 50으로 지정하였다.
결과
결과는 결장경검사 음성자 유래 백혈 세포에서 본 개시내용의 표적 마커 (NDRG4, BCAT1, IKZF1, 셉틴9, SDC2, VAV3, IRF4, TMEFF2, SALL1, BCAN, POU4F2, PKNOX2, ASCL4, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, NKX2-6, SLC24A2, 및 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5을 포함한 5개 유전자간 영역)의 메틸화 존재도가 SALL1 및 PKNOX2를 예로 들면, 결장암 환자로부터의 조직 샘플에 비해서 유의하게 더 낮다 (p < 0.01)는 것을 보여주었다 (도 2 참조). 나머지 검사된 표적 마커 각각에서도 유의한 차이 (p < 0.01)가 관찰되었고, 그 결과는 여기에 도시하지 않았다. 특히, 표적 마커의 메틸화 존재도는 후기 선종 조직 및 결장직장암 조직에 비해서 주변암성 조직에서 더 낮았다. 이것은 검사된 각각의 표적 마커가 백혈 세포 샘플을 사용하여 결장직장 신생물에 대한 진단 및 스크리닝에서 잠재적 적용성을 갖는다는 것을 보여주었다.
실시예 3: 세포-무함유 DNA를 사용한 메틸화된 표적 마커의 정량화
CRC 혈장 샘플에 대한 메틸화된 마커의 임상 성능을 검증하기 위해서, 우리는 본 명세서에 개시된 방법 (또한 사전-증폭 방법이라고도 함)을 사용하여 결장경검사에서 음성인 107개 혈장 대조군 샘플 및 88개 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플에서 13개 마커 (즉, NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1)를 검사하였다. 88개 임상 진단된 CRC 혈장 샘플 중에서, 15개 샘플은 CRC 병기 I로 진단된 대상체 유래였고, 26개 샘플은 CRC 병기 II로 진단된 대상체 유래였으며, 28개 샘플은 CRC 병기 III으로 진단된 대상체 유래였고, 19 개 샘플은 CRC 병기 IV로 진단된 대상체 유래였다.
사전-증폭 방법
사전-증폭 방법은 하기 단계를 포함한다:
1. 세포-무함유 DNA (cfDNA) 샘플은 QIAamp 순환 핵산 키트 (Qiagen)를 사용하여 1-4 mL 혈장 샘플로부터 수득하였다.
2. 바이술파이트 시약 (MethylCode™ 바이술파이트 전환 키트)을 사용한 바이술파이트 전환을 위한 투입량으로 20 ng cfDNA를 사용하여 전환된 cfDNA를 수득하였다.
3. 전환된 cfDNA 샘플을 사전-증폭하였다. 간략하게, 상기 단계 2에서 수득된 전환된 cfDNA는 NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1에 특이적인 메틸화 특이적 프라이머 쌍 (표 2 참조)의 존재 하에서 PCR 반응으로 사전-증폭하였다. PCR 반응 시스템에서, 각 프라이머는 200 nM의 최종 농도였다.
25 ㎕ PCR 믹스는 10 ㎕의 cfDNA, 상기 기재된 프라이머 세트를 함유하는 2.5 ㎕의 사전혼합된 용액, 및 12.5 ㎕의 PCR 시약 믹스 (Luna® 유니버설 프로브 qPCR 마스터 믹스 (NEB))로 구성되었다.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다: ProFlex™ PCR 시스템 (Thermo Fisher)을 사용하여, 95℃에서 3분에 이어서, 95℃에서 30초 및 56℃에서 60초의 8 사이클.
4. 상기 단계 3에서 획득된 생산물을 10배까지 희석한 다음에 NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1에 특이적인, 몇몇 다수의 형광 PCR 검출에 사용하였다.
qPCR 믹스는 10 ㎕의 희석된 단계 3에서 획득된 생산물, 2.5 ㎕ 프라이머/프로브 풀, 12.5 ㎕의 PCR 시약 믹스 (Luna® 유니버설 프로브 qPCR 마스터 믹스 (NEB))로 구성되었다. 비-CpG ACTB 영역이 각 반응 웰에 대한 내부 대조군으로서 사용되었다 (표 2 참조). 상이한 마커에 대한 검출 프로브는 상이한 형광으로 표지하였다. PCR 반응 시스템에서, 각각의 프라이머는 500 nM의 최종 농도였고, 각각의 검출 프로브는 200 nM의 최종 농도였다.
PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분에 이어서, 95℃에서 15초 및 56℃에서 40초의 50 사이클 (이 동안 형광이 검출됨). ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여, 상응하는 형광 채널에서 상이한 형광이 검출되었다.
결과
증폭 신호없는 샘플에 대한 Ct 값은 50으로 설정되었다. 기준 Ct 값은 개별적으로, 각 검사된 마커에 대해 설정되었다. 검사된 마커 중 어느 하나의 Ct 값이 그의 상응하는 기준 Ct 값과 동일하거나 또는 그에 비해 낮으면, 샘플은 양성 샘플로서 분류된다. 도 3은 결장경 검사에서 음성인 개체군 및 CRC를 갖는 개체군에서 표적 마커 SALL1 및 BCAN의 Ct 값 분포를 도시한다. 도 3에서 확인된 바와 같이, CRC를 갖는 개체군에서 표적 마커 SALL1 및 BCAN의 메틸화 수준은 결장경 검사 음성인 개체군에 비해서 유의하게 (p 값 = SALL1 및 BCAN에 대해 각각 2.14E-4 및 1.07E-8) 더 높았다. 다른 표적 마커에 대한 결과는 유사하였고 (p < 0.01), 도시되지 않았다.
하기 표 3은 사전-증폭 방법에서 5개 표적 마커 (즉, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN 및 VAV3)를 사용한 비교 결과를 도시한다. 표 3에 표시된 바와 같이, 사전-증폭 방법은 CRC에 대해 초고감도 (86.4%) 및 결장경검사 음성 개체군에 대해 고특이성 (90.7%)을 보였고, 이것은 예를 들어, 임상 시험 샘플 중 CRC에 대해 48.2%의 감도를 갖는, 기존 상용화된 마커, 예를 들어 셉티9에 비해 매우 월등하였다 (참조: T.R. Church et al., Gut.; 63:317-325 (2014)). 13개 표적 마커 내에서 나머지 마커 조합 (예를 들어, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, 및 NDRG4의 조합; 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, 및 TMEFF2의 조합, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3, BCAN, NDRG4, SDC2, PKNOX2, TMEFF2, 및 유전자간 영역 1의 조합 등)을 분석하였고, 결과는 CRC에 대한 감도가 85% 이상이고, 결장경검사 음성 개체군에 대한 특이성은 90% 이상인 것으로 확인되었다.
Figure pct00016
CRC 분류에서 사전-증폭 방법 및 셉틴9 단독 방법의 감도를 또한 비교하였다. 셉틴9 단독 방법은 표적 마커가 오직 셉틴9인 것을 제외하고, 사전-증폭 방법과 유사하게 수행하였다.
표 4에 표시된 바와 같이, 사전-증폭 방법에서, CRC 병기 I, 병기 II, 병기 III, 및 병기 IV의 감도는 각각 73.3%, 80.8%, 89.3%, 및 100%였다. 대조적으로, 셉틴9 단독 방법에서, CRC 병기 I, 병기 II, 병기 III, 및 병기 IV의 감도는 각각 26.7%, 65.4%, 75.0%, 및 79%였다. 그러므로, 사전-증폭 방법은 셉틴9 단독 방법과 비교하여 감도의 유의한 증가를 보였다.
Figure pct00017
각각의 검사된 표적 마커의 Ct 값은 CRC 샘플에서 메틸화된 카피의 부재 또는 이의 존재를 확인하기 위해 정량화되었다. 대안적으로, 내부 대조군 ACTB에 대한 각 검사된 표적 마커의 델타 Ct 값은 상대적 메틸화 수준을 나타내기 위해 계산되었다. 중요한 것은, 모든 검사된 마커가 0.8 내지 0.9 범위의 AUC로 대조군으로부터 CRC를 분리하는 분류력을 가졌다는 것이다 (도 4에 도시된 바와 같음). 상이한 알고리즘, 예컨대 선형 판별 분석, SVM, 랜덤 포레스트, 선형 회귀, 로지스틱 회귀 등을 사용하여 조기 암 검출의 분류자를 구축하였다. 마커의 상이한 조합을 사용하여 최적 성능을 획득하였다. 조합 중 하나 (SALL1, BCAT1, 및 셉틴9)에 대한 ROC 곡선이 도 5에 도시되었다. 다른 조합에 대한 ROC 곡선은 도 5와 유사하였고, 여기에 도시하지 않았다.
실시예 4: 사전-증폭 방법 및 직접 qPCR 방법 간 LOD 비교
사전-증폭 방법 및 직접 qPCR 방법의 LOD를 비교하기 위해서, 본 발명자는 사전-증폭 방법 및 직접 qPCR 방법 둘 모두를 사용하여 13개 표적 마커 (즉, VAV3, NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1)를 검사하였다. 직접 qPCR 방법은 사전-증폭 단계가 없는 것을 제외하고, 사전-증폭 방법과 동일하게 수행하였다. 각 방법에서, 13개 표적 마커는 동시에 사전-증폭/증폭되었지만, 정량화는 각 표적 마커에 대해 별도로 수행하였다. 표적 마커 VAV3에 대한 사전-증폭 방법 및 직접 qPCR 방법 간 LOD 비교는 하기에 표시하였다. 나머지 12개의 표적 마커에 대한 사전-증폭 방법 및 직접 qPCR 방법 간 LOD 비교는 유사하게 수행하였고, 여기에 도시하지는 않았다.
간략하게, CRC 조직 DNA는 0.5% 및 0.2% 비율로 혈액 세포 DNA에 혼합하였고, 40 ng DNA를 바이술파이트-처리하였으며 (MethylCode™ 바이술파이트 전환 키트), 전환된 DNA 절반을 사전-증폭에 이어서 qPCR (즉, 사전-증폭 방법)에 사용하였고, 나머지 절반의 전환된 DNA는 qPCR에 직접 (즉, 직접 qPCR 방법) 사용하였다. 사전-증폭 단계에서 최종 프라이머 농도는 50 nM이었다. 25 ㎕ PCR 믹스는 10 ㎕의 전환된 DNA, 상기 기재된 프라이머를 함유하는 2.5 ㎕의 사전믹스된 용액; 및 12.5 ㎕의 PCR 시약 믹스 (Luna® 유니버설 프로브 qPCR 마스터 믹스 (NEB))로 구성되었다. PCR 프로그램은 95℃에서 3분에 이어서, 95℃에서 30초 및 56℃에서 60초의 8 사이클이었다. 사전-증폭 단계 후에 획득된 생산물은 10배로 희석하였고 qPCR에 사용하였다. qPCR 믹스는 10 ㎕ 주형 DNA, 2.5 ㎕ 프라이머/프로브 풀 및 12.5 ㎕의 LUNA 마스터 믹스로 구성되었다. qPCR 프로그램은 95℃에서 5분에 이어서, 95℃에서 15초 및 56℃에서 40초의 50 사이클 (이 동안 형광이 검출됨)로, ABI 7500 실시간 PCR 시스템 상에서 실행하였다. 4개 복제물을 동시에 수행하였다. 결과는 하기 표 5에 표시되었다.
Figure pct00018
표 5에 표시된 바와 같이, 직접 qPCR 방법과 비교하여, 사전-증폭 방법은 개선된 LOD (0.50% 대 0.20% CRC DNA 백분율), 안정성, 및 더 높은 검출 감도를 보였다. 나머지 12개의 표적 마커 (즉, NDRG4, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2 및 유전자간 영역 1)에 대한 사전-증폭 방법은 직접 qPCR 방법에 비해서 더 양호하거나 또는 나쁘지 않은 결과를 보였고, 그 결과는 여기에 도시하지 않았다.
실시예 5: 세포-무함유 DNA를 사용한 메틸화된 표적 마커의 정량화, 및 사전-증폭 방법 없음과 비교.
CRC 혈장 샘플에 대한 메틸화된 마커의 임상 성능을 검증하기 위해서, 우리는 사전-증폭 방법 및 사전-증폭 방법 없음을 사용하여 32개 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 및 결장경검사에서 음성인 29 개 혈장 대조군 샘플에서 5개 마커 (셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3)를 검사하였다. 사전-증폭 방법 없음은 사전-증폭 단계 및 희석 단계가 부재하는 것을 제외하고, 사전-증폭 방법과 유사하게 수행하였다. 32개 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 중에서, 2개 샘플은 CRC 병기 I로 진단된 대상체 유래였고, 9 개 샘플은 CRC 병기 II로 진단된 대상체 유래였으며, 13개 샘플은 CRC 병기 III으로 진단된 대상체 유래였고, 5개 샘플은 CRC 병기 IV으로 진단된 대상체 유래였고, 3개 샘플은 미지 병기였다.
실험은 하기 단계를 포함하였다:
1. 세포-무함유 DNA (cfDNA) 샘플은 QIAamp 순환 핵산 키트 (Qiagen)를 사용하여 3-5 mL 혈장 샘플에서 수득하였다.
2. DNA가 40 ng 미만이었으면, cfDNA는 2개 부분으로 나누었고 바이술파이트 시약 (MethylCode™ 바이술파이트 전환 키트)을 사용한 바이술파이트 전환을 위한 투입물로서 사용하여서, 하나는 사전-증폭 방법을 위한 10 ㎕ 용출액, 나머지 하나는 20 ㎕ 용출액으로서, 2개의 동시 반응으로, 전환된 cfDNA를 수득하였다. DNA가 40 ng 초과이면, 20 ng cfDNA를 2개 반응에 사용하였고, 용출 과정은 상기와 동일하였다.
3. 사전-증폭 방법 경우에, 1개 반응 (10 ㎕ 용출액) 중 전환된 cfDNA를 사전-증폭하였다. 간략하게, 상기 단계 2에서 수득된 전환된 cfDNA 샘플은 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3에 특이적인, 메틸화-특이적 프라이머 쌍 (표 2 참조)의 존재 하에서 PCR 반응을 통해 사전-증폭시켰다. PCR 반응 시스템에서, 각각의 프라이머는 200 nM의 최종 농도였다. 사전-증폭 프로그램, 희석 및 qPCR 어세이는 실시예 3과 동일하였다.
4. 사전-증폭 방법 없음 경우에, 나머지 반응 (20 ㎕ 용출액)의 전환된 cfDNA 샘플을 2개의 상이한 웰에서 qPCR 어세이에 사용하였는데, 각 웰은 10 ㎕의 전환된 DNA가 존재하였다. qPCR 믹스 및 프로그램은 사전-증폭 방법과 동일하였다.
5. 비-CpG ACTB 영역이 각 반응 웰에 대한 내부 표준으로서 사용되었다 (표 2 참조). 상이한 마커에 대한 검출 프로브는 상이한 형광으로 표지되었다. PCR 반응 시스템에서, 각각의 프라이머는 500 nM의 최종 농도였고, 각각의 검출 프로브는 200 nM의 최종 농도였다.
결과
Ct 값은 증폭 신호없는 샘플에 대해 50으로 설정하였다. 기준 Ct 값은 개별적으로 각 검사된 마커에 대해 설정되었다. 검사된 마커 중 어느 하나의 Ct 값이 그의 상응하는 기준 Ct 값과 동일하거나 또는 그에 비해 낮으면, 샘플은 양성 샘플로서 분류된다.
하기 표 6은 사전-증폭 방법 및 사전-증폭 방법 없음에서 5개 표적 마커 (셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN 및 VAV3)를 사용한 비교 결과를 표시한다. 표 6에 표시된 바와 같이, 사전-증폭 방법은 CRC에 대해 초고 감도 (96.9%) 및 결장경검사 음성 개체군에 대해 고 특이성 (93.1%)을 보였고, 사전-증폭 방법 없음에 대한 감도 및 특이성은 각각 84.4% 및 93.1%였다. 사전-증폭 방법 없음의 감도는 또한 셉틴9 단독 방법에 비해서 훨씬 더 높았다.
Figure pct00019
CRC 혈장 샘플에 대한 메틸화된 마커의 임상 성능을 검증하기 위해서, 우리는 상기 기술된 바와 같이 사전-증폭 방법 및 사전-증폭 방법 없음을 사용하여 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 및 결장경검사 음성 혈장 대조군 샘플에서 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커의 임의의 조합을 포함한, 더 많은 마커를 검사하였다. 예를 들어, 하기 조합 중 어느 하나가 검사된다: (1) 셉틴9, (2) 셉틴9, BCAT1; (3) 셉틴9 및 IKZF1; (4) 셉틴9 및 NDRG4; (5) 셉틴9 및 BCAN; (6) 셉틴9 및 VAV3; (7) 셉틴9 및 IRF4; (8) BCAT1 및 IKZF1; (9) BCAT1 및 NDRG4; (10) BCAT1 및 BCAN; (11) BCAT1 및 VAV3; (12) BCAT1 및 IRF4; (13) IKZF1 및 NDRG4; (14) IKZF1 및 BCAN; (15) IKZF1 및 VAV3; (16) IKZF1 및 IRF4; (17) NDRG4 및 BCAN; (18) NDRG4 및 VAV3; (19) NDRG4 및 IRF4; (20) BCAN 및 VAV3; (21) BCAN 및 IRF4; (22) VAV3 및 IRF4; (23) 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1; (24) BCAT1, IKZF1, 및 NDRG4; (25) IKZF1, NDRG4, 및 BCAN; (26) NDRG4, BCAN, 및 VAV3; (27) BCAN, VAV3, 및 IRF4; (28) 셉틴9, BCAT1, 및 NDRG4; (29) 셉틴9, BCAT1, 및 BCAN; (30) 셉틴9, BCAT1, 및 VAV3; (31) 셉틴9, BCAT1, 및 IRF4; (32) BCAT1, IKZF1, 및 BCAN; (33) BCAT1, IKZF1, 및 VAV3; (34) BCAT1, IKZF1, 및 IRF4.
실시예 6: 세포-무함유 DNA를 사용한 CRC 메틸화된 표적 마커 (셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3 및 IRF4)의 정량화에 의한 CRC 검출.
더 많은 마커 조합의 임상 성능을 평가하기 위해서, 우리는 본 명세서에 개시된 방법 (또한 사전-증폭 방법이라고도 함)을 사용하여 286개 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 및 112개 결장경검사 음성 혈장 대조군 샘플에서 5개 마커 (셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3 및 IRF4)를 검사하였다. 286개 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 중에, 48개 샘플은 CRC 병기 I로 진단된 대상체 유래이고, 113개 샘플은 CRC 병기 II로 진단된 대상체 유래이고, 107개 샘플은 CRC 병기 III으로 진단된 대상체 유래이고, 18개 샘플은 CRC 병기 IV로 진단된 대상체 유래였다.
실험 방법은 실시예 3과 유사하였다.
결과
Ct 값은 증폭 신호없는 샘플에 대해 50으로 설정되었다. 기준 Ct 값은 개별적으로 각 검사 마커에 대해 검사된 마커 중 어느 하나의 Ct 값이 그의 상응하는 기준 Ct 값과 동일하거나 또는 그에 비해 낮으면, 샘플은 양성 샘플로 분류된다.
표 7에 표시된 바와 같이, 사전-증폭 방법 (CRC 메틸화된 마커 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3 및 IRF4의 정량화)은 CRC에 대해 초고 감도 (84.3%) 및 결장경검사 음성 개체군에 대해 고 특이성 (90.3%)을 보였다.
Figure pct00020
표 8에 표시된 바와 같이, 사전-증폭 방법 (CRC 메틸화된 마커 셉틴9, BCAT1, IKZF1, VAV3 및 IRF4의 정량화)에서, CRC 병기 I, 병기 II, 병기 III, 및 병기 IV의 감도는 각각 62.5%, 85.8%, 88.8%, 및 100%였다.
Figure pct00021
더 많은 마커 조합의 임상 성능을 평가하기 위해서, 우리는 상기 개시된 방법을 사용하여 임상적으로 진단된 CRC 혈장 샘플 및 결장경검사 음성 혈장 대조군 샘플에서 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커의 임의의 조합을 포함한, 더 많은 마커를 검사하였다. 예를 들어, 하기 조합 중 어느 하나가 검사된다: (1) 셉틴9, (2) 셉틴9, BCAT1; (3) 셉틴9 및 IKZF1; (4) 셉틴9 및 NDRG4; (5) 셉틴9 및 BCAN; (6) 셉틴9 및 VAV3; (7) 셉틴9 및 IRF4; (8) BCAT1 및 IKZF1; (9) BCAT1 및 NDRG4; (10) BCAT1 및 BCAN; (11) BCAT1 및 VAV3; (12) BCAT1 및 IRF4; (13) IKZF1 및 NDRG4; (14) IKZF1 및 BCAN; (15) IKZF1 및 VAV3; (16) IKZF1 및 IRF4; (17) NDRG4 및 BCAN; (18) NDRG4 및 VAV3; (19) NDRG4 및 IRF4; (20) BCAN 및 VAV3; (21) BCAN 및 IRF4; (22) VAV3 및 IRF4; (23) 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1; (24) BCAT1, IKZF1, 및 NDRG4; (25) IKZF1, NDRG4, 및 BCAN; (26) NDRG4, BCAN, 및 VAV3; (27) BCAN, VAV3, 및 IRF4; (28) 셉틴9, BCAT1, 및 NDRG4; (29) 셉틴9, BCAT1, 및 BCAN; (30) 셉틴9, BCAT1, 및 VAV3; (31) 셉틴9, BCAT1, 및 IRF4; (32) BCAT1, IKZF1, 및 BCAN; (33) BCAT1, IKZF1, 및 VAV3; (34) BCAT1, IKZF1, 및 IRF4.
SEQUENCE LISTING <110> SINGLERA HEALTH TECHNOLOGIES (SHANGHAI) LTD. <120> METHODS AND KITS FOR SCREENING COLORECTAL NEOPLASM <130> 071918-8008WO03 <160> 172 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caacgcaccc aacaca 16 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gcggagtttg gggga 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tacgtggcgg gttgg 15 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 aaaaaaacaa ccttaatatc ttc 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gtttttttgg ttcggagttg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 caaaacgaaa cacgaaaaaa ata 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gtagttggat gggattattt 20 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 cacccgcaaa atcctct 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 ggagtgtaga aattaataag 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 ctcgcttcct cctcctac 18 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 cggagtcgag tttag 15 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 accgccgacc cttt 14 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gtaatattta gggattggg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 ctccttataa caacaacttc 20 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 gagggtgggt ttggtaa 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 gatataaaaa caaccctcca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 gggaagaaag ggggttttgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 tacgacgaaa actacgcgaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 aacatccgtt caaactaaca 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 ggttgtgcga agttgag 17 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gttttaggag ttatttgggt ttgc 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 actataacac ctcgctacta acgct 25 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 tttttgaaag tttgagaaaa tgt 23 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 ccgacgcctc taccaa 16 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 ttgttggagy gttaggtttg g 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 ccraaaaaac cttaaactcc cc 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 ttatttcggg gaaggttacg 20 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 gcgaaaacga aatcataaaa taaac 25 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 cgagtcgagt ttgggt 16 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 acctccgaaa caaaatcta 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 tgttagagtt tattgggatg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gaaaaccgaa tctcaaacac 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 atacgggaga aagagtacgt ta 22 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 aacgtaaccg tacaacctaa acg 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 tagttttcgg agaagacggc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ctataaccct acgatcgcct 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 agggagttta atagcgatcg agt 23 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tttactaaac accccgaaaa c 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 aggtcggttt ttatatggtg 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 tcgatataac tactccaaat c 21 <210> 41 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 gggagggggt agtagg 16 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgctcattta atttaaattt atttc 25 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 gggcgcgata gtttgag 17 <210> 44 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 cccgcgccct ttcc 14 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 ggggcgcggt tttttta 17 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 ctaaactacg ctaaattcct 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 agggatttag gttaggggtc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 acgacatcct tcaaaccgac 20 <210> 49 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 aggttcgggt gaggag 16 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 aaacgtctat cccaaaactt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 agttaaaagt aagggtagga 20 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 ccccgctaaa aattaacca 19 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 ggtcgggttg agattgg 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 ggtggggttg agattgg 17 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 gtgatggagg aggtttagta agtt 24 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 gtcgattcgc gttttcgtcg 20 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 tcggtttttt cgcggcg 17 <210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 cgccccgtcg ccgaat 16 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 ttgttgcggt cgcggacg 18 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 agggcgtcgc gttttcggg 19 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 tttcgatttc gcgcgggg 18 <210> 63 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 tgcgccggag acgcg 15 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 cgcgttcgag ttaagagtcg cg 22 <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 cgtcgggagg gtcgg 15 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 cgtcgtcgtt ttcggatttt gtacg 25 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 cggtggttcg taggggtcgc g 21 <210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 cgtagcgcgg cgggg 15 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 ttcgttattt gggtcgcggg 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 cgacgccgac cgcgccctcg 20 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 tcggacgcgt tttcggg 17 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 cgcgtagtta tcgttagacg gcg 23 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 tcgaaaagac gcgtggtttc gt 22 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 ggttacgcgg cgcgtgg 17 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 tcgtggtagc gttacgcga 19 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 agacgggcgt tttttgtgcg a 21 <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 tcgttaatta gtatcgcgac ga 22 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 agtcggtcga ggttttcgt 19 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 tgttttgggc gcgttcga 18 <210> 80 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 cgcgttcggg gcgt 14 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 ttcgtttcgg ggcgggg 17 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 cgttttgtcg ttgtaggttt cgt 23 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 cgggggtttt aaatttacgt ttcg 24 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 cggtttttgt cggggtgcgg 20 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30 <210> 86 <211> 7316 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gcactgttct gcttttcact gttaatccaa cctgctccca aacatcaccc ctcctccgca 60 gagtgctgaa gatgaagaga gcccagcggc acaggggacc cagagcttgc ccttctgctg 120 actcagtagt gactccgctg cctgtcatga ctgatgtttc cagaagggtc agggcctcct 180 caacctacct cttccttatg cacctttgtt tgatgcaata gccctgggga ctctcacgat 240 tacgtttctt cttcatctat tgtctccact tttatttatt tatttatgta ttttttagac 300 tctatcaccc aggctggagt gcagcagcgc gatctcggct cactgcaacg tccgcctcct 360 gggttcaagt gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct aggattacag gtatgtgcac 420 cacgcccagt taatttttgt atttttagta gagatggggt ttcaccatgt tggccaggct 480 ggtcttgaac tcctgacctc aggtgatcca cccacctcgg cccccaaatg tgctgggatt 540 acaggcatga gccaccgcgc ccggccctac tgtctccact tttaggagtt caaatccaca 600 acctgactca ctggaatgct cacaggagtt catgaactat ctgagctaca tggatagtct 660 gcatgagttc aaggccactg cagacaccat gtctcagaca ggcgtgtcat agtgtcaaag 720 ctcctgttag gcagcctgca gaacagccta ggccccgtga attatgtcac tagaacatca 780 acaattaatt ttgtccaatg acaaagtctg aaatgactga aaagggtagg actcaggtaa 840 gcctgaaaga atctctcatg cgataataac aatttcatca tgaataataa taatgaccat 900 gtattgaaca cttaaactta agtcatgcgt ctggcactat attaagcatt ttctttatat 960 tctgttattt aatctttaca ggaatcctga ggtcagcatc atcccaattt cacagagtat 1020 gacatgacgt ctcagagagg gtaagcagct tgccaaacat tccacagcca ggaagctgta 1080 ggaccagcct gtgctcctaa ggactggctc ctggctgcta tatatagaac taagcctggt 1140 ggaggtgtca gaaatagagg ttcacttctg tcatcaccga cctccctcca cacctttgca 1200 aaggaggaaa ctgagaggca gggatttccg cagagcaagg aacccaaatt gctgcctcct 1260 gtgatttata cactgcaccc caagctgtag gggtaaccca aggacaaagc tgtaacccaa 1320 gcgggaacat atgccccatc tggggccacc aaaatcttac cagcttcctc agctggtgga 1380 tcggttaatt cacggccaca gccccctgga gctgggggaa aggaaaacca gggcgtctcc 1440 gcaaaccagc ccagagagag gtctgcggaa gggcccggaa gcctgcaggc ccctctgcac 1500 ccccaacccc accgccatcc tggacctcca agatgacctg gtccaacaga gtcctgcatg 1560 gaaaagactg gaacccaggg aggagcagag ccccgcccaa ggtcaccggc cgagcctgaa 1620 tagaacccgg ttctccagga gccctgtctt tagctgtctt gtccaaataa aatttttcag 1680 gccatcagat ttccgtactc cctggagtgg gacttcatct gggaccaaag gagggctggt 1740 gaggggagtg gcaggaggga ggagtgcctc ggggccccga gcaggatgag cctgaggaag 1800 agacgggtcc ccatgttccc tttcccgctc agataatgga ggtgaattga ggggagcaga 1860 gacctcccca ccttcagggt gggaccctga gggaccagga cacctttgct aggggatgtc 1920 cctcctcact cctgcacaag ttcctcaagg acaccctcgg gctccgaaaa cggggggagg 1980 gggacgacgc cccagaggcc cctgagcccc tggttcttcc cgaccctaag ggcttttctc 2040 cctcggttcc 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caccgcgacg cccggaggcg gcggggtctc tttgttcggg cggcgggcac 2940 gggggaccac ctcccacggt gtcaccgcac ccaccccgcg cccttcctcc gcctcctgga 3000 gttcaccggg accaggtggc ggcgggtgcc tttttggggg tgcgcggcca tgcaattggt 3060 ggattttttt aaaccgtttt ggagggggga gcgcggcgtt gggggcggga gagcgctcct 3120 ggctgtgagc tgctcctgcc gcttcgctcc gcgctctcct gccgctccgc tccgggtctc 3180 ccgcgctcct ctccccggct cggccgagcg cgctgccccg acgccgccac ccagagccgg 3240 gccgcgccgg gcgccgagat gaaggtgctg ggacaccggc tggagctgct cacaggtacc 3300 gcccgcctgc cccgcagccg gccgccactt tccgagttgg agcggactcc gggcgcggcg 3360 gccggggact ggggcggctc gggtctgagc aggaaggggt gcggacccca actaagtcct 3420 agttttgtgc tacctgtttg tgtgcggagc ccagccccgg gagaggactt gaggttgtgg 3480 cgagtccctg gcgctggcgt ccgggctgcg ggagcaccgg tcagggggtg gccccatggg 3540 gtctctgacc agcggagctc ggattaggac cctgaaagct agctcagggc tcctgccctc 3600 caatcagtgt cgcttgtccc ctaagaaagg acccgtgggc ttctggcagg acccgcgcca 3660 tggacctctt atttctgcgc cctgtgacaa tctgagccgt ctttctctgg gggagaagtt 3720 tcttgctggg 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<211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 172 atcgtacgta aggttcggag cga 23

Claims (78)

  1. 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
    (II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 표적 마커는 셉틴9(Septin9), BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역(INTERGENIC REGION) 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (I). 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
    (II). 단계 (I)의 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계로서, 적어도 2개의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 2개의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (III). 단계 (II)에서 정량화된 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 이어서, 표적 마커 세트는 4, 5, 6, 7, 8, 9 개 또는 그 초과의 표적 마커를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (II)는
    (i) 단계 (I)에서 수득된 처리된 DNA 내의 표적 마커 세트의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 표적 마커 세트는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (ii) 상기 하위 단계 (i)로부터 획득된 DNA 내의 표적 마커 세트의 개별 메틸화 수준을 정량화하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (I) 전에 대상체 유래 생물학적 샘플로부터 DNA를 수득하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (a). 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b). 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
    (c). 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커(들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하며; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
    (d). 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
    (e). 단계 (d)로부터의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 상응하는 기준 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 그의 상응하는 기준 수준에 비해서 동일하거나 더 높은 메틸화 수준은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 또는 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  7. 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법으로서, 하기 단계:
    (a). 대상체로부터 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b). 단계 (a)로부터 수득된 생물학적 샘플 중 DNA를, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약으로 처리하여, 처리된 DNA를 수득하는 단계;
    (c). 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 일부분을, 사전-증폭 프라이머 풀을 사용하여 사전-증폭하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커(들)의 적어도 일부분이 사전-증폭되고, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하며; 단계 (c)는 존재하거나 또는 부재하는 것인 단계;
    (d). 단계 (c)가 존재하면, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 기반으로 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 개별적으로 정량화하는 단계로서, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단계; 및
    (e). 단계 (d)로부터의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 각각, 치료전 대상체로부터 수득된 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 대해서 단계 (a), 단계 (b), 임의로 단계 (c), 및 단계 (d)를 반복함으로써 정량화된 치료 전 동일 대상체로부터 수득된 하나 이상의 표적 마커(들)의 상응하는 메틸화 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 표적 마커(들)의, 치료 전 그의 상응하는 메틸화 수준에 비해서 더 낮은 메틸화 수준은, 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 Hg19 좌표로 정의되는 각각의 영역, 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트(bisulfite) 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00022

    Figure pct00023
    .
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, DNA는 게놈 DNA 또는 세포-무함유 DNA를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포-무함유 DNA는 순환 종양 DNA를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 1 ng, 0.8 ng, 0.6 ng, 0.4 ng, 0.2 ng, 0.1 ng, 0.08 ng 이하 또는 0.04 ng 이하의 양으로 생물학적 샘플에 존재하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포-무함유 DNA 중 표적 마커는 표적 마커에 대한 검출 어세이의 감도 수준 미만의 농도로 생물학적 샘플에 존재하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하위 단계 (i) 또는 단계 (c)로부터 획득된 DNA는 하위 단계 (ii) 또는 단계 (d) 전에 희석제로 희석되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 조직 절편, 생검, 파라핀-포매 조직, 체액, 결장 삼출액, 수술 절제 샘플, 단리된 혈액 세포, 혈액 단리 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 체액은 전체 혈액, 혈액 혈청, 혈액 혈장, 소변, 점액, 타액, 복막액, 흉막액, 흉부액, 활액, 뇌척수액, 흉막천자액, 복수, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체의 혈액 혈장으로부터 수득되는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 결장 삼출액은 분변 샘플 및 관장 세척 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은, CpG 부위(들)에 비메틸화된 시토신 잔기(들)를 선택적으로 변형시켜서 변형된 잔기(들)를 생성시키지만, 메틸화된 시토신 잔기(들)는 유의하게 변형시키지 않는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 시약은 바이술파이트 시약을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 시약은, 비메틸화된 경우에는 잔기를 선택적으로 절단하지만 메틸화된 경우에는 잔기를 절단하지 않거나, 또는 메틸화된 경우에는 잔기를 선택적으로 절단하지만 비메틸화된 경우에는 잔기를 절단하지 않는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 시약은 메틸화 감응성 제한 효소(MSRE)인 방법.
  27. 제26항에 있어서, MSRE은 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제4항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 사전-증폭 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 표적 마커(들) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 표적 마커(들) 중 하나의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpG 부위를 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 사전-증폭 프라이머 풀은 대조 마커를 증폭하기 위한 대조 프라이머 쌍을 더 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것인 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 표적 마커는 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드 존재 하에서 증폭되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 정량화는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)(예를 들어, 실시간 PCR, 디지탈 PCR), 핵산 시퀀싱, 질량-기반 분리 (예를 들어, 전기영동, 질량 분광법), 또는 표적 포획(예를 들어, 혼성화, 마이크로어레이)에 의해 수행되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 정량화는 실시간 PCR에 의해 수행되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 실시간 PCR은 다중복합 실시간 PCR인 방법.
  37. 제6항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용하여 증폭하는 것을 포함하고, 획득된 DNA의 적어도 일부분이 증폭되며; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 정량화 프라이머 쌍(들) 및 DNA 중합효소를 사용하여 증폭하는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (c)로부터 획득된 DNA의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 적어도 하나의 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (c)의 사전-증폭 프라이머 풀 중 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍(들)과 동일한 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 내의 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인되고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)에서 사용되는 정량화 프라이머 쌍(들)은, 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 내의 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인되는 것인 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)는 검출제의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 형광 프로브는 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료(예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표지되고, 그의 3' 말단에서 소광제(quencher)(예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL 또는 TAMRA)로 표지되는 것인 방법.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (d)의 표적 마커(들)의 Ct 값(들)을 기준 Ct 값과 비교하는 것을 포함하고, 적어도 하나의 표적 마커의, 그의 상응하는 기준 Ct 값에 비해서 동일하거나 더 낮은 Ct 값은, 대상체가 결장직장 신생물을 갖거나, 결장직장 신생물이 발생되거나 발생될 위험성이 있거나, 또는 결장직장 신생물이 발달되거나 발달될 확률이 증가되거나, 또는 결장직장 신생물의 불량한 예후 또는 불량한 예후의 위험성을 갖는다는 것을 나타내거나; 또는 적어도 하나의 표적 마커의, 치료 전 그의 상응하는 Ct 값에 비해서 더 높은 Ct 값은, 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체가 치료에 반응성임을 나타내는 것인 방법.
  46. 제4항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 사전-증폭은 5 내지 30 사이클의 반응을 포함하고, 각 사이클은 40℃∼80℃에서 5초 내지 5분의 반응 전에 85℃∼99℃에서 5초 내지 5분의 반응을 포함하는 것인 방법.
  47. 제6항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중 다수의 CpG 디뉴클레오티드, TpG 디뉴클레오티드, 또는 CpA 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA 중 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함하고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커 중 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드의 존재 또는 수준을 기반으로 시토신 잔기(들)의 메틸화 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  49. 제6항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 존재하면, 단계 (d)의 정량화는, 단계 (c)로부터 획득된 DNA를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행되고; 단계 (c)가 부재하면, 단계 (d)의 정량화는 단계 (b)로부터 수득된 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커를 다수의 분획으로 분할함으로써 수행되는 것인 방법.
  50. 제6항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 기준 수준은, 결장직장 신생물을 갖거나 또는 가질 위험성이 있는 개체의 그룹 및 결장직장 신생물을 갖지 않거나 또는 가질 위험성이 없는 개체의 그룹으로부터 수득된 임상 샘플을 기반으로 결정되는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장 신생물은 결장직장암, 거대 결장직장 선종, 및/또는 무경성 톱니상 용종인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장 신생물은 전암성인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  54. 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한 키트로서,
    (a). DNA를 처리하기 위한 제1 시약으로서, DNA에서 비메틸화 부위와 메틸화 부위를 구별할 수 있는 것인 제1 시약;
    (b). 임의로, 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 마커 중 적어도 하나의 표적 서열을 사전-증폭하기 위한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 제1 프라이머 풀로서, 적어도 하나의 프라이머 쌍은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 표적 서열은 적어도 하나의 CpG 부위를 포함하는 제1 프라이머 풀; 및
    (c). 제2 시약으로서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 메틸화 수준을 정량화하기 위한 것이며, 적어도 하나의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, IKZF1, BCAN, VAV3, IRF4, POU4F2, SALL1, PKNOX2, SDC2, ASCL4, TMEFF2, SLC24A2, NDRG4, NKX2-6, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, CRHBP, 유전자간 영역 1, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, 유전자간 영역 4, 및 유전자간 영역 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 제2 시약
    을 포함하는, 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한 키트.
  55. 제54항에 있어서, 적어도 하나의 표적 마커는 다수의 표적 마커를 포함하고, 다수의 표적 마커는 셉틴9, BCAT1, 및 IKZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 마커를 포함하는 것인 키트.
  56. 제55항에 있어서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제2 프라이머 풀을 포함하고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제2 시약은 엄격 조건, 중등도 엄격 조건, 또는 고도 엄격 조건 하에서, 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열의 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 다수의 정량화 프라이머 쌍을 포함하는 제3 프라이머 풀을 포함하는 것인 키트.
  57. 제56항에 있어서, 제2 프라이머 풀 중 적어도 하나의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일한 것인 키트.
  58. 제56항에 있어서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제2 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 프라이머 풀에 의해 사전-증폭된 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인되고; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀의 정량화 프라이머 쌍은 제1 시약으로 처리된 DNA 내의 적어도 하나의 표적 마커의 적어도 하나의 표적 서열 내 적어도 일부분을 증폭하도록 디자인되는 것인 키트.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제3 프라이머 풀은 적어도 하나의 메틸화-특이적 프라이머 쌍을 포함하는 것인 키트.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 풀 및 제2 프라이머 풀은 단일 용기 또는 별개 용기에 포장되는 것인 키트.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 차단제 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 키트.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 검출제를 더 포함하는 키트.
  63. 제62항에 있어서, 검출제는 형광 프로브, 인터컬레이팅 염료, 발색단-표지된 프로브, 방사성동위원소-표지된 프로브, 및 바이오틴-표지된 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  64. 제63항에 있어서, 형광 프로브는 서열번호 57-85, 172로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 형광 프로브는 그의 5' 말단에서 형광 염료(예를 들어, FAM, HEX/VIC, TAMRA, Texas Red, 또는 Cy5)로 표지되고, 그의 3' 말단에서 소광제(예를 들어, BHQ1, BHQ2, BHQ3, DABCYL, TAMRA 또는 lowa Black Dark Quenchers)로 표지되는 것인 키트.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 중합효소 및/또는 대상체 유래 생물학적 샘플을 함유하기에 적합한 용기를 더 포함하는 키트.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 및/또는 키트 결과의 해석을 위한 설명서를 더 포함하는 키트.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시약은 바이술파이트 시약 또는 메틸화 감응성 제한 효소(MSRE)를 포함하는 것인 키트.
  69. 제68항에 있어서, 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 나트륨 바이술파이트, 칼륨 바이술파이트, 칼슘 바이술파이트, 마그네슘 바이술파이트, 알루미늄 바이술파이트, 아황산수소 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  70. 제68항에 있어서, MSRE는 HpaII, SalI, SalI-HF®, ScrFI, BbeI, NotI, SmaI, XmaI, MboI, BstBI, ClaI, MluI, NaeI, NarI, PvuI, SacII, HhaI 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 표적 마커는 BCAN, PKNOX2, VAV3, NDRG4, 및 IRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함하는 것인 키트.
  72. 제71항에 있어서, 다수의 표적 마커는 POU4F2, SALL1, SDC2, ASCL4, 유전자간 영역 1, TMEFF2, 유전자간 영역 4, NKX2-6, 유전자간 영역 5, SLC24A2, 유전자간 영역 2, 유전자간 영역 3, KCNA6, SOX1, HS3ST2, FGF12, KCTD8, HMX1, MARCH11, 및 CRHBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커를 더 포함하는 것인 키트.
  73. 제54항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적 마커는 a) 하기 기재된 Hg19 좌표로 정의되는 각각의 영역, 및 각각의 출발 부위의 상류 5 kb 및 상기 기술된 각 영역의 각각의 말단 부위의 하류 5 kb, 또는 b) a)의 바이술파이트 전환된 대응물, 또는 c) a)의 MSRE 처리된 대응물이거나 또는 그를 포함하는 것인 키트:
    Figure pct00024

    Figure pct00025
    .
  74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 풀이 존재하면, 제1 프라이머 풀은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하고, 임의로, 제2 프라이머 풀은 제1 프라이머 풀 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과 동일한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하며; 제1 프라이머 풀이 부재하면, 제3 프라이머 풀은 서열번호 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24, 25/26, 27/28, 29/30, 31/32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 41/42, 43/44, 45/46, 47/48, 49/50, 51/52, 53/54, 및 170/171로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 쌍을 포함하거나 또는 그로 이루어진 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 것인 키트.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 풀, 제2 프라이머 풀, 또는 임의로 제3 프라이머 풀은 대조 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 더 포함하는 것인 키트.
  76. 제75항에 있어서, 대조 마커는 ACTB, GAPDH, 튜불린, ALDOA, PGK1, LDHA, RPS27A, RPL19, RPL11, ARHGDIA, RPL32, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  77. 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 풀의 분획을 각각 수용하기 위한 다수의 용기를 더 포함하는 키트.
  78. 대상체에서 결장직장 신생물의 진단, 결장직장 신생물의 발생 또는 발생 위험성에 대한 스크리닝, 또는 결장직장 신생물의 발달 또는 예후의 평가를 위한, 또는 결장직장 신생물의 치료를 받은 대상체에서 치료 반응의 모니터링을 위한 진단 키트의 제조에서의 제54항 내지 제77항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
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