TW202144586A - 篩查結直腸瘤的方法和試劑盒 - Google Patents

篩查結直腸瘤的方法和試劑盒 Download PDF

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Abstract

本申請關於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，以及在所述方法中使用的試劑盒。

Description

篩查結直腸瘤的方法和試劑盒
本申請總體上關於生物醫學領域。具體來說，本申請關於一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，以及在所述方法中使用的試劑盒。
在癌變前的腺瘤晚期或癌症早期對結直腸瘤進行早期檢測表明可以顯著降低患者的死亡率。當前的結直腸瘤篩查手段包括結腸鏡檢查或對糞便、血液樣品的分子檢查，這些篩查手段都是侵入性的或只有極少的標記物，限制了患者對癌症篩查的配合度或檢測靈敏度。
因此，亟需開發一種方法和/或試劑盒，其可以從生物樣品中數量極為有限的細胞外游離DNA高效地讀取表觀遺傳學資訊，而且可以在醫院檢驗科裡很容易地配置並可以可靠地應用。
在一個方面，本申請提供了一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中所述目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5； 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在另一方面，本申請提供了一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中至少兩個目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4，並且至少兩個目標標記物選自下組：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP，並且 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在一些實施方式中，本申請中所述的一組目標標記物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多個目標標記物。
在一些實施方式中，本申請中所述的步驟（II）包括： 用預擴增引子庫預擴增從步驟（I）獲得的所述經處理的DNA中的一組目標標記物中的至少一個目標標記物的至少一部分，並且所述一組目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別定量分析從所述子步驟（i）獲取的DNA中所述一組目標標記物的甲基化含量。
在一些實施方式中，本申請所述的方法進一步包括在所述步驟（I）之前從來自個體的生物樣品中獲得DNA。
在另一方面，本申請提供了一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理從步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在一些實施方式中，上述方法的步驟（c）或步驟（d）中所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
在另一方面，本申請提供了一種在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a）、步驟（b）、可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
在一些實施方式中，上述方法的步驟（c）或步驟（d）中所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
在一些實施方式中，所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，所述各個目標標記物包含或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域：
目標標記物 Hg19 座標
NDRG4 chr16:58496750-58547532
BCAT1 chr12:24964295-25102393
IKZF1 chr7:50343720-50472799
Septin9 chr17:75276651-75496678
SDC2 chr8:97505579-97624000
VAV3 chr1:108113782-108507766
IRF4 chr6:391739-411447
TMEFF2 chr2:192813769-193060435
SALL1 chr16:51169886-51185278
BCAN chr1:156611182-156629324
POU4F2 chr4:147560045-147563626
PKNOX2 chr11:125034583-125303285
ASCL4 chr12:108168162-108170421
KCNA6 chr12:4918342-4960277
SOX1 chr13:112721913-112726020
HS3ST2 chr16:22825498-22927659
FGF12 chr3:191857184-192485553
KCTD8 chr4:44175926-44450824
HMX1 chr4:8847802-8873543
MARCH11 chr5:16067248-16180871
CRHBP chr5:76248538-76276983
NKX2-6 chr8:23559964-23564111
SLC24A2 chr9:19507450-19786926
基因間隔區1 chr6:19679885-19693988
基因間隔區2 chr10:130082033-130087148
基因間隔區3 chr10:133107880-133113966
基因間隔區4 chr7:152620588-152624685
基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）甲基化敏感限制酶（MSRE）處理後的a）的對應區域。
在一些實施方式中，從步驟（a）中獲取的所述生物樣本中的所述DNA包括基因組DNA或細胞外游離DNA。在一些實施方式中，所述細胞外游離DNA包括循環腫瘤DNA。在一些實施方式中，所述細胞外游離DNA中的所述目標標記物在所述生物樣品中的數量不超過1 ng、0.8 ng、0.6 ng、0.4 ng、0.2 ng、0.1 ng、0.08 ng或不超過0.04 ng。在一些實施方式中，所述細胞外游離DNA中的所述目標標記物在所述生物樣品中的濃度低於用於所述目標標記物的檢測分析的靈敏度水平。
在一些實施方式中，子步驟（i）或步驟（c）中獲取的DNA在子步驟（ii）或步驟（d）之前使用稀釋劑稀釋。
在一些實施方式中，所述生物樣品選自下組：組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的組織、體液、結腸流出物、手術切除樣本、分離的血細胞、分離自血液的細胞，及其任意組合。在一些實施方式中，所述體液選自下組：全血、血清、血漿、尿液、黏液、唾液、腹膜液、胸腔液、胸膜積液、滑液、腦脊髓液、胸腔穿刺液、腹腔積液，及其任意組合。在一些實施方式中，從所述個體的血漿中獲得所述生物樣品。在一些實施方式中，所述結腸流出物選自下組：糞便樣品和灌腸洗滌樣品。
在一些實施方式中，所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑在CpG位點選擇性地修飾未甲基化的胞嘧啶殘基以產生修飾的殘基，但並不顯著性地修飾甲基化的胞嘧啶殘基。在一些實施方式中，所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑包括亞硫酸氫鹽試劑。在一些實施方式中，所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。
在一些實施方式中，所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑選擇性地切割未甲基化的殘基但不切割甲基化的殘基，或者選擇性地切割甲基化的殘基但不切割未甲基化的殘基。在一些實施方式中，所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑是甲基化敏感限制酶（MSRE）。在一些實施方式中，所述MSRE選自下組：Hpa II酶、Sal I酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
在一些實施方式中，所述預擴增引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。在一些實施方式中，其中所述至少一個甲基化特異性引子對包含一個正向引子和一個反向引子，所述引子均包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列與所述目標標記物之一的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標標記物之一的至少9個連續核苷酸包含至少一個CpG位點。
在一些實施方式中，所述預擴增引子庫進一步包含用於擴增對照標記物的對照引子對。在一些實施方式中，所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白（tubulin）、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。
在一些實施方式中，所述至少一個甲基化特異性引子對包含如下表2所示的一對或多對選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171。
在一些實施方式中，在步驟（c）中，所述至少一個目標標記物在一個或多個封閉寡核苷酸存在的情況下被擴增。
在一些實施方式中，所述定量分析是透過以下方式進行：聚合酶鏈式反應（例如即時聚合酶鏈式反應、數位聚合酶鏈式反應）、核酸定序、基於質量的分離（例如電泳法、質譜法）或標靶捕獲（例如雜交、微陣列）。在一些實施方式中，所述定量分析是透過即時聚合酶鏈式反應進行的，任選地所述即時聚合酶鏈式反應是多重即時聚合酶鏈式反應。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（c）中所獲取的DNA進行擴增；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物進行擴增。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）使用的所述定量引子對能夠與步驟（c）中所獲取的DNA的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對能夠與步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
在一些實施方式中，所述步驟（d）在檢測試劑存在的情況下進行。在一些實施方式中，所述檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。在一些實施方式中，所述螢光探針包括選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 57-85和172。在一些實施方式中，所述螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或TAMRA）。
在一些實施方式中，步驟（e）包括比較步驟（d）的所述目標標記物的Ct值和參考Ct值，其中至少一個目標標記物的Ct值與其相應的參考Ct值相同或比其相應的參考Ct值更低表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險；或者至少一個目標標記物的Ct值比其治療前相應的Ct值更高表明所述正在接受結直腸瘤治療的個體對所述治療有反應。
在一些實施方式中，所述預擴增包括5到30個反應循環，其中每個循環包括在40~80°C下反應5秒 – 5分鐘，之後在85~99°C下反應5秒 - 5分鐘。
在一些實施方式中，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定其甲基化含量；在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定至少一個目標標記物的甲基化含量。在一些實施方式中，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量；在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。
在一些實施方式中，步驟（e）中的所述參考含量是基於從患有結直腸瘤或具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本和從未患結直腸瘤或不具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本來確定的。
在一些實施方式中，所述結直腸瘤是結直腸癌、結直腸腺瘤、和/或無蒂鋸齒狀息肉。在一些實施方式中，所述結直腸瘤是癌前的。在一些實施方式中，所述個體是人。
在另一方面，本申請提供了一種用於診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的試劑盒，其包含： 處理DNA的第一試劑，其中所述第一試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點； 任選地第一引子庫，所述第一引子庫包含用於預擴增選自下組的至少一個目標標記物的至少一個目標序列的至少一個引子對：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5，其中所述至少一個引子對可與被所述第一試劑處理後的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標序列包含至少一個CpG位點；和 第二試劑，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑用於定量分析被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標標記物中的甲基化含量；如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑用於定量分析經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑包含第二引子庫，所述第二引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交；在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑包括第三引子庫，所述第三引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物中的至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
在一些實施方式中，所述第二引子庫中的至少一個定量引子對和所述第一引子庫中的至少一個引子對相同。在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第二引子庫中的定量引子對被設計為用於擴增被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列內的至少一部分；在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫的定量引子對被設計為用於擴增經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少一個目標序列中的至少一部分。
在一些實施方式中，所述第一引子庫、第二引子庫或第三引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。
在一些實施方式中，所述第一引子庫和所述第二引子庫被包裝在單一容器內或被包裝在獨立容器內。在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含一個或多個封閉寡核苷酸。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含檢測試劑。在一些實施方式中，所述檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。在一些實施方式中，所述螢光探針包括選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 57-85和172。在一些實施方式中，所述螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、TAMRA或lowa Black Dark Quenchers）。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含DNA聚合酶和/或一個適合存放從所述個體中獲取的所述生物樣品的容器。在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含使用說明書和/或對試劑盒檢測結果的解釋。
在一些實施方式中，所述第一試劑包括亞硫酸氫鹽試劑或甲基化敏感限制酶（MSRE）。在一些實施方式中，所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。在一些實施方式中，所述MSRE選自下組：Hpa II酶、SalI酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第一引子庫包含多個引子對用於在多個目標標記物中預擴增至少一個目標序列，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1，並進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫包含多個引子對用於擴增多個目標標記物中的至少一個目標序列，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1，並進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，所述各個目標標記物包含或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域：
目標標記物 Hg19 座標
NDRG4 chr16:58496750-58547532
BCAT1 chr12:24964295-25102393
IKZF1 chr7:50343720-50472799
Septin9 chr17:75276651-75496678
SDC2 chr8:97505579-97624000
VAV3 chr1:108113782-108507766
IRF4 chr6:391739-411447
TMEFF2 chr2:192813769-193060435
SALL1 chr16:51169886-51185278
BCAN chr1:156611182-156629324
POU4F2 chr4:147560045-147563626
PKNOX2 chr11:125034583-125303285
ASCL4 chr12:108168162-108170421
KCNA6 chr12:4918342-4960277
SOX1 chr13:112721913-112726020
HS3ST2 chr16:22825498-22927659
FGF12 chr3:191857184-192485553
KCTD8 chr4:44175926-44450824
HMX1 chr4:8847802-8873543
MARCH11 chr5:16067248-16180871
CRHBP chr5:76248538-76276983
NKX2-6 chr8:23559964-23564111
SLC24A2 chr9:19507450-19786926
基因間隔區1 chr6:19679885-19693988
基因間隔區2 chr10:130082033-130087148
基因間隔區3 chr10:133107880-133113966
基因間隔區4 chr7:152620588-152624685
基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）MSRE處理後的a）的對應區域。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第一引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由如下表2所示的選自下組的至少一對核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171，任選地，其中所述第二引子庫包含至少一個與所述第一引子庫中的至少一個引子對相同的引子對。在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由如下表2所示的選自下組的至少一對核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171。
在一些實施方式中，所述第一引子庫、所述第二引子庫或任選地，第三引子庫進一步包含用於擴增對照標記物的引子對。在一些實施方式中，所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含多個容器，每個容器均用於接收所述第二引子庫的組分。
在另一方面，本申請提供了根據本申請所述的試劑盒在製造用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後或監測接受結直腸瘤治療的個體對治療的反應的診斷試劑盒中的用途。
在另一方面，本申請提供了用於定量分析目標標記物的甲基化含量的試劑在製造試劑盒中的用途，所述試劑盒被用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法中，其中所述方法包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理從步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化和甲基化的CpG位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在另一方面，本申請提供用於定量分析目標標記物的甲基化含量的試劑在製造試劑盒中的用途，所述試劑盒被用於在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法中，其中所述方法包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化和甲基化的CpG位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分，其中至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a）、步驟（b）、可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
雖然本申請揭露了本申請的各個方面和各種實施方式，但是所屬技術領域中具通常知識者可以在不脫離本申請的精神和範圍的前提下做出各種等同改變或修改。本申請揭露的各個方面和各種實施方式均是示例性的，並不旨在限制本申請的範圍，本申請的實際保護範圍以申請專利範圍為準。除非另有說明，否則本申請中使用的所有技術和科學術語均是所屬技術領域中具通常知識者通常理解的含義。本申請引用的所有參考文獻、專利和專利申請均透過引用併入本申請。
需注意的是，在本申請的說明書和申請專利範圍中，單數形式的「一個」、「一種」和「所述」均包括其複數形式，除非上下文另有說明。因此，例如，「一種試劑」包括多種試劑。
在本申請的說明書和申請專利範圍，除非另有說明，否則術語「包含」、「包括」或「含有」是指含有所列出的數值、步驟或成分，但也不排除還含有其他數值、步驟或成分。
傳統上，對癌症的診斷依賴於對單個標記物（例如，基因突變）的檢測，但是很可惜的是，通常很難透過檢測單個標記物來檢測癌症，或者很難透過檢測單個標記物來區分多種類型的癌症。此外，在生物樣品中單個標記物的含量通常是極為有限的，這進一步降低了對癌症的診斷特異性和/或診斷靈敏度。因此，僅識別單個標記物的分析法被證明具有有限的預測價值。
在一個方面，本申請預擴增至少一個目標標記物的至少一部分，以使得所述至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，之後基於從所述預擴增獲得的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量。這樣的預擴增步驟可以提高目標標記物的數量/含量，並可以顯著提高對結直腸瘤的診斷特異性和/或診斷靈敏度。在另一方面，本申請同時定量分析生物樣品中的多個目標標記物的甲基化含量，以提高對結直腸瘤的診斷特異性和/或診斷靈敏度。在一些實施方式中，所述多個目標標記物在定量分析之前不進行預擴增。在一些實施方式中，所述多個目標標記物在定量分析之前進行預擴增。特別地，本申請的發明人出人意料地發現同時定量分析生物樣品內的多個目標標記物的甲基化含量，或預擴增步驟和定量分析步驟結合在一起可以顯著提高對結直腸瘤的診斷特異性和/或診斷靈敏度，使得對結直腸瘤的早期檢測成為可能，例如在癌變前的腺瘤期或癌症早期。所屬技術領域中具通常知識者可以理解的是，在上下文中的診斷「靈敏度」定義的是被正確鑑定為陽性結果的比例，也就是被正確鑑定出患病的個體的百分比。而「特異性」定義的是被正確鑑定為陰性結果的比例，也就是被正確鑑定出不患病的個體的百分比。
1. 方法
在一個方面，本申請提供了一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中所述目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5； 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在另一方面，本申請提供了一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中至少兩個目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4，並且至少兩個目標標記物選自下組：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP，並且 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在另一方面，本申請提供了一種在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中所述目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5； 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（I）和步驟（II）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
在另一方面，本申請提供了一種在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中至少兩個目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4，並且至少兩個目標標記物選自下組：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP，並且 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（I）和步驟（II）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
在一些實施方式中，本申請所述的一組目標標記物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多個目標標記物。
在一些實施方式中，本申請所述的步驟（II）包括： 用預擴增引子庫預擴增從步驟（I）獲得的所述經處理的DNA中的一組目標標記物中的至少一個目標標記物的至少一部分，並且所述一組目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別定量分析從所述子步驟（i）獲取的DNA中所述一組目標標記物的甲基化含量。
在一些實施方式中，存在步驟（II）的子步驟（i）。在一些實施方式中，不存在步驟（II）的子步驟（i）。在一些實施方式中，上述方法進一步包括在所述步驟（I）之前從來自個體的生物樣品中獲得DNA。
在一些實施方式中，本申請提供一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； (b) 用試劑處理從步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； (c) 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； (d) 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 (e).      分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
另一方面，本申請提供一種在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，包括如下步驟： (a) 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； (b) 用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； (c) 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； (d) 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 (e).      分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a）、步驟（b）、可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
本文中所使用的術語「篩查」是指對病理狀態、疾病或病況進行鑑定，例如對結直腸瘤的鑑定，或對患有結直腸瘤但可能從特定的治療方案中獲益的個體進行鑑定。在本申請中，術語「篩查」和術語「診斷」可能互換使用。本文中所使用的術語「瘤」或「腫瘤」應當理解為是指包含腫瘤細胞的病灶、腫瘤或其他包囊化或未包囊化的塊體或其他形式的生長物。「腫瘤細胞」應當理解為是指顯示出異常生長的細胞。術語「生長」應當以最廣泛的意義理解並且包括增殖。於此而言，細胞異常生長的一個實例是細胞失控的增殖。另一個實例是細胞因凋亡失敗而延長其通常的壽命。腫瘤細胞可以是良性細胞或惡性細胞。在一些實施方式中，腫瘤是腺瘤或腺癌。不使本發明限於任一理論或作用模式，腺瘤通常是源自上皮的良性腫瘤，其源自上皮組織或顯示出清晰界定的上皮結構。這些結構物可以具有腺狀外觀。它可能在腺瘤內部包含惡性細胞群體，例如，隨著良性腺瘤或良性腫瘤病灶進展成惡性腺癌而發生。在一些實施方式中，瘤是惡性的，例如癌。在一些實施方式中，瘤不是惡性的，例如腺瘤。
本文中所使用的術語「結直腸瘤」是指存在於結腸、直腸和/或闌尾的瘤。在一些實施方式中，結直腸瘤是結直腸癌、結直腸腺瘤和/或無蒂鋸齒狀息肉。在一些實施方式中，結直腸瘤是癌前的。
本文中所使用的術語「癌前」指的是展示出與癌症進展風險升高相關的一些組織學變化的瘤。就結直腸細胞增殖性病症來說，這類狀況的實例包括高度發育異常的細胞增殖性疾病，例如結腸的腺瘤狀息肉。
本文中在描述瘤（例如，腺瘤或腺癌）時所用的術語「形成」被理解為是指表現出發育異常的個體的一個或多個細胞。對這一點而言，腺瘤或腺癌可能已形成發展，因為已形成非正常增長的細胞團塊，也可以是腺瘤或腺癌處在極早期，在診斷時只有相比數量極少的細胞出現非正常分裂。本申請也延伸至評估個體的結直腸瘤（例如，結直腸癌）形成風險。
本文中所用的術語「評估」指的是區分來自患有結直腸瘤進展的個體和未患有結直腸瘤進展的個體的樣本的能力，或者區分來自處於結直腸瘤進展不同階段的個體的樣本的能力。在一些實施方式中，該評估關於確定個體的腫瘤是否進入進展階段或是否具有較高可能性進入進展階段。在一些實施方式中，該評估關於對個體的腫瘤進行分類，例如I期、II期、III期、IV期等。在一些實施方式中，該評估關於確定個體的腫瘤是否減輕或加重。在一些實施方式中，該評估可以協助評價一種治療具有臨床受益的可能性。在一些實施方式中，該評估可能關於患者在接受治療（例如，用特定的藥物進行治療）後是否好轉和/或好轉的可能性。透過為任何特定患者選擇最合適的治療方式，本申請的評估方法可以被用於在臨床上做出治療決定。在施用治療方案（例如，給定的治療方案，包括例如給定的治療藥劑或組合的施用，手術干預、類固醇治療等）後，本申請的評估方法在評價該患者能否長期存活的可能性上是有價值的工具。
所屬技術領域中具通常知識者所理解的「區分」不能達到對所分析的樣品100%正確。但是，依然要求對具有統計學意義的數量的樣品能夠正確分類。具有統計學意義的數量可以由所屬技術領域中具通常知識者透過使用不同的統計工具來確定，例如但不限於確定可信區間、確定p 值，學生氏T檢驗或Fisher區分方程式。有關詳細資訊，請參見Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。在一些實施方式中，可信區間為至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施方式中，p 值小於0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
本文所用的術語「進展」是指細胞的形態和生理沿著遺傳確定的途徑改變，例如，從先前、較低或早期到後來的、更複雜或更高級階段的生理成熟中的自然發展過程。
本文所用的術語「預後」是指預測疾病（例如，癌症）的疾病症狀（包括例如復發、加劇、抗藥性）結果的可能性。該術語還指對治療的臨床獲益可能性的預測。在一些實施方式中，使用統計算法為個體提供疾病的預後。例如，預後可以是手術、癌症（例如，實體瘤，例如結直腸癌、黑素瘤和腎細胞癌）的臨床亞型的進展、一種或多種臨床因素的進展或從疾病中恢復。預後可以是預後不良（例如可能復發或產生抗藥性）或預後良好。
本文所用的術語「有反應」是指個體對治療的有益反應。可以透過任何能夠指示個體獲益的終點（endpoint）來評估個體對治療的反應，包括但不限於：（1）在某種程度上抑制疾病的發展，包括減慢速度和完全停滯；（2）減少疾病發作和/或症狀的數量；（3）縮小病變尺寸；（4）抑制（即減少、減慢或完全停止）疾病細胞浸潤到鄰近的周圍器官和/或組織中；（5）抑制（即減少、減慢或完全停止）疾病傳播；（6）在一定程度上緩解與該疾病有關的一種或多種症狀；（7）治療後無病表現的時間增加；（8）自身免疫反應降低，可能但不一定導致疾病病變消退或消融，例如無進展生存期；（9）增加總生存率；（10）反應率更高；和/或（11）治療後給定時間點死亡率降低。術語「受益」、「有益」或「獲益」在最寬的含義上使用，指任何期望的效果。
在本申請中，以下關於步驟（a）、步驟（b）、步驟（c）和步驟（d）的詳細描述適用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，和監測接受結直腸瘤治療的個體對治療的反應的方法。但是將分別描述這兩個方法的步驟（e）。另外，在本申請中，本申請的步驟（I）與本申請的步驟（b）相同或至少相似。另外，本申請的步驟（II）的子步驟（i）與本申請的步驟（c）相同或至少相似。本申請的步驟（II）的子步驟（ii）與本申請的步驟（d）相同或至少相似。另外，本申請的步驟（III）與本申請的步驟（e）相同或至少相似。因此，以下將步驟（I）和步驟（b）統稱為「步驟（b）」，以下將步驟（II）的子步驟（i）和步驟（c）統稱為「步驟（c）」。以下將步驟（II）的子步驟（ii）和步驟（d）統稱為「步驟（d）」，以下將步驟（III）和步驟（e）統稱為「步驟（e）」。
步驟（ a ）
在根據本申請的方法的步驟（a）中，從所述個體中獲取包含DNA的生物學樣本。
本文所用的術語「生物樣品」是指獲自或衍生自目標個體的生物組合物，其包含基於物理、生化、化學和/或生理特徵待表徵或待識別的細胞和/或其他分子實體（例如DNA）。生物樣品包括但不限於透過所屬技術領域中具通常知識者已知的任何方法獲得的個體的細胞、組織、器官和/或生物體液。在一些實施方式中，所述生物樣品選自下組：組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的組織、體液、結腸流出物、手術切除樣本、分離的血細胞、分離自血液的細胞，及其任意組合。在一些實施方式中，所述體液選自下組：全血、血清、血漿、尿液、黏液、唾液、腹膜液、胸腔液、胸膜積液、滑液、腦脊髓液、胸腔穿刺液、腹腔積液，及其任意組合。在一些實施方式中，所述結腸流出物選自下組：糞便樣品和灌腸洗滌樣品。選擇最適合根據本文申請的方法的檢測的樣品將取決於情境的性質。在一些實施方式中，所述生物樣品獲自個體的全血。在一些實施方式中，所述生物樣品獲自個體的血漿。所屬技術領域中具通常知識者知道從全血製備血漿的各種方法。例如，在一些實施方式中，血漿透過將來自個體的全血離心一次、兩次、三次、四次、五次或更多次來獲得。
本文所用的術語「個體」包括人類和非人類的動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物。「個體」也可以是家畜，例如牛、豬、綿羊、家禽和馬；或齧齒動物，例如大鼠、小鼠；或非人類靈長類動物，例如猿、猴、恒河猴；或家養的動物，例如狗或貓。在一些實施方式中，個體是人類或非人類靈長類動物。在一些實施方式中，個體是人類。在本申請中，「個體」和「受試者」可能互換使用。
在一些實施方式中，所述DNA是從所述生物樣本中分離的。從生物樣品中分離和純化DNA可以透過使用本領域已知的各種方法來實施，包括使用可商購的試劑盒。例如，透過以下方式從細胞和組織中分離DNA：在高度變性和還原條件下裂解原材料、部分使用蛋白質降解酶、純化透過苯酚/氯仿提取技術獲得的核酸組分，並透過透析或乙醇沉澱從水相中回收核酸（參見例如Sambrook, J., Fritsch, E. F. in T. Maniatis, C S H, Molecular Cloning, 1989）。又例如，現在有許多試劑系統特別適用於從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段、從細菌裂解物中分離質體DNA，以及從血液、組織或細胞培養物中分離較長鏈的核酸（基因組DNA、總細胞RNA）。許多這些可商購的純化系統中是基於相當眾所周知的原理，即，在不同離液鹽的溶液的存在下將核酸與礦物載體相結合。在這些系統中，細磨的玻璃粉、矽藻土或矽膠的懸浮液被用作載體材料。在例如US7888006B2和EP1626085A1中描述了從生物樣品中分離和純化DNA的一些其他方法。在方法之間進行選擇將受到幾個因素的影響，包括時間、費用和所需的DNA數量。
在一些實施方式中，生物樣品中包含的DNA包括基因組DNA。本文所用的術語「基因組DNA」是指包含細胞或生物體的完整基因組及其片段或部分的DNA。基因組DNA是來源於個體的大段DNA（例如長於大約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200或300kb），並且可以具有天然修飾，例如DNA甲基化。
在一些實施方式中，生物樣品中包含的DNA包括細胞DNA。本文所用的術語「細胞DNA」是指存在於細胞內的DNA，或從體內細胞中獲取DNA並在體外分離、或以其他方式在體外操作，只要該DNA未從體內細胞中移除。
在一些實施方式中，生物樣品中包含的DNA包括細胞外游離DNA。本文所用的術語「細胞外游離DNA」是指在體內的細胞外存在的DNA片段。該術語也可以被用於指代獲取自體內的細胞外來源並在體外分離、或操作的DNA片段。細胞外游離DNA中的DNA片段通常具有約100到200bp的長度，推測與被包裹於核小體的DNA片段的長度有關。細胞外游離DNA包括例如細胞外游離胎兒DNA和循環腫瘤DNA。細胞外游離胎兒DNA在孕婦的體內（例如血液）中循環，代表胎兒基因組，而循環腫瘤DNA在癌症患者的體內（例如血液）中循環。在一些實施方式中，細胞外游離DNA可基本上不含個體的細胞DNA。例如，所述細胞外游離DNA可包含小於約1,000ng/mL、小於約100ng/mL、小於約10ng/mL、小於約1ng/mL的細胞DNA。
可以透過使用本領域已知的常規技術來製備細胞外游離DNA。例如，可以透過以約200–20,000g、約200–10,000g、約200–5,000g、約300–4000g等的速度離心血液樣品約3-30分鐘、約3-15分鐘、約3-10分鐘、約3-5分鐘來獲得血液樣品的細胞外游離DNA。例如，在一些實施方式中，可以透過將個體的血漿或血清離心一、二、三、四、五次或更多次來獲得血液樣本的細胞外游離DNA。在一些實施方式中，為了從包含可溶性DNA的無細胞組分中分離細胞及其片段，可以透過微濾來獲得所述生物樣品。通常來說，微濾可以透過使用過濾器來進行，例如，0.1微米〜0.45微米的膜過濾器，諸如0.22微米的膜過濾器。
在一些實施方式中，使用商購的DNA提取產品從全血、血清或血漿中提取細胞外游離DNA用於分析。這種提取方法據稱對循環DNA的回收率高（＞50%），某些產品（例如Qiagen生產的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit）據稱可提取小尺寸的DNA片段。所使用的典型樣品量為1-5mL血清或血漿。
在一些實施方式中，細胞外游離DNA包括循環腫瘤DNA。循環腫瘤DNA（「ctDNA」）是與細胞無關的體液（例如血液、尿液、唾液、痰、糞便、胸膜液、腦脊液等）中腫瘤來源的片段化DNA。通常，ctDNA高度片段化，平均長度約為150個鹼基對。ctDNA通常包括體液（例如血漿）中細胞外游離DNA的極小部分，例如ctDNA可能構成血漿DNA的不到約10%。通常，該百分比小於約1%，例如小於約0.5%或小於約0.01%。另外，血漿DNA的總量通常非常低，例如約10ng/mL血漿。ctDNA的數量因人而異，並且取決於腫瘤的類型、位置，對於癌性腫瘤，則取決於癌症的階段。但是，ctDNA通常在體液中非常罕見，只能透過極其敏感和特異性的技術進行檢測。檢測ctDNA可能有助於檢測和診斷腫瘤、指導腫瘤特異性治療、監測治療以及監測癌症的緩解。
步驟（ b ）
在根據本申請的方法的步驟（b）中，用能夠區分DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑處理步驟（a）中獲取的生物樣品中的DNA，從而獲得經處理的DNA。
DNA甲基化是（例如，透過DNA甲基轉移酶的作用）將甲基添加到DNA分子上（例如，添加至DNA分子的一個或多個胞嘧啶鹼基）的生物學過程。在哺乳動物中，DNA甲基化出現於胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸（即「CpG位點」）的5’位置，當其出現在基因的啟動子或第一個外顯子中的5’-CpG-3’二核苷酸中時，會導致基因的表觀遺傳去活化。充分證明DNA甲基化在調節基因表達、腫瘤發生、以及其他遺傳和表觀遺傳疾病中起重要作用。
如本文所用，術語「甲基化的胞嘧啶殘基」是指胞嘧啶殘基的衍生物，其中一個甲基連接至胞嘧啶環的碳原子上（例如C5）。術語「未甲基化的胞嘧啶殘基」是指未衍生化的胞嘧啶殘基，其中與「甲基化的胞嘧啶殘基」相反，在胞嘧啶環的碳原子（例如C5）上沒有甲基連接。其內的胞嘧啶殘基被甲基化的CpG位點就是甲基化的CpG位點，而其內的胞嘧啶殘基未被甲基化的CpG位點是未甲基化的CpG位點。
在一些實施方式中，步驟（b）中使用的試劑能夠區分DNA中的未甲基化和甲基化的CpG位點，從而獲得經處理的DNA。該試劑可以選擇性地作用於未甲基化的胞嘧啶殘基，但不能顯著地作用於甲基化的胞嘧啶殘基。或者該試劑可以選擇性地作用於甲基化的胞嘧啶殘基，而不顯著地作用於未甲基化的胞嘧啶殘基。因此，原始DNA以取決於是否被甲基化的方式轉化為經處理的DNA，從而可以透過其雜交行為將經處理的DNA與原始DNA區分開。
例如，一些試劑可以選擇性地將未甲基化的胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶、胸腺嘧啶或雜交上與胞嘧啶不同的另一鹼基，而甲基化的胞嘧啶殘基依然處於未轉化狀態。又例如，一些試劑可以選擇性地切割甲基化的殘基，或者選擇性地切割未甲基化的殘基。
如本文所用，「經處理的DNA」是指已經用能夠區分DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑處理後的DNA，即DNA中的DNA甲基化狀態已經改變。
在一些實施方式中，步驟（b）的所述試劑在CpG位點選擇性地修飾未甲基化的胞嘧啶殘基以產生修飾的殘基，但並不顯著性地修飾甲基化的胞嘧啶殘基。
在一些實施方式中，步驟（b）的所述試劑包括亞硫酸氫鹽試劑。如本文所用，術語「亞硫酸氫鹽試劑」是指，例如本申請所揭露的可用於區分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列的包括亞硫酸氫鹽、亞硫酸氫根離子或其任意組合的試劑。在本申請中，用亞硫酸氫鹽試劑處理DNA也被描述為「亞硫酸氫鹽反應」或「亞硫酸氫鹽處理」，指的是轉化未甲基化的胞嘧啶殘基的反應，特別是在亞硫酸氫根離子存在的情況下，核酸中未甲基化的胞嘧啶殘基被轉化為尿嘧啶鹼基、胸腺嘧啶鹼基或在雜交行為上與胞嘧啶不同的其他鹼基，而其中甲基化的胞嘧啶殘基未被顯著地轉化。換言之，亞硫酸氫鹽處理可用於區分甲基化的CpG二核苷酸和未甲基化的CpG二核苷酸。
Frommer, M.,et al., Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 1827-31和Grigg, G., Clark, S.,Bioessays 16 (1994) 431-6中詳細描述了用於檢測甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽反應。亞硫酸氫鹽反應包括脫氨基步驟和脫磺酸基步驟（參見Grigg and Clark, 同上）。「甲基化的胞嘧啶殘基未被顯著地轉化」這一陳述，不排除非常小的百分比（例如，小於0.1%、小於0.2%、小於0.3%、小於0.4%、小於0.5%、小於0.6%、小於0.7%、小於0.8%、小於0.9%、小於1%、小於2%、小於3%、小於4%、小於5%、小於6%、小於7%、小於8%、小於9%、小於10%、小於11%、小於12%、小於13%、小於14%、小於15%、小於16%、小於17%、小於18%、小於19%、小於20%）的甲基化的胞嘧啶殘基被轉化為尿嘧啶、胸腺嘧啶或在雜交行為上與胞嘧啶不同的其他鹼基，儘管其意在僅僅轉化未甲基化的胞嘧啶殘基。
在例如參考Frommer M.,et al. （同上）或Grigg and Clark（同上）的情況下（它們揭露了亞硫酸氫鹽處理的基本參數），所屬技術領域中具通常知識者知道如何進行亞硫酸氫鹽處理，特別是脫氨基步驟和脫磺酸基步驟。孵育時間和溫度對脫氨基效率的影響、以及影響DNA降解的參數都已揭露。
在一些實施方式中，所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。在一些實施方式中，所述亞硫酸氫鹽試劑是亞硫酸氫鈉。在一些實施方式中，亞硫酸氫鹽試劑是可商購的，例如，MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit、EpiMarkTM Bisulfite Conversion Kit、EpiJETTM Bisulfite Conversion Kit、EZ DNA Methylation-GoldTM Kit等。在一些實施方式中，根據試劑盒的使用說明書進行亞硫酸氫鹽反應。
在一些實施方式中，步驟（b）的所述試劑選擇性地切割未甲基化的殘基但不切割甲基化的殘基，或者選擇性地切割甲基化的殘基但不切割未甲基化的殘基。
在一些實施方式中，步驟（b）的所述試劑是甲基化敏感限制酶（MSRE）。
術語「甲基化敏感限制酶」是指根據其識別位點的甲基化狀態而選擇性地消化核酸的酶。對於當識別位點未被甲基化或半甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點被甲基化時，不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。對於當識別位點被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點未被甲基化時，不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。在一些實施方式中，甲基化敏感限制酶的識別序列含有CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)。在一些實施方式中，當該CG二核苷酸中的胞嘧啶在C5碳原子處被甲基化時，甲基化敏感限制酶不進行剪切。
在一些實施方式中，所述MSRE選自下組：Hpa II酶、Sal I酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
使用本領域已知的方法，使用能區分目標區域內的甲基化的CpG二核苷酸和未甲基化的CpG二核苷酸的甲基化敏感限制酶或包含甲基化敏感限制酶的一系列限制酶試劑來確定甲基化，例如但不限於，差異性甲基化雜交（「DMH」）。
在一些實施方式中，步驟（a）的DNA可以在用甲基化敏感限制酶處理之前被切割。這樣的方法是本領域已知的，並且可以既包括物理方式也包括酶促方式。特別較佳的是使用一種或多種對甲基化不敏感的並且其識別位點富含AT並且不包含CG二核苷酸的限制酶。使用此類酶使得DNA片段中的CpG位點和CpG富集區域得以保存。在一些實施方式中，此類限制酶選自Mse I酶、 Bfa I酶、 Csp6 I酶、 Tru1 I酶、 Tru9 I酶、 Mae I酶、 Xsp I酶及其任意組合。
步驟（ c ）
在根據本申請的方法的步驟（c）中，用預擴增引子庫對從步驟（b）獲得的經處理的DNA中的至少一個目標標記物進行預擴增，其中至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增。在本申請中，步驟（c）也可以被稱為預擴增步驟。儘管不希望受到任何理論的束縛，但認為實現本申請的目的不一定需要步驟（c）。在一些實施方式中，本申請的方法的步驟（c）存在。在一些實施方式中，本申請的方法的步驟（c）不存在。
對目標標記物進行預擴增的目的之一是增加經處理的DNA中的目標標記物的數量。如本文所用，術語「擴增」大體上是指任何能夠導致分子或一組相關分子的拷貝數增加的過程。當「擴增」被用於多核苷酸分子時，是指通常從少量多核苷酸開始產生多拷貝的多核苷酸分子或多核苷酸分子的一部分的多份拷貝，其中被擴增的物質（擴增子，PCR擴增子）通常是可被檢測到的。多核苷酸的擴增涵蓋多個化學和酶促過程。擴增的形式包括透過聚合酶鏈式反應（逆轉錄PCR、PCR）、鏈置換擴增（SDA）反應、轉錄介導擴增（TMA）反應、基於核酸序列的擴增（NASBA）反應或連接酶鏈反應（LCR），從一個或幾個拷貝的模板RNA或DNA分子生成多個DNA拷貝。
如本文所用，術語「目標標記物」是指這樣的目的核酸或基因區域：其甲基化含量指示著結直腸瘤（例如，結直腸癌），或指示著結直腸瘤（例如，結直腸癌）形成或形成的風險，或指示著結直腸瘤（例如，結直腸癌）的進展或預後。在本申請中，術語「標記物」和「基因」可以互換使用。術語「標記物」或「基因」應被認為包括其所有轉錄變體（例如，術語「Septin9」應包括例如其截短的轉錄物Q9HC74）及其所有啟動子和調控元件。如所屬技術領域中具通常知識者所理解的，已知某些基因在個體之間表現出等位基因變異或單核苷酸多態性（「SNP」）。SNP包括不同長度的簡單的重複序列（例如二核苷酸和三核苷酸重複）的插入和缺失。因此，本申請應被理解為擴展到由任何其他突變、多態性或等位基因變異產生的標記物/基因的所有形式。另外，應當理解，術語「標記物」和「基因」應既包括標記物或基因的正義鏈序列，也包括標記物或基因的反義鏈序列。
本文所用的術語「目標標記物」被寬泛地解釋為既包括1）在生物樣品或基因組DNA中發現的原始標記物（處於特定的甲基化狀態），也包括2）其經過處理的序列（例如亞硫酸氫鹽轉化後的對應區域或MSRE處理後的對應區域）。亞硫酸氫鹽轉化後的對應區域與基因組序列中的目標標記物不同之處在於，一個或多個未甲基化的胞嘧啶殘基被轉化為尿嘧啶鹼基、胸腺嘧啶鹼基或在雜交行為上與胞嘧啶不同的其他鹼基。經MSRE處理的對應區域與基因組序列中的目標標記物不同之處在於，該序列在一個或多個MSRE切割位點處被切割。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的一個或多個標記物（例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28個標記物）：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的14個標記物：NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的13個標記物：NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的11個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2、TMEFF2和基因間隔區1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的10個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2、TMEFF2和基因間隔區1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的10個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2和TMEFF2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的9個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2和TMEFF2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的7個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN和NDRG4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的6個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN和NDRG4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的6個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4和BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的5個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的5個標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和IRF4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的3個標記物：SALL1、BCAT1和Septin9。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物可以是至多一個目標標記物（即一個標記物且不超過一個標記物）。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是Septin9。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是NDRG4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是PKNOX2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是VAV3。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IRF4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是POU4F2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是SALL1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是TMEFF2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是ASCL4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是FGF12。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是基因間隔區1。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包括多個目標標記物。在一些實施方式中，多個目標標記物包含選自下組的至少兩個或三個標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物進一步包含選自下組的一個、兩個、三個、四個或五個額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物進一步包含選自下組的一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個）額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含Septin9和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、BCAT1、IKZF1、NDRG4、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包括BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAT1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、NDRG4、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9、和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IKZF1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、BCAT1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、BCAT1、PKNOX2、NDRG4、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9、和/或BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAN和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、NDRG4、IRF4、或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括VAV3和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BBCAN、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、NDRG4和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IRF4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、NDRG4、PKNOX2、VAV3或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或NDRG4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括PKNOX2和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含POU4F2和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括SALL1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括TMEFF2和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、ASCL4、SALL1、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、NDRG4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括ASCL4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、NDRG4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括FGF12和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、ASCL4、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、NDRG4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括基因間隔區1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、ASCL4、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、FGF12、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、NDRG4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包括NDRG4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、ASCL4、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、FGF12、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、BCAN或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在本申請中，應該理解的是，標記物/基因既透過引用其名稱又通過其染色體座標來進行描述。所述染色體座標與2009年2月發佈的人類基因組資料庫Hg19版本一致（在本文中稱為「Hg19座標」）。
在本申請中，應理解目標標記物還包括基因間隔區，其被稱為「基因間隔區1」、「基因間隔區2」、「基因間隔區3」、「基因間隔區4」、「基因間隔區5」，由其各自的染色體座標定義。例如，在本申請中，基因間隔區1是指由chr6:19679885-19693988定義的區域；基因間隔區2是指由chr10:130082033-130087148定義的區域；基因間隔區3是指由chr10:133107880-133113966定義的區域；基因間隔區4是指由chr7:152620588-152624685定義的區域；基因間隔區5是指由chr8:70945014-70949177定義的區域。
在一些實施方式中，所述的各個目標標記物包括或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域：
目標標記物 Hg19 座標
NDRG4 chr16:58496750-58547532
BCAT1 chr12:24964295-25102393
IKZF1 chr7:50343720-50472799
Septin9 chr17:75276651-75496678
SDC2 chr8:97505579-97624000
VAV3 chr1:108113782-108507766
IRF4 chr6:391739-411447
TMEFF2 chr2:192813769-193060435
SALL1 chr16:51169886-51185278
BCAN chr1:156611182-156629324
POU4F2 chr4:147560045-147563626
PKNOX2 chr11:125034583-125303285
ASCL4 chr12:108168162-108170421
KCNA6 chr12:4918342-4960277
SOX1 chr13:112721913-112726020
HS3ST2 chr16:22825498-22927659
FGF12 chr3:191857184-192485553
KCTD8 chr4:44175926-44450824
HMX1 chr4:8847802-8873543
MARCH11 chr5:16067248-16180871
CRHBP chr5:76248538-76276983
NKX2-6 chr8:23559964-23564111
SLC24A2 chr9:19507450-19786926
基因間隔區1 chr6:19679885-19693988
基因間隔區2 chr10:130082033-130087148
基因間隔區3 chr10:133107880-133113966
基因間隔區4 chr7:152620588-152624685
基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）甲基化敏感限制酶（MSRE）處理後的a）的對應區域。在公共資料庫（例如UCSC Genome Browser、Ensemble和NCBI網站）中可以獲得如上所述的Hg19座標的特定核苷酸序列，以及每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb。
在一些實施方式中，所述各個目標標記物也包括其所有變體。變體包括來自相同區域的、與本文所述的標記物/基因區域具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性（即，具有一個或多個缺失、插入、取代、反向序列等）的核酸序列。因此，本申請內容應理解為延伸至實現相同結果的此類變體，儘管事實上個體間的實際核酸序列具有微小的遺傳變異。
如本文所用，術語「序列同一性的百分比（%）」是指候選序列的胺基酸（或核酸）殘基和參考序列的胺基酸（或核酸）殘基進行序列比對後的相同百分比，比對時可以引入間隔（如有必要）以使得相同的胺基酸（或核酸）數目達到最多。換句話說，胺基酸序列（或核酸序列）的序列同一性百分比（%）可以透過用與參考序列相同的胺基酸殘基（或鹼基）的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基（或鹼基）的總數（以較短者為準）來計算。胺基酸殘基的保守取代可以被認為或可以不被認為是相同的殘基。可以透過以下方式來確定胺基酸（或核酸）序列同一性的百分比，例如，可以使用公開的工具如BLASTN、BLASTp（可在美國國家生物技術資訊中心（NCBI）的網站上獲得，也可參見Altschul S.F.et al. ,J. Mol. Biol. , 215:403–410 (1990); Stephen F.et al. , Nucleic Acids Res., 25:3389–3402 (1997))、ClustalW2（可在歐洲生物資訊研究所的網站上找到），也可參見Higgins D.G.et al. ,Methods in Enzymology , 266:383-402 (1996); Larkin M.A.et al. ,Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)）和ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。所屬技術領域中具通常知識者可以使用所述工具提供的默認參數，或者可以（例如，透過選擇合適的演算法）定制適合比對的參數。
在本文提供的步驟（c）中，至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增。在一些實施方式中，目標標記物的預擴增部分在目標標記物的亞區域內。
在不使本申請限於任一理論或作用模式的情況下，據信測量目標標記物的亞區域內的甲基化含量尤其有用，所述亞區域包含在結直腸瘤（例如，結直腸癌）中經常被超甲基化（hypermethylated）的高密度CpG二核苷酸。這一發現使得亞區域成為分析的一個特別有用的目標，因為它既可以簡化篩查過程（因為需要分析的DNA區域更短且界定更為清晰），而且進一步地，相比於對目標標記物的整個Hg19區域進行分析所獲得的結果，從這些亞區域所獲得的結果會在超甲基化的存在或不存在這方面提供顯著地更為明確的結果。因此，該發現既簡化了診斷、篩查/監測過程，又增加了結直腸瘤診斷的敏感度和特異性。在一些實施方式中，各個目標標記物的亞區域包含或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域：
目標標記物 Hg19 座標的亞區域
NDRG4 chr16:58497307-58497392
BCAT1 chr12:25102016-25102110
IKZF1 chr7:50343793-50343896
Septin9 chr17:75369603-75369693
SDC2 chr8:97506253-97506331
VAV3 chr1:108507591-108507674
IRF4 chr6:392282-392377
TMEFF2 chr2:193059426-193059517
SALL1 chr16:51190041-51190146
BCAN chr1:156611866-156611966
POU4F2 chr4:147560088-147560191
PKNOX2 chr11:125036431-125036547
ASCL4 chr12:108169374-108169473
KCNA6 chr12:4918853-4918959
SOX1 chr13:112758808-112758890
HS3ST2 chr16:22825783-22825873
FGF12 chr3:192125861-192125964
KCTD8 chr4:44449597-44449687
HMX1 chr4:8859817-8859921
MARCH11 chr5:16180271-16180378
CRHBP chr5:76249633-76249729
NKX2-6 chr8:23564141-23564235
SLC24A2 chr9:19788670-19788750
基因間隔區1 chr6:19691885-19691988
基因間隔區2 chr10:130085033-130085148
基因間隔區3 chr10:133110880-133110966
基因間隔區4 chr7:152622588-152622685
基因間隔區5 chr8:70947014-70947177
以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）MSRE處理後的a）的對應區域。
在一些實施方式中，各個目標標記物的亞區域包含或是選自下組的多核苷酸序列：SEQ ID NO：86-112、167、或其亞硫酸氫鹽轉化後的對應區域、或其MSRE處理的對應區域。在一些實施方式中，目標標記物的亞區域的經亞硫酸氫鹽轉化後的對應區域包含或是選自下組的多核苷酸序列：SEQ ID NO：113-166、168、169。每個目標標記物的亞區域的SEQ ID NO列在下表1中，圖6中提供了具體序列。
表 1. 各個目標標記物的示例性亞區域
目標標記物 基因組序列 經亞硫酸氫鹽轉化後的序列 (C to T) 經亞硫酸氫鹽轉化後的序列 (G to A)
NDRG4 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 140
BCAT1 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 141
IKZF1 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 142
Septin9 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 143
SDC2 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 117 SEQ ID NO: 144
VAV3 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 145
TMEFF2 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 119 SEQ ID NO: 146
SALL1 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 147
BCAN SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 121 SEQ ID NO: 148
POU4F2 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 149
PKNOX2 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 123 SEQ ID NO: 150
ASCL4 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 151
KCNA6 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 125 SEQ ID NO: 152
SOX1 SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 153
HS3ST2 SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 127 SEQ ID NO: 154
FGF12 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 155
KCTD8 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 129 SEQ ID NO: 156
HMX1 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 157
MARCH11 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 131 SEQ ID NO: 158
CRHBP SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 159
NKX2-6 SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 133 SEQ ID NO: 160
SLC24A2 SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 161
基因間隔區1 SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 162
基因間隔區2 SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 163
基因間隔區3 SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 164
基因間隔區4 SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 165
基因間隔區5 SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 166
IRF4 SEQ ID NO: 167 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 169
在一些實施方式中，NDRG4的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 86、113和140；BCAT1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 87、114和141；IKZF1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 88、115和142；Septin9的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 89、116和143；SDC2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 90、117和144；VAV3的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 91、118和145；TMEFF2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 92、119和146；SALL1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 93、120和147；BCAN的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 94、121和148；POU4F2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 95、122和149；PKNOX2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 96、123和150；ASCL4的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 97、124和151；KCNA6的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 98、125和152；SOX1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 99、126和153；HS3ST2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 100、127和154；FGF12的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 101、128和155；KCTD8的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 102、129和156；HMX1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 103、130和157；MARCH11的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 104、131和158；CRHBP的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 105、132和159；NKX2-6的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 106、133和160；SLC24A2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 107、134和161；基因間隔區1的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 108、135和162；基因間隔區2的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 109、136和163；基因間隔區3的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 110、137和164；基因間隔區4的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 111、138和165；基因間隔區5的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 112、139和166；和/或IRF4的亞區域包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 167、168和169。
在一些實施方式中，細胞外游離DNA中的目標標記物以不超過1ng、不超過0.9ng、不超過0.8ng、不超過0.7ng、不超過0.6ng、不超過0.5ng、不超過0.4ng、不超過0.3ng、不超過0.2ng、不超過0.1ng、不超過0.09ng、不超過0.08ng、不超過0.07ng、不超過0.06ng、不超過0.05ng、不超過0.04ng、不超過0.03ng、不超過0.02ng或不超過0.01ng的量存在於生物樣品中。在一些實施方式中，細胞外游離DNA中的目標標記物以不超過0.1%、不超過0.2%、不超過0.3%、不超過0.4%、不超過0.5%、不超過0.6%、不超過0.7%、不超過0.8%、不超過0.9%、不超過1%的百分比存在於生物樣品中。在一些實施方式中，細胞外游離DNA中的所述目標標記物在生物樣品中的濃度低於用於目標標記物的檢測分析的靈敏度含量。「檢測分析的靈敏度」是對檢測分析在分析濃度/量的微小差異之間進行區分的能力的度量。如果存在於生物樣品中的細胞外游離DNA中的目標標記物低於檢測分析的靈敏度含量，那麼將無法使用常規方法來定量分析樣品中每個目標標記物的甲基化含量。相反，本申請揭露的方法在檢測樣品中極少量的目標標記物方面是實用並優越的。在一些實施方式中，細胞外游離DNA中的目標標記物以不超過0.08ng或不超過0.04ng的量存在於生物樣品中。
在一些實施方式中，步驟（c）的獲得的DNA在下一步驟（即步驟（d））之前用稀釋劑稀釋。在一些實施方式中，稀釋劑選自下組：不含核酸酶的水、Tris-EDTA緩衝液和沒有PCR抑制作用的任何其他緩衝液。在一些實施方式中，將步驟（c）的所述預擴增的DNA直接添加至下一步驟（即步驟（d）），而無需事先稀釋。
經處理的DNA中的所述至少一個目標標記物用預擴增引子庫預擴增。如本文所用，術語「引子」是指這樣的單鏈寡核苷酸，其能夠在合適的條件（例如緩衝液和溫度）下，在四種不同的三磷酸核苷和用於聚合的試劑（例如DNA聚合酶）的存在下，作為模板指導的DNA合成的起始點。在任何給定的情況下，引子的長度取決於例如引子的預期用途，並且通常在15至30個核苷酸的範圍內。短的引子分子通常需要較低的溫度才能與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引子不必反映模板的確切序列，但必須足夠互補以能與該模板雜交。引子位點是模板上與引子雜交的區域。引子對是一組引子，其包括與待擴增的序列的5’末端雜交的5’正向引子和與待擴增的序列的3’末端的互補鏈雜交的3’反向引子。所屬技術領域中具通常知識者可以基於本領域的通常知識根據待擴增的標記物設計引子（參見，例如PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995）。此外，一些用於設計在各種各樣分析中使用的最佳探針和/或引子的軟體包是公開的，例如可從美國馬薩諸塞州劍橋市的基因組研究中心（the Center for Genome Research, Cambridge, Mass., USA）獲得的Primer 3。顯然，在設計探針或引子時其潛在用途也應考慮在內。例如，設計用於本發明目的的引子可以包括至少一個CpG位點，或者從該引子獲得的擴增產物可以包括至少一個CpG位點。用於設計檢測DNA甲基化狀態的引子的工具也是本領域已知的，例如MethPrimer（Li LC and Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002 Nov;18(11):1427-31）。在本申請中，透過將預擴增引子作為引子庫，經處理的DNA中的任何目標標記物（至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分或至少一個目標標記物的一個亞區域）均可以被預擴增。
本文所用的術語「寡核苷酸」定義為包含兩個或更多個核苷酸（例如，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）的分子，較佳為至少5個核苷酸，更佳為至少約10-15個核苷酸，更佳為至少約15至30個核苷酸或更長（例如，寡核苷酸的長度通常少於200個殘基（例如，在15至100個核苷酸之間），但是，如本文所用，該術語也意在覆蓋更長的多核苷酸鏈）。確切的大小將取決於許多因素，而這些因素又取決於寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸通常用其長度來指代。例如，具有24個殘基的寡核苷酸被稱為「24聚體」（24-mer）。寡核苷酸可透過自身雜交或與其他多核苷酸雜交形成二級和三級結構。這樣的結構可以包括但不限於雙鏈體、髮夾、十字形、彎折和三鏈體。可以以任何方式產生寡核苷酸，包括化學合成、DNA複製、反轉錄、PCR或其任意組合。
如本文所用，術語「互補」是指核苷酸或核酸之間的雜交或鹼基配對，例如，雙鏈DNA分子的兩條鏈之間，或待定序或擴增的單鏈核酸上的引子結合位點和寡核苷酸引子之間。互補核苷酸通常是A和T（或A和U），或C和G。當一條鏈的核苷酸以最佳的方式對齊、並比較、並有適當的核苷酸插入或缺失後，與另一鏈的至少約80%（通常至少約90%至95%，更佳地為約98%至100%）的核苷酸配對，兩條單鏈RNA或DNA分子就被稱為是互補的。或者，當RNA鏈或DNA鏈在選擇性雜交條件下與其互補序列雜交時，互補存在。通常，當在至少14至25個核苷酸的一段上具有至少約65%（較佳至少約75%、更佳至少約90%）的互補性時，將發生選擇性雜交。參見M. Kanehisa,Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)，作為參考併入本文。
在一些實施方式中，預擴增引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。在一些實施方式中，預擴增引子庫包含多個甲基化特異性引子對。在一些實施方式中，預擴增步驟透過甲基化特異性PCR（「MSP」）進行，甲基化特異性PCR是使用甲基化特異性引子的PCR。Hermanet al. , Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci USA. 1996 September 3; 93 (18): 9821-6和United States Patent No. 6,265,171中已描述了該技術（即MSP）。
如本文所用，術語「甲基化特異性引子對」是指經特異性設計以識別CpG位點以利用甲基化的差異來擴增經處理的DNA中的特定目標標記物的引子對。引子僅作用於具有特定甲基化狀態或沒有特定甲基化狀態的分子。例如，引子可以是寡核苷酸，在嚴格條件、中等嚴格條件或高度嚴格條件下，其可以以甲基化特異性方式與具有甲基化的特定CpG位點特異性雜交，但不能與沒有甲基化的特定CpG位點雜交。因此，引子將特異性擴增在特定CpG位點具有甲基化的目標標記物。又例如，引子可以是寡核苷酸，在嚴格條件、中等嚴格條件或高度嚴格條件下，其可以以甲基化特異性的方式與未甲基化的特定的CpG位點特異性雜交，但是不能與甲基化的特定的CpG位點雜交。因此，引子將特異性擴增在特定CpG位點沒有甲基化的目標標記物。因此，在本申請中，對在經處理的DNA內的至少一個目標標記物的預擴增中使用甲基化特異性引子，可以區分甲基化的和未甲基化的CpG位點。本申請的甲基化特異性引子對包含至少一個與亞硫酸氫鹽處理的CpG二核苷酸雜交的引子。因此，所述特異性針對甲基化DNA的引子的序列包含至少一個CpG二核苷酸，並且所述特異性針對未甲基化DNA的引子的序列在CpG的C位置上包含「T」，和/或在CpG中G位置上包含「A」。
在一些實施方式中，所述至少一個甲基化特異性引子對包含一個正向引子和一個反向引子，所述引子均包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列與所述目標標記物之一（或目標標記物的亞區域）的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標標記物之一（或目標標記物的亞區域）的至少9個連續核苷酸包含至少一個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個）CpG位點。
如本文所用，術語「雜交」可以指其中兩條單鏈多核苷酸非共價形式結合以形成穩定的雙鏈多核苷酸的過程。在一個方面，所得的雙鏈多核苷酸可以是「雜交物」或「雙鏈」。「雜交條件」中的鹽濃度通常約小於1M，經常小於約500mM並且可以小於約200mM。「雜交緩衝液」包括緩衝鹽溶液，例如5% SSPE，或本領域已知的其他此類緩衝液。雜交溫度可以低至5℃，但是通常高於22℃，並且更為通常地高於約30℃，並且通常超過37℃。雜交通常在嚴格條件下進行，即，在該條件下序列將與其目標序列雜交但不與其他非互補序列雜交。嚴格條件是取決於序列的，並且在不同情況下有所不同。例如，更長的片段可能需要比短片段更高的雜交溫度才能進行特異性雜交。由於其他因素可能會影響雜交的嚴格性，包括鹼基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在以及鹼基錯配的程度，因此參數組合比單獨使用任何一個參數的絕對測量更為重要。通常嚴格條件被選定為比特定序列在特定的離子強度和pH下的解鏈溫度（Tm ）低約5℃。
Tm 可以是雙鏈核酸分子群體中的一半被分離成單鏈的溫度。用於計算核酸的Tm 的幾個方程式是本領域眾所周知的。如標準參考文獻所示，當核酸在1M NaCl水溶液中時，可以透過公式Tm =81.5+0.41（％G+C）計算出簡單估算的Tm 值（參見例如Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid Hybridization (1985)）。其他參考文獻（例如Allawi and SantaLucia, Jr., Biochemistry, 36:10581-94 (1997)）包括替代的計算方法，其計算Tm 時將結構和環境以及序列特徵等考慮在內。
通常，雜交物的穩定性是關於離子濃度和溫度的函數。通常，雜交反應在較低嚴格條件下進行，然後在具有不同但較高嚴格性的洗滌液中洗滌。示例性的嚴格條件包括pH約7.0至約8.3、溫度至少25℃、鈉離子（或其他鹽）濃度為至少0.01M至不超過1M。例如，5 x SSPE（750 mM NaCl，50 mM磷酸鈉，5 mM EDTA，pH 7.4）和約30°C的溫度適合於等位基因特異性雜交，儘管合適的溫度取決於雜交區域的長度和/或GC含量。在一個方面，確定錯配百分比的「雜交嚴格性」可以如下：1）高度嚴格性：0.1 x SSPE，0.1% SDS，65°C；2）中等嚴格性（也稱為中度嚴格性）：0.2 x SSPE，0.1% SDS，50 °C；3）低嚴格性：1.0 x SSPE，0.1% SDS，50°C。應當理解，使用替代的緩衝劑、鹽和溫度可以達到相同的嚴格性。例如，中等嚴格雜交可以是指允許核酸分子（例如探針）結合互補核酸分子的條件。雜交的核酸分子通常具有至少60%的同一性，包括例如至少70%、75%、80%、85%、90%或95%的同一性。中等嚴格條件可以是與下述條件達到同等效果的條件：42°C，50%甲醯胺，5 x Denhardt溶液，5x SSPE，0.2% SDS雜交，然後用42°C，0.2x SSPE，0.2% SDS進行洗滌。高度嚴格條件可以透過如下條件提供，例如，42°C，50% 甲醯胺，5 x Denhardt溶液，5 x SSPE，0.2% SDS雜交，然後65°C，0.1x SSPE和0.1% SDS中洗滌。低嚴格性雜交可以是與下述條件達到同等效果的條件：22°C，10%甲醯胺，5 x Denhardt溶液，6 x SSPE，0.2％SDS雜交，然後在1x SSPE，0.2% SDS中於37°C洗滌。Denhardt的溶液包含1%聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮和1%牛血清白蛋白（BSA）。20 x SSPE（氯化鈉，磷酸鈉，EDTA）包含3 M氯化鈉、0.2 M磷酸鈉和0.025 M EDTA。其他合適的中等嚴格性和高度嚴格性雜交緩衝液和條件是所屬技術領域中具通常知識者眾所周知的，並且描述於例如Sambrooket al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989)和Ausubelet al. , Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons (1999)。
在一些實施方式中，預擴增引子庫還包含用於擴增對照標記物的對照引子對。通常，對照標記物是具有已知特徵（例如，序列已知，每個細胞的拷貝數已知）的核酸，用於與實驗目標（例如，濃度未知的核酸）進行比較。對照可以是內源的，較佳為不變的基因，可以將分析中的實驗核酸或目標核酸相對其進行標準化。此類因為樣品間差異而標準化的對照可能發生在例如樣品處理，分析效率等，並且允許精確的樣品間數據比較，定量分析擴增效率和偏差。
在一些實施方式中，所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。在一些實施方式中，對照引子對的序列如下表2的SEQIDNO：55和56所示。
在一些實施方式中，所述至少一個甲基化特異性引子對包含如下表2所示的一對或多對選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171。本申請中使用的引子對的序列號以「SEQ ID NO：n/m」的形式表示。例如，SEQ ID NO：1/2是指分別具有如下表2所示的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列的引子對。
SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171所示的引子對被分別用於擴增標記物NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、基因間隔區1、ASCL4、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區4、NKX2-6、SLC24A2、基因間隔區5和IRF4。
在一些實施方式中，在步驟（c）中，所述至少一個目標標記物在一個或多個封閉寡核苷酸的存在下被擴增。此類封閉寡核苷酸的用途已經被描述於Yuet al. ,BioTechniques 23:714-720, 1997。封閉序列與預擴增引子對同時與經處理的DNA雜交。目標標記物的預擴增終止於封閉序列的5’位置，使得目標標記物的預擴增在與封閉序列互補的序列存在的情況下被抑制。封閉序列可以被設計為以甲基化狀態特異性方式與經處理的DNA雜交。例如，為了檢測未甲基化核酸群體中的甲基化核酸，可以透過使用在相關位置包含「CpA」或「TpA」的封閉序列來抑制在所述位置未甲基化的核酸的擴增，與之對應，如果需要抑制甲基化核酸擴增，則使用「CpG」。
對於使用了封閉寡核苷酸的PCR方法，對聚合酶介導的擴增的有效干擾要求封閉寡核苷酸不能被聚合酶延長。較佳地，這是透過使用封閉物來實現的，所述封閉物為3'-脫氧寡核苷酸或在3'位置衍生的具有「游離」羥基以外的寡核苷酸。例如，3'-O-乙醯基寡核苷酸是較佳的封閉物分子類別的代表。
另外，聚合酶介導的封閉寡核苷酸的分解應當被阻止。較佳地，此類阻止包括使用缺乏5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶，或使用例如在其5'-末端具有硫醇鹽橋的修飾的封閉寡核苷酸，使封閉物分子抗核酸酶。特定的應用可能不需要對封閉物進行5'修飾。例如，如果封閉物結合位點和引子結合位點重疊，因而阻止了引子的結合（例如使用過量的封閉物），封閉寡核苷酸的降解將被基本上阻止。這是因為聚合酶不會將引子延伸至、並超過封閉物（沿5'-3'方向），該過程通常會導致雜交的封閉寡核苷酸降解。
出於本申請的目的並且也如本文所實施，特別佳的封閉物/PCR實施方式包括使用肽核酸（PNA）寡聚物作為封閉寡核苷酸。此類PNA封閉低聚物是理想的，因為它們既不會被分解也不會被聚合酶延伸。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是用DNA聚合酶預擴增的。如本文所用，術語「DNA聚合酶」是指催化三磷酸單脫氧核糖核苷酸（dNTP）合成多聚脫氧核糖核苷酸的酶，其完成在DNA複製、修復以及在某些情況下細胞分化中的最基本功能。
原核生物中的DNA聚合酶的實例包括DNA聚合酶I、DNA聚合酶II、DNA聚合酶III、DNA聚合酶IV和DNA聚合酶V。已知在大腸桿菌（E. coli ）中有DNA聚合酶I、II和III。 DNA聚合酶III在基因組複製中似乎是最重要的。DNA聚合酶I的重要性在於其可以在增長的鏈的末端刪除掉未配對的鹼基。逆轉錄病毒具有獨特的DNA聚合酶，即，逆轉錄酶，它使用RNA模板合成DNA。對於真核生物，DNA聚合酶的實例是聚合酶α、β、λ、γ、σ、μ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、θ和Rev1。動物細胞的DNA聚合酶負責DNA在細胞核和粒線體中的複製。
在預擴增步驟中使用的PCR試劑可以是任何可商購的PCR混合物（例如KAPA2G Fast Multiplex PCR Kit, Luna® Universal Probe qPCR Master Mix, EpiTect MethyLight PCR Kit等），其用於擴增經處理的DNA。或者，所屬技術領域中具通常知識者可以在實驗室中製備包括Mg2+ 、dNTP、DNA聚合酶等的PCR試劑。所屬技術領域中具通常知識者還可以根據實際需要選擇合適的PCR反應系統和PCR反應條件。在一些實施方式中，步驟（c）的預擴增包括5至30個反應循環，其中每個循環包括在85〜99℃下反應5秒到5分鐘，然後在40〜80℃下反應5秒到5分鐘。在一些實施方式中，步驟（c）的預擴增包括10至20個反應循環，其中每個循環包括在90〜99℃下反應15秒到2分鐘，然後在45〜60℃下反應30秒到3分鐘。在一些實施方式中，步驟（c）的預擴增包括15個反應循環，其中每個循環包括在95℃下反應30秒，然後在56℃下反應60秒。
步驟（ d ）
在根據本申請的方法的步驟（d）中，如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量。在本申請中，步驟（d）也可以被命名為定量分析步驟。
如本文所用，術語「甲基化狀態」指的是DNA區域內的一個特定的核苷酸或多個核苷酸的甲基化的存在、不存在和/或甲基化的數量。特定DNA序列的甲基化狀態（例如，本文所述的目標標記物）可以指示序列中每個鹼基的甲基化狀態，或者可以指示序列中的鹼基對的子集的甲基化狀態（例如，胞嘧啶殘基的甲基化狀態或一個或多個特定的限制酶識別序列的甲基化狀態），或者可以指示序列中區域甲基化密度的資訊，雖然不能提供甲基化發生在序列中何處的精確資訊。甲基化狀態可以任選地由「甲基化含量」來表示或指示。甲基化含量可以透過例如定量分析在用甲基化敏感性限制性酶進行限制性消化後存在的完整DNA的量來確定。在該例中，如果使用定量PCR對DNA中的特定序列進行定量分析，模板DNA的量大約等於模擬處理的對照則表明該序列未高度甲基化，而模板量明顯少於模擬處理的樣品中的模板量則表明該序列中存在甲基化DNA。因此，如上述例子中的甲基化含量代表著甲基化狀態，並且因此可以用作甲基化狀態的定量指標。當需要將樣品中序列的甲基化狀態與閾值含量進行比較時，這尤其有用。
在DNA序列內一個或多個特定的CpG甲基化位點（每個具有兩個CpG二核苷酸序列）的甲基化狀態包括「未甲基化」、「完全甲基化」和「半甲基化」。術語「半甲基化」是指雙鏈DNA其中僅其一條鏈被甲基化的甲基化狀態。術語「超甲基化」是指，相對於正常對照DNA樣品中的相應的CpG二核苷酸處5-甲基胞嘧啶的數量，在檢測的DNA樣品的DNA序列中一個或多個CpG二核苷酸處5-甲基胞嘧啶的數量增加所對應的平均甲基化狀態。一個殘基的甲基化狀態可以是定性讀數或定量讀數，例如透過甲基化含量來表示的。在本申請中，術語「甲基化狀態」和「甲基化含量」可以互換使用。根據本申請，可以同時確定一個以上的不同甲基化含量。
如本文所述，如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲得的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的5種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的5種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和IRF4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包括選自下組的至少兩種、三種、四種、五種、六種或七種目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、NDRG4、BCAN、VAV3、IRF4或其任何組合。上文步驟（c）小節中有關「目標標記物」的詳細描述（包括但不限於目標標記物的定義，目標標記物的特定組合等）也適用於步驟（d）中記載的「從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物」（對於不存在步驟（c）的情況）。DNA序列（例如目標標記物）內的一個或多個CpG二核苷酸序列的甲基化含量/狀態可以透過本領域中已知的各種分析方法來確定。
在一些實施方式中，步驟（d）的所述定量分析是透過以下方式進行：聚合酶鏈式反應（例如即時聚合酶鏈式反應、數位聚合酶鏈式反應）、核酸定序、基於質量的分離（例如電泳法、質譜法）或標靶捕獲（例如雜交、微陣列）。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲得的DNA透過使用MSP（參見Herman，同上）分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量。例如，透過使用在中等和/或高度嚴格條件下與未轉化序列特異性雜交的一種或多種引子，僅當模板在CpG位點包含甲基化胞嘧啶時才產生擴增產物。
在一些實施方式中，步驟（d）的定量分析透過即時PCR進行。即時PCR的非限制性實例包括Cottrellet al. ,Nucl. Acids Res. 32: e10, 2003描述的HeavyMethylTM PCR；Eadset al. ,Cancer Res. 59:2302-2306, 1999描述的MethyLight™ PCR；Randet al. ,Nucl. Acids Res. 33:e 127, 2005描述的Headloop PCR。
如本文所用，術語「HeavyMethylTM PCR」是指本領域公認的一種即時PCR技術，其中一個或多個不可延伸性核酸（例如，寡核苷酸）封閉物以甲基化特異性方式與亞硫酸氫鹽處理的核酸結合（即，封閉物在中等至高等嚴格條件下與未突變的DNA特異性結合）。使用一種或多種引子進行擴增反應，所述引子可以任選地是甲基化特異性的，但旁側分佈一個或多個封閉物。在未甲基化的核酸（即未突變的DNA）存在的情況下，封閉物結合並且無PCR產物產生。使用基本上像例如Hollandet al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 88:7276-7280, 1991所述的TaqManTM 分析方法，樣品中核酸的甲基化含量得以確定。
如本文所用，術語「MethyLight™ PCR」是指基於本領域公認的一種基於螢光的即時PCR技術，其中採用了稱為TaqManTM 探針的雙標記螢光寡核苷酸探針，並且被設計為可同位於正向和反向擴增引子之間的富含CpG的序列雜交。所述的TaqMan™探針包含一個螢光「報告因子部分」和「淬滅劑部分」共價結合到與TaqMan™寡核苷酸的核苷酸相連的接頭部分（例如，亞磷醯胺）。在PCR擴增過程中，與富含CpG的序列雜交的TaqMan™探針被Taq聚合酶的5’核酸酶活性切割，從而在PCR反應過程中產生以即時方式檢測的信號。在該方法中，可以將分子信標用作可檢測的探針，並且該系統不依賴於所使用的DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性（參見Mhlanga and Malmberg,Methods 25:463-471, 2001）。
如本文所用，術語「Headloop PCR」是指本領域公認的一種即時PCR，其選擇性地擴增目標核酸，但是透過將3’莖環延伸形成不能進一步提供擴增模板的髮卡結構來抑制非擴增目標變體的擴增。
在一些實施方式中，所述即時PCR是多重即時PCR。
如本文所用，術語「多重」可指，透過使用一個以上的標記物，每個標記物具有至少一個不同的檢測特徵，例如螢光特徵（例如，激發波長、發射波長、發射強度、FWHM（半峰高處的全寬度）或螢光壽命）或獨特的核酸或蛋白序列特徵，可以同時對多個標記物（例如多個核酸序列）的存在和/或量進行測定的分析或其他分析方法。
在一些實施方式中，步驟（d）的定量分析透過核酸定序進行。核酸定序的示例性方法是本領域已知的，參見，例如Frommeret al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992; Clarket al. ,Nucl. Acids Res. 22:2990-2997, 1994。例如，透過將未使用亞硫酸氫鹽處理的樣品獲得的序列或目標區域的已知核苷酸序列與使用亞硫酸氫鹽處理的樣品獲得的序列進行比較，有助於鑑定DNA序列中甲基化胞嘧啶。與未處理的樣品相比，在亞硫酸氫鹽處理的樣品中的任意胞嘧啶位點檢測到的胸腺嘧啶殘基都可以認為是由亞硫酸氫鹽處理而引起的突變，即該位點存在甲基化的胞嘧啶。
用於定序DNA的方法是本領域已知的，並且包括例如雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert法（參見Sambrooket al. ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. , CSHP, New York 1989)）、焦磷酸定序（參見Uhlmannet al. ,Electrophoresis , 23: 4072-4079, 2002）、固相焦磷酸定序（參見Landegrenet al. ,Genome Res. , 8(8): 769-776, 1998）、固相微定序（參見例如，Southernet al. ,Genomics , 13:1008-1017, 1992）、採用FRET的微定序（參見例如，Chen and Kwok,Nucleic Acids Res . 25:347-353, 1997）、連接法定序或超深度定序（參見Marguileset al. ,Nature 437 (7057): 376-80 (2005)）。
在一些實施方式中，步驟（d）的所述定量分析透過基於質量的分離（例如電泳、質譜法）進行。
例如，甲基化胞嘧啶殘基的存在可以透過聯合亞硫酸氫鹽限制分析法（COBRA）進行檢測，基本如Xiong and Laird,Nucl. Acids Res., 25:2532-2534, 2001所述。這種方法利用了在使用可以選擇性地突變未甲基化的胞嘧啶殘基的化合物（例如，亞硫酸氫鹽）處理之後，在甲基化和未甲基化的核酸之間的限制酶識別位點的差異。例如，限制性核酸內切酶Taq1切割序列TCGA，在對未甲基化核酸進行亞硫酸氫鹽處理後該序列將是TTGA，因此將不被切割。然後使用本領域已知的檢測手段例如電泳和/或質譜法，檢測消化的和/或未消化的核酸。
又例如，在用選擇性突變未甲基化胞嘧啶殘基的化合物處理後，基於核苷酸序列和/或二級結構的差異，使用不同的技術來檢測擴增產物中核酸差異，例如甲基化特異性單鏈構象分析（MS-SSCA）（Biancoet al. ,Hum. Mutat. , 14:289-293, 1999）、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳（MS-DGGE）（Abrams and Stanton,Methods Enzymol. , 212:71-74, 1992）和甲基化特異性變性高效液相色譜（MS-DHPLC）（Denget al. ,Chin. J. Cancer Res. , 12:171-191, 2000）。
在一些實施方式中，步驟（d）的定量分析是透過標靶捕獲（例如雜交、微陣列）來進行的。
透過雜交的合適的檢測方法是本領域已知的，例如Southern、斑點印跡、狹縫印跡或其他核酸雜交方式（Kawaiet al. ,Mol. Cell. Biol. 14:7421 -7427, 1994; Gonzalgoet al. ,Cancer Res. 57:594-599, 1997）。在一些實施方式中，用於雜交分析的探針被可檢測地標記。在一些實施方式中，用於雜交分析的基於核酸的探針是未標記的。這種未標記的探針可以固定在固體載體如微陣列上，並且可以與被可檢測地標記的目標核酸分子雜交。
微陣列的一個實例是甲基化特異性微陣列，其可用於區分具有轉化的胞嘧啶殘基的序列和具有未轉化的胞嘧啶殘基的序列（參見Adorjanet al. ,Nucl. Acids Res. , 30: e21, 2002）。基於雜交的分析還可被用於用甲基化敏感的限制酶處理後的核酸。
又例如，可透過寡核苷酸探針確定DNA序列內CpG二核苷酸序列的甲基化狀態，所述寡核苷酸探針與PCR擴增引子同時與亞硫酸氫鹽處理的DNA雜交（其中所述引子可以是甲基化特異性引子或標準引子）。
在一些實施方式中，步驟（d）在檢測試劑的存在下進行。如本文所用，術語「檢測試劑」是在定量分析步驟中用於檢測核酸的存在、不存在或量的試劑。
本領域已知的各種檢測試劑在本申請中都可使用。在一些實施方式中，檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。
在一些實施方式中，螢光探針選自下列表2中所示的SEQ ID NO：57-85、172。
在一些實施方式中，螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或TAMRA）。
標記可以透過直接或間接方法來完成。直接標記關於將標記直接（共價或非共價）偶聯至試劑上。間接標記關於第二試劑與第一試劑的結合（共價或非共價）。第二試劑應與第一試劑特異性結合。所述第二試劑可以與合適的標記偶聯和/或第二試劑是可與第二試劑結合的第三試劑的目標（受體）。使用二級、三級甚至更高階的試劑通常會增加信號強度。合適的二級和高級試劑可以包括抗體、二級抗體和眾所周知的鏈黴親和素-生物素系統（Vector Laboratories，Inc.）。試劑或基質也可以被本領域中已知的一個或多個標籤「標記」。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包含使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（c）中所獲取的DNA進行擴增，其中所述獲取的DNA的至少一部分被擴增。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包含使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物進行擴增。
如本文所用，術語「定量引子對」是指在定量分析步驟中使用的一個或多個引子對。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）使用的所述定量引子對能夠與步驟（c）中所獲取的DNA的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對能夠與步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）中所使用的至少一個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28或更多個）定量引子對與在步驟（c）的預擴增引子庫中的至少一個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28或更多個）甲基化特異性引子對相同。
在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對被設計為用於擴增步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少一部分。在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對被設計為用於擴增步驟（c）中所獲取的DNA的至少一部分，即步驟（c）和步驟（d）被設計為巢式PCR。
巢式PCR是PCR的一種改進，旨在提高靈敏度和特異性。巢式PCR關於使用兩個引子組和兩個連續的PCR反應。進行第一輪擴增以產生第一擴增子，並使用一個引子對進行第二輪擴增，其中一個或兩個引子與由初始引子對界定的區域內的位點退火，即第二個引子對被認為是「嵌套」在第一對引子中。以這種方式，不包含正確內部序列的來自第一次PCR反應的背景擴增產物在第二次PCR反應中不再被進一步擴增。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的一個或多個TpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的一個或多個TpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。在一些實施方案中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的一個或多個CpA二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的一個或多個CpA二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。
在一些實施方式中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析是透過將步驟（c）中所獲取的DNA分成多個部分來進行。在一些實施方式中，如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析是透過將步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物分成多個部分來進行。在一些實施方式中，對多個部分進行多個不同的定量分析實驗，其中在多個部分之一中定量分析所述從步驟（c）中所獲取的DNA（或從步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物），如果存在於部分中，則將其在多個部分之一中定量。在一些實施方式中，定量分析每個部分中的對照標記物。
步驟（ e ）
在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法的步驟（e）中，步驟（d）的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量分別與相應的參考含量進行比較，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在正在接受結直腸瘤治療的個體監測其對治療反應的方法的步驟（e）中，分別比較步驟（d）中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a），步驟（b），可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
根據本申請的方法的步驟（e）也可以被稱為比較步驟。
本文所用的術語「比較」是指分別對檢測的生物樣本所含有的透過定量分析步驟獲取的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量與其相應的參考含量進行對比。應當理解，本文所用的術語是指相應參數或值的比較，例如，將絕對量與絕對參考量進行比較，將濃度與參考濃度進行比較，或從檢測的樣本中獲得的強度信號同參考樣本的同類型的強度信號進行比較。可以透過手動或電腦輔助進行比較。對於電腦輔助進行的比較，可以將所確定的量的值與透過電腦程序儲存在資料庫中的合適參考的值進行比較。該電腦程序可以進一步評估比較的結果，並以合適的輸出格式自動提供期望的評估。基於定量分析步驟中至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量與相應參考含量的比較，可以識別出患有結直腸瘤、或者有結直腸瘤形成或形成的風險、或者有結直腸瘤發展或發展的可能性增加、或者有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險的個體；還可以在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應。
如本文所用，術語「參考含量」是指將個體納入或排除結腸直腸瘤或結腸直腸瘤的形成或形成的風險的閾值含量，或是指用於在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的閾值含量。
例如，對於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，如果檢測樣本中一個或多個目標標記物的甲基化含量等於或高於其相應的參考含量，則該個體可被認為患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。在一些實施方式中，檢測樣本中一個或多個目標標記物的甲基化含量至少是其相應參考含量的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。在本申請中，為了在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後，不需要每個目標標記物的甲基化含量均等於或高於其相應的參考含量。準確的說，如果在定量分析步驟中進行定量分析的至少一種目標標記物的甲基化含量等於或高於其相應的參考含量就足夠了。
又例如，對於在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，如果測試樣品的一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低，則該個體可被認為對治療有反應。在一些實施方式中，在進行結直腸瘤治療後獲得的生物樣品中的一種或多種目標標記物的甲基化含量至少比進行結直腸瘤治療之前的相應甲基化含量低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%。在本申請中，為了在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應，不需要每個目標標記物的甲基化含量均低於其接受結直腸瘤治療前的相應參考含量。準確的說，如果在定量分析步驟中進行定量分析的至少一種目標標記物的甲基化含量低於其接受結直腸瘤治療前的相應參考含量就足夠了。
目標標記物的甲基化的參考含量可以源自一個或多個參考樣品，其中參考含量獲自與檢測目的樣品的實驗平行進行的實驗。或者，可以在資料庫中獲得參考含量，該資料庫包括來自一個或多個參考樣品或疾病參考樣品的數據、標準或含量的集合。在一些實施方式中，此類數據、標準或含量的集合被標準化，以便可用於與來自一個或多個樣品的數據進行比較的目的。「標準化」是將測量原始數據轉換為可以直接與其他標準化數據進行比較的數據的過程。標準化被用於克服因不同的分析方法裡因素不同而導致的、分析方法特異性的誤差，例如上樣量的不同、結合效率的不同、檢測靈敏度的不同和其他各類的誤差。
在一些實施方式中，參考資料庫包括來自一個或多個參考樣品的目標標記物和/或其他實驗室和臨床數據的甲基化含量。在一些實施方式中，參考資料庫包括目標標記物的甲基化含量，其各自被標準化為在與參考樣品相同的條件下檢測的對照標誌物的甲基化含量的百分比。為了與目標標記物的如此標準化甲基化含量進行比較，測試樣品的目標標記物的甲基化含量也被測量並計算為在與測試樣品相同的條件下檢測的對照標記物的甲基化含量的百分比。
在一些實施方式中，透過匯總獲自健康個體和/或非腫瘤個體（即已知沒有腫瘤的個體）的參考樣品的參考含量數據來建立參考資料庫。在一些實施方式中，透過匯總獲自正在接受結直腸瘤治療的個體的參考樣品的參考含量數據來建立參考資料庫。在一些實施方式中，透過匯總獲自結直腸瘤不同階段的個體的參考樣品的數據來建立參考資料庫，所述結直腸瘤不同階段是透過例如目標標記物的不同的甲基化含量來證明的。
所屬技術領域中具通常知識者可以根據期望的靈敏度和特異性來選擇參考含量。確定合適的參考含量的手段是所屬技術領域中具通常知識者已知的，例如參考含量可以從臨床研究中收集的數據來確定。
在一些實施方式中，步驟（e）的參考含量是基於從患有結直腸瘤或具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本和從未患結直腸瘤或不具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本來確定的。
所屬技術領域中具通常知識者可以基於各種因素，例如年齡、性別、病史、家族史、症狀等，來確定個體是否患結直腸瘤或具有患結直腸瘤的風險。
在一些實施方式中，用循環閾值（即Ct值）來表示目標標記物的甲基化含量和參考含量。如本文所用，術語「Ct值」是指在背景信號以上可以檢測到PCR產物的螢光的循環數。Ct值與樣品中目標標記物的數量成反比，即Ct值越低，樣品中目標標記物的數量就越大。
例如，在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法的步驟（e）中，其中至少一個目標標記物的Ct值相對於其相應的參考Ct值相同或更低表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。在一些實施方式中，如果步驟（d）的多個目標標記物中的至少一個的Ct值比其對應的參考Ct值低2-10個循環（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個循環），則確定所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
如本文所用，術語「可能性增加」，是指與從中獲得參考樣品的個體相比，在個體發展結直腸瘤或有結直腸瘤預後不良的可能性含量方面總體增加5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
又例如，在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法的步驟（e）中，步驟（d）的目標標記物的Ct值與參考Ct值進行比較，其中至少一個目標標記物的Ct值相比其治療前的相應的Ct值更高表明所述個體對治療有反應。在一些實施方式中，如果步驟（d）的多個目標標記物中的至少一個的Ct值比其進行治療之前的相應的參考Ct值高2-10個循環（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個循環），則確定該個體對結直腸瘤的治療有反應。
2. 試劑盒
在另一方面，本申請還提供了一種用於診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的試劑盒，其包含： 處理DNA的第一試劑，其中所述第一試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點； 任選地第一引子庫，所述第一引子庫包含用於預擴增選自下組的至少一個目標標記物的至少一個目標序列的至少一個引子對：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5，其中所述至少一個引子對可與被所述第一試劑處理後的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標序列包含至少一個CpG位點；和 第二試劑，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑用於定量分析被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個（例如，每個）目標標記物中的甲基化含量；如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑用於定量分析經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種（例如兩種，三種）標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑包含第二引子庫，所述第二引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑包括第三引子庫，所述第三引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物中的至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第二引子庫中的至少一個定量引子對和所述第一引子庫中的至少一個引子對相同。在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第二引子庫中的定量引子對被設計為用於擴增被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列內的至少一部分。在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫的定量引子對被設計為用於擴增經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少一個目標序列中的至少一部分。在一些實施方式中，所述第一、第二或第三引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。
在一些實施方式中，所述第一引子庫和所述第二引子庫被包裝在單一容器內或被包裝在獨立容器內。在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含一個或多個封閉寡核苷酸。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含檢測試劑。在一些實施方式中，所述檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。在一些實施方式中，所述螢光探針包括選自下組的寡核苷酸序列：SEQ ID NO: 57-85、172。在一些實施方式中，所述螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、TAMRA或lowa Black Dark Quenchers）。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含DNA聚合酶和/或適合存放從所述個體中獲取的所述生物樣品的容器。在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含使用說明書和/或對試劑盒檢測結果的解釋。
在一些實施方式中，所述試劑盒可包含包裝在獨立的容器中的反應緩衝液，該反應緩衝液針對由聚合酶介導的引子延伸（例如PCR）進行了最佳化。較佳的是這樣的試劑盒：其進一步包括容器，所述容器適合容納用於在個體的生物樣品中確定選自下組的至少1個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多個）目標標記物的甲基化的裝置：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、NDRG4、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，所述第一試劑包括亞硫酸氫鹽試劑或甲基化敏感限制酶（MSRE）。在一些實施方式中，所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。在一些實施方式中，亞硫酸氫鹽試劑是亞硫酸氫鈉。在一些實施方式中，所述MSRE選自下組：Hpa II酶、Sal I酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
在一些實施方式中，所述第一引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對，用於預擴增選自下組的至少一個目標標記物中的至少一個目標序列：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包含選自下組的一個或多個標記物（例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28個標記物）：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物可以是至多一個目標標記物（即，一個標記物且不超過一個標記物）。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是Septin9。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是NDRG4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是PKNOX2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是VAV3。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IRF4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是POU4F2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是SALL1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是TMEFF2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是ASCL4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是FGF12。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是基因間隔區1。
在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物包括多個目標標記物。在一些實施方式中，多個目標標記物包含至少兩個或三個選自下組的標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。在一些實施方式中，本申請的多個目標標記物進一步包含一個、兩個、三個、四個或五個額外的選自下組的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，本申請的多個目標標記物進一步包含一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 ，17、18、19、20個）額外的選自下組的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含Septin9和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、BCAT1、IKZF1、NDRG4、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAT1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、NDRG4、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IKZF1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、BCAT1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、BCAT1、PKNOX2、NDRG4、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9和/或BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAN和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含VAV3和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、NDRG4和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IRF4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、NDRG4、PKNOX2、VAV3或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或NDRG4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含PKNOX2和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含NDRG4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、ASCL4、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、FGF12、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、BCAN或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，所述的各個目標標記物包括或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域：
目標標記物 Hg19 座標
NDRG4 chr16:58496750-58547532
BCAT1 chr12:24964295-25102393
IKZF1 chr7:50343720-50472799
Septin9 chr17:75276651-75496678
SDC2 chr8:97505579-97624000
VAV3 chr1:108113782-108507766
IRF4 chr6:391739-411447
TMEFF2 chr2:192813769-193060435
SALL1 chr16:51169886-51185278
BCAN chr1:156611182-156629324
POU4F2 chr4:147560045-147563626
PKNOX2 chr11:125034583-125303285
ASCL4 chr12:108168162-108170421;
KCNA6 chr12:4918342-4960277;
SOX1 chr13:112721913-112726020;
HS3ST2 chr16:22825498-22927659;
FGF12 chr3:191857184-192485553;
KCTD8 chr4:44175926-44450824;
HMX1 chr4:8847802-8873543;
MARCH11 chr5:16067248-16180871;
CRHBP chr5:76248538-76276983;
NKX2-6 chr8:23559964-23564111
SLC24A2 chr9:19507450-19786926
基因間隔區1 chr6:19679885-19693988
基因間隔區2 chr10:130082033-130087148
基因間隔區3 chr10:133107880-133113966
基因間隔區4 chr7:152620588-152624685
基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）甲基化敏感限制酶（MSRE）處理後的a）的對應區域。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫存在，則所述第一引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由選自下組的如下表2所示的至少一對核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171，任選地其中所述第二引子庫包含至少一個與所述第一引子庫中的至少一個引子對相同的引子對。
在一些實施方式中，如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由選自下組的如下表2所示的至少一對核苷酸序列組成SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50，51/52、53/54和170/171。
在一些實施方式中，所述第一引子庫、所述第二引子庫，或可選地所述第三引子庫進一步包含用於擴增對照標記物的引子對。在一些實施方式中，所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。
在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含多個容器，每個容器均用於接收所述第二引子庫的組分。
在一些實施方式中，所述試劑盒還包含可用於進行CpG位置特異性甲基化分析的標準試劑，其中所述分析包括以下一種或多種技術：MS-SNuPE、MSP、MethyLight™、HeavyMethylTM 、COBRA和核酸定序。
在一些實施方式中，所述試劑盒可包含選自下組的額外的試劑：緩衝液（例如限制酶、PCR、保存或洗滌緩衝液）、DNA回收試劑或試劑盒（例如沉澱、超濾、親和柱）和DNA回收組件。
在一些實施方式中，本申請的試劑盒可包含： 亞硫酸氫鹽試劑； 可選地第一引子庫，所述引子庫包含多個甲基化特異性引子對，用於在包含至少2個（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多個）選自下組的標記物的多個目標標記物中預擴增至少兩個目標序列：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、NDRG4、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP，其中所述甲基化特異性引子對包含或由選自下組的如下表2所示的至少兩對核苷酸序列組成：SEQ ID NO: 1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171； 第二試劑，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑用於定量分析被所述第一引子庫預擴增的多個目標標記物的至少一個（例如，每個）的甲基化含量，其中所述第二試劑包含第二引子庫，所述第二引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與被所述第一引子庫預擴增的所述多個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交；如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑用於定量分析經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5，其中所述第二試劑包含第三引子庫，所述第三引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物中的至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
本申請的試劑盒還可包含包裝在獨立容器中的其他組分，例如適用於封閉、洗滌或包覆的緩衝液或溶液。
本申請的試劑盒可進一步包含在DNA富集領域中已知的以下組分的一種或幾種：蛋白質組分，所述蛋白質選擇性地結合甲基化的DNA；三鏈形成核酸組分，一個或多個接頭，任選地在合適的溶液中；用於進行連接的物質或溶液，例如連接酶、緩衝液；用於進行管柱層析的物質或溶液；用於進行免疫學為基礎的富集（例如免疫沉澱）的物質或溶液；用於進行核酸擴增的物質或溶液，例如PCR；一種染料或幾種染料，若適用於偶聯劑，若適用於溶液中；用於進行雜交的物質或溶液；和/或用於進行洗滌步驟的物質或溶液。
3. 用途
在另一方面，本申請提供了本申請的試劑盒在製造用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後或監測接受結直腸瘤治療的個體對治療的反應的診斷試劑盒中的用途。
在另一方面，本申請提供用於定量分析目標標記物的甲基化含量的試劑在製造試劑盒中的用途，所述試劑盒被用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法中，其中所述方法包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化和甲基化的CpG位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物中的至少一部分，其中至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
在另一方面，本申請提供用於定量分析目標標記物的甲基化含量的試劑在製造試劑盒中的用途，所述試劑盒被用於在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法中，其中所述方法包括如下步驟： 從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； 用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化和甲基化的CpG位點，從而獲得經處理的DNA； 用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分，其中至少一個（例如，每個）目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； 如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別比較步驟（d）中的所述至少一個（例如，每個）目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a）、步驟（b）、可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
在一些實施方式中，上述步驟（c）的所述至少一種目標標記物包括一種或多種選自下組的標記物（例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28個標記物）：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4、和基因間隔區5。
在一些實施方式中，上述步驟（c）的所述至少一個目標標記物可以是至多一個目標標記物（即，一個標記物且不超過一個標記物）。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是Septin9。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是BCAN。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是PKNOX2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是VAV3。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是IRF4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是NDRG4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是POU4F2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是SALL1。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是TMEFF2。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是ASCL4。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是FGF12。在一些實施方式中，所述至少一個目標標記物是基因間隔區1。
在一些實施方式中，上述步驟（c）的所述至少一個目標標記物包括多個目標標記物。在一些實施方式中，多個目標標記物包含至少兩個或三個選自下組的標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。在一些實施方式中，本申請的多個目標標記物進一步包含一個、兩個、三個、四個或五個額外的選自下組的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物進一步包含選自下組的一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個）額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含Septin9和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN 、BCAT1、IKZF1、NDRG4、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、BCAT1和/或IKZF1。
一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAT1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、NDRG4、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9、和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IKZF1和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：BCAN、Septin9、BCAT1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含BCAN、Septin9、BCAT1、PKNOX2、NDRG4、VAV3、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含NDRG4、Septin9和/或BCAT1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含BCAN和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、NDRG4、IRF4、PKNOX2或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含VAV3和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含IRF4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、NDRG4、PKNOX2、VAV3或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含PKNOX2和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、NDRG4、IRF4或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
在一些實施方式中，本申請所述的多個目標標記物包含NDRG4和選自下組的至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個）額外的目標標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、BCAN、POU4F2、PKNOX2、SDC2、TMEFF2、SALL1、SLC24A2、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、ASCL4、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、FGF12、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2、3、4、5、6或7個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1、IKZF1、PKNOX2、VAV3、IRF4、BCAN或其任何組合。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含Septin9、BCAT1和/或IKZF1。在一些實施方式中，所述至少一個（例如，至少1、2或3個）額外的目標標記物包含BCAN、VAV3和/或IRF4。
具體實施方式
所有實施例中使用的生物材料，包括各種選殖和表達質體、培養基、酶、緩衝液、各種培養方法、蛋白質提取和純化方法以及其他分子生物學操作方法，都是所屬技術領域中具通常知識者所熟知的。更多細節請參照Sambrooket al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. 和Frederick M. Ausubel等人編寫的「Short Protocols in Molecular Biology」(Yan Ziying等譯，科學出版社（北京），1998)。
實施例 1 ：甲基化特異性引子的驗證
為了進行最初的概念驗證，發明人選擇了經亞硫酸氫鹽轉化的參考DNA以評估引子/探針特異性。針對28個目標標記物（即NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、IRF4、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、ASCL4、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、NKX2-6、SLC24A2和5個基因間隔區，包括基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5）設計了定制的引子/探針組合。在概念驗證實驗中，發明人製備了所有CpG位點完全甲基化的DNA與完全未甲基化的DNA的混合物（比例為10%、25%、50%、100%），其中總輸入量為4 ng。透過使用引子和探針（序列如表2所示），對上述混合物中的28個目標標記物進行評價（設定三個重複）。實驗方法詳述如下。
亞硫酸氫鹽轉化的完全甲基化的DNA和亞硫酸氫鹽轉化的完全未甲基化的DNA購自Qiagen公司（EpiTect Control DNA），並混合以提供在完全未甲基化的DNA中分別包含100%、50%、25%、10%比例的完全甲基化DNA的DNA混合物，每種DNA混合物中的DNA總量為4 ng。
在甲基化特異性引子對（參見表2）和對28種目標標記物（即，NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、IRF4、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、ASCL4、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、NKX2-6、SLC24A2和5個基因間隔區（包括基因間隔區1，基因間隔區2，基因間隔區3，基因間隔區4和基因間隔區5）具有特異性的檢測探針（參見表2）的存在下，透過PCR反應擴增該DNA混合物。在PCR反應中，還透過甲基化非特異性引子（見表2）和檢測探針（見表2）擴增對照標記物ACTB。在單獨的檢測分析中，分別擴增28種目標標記物中的每一種以及一個對照標記物。不同標記物的檢測探針被標記不同的螢光標籤（FAM、HEX、VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5）和相應的猝滅劑（BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或TAMRA）。在PCR反應系統中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。
表 2. 各個目標標記物的引子對序列和探針序列
標記物 正向引子序列 反向引子序列 探針序列
NDRG4 CAACGCACCCAACACA (SEQ ID NO: 1) GCGGAGTTTGGGGGA (SEQ ID NO: 2) GTCGATTCGCGTTTTCGTCG (SEQ ID NO: 57)
BCAT1 TACGTGGCGGGTTGG (SEQ ID NO: 3) AAAAAAACAACCTTAATATCTTC (SEQ ID NO: 4) TCGGTTTTTTCGCGGCG (SEQ ID NO: 58)
IKZF1 GTTTTTTTGGTTCGGAGTTG (SEQ ID NO: 5) CAAAACGAAACACGAAAAAAATA (SEQ ID NO: 6) CGCCCCGTCGCCGAAT (SEQ ID NO: 59)
Septin9 GTAGTTGGATGGGATTATTT (SEQ ID NO: 7) CACCCGCAAAATCCTCT (SEQ ID NO: 8) TTGTTGCGGTCGCGGACG (SEQ ID NO: 60)
SDC2 GGAGTGTAGAAATTAATAAG (SEQ ID NO: 9) CTCGCTTCCTCCTCCTAC (SEQ ID NO: 10) AGGGCGTCGCGTTTTCGGG (SEQ ID NO: 61)
VAV3 CGGAGTCGAGTTTAG (SEQ ID NO: 11) ACCGCCGACCCTTT (SEQ ID NO: 12) TTTCGATTTCGCGCGGGG (SEQ ID NO: 62)
TMEFF2 GTAATATTTAGGGATTGGG (SEQ ID NO: 13) CTCCTTATAACAACAACTTC (SEQ ID NO: 14) TGCGCCGGAGACGCG (SEQ ID NO: 63)
SALL1 GAGGGTGGGTTTGGTAA (SEQ ID NO: 15) GATATAAAAACAACCCTCCA (SEQ ID NO: 16) CGCGTTCGAGTTAAGAGTCGCG (SEQ ID NO: 64)
BCAN GGGAAGAAAGGGGGTTTTGT (SEQ ID NO: 17) TACGACGAAAACTACGCGAA (SEQ ID NO: 18) CGTCGGGAGGGTCGG (SEQ ID NO: 65)
POU4F2 AACATCCGTTCAAACTAACA (SEQ ID NO: 19) GGTTGTGCGAAGTTGAG (SEQ ID NO: 20) CGTCGTCGTTTTCGGATTTTGTACG (SEQ ID NO: 66)
PKNOX2 GTTTTAGGAGTTATTTGGGTTTGC (SEQ ID NO: 21) ACTATAACACCTCGCTACTAACGCT (SEQ ID NO: 22) CGGTGGTTCGTAGGGGTCGCG (SEQ ID NO: 67) CGTAGCGCGGCGGGG (SEQ ID NO: 68)
基因間隔區1 TTTTTGAAAGTTTGAGAAAATGT (SEQ ID NO: 23) CCGACGCCTCTACCAA (SEQ ID NO: 24) TTCGTTATTTGGGTCGCGGG (SEQ ID NO: 69)
ASCL4 TTGTTGGAGYGTTAGGTTTGG (SEQ ID NO: 25) CCRAAAAAACCTTAAACTCCCC (SEQ ID NO: 26) CGACGCCGACCGCGCCCTCG (SEQ ID NO: 70)
基因間隔區2 TTATTTCGGGGAAGGTTACG (SEQ ID NO: 27) GCGAAAACGAAATCATAAAATAAAC (SEQ ID NO: 28) TCGGACGCGTTTTCGGG (SEQ ID NO: 71)
基因間隔區3 CGAGTCGAGTTTGGGT (SEQ ID NO: 29) ACCTCCGAAACAAAATCTA (SEQ ID NO: 30) CGCGTAGTTATCGTTAGACGGCG (SEQ ID NO: 72)
KCNA6 TGTTAGAGTTTATTGGGATG (SEQ ID NO: 31) GAAAACCGAATCTCAAACAC (SEQ ID NO: 32) TCGAAAAGACGCGTGGTTTCGT (SEQ ID NO: 73)
SOX1 ATACGGGAGAAAGAGTACGTTA (SEQ ID NO: 33) AACGTAACCGTACAACCTAAACG (SEQ ID NO: 34) GGTTACGCGGCGCGTGG (SEQ ID NO: 74)
HS3ST2 TAGTTTTCGGAGAAGACGGC (SEQ ID NO: 35) CTATAACCCTACGATCGCCT (SEQ ID NO: 36) TCGTGGTAGCGTTACGCGA (SEQ ID NO: 75)
FGF12 AGGGAGTTTAATAGCGATCGAGT (SEQ ID NO: 37) TTTACTAAACACCCCGAAAAC (SEQ ID NO: 38) AGACGGGCGTTTTTTGTGCGA (SEQ ID NO: 76)
KCTD8 AGGTCGGTTTTTATATGGTG (SEQ ID NO: 39) TCGATATAACTACTCCAAATC (SEQ ID NO: 40) TCGTTAATTAGTATCGCGACGA (SEQ ID NO: 77)
HMX1 GGGAGGGGGTAGTAGG (SEQ ID NO: 41) CGCTCATTTAATTTAAATTTATTTC (SEQ ID NO: 42) AGTCGGTCGAGGTTTTCGT (SEQ ID NO: 78)
MARCH11 GGGCGCGATAGTTTGAG (SEQ ID NO: 43) CCCGCGCCCTTTCC (SEQ ID NO: 44) TGTTTTGGGCGCGTTCGA (SEQ ID NO: 79)
CRHBP GGGGCGCGGTTTTTTTA (SEQ ID NO: 45) CTAAACTACGCTAAATTCCT (SEQ ID NO: 46) CGCGTTCGGGGCGT (SEQ ID NO: 80)
基因間隔區4 AGGGATTTAGGTTAGGGGTC (SEQ ID NO: 47) ACGACATCCTTCAAACCGAC (SEQ ID NO: 48) TTCGTTTCGGGGCGGGG (SEQ ID NO: 81)
NKX2-6 AGGTTCGGGTGAGGAG (SEQ ID NO: 49) AAACGTCTATCCCAAAACTT (SEQ ID NO: 50) CGTTTTGTCGTTGTAGGTTTCGT (SEQ ID NO: 82)
SLC24A2 AGTTAAAAGTAAGGGTAGGA (SEQ ID NO: 51) CCCCGCTAAAAATTAACCA (SEQ ID NO: 52) CGGGGGTTTTAAATTTACGTTTCG (SEQ ID NO: 83)
基因間隔區5 GGTCGGGTTGAGATTGG (SEQ ID NO: 53) GGTGGGGTTGAGATTGG (SEQ ID NO: 54) CGGTTTTTGTCGGGGTGCGG (SEQ ID NO: 84)
IRF4 AAAAAAAAAAAAACTCCACATTT (SEQ ID NO: 170) TAGTTGNGGAGTTTGGG (N=A, G, C或T) (SEQ ID NO: 171) ATCGTACGTAAGGTTCGGAGCGA (SEQ ID NO: 172)
ACTB GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 55) CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO: 56) ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (SEQ ID NO: 85)
製備PCR反應系統，其包含：10μL的DNA混合物（4ng DNA），包含上述引子和探針的預混液2.5μL；PCR試劑（Luna® Universal Probe qPCR Master Mix（NEB））12.5μL。
PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒（採集螢光），50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。
結果
計算每個PCR反應的Ct（循環閾值）值，並分析不同DNA混合物的每個標記物的PCR反應的Ct值。對於每個檢測的標記物，已經發現PCR反應中使用的甲基化特異性引子對提供的Ct值隨著DNA混合物中轉化的甲基化DNA百分比的增加而成比例地降低。對於所有檢測的標記物，甲基化模板的百分比與預期的Ct值具有高度相關性（所有檢測的標記物的相關係數R＞ 0.9）和線性，這表明用於預擴增目標標記物的引子具有甲基化特異性。可以透過圖1A（用PKNOX2的甲基化特異性引子獲得）的曲線的含量位移與圖1B（用對照標記物ACTB的甲基化非特異性引子獲得）的重疊曲線的比較得出相關性。除PKNOX2以外的其他標記物的甲基化特異性引子的檢測結果與圖1A相似，此處未顯示。
實施例 2 ：比較目標標記物在不同組織中的甲基化豐度
為了證明所選目標標記物對腫瘤組織的可行性和特異性，我們在結直腸癌患者的結直腸癌組織（CRC-組織）、高級別腺瘤組織（AA-組織）、癌旁組織（para-組織）中檢測了28種標記物，結腸鏡檢查為陰性的人群的白血球（WBC）作為對照。實驗方法詳述如下。
在來自不同細胞和組織的DNA樣品中檢測目標標記物的甲基化豐度，以探求這些目標標記物在結直腸瘤的診斷或篩查中的潛能。在本實施例中檢測的目標標記物包括NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、IRF4、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、ASCL4、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、NKX2-6、SLC24A2和5個基因間隔區，包括基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
該過程包括以下步驟：
1、分別從白血球、癌旁組織、高級別腺瘤組織和結直腸癌組織獲得DNA樣品，每種樣品有10個生物學樣品（即總共40個樣品）。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白血球DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。
2、將上述步驟1中獲得的DNA樣品用亞硫酸氫鹽試劑（MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit）處理，以獲得轉化的DNA。
3、對轉化的DNA進行螢光PCR。簡而言之，在甲基化特異性引子對（參見表2）和對27種目標標記物（即NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、IRF4、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、ASCL4、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、NKX2-6、SLC24A2和5個基因間隔區（包括基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5）具有特異性的檢測探針（參見表2）的存在下，透過PCR反應擴增步驟2中獲得的轉化的DNA。在PCR反應中，還透過甲基化非特異性引子（見表2）和檢測探針（見表2）擴增對照標記物ACTB。不同標記物的檢測探針加上不同的螢光標籤。在PCR反應系統中，每個引子的終濃度為500 nM，每個檢測探針的終濃度為200 nM。
製備PCR反應系統，其包含：10μL的轉化的DNA，包含上述引子和探針的預混液2.5μL；PCR試劑（Luna®Universal Probe qPCR Master Mix（NEB））12.5μL。
PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒（採集螢光），10個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。
4、計算、匯總並比較從白血球、癌旁組織、高級別腺瘤組織和結直腸癌組織獲得的樣品的Ct值。未測定的孔的Ct值被設定為50。
結果
結果顯示，本申請的目標標記物（NDRG4、BCAT1、IKZF1、Septin9、SDC2、VAV3、IRF4、TMEFF2、SALL1、BCAN、POU4F2、PKNOX2、ASCL4、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、NKX2-6、SLC24A2和5個基因間隔區，包括基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5）在結腸鏡檢查為陰性的人群中的白血球的甲基化豐度顯著地（p ＜0.01）低於結腸癌患者的組織樣本（參見圖2），以SALL1和PKNOX2為例。在每一個其他的檢測目標標記物中也觀察到了顯著差異（p ＜0.01），此處未顯示結果。尤其是，癌旁組織中目標標記物的甲基化豐度低於晚期腺瘤組織和結直腸癌組織中的甲基化豐度。這表明，所檢測的每種目標標記物在透過使用白血球樣品進行結直腸瘤的診斷和篩查中均具有潛在的應用價值。
實施例 3 ：用細胞外游離 DNA 定量分析目標標記物的甲基化
為了驗證甲基化標記物對CRC血漿樣品的臨床性能，我們使用本文所揭露的方法（也被稱為預擴增方法）檢測了88份經臨床診斷為CRC的血漿樣品和107份結腸鏡檢查為陰性的血漿對照樣品中的13個標記物（即NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1）。在88個經臨床診斷為CRC的血漿樣品中，有15個樣品來自診斷為CRC I期的個體，有26個樣本來自診斷為CRC II期的個體，有28個樣本來自診斷為CRC III期的個體，有19個樣本來自診斷為CRC IV期的個體。
預擴增方法
預擴增方法包括以下步驟：
1、使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)從1-4ml血漿樣品中獲得細胞外游離DNA（cfDNA）樣品。
2、使用亞硫酸氫鹽試劑（MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit）對20ng cfDNA進行亞硫酸氫鹽轉化以獲得轉化的cfDNA。
3、將轉化的cfDNA樣品進行預擴增。簡而言之，在甲基化特異性引子對（參見表2）的存在下，透過PCR反應對從上述步驟2獲得的轉化的cfDNA進行預擴增，所述甲基化特異性引子對專門針對NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1而設計。在PCR反應系統中，每個引子的終濃度均為200 nM。
25μL PCR混合物由10μL轉化的cfDNA、2.5μL含有上述引子的預混液和12.5μL PCR試劑（Luna®Universal Probe qPCR Master Mix（NEB））組成。
PCR反應條件如下：95℃ 3分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，8個循環。使用ProFlexTM PCR系統（Thermo Fisher）。
4、將從上述步驟3獲得的產物稀釋10倍，然後用於多重螢光PCR檢測，專門針對NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1。
qPCR混合物由10μL稀釋的來自步驟3的產物、2.5μL引子/探針池、12.5μL PCR試劑（Luna® Universal Probe qPCR Master Mix（NEB））組成。非CpG的ACTB區域用作每個反應孔的內參（參見表2）。不同標記物的檢測探針用不同的螢光進行標記。在PCR反應系統中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。
PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒（採集螢光），50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。
結果
將沒有擴增信號的樣品的Ct值設置為50。分別為每個檢測標記物設置一個參考Ct值。如果任一項被檢測的標記物中的Ct值等於或低於其對應的參考Ct值，則該樣品被分類為陽性樣品。圖3顯示患有CRC的群體和結腸鏡檢查為陰性的群體中目標標誌物SALL1和BCAN的Ct值分佈。如圖3所示，患有CRC的群體中目標標誌物SALL1和BCAN的甲基化含量顯著高於結腸鏡檢查為陰性的群體（對於SALL1和BCAN，p值分別等於2.14E-4和1.07E-8）。其他目標標記物的結果與之類似（p＜0.01），未在此顯示。
下表3顯示了在預擴增方法中使用5種目標標記物（即Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN和VAV3）的對比結果。如表3所示，預擴增方法顯示出對CRC的超高靈敏度（86.4%）和對結腸鏡檢查為陰性的群體的高特異性（90.7%），遠優於現有的商業化標記物，例如Septin9，其臨床試驗樣本中對CRC的靈敏度為48.2%（參見T.R. Churchet al. ,Gut. ; 63:317–325 (2014)）。也分析了13種目標標記物的其他標記物組合（例如Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN和NDRG4的組合；Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2和TMEFF2的組合；Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3、BCAN、NDRG4、SDC2、PKNOX2、TMEFF2和基因間隔區1的組合等），並且結果表明對CRC的靈敏度不低於85%，並且對結腸鏡檢查為陰性的群體的特異性不低於90%。
表 3. 預擴增方法結果和結腸鏡檢查結果的對比
結腸鏡檢查結果 準確率 陽性樣本 陰性樣本 總數
結直腸癌 86.4% 76 12 88
結腸鏡陰性 90.7% 10 97 107
還比較了預擴增方法和單獨的Septin9方法在CRC分類中的靈敏度。單獨的Septin9方法與預擴增方法操作相似，不同之處在於前者的目標標記物只有Septin9。
如表4所示，在預擴增方法中，CRC I期、II期、III期、IV期的靈敏度分別為73.3%、80.8%、89.3%和100%。相反，在單獨的Septin9方法中，CRC I期、II期、III期、IV期的靈敏度分別為26.7%、65.4%、75.0%和79%。因此，與單獨的Septin9方法相比，預擴增方法顯示出靈敏度的顯著提高。
表 4. 預擴增方法的結果和單獨 Septin9 方法的結果的對比
預擴增方法的結果 單獨 Septin9 方法的結果
臨床分類 準確率 陽性樣本 陰性樣本 總數 準確率
I期 73.3% 11 4 15 26.7%
II期 80.8% 21 5 26 65.4%
III期 89.3% 25 3 28 75.0%
IV期 100.0% 19 0 19 79.0%
定量分析每個檢測的目標標記物的Ct值，以確定CRC樣品中是否存在甲基化拷貝。或者，可以計算每個檢測的目標標記物相對於內部對照ACTB的相對Ct值，代表其相對甲基化含量。重要的是，所有檢測的標記物均具有AUC在從0.8到0.9之間的區分CRC和對照的分類能力（如圖4所示）。例如，線性判別分析、支持向量機、隨機森林演算法、線性回歸、邏輯回歸等不同的演算法已被用於建立早期癌症檢測的分類工具。標記物的不同組合已被用於實現最優的性能。所述的組合之一（SALL1、BCAT1和Septin9）的ROC曲線如圖5所示。其他組合的ROC曲線與圖5相似，此處未顯示。
實施例 4 ：預擴增方法和直接 qPCR 方法的 LOD 比較
為了比較預擴增方法和直接qPCR方法的LOD，發明人既採用預擴增方法又採用直接qPCR方法檢測了13種目標標記物（即，VAV3、NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1）。除了沒有預擴增步驟外，直接qPCR方法的操作與預擴增方法相同。在每個方法中，同時擴增/預擴增13種目標標記物，但是分別定量分析每種目標標記物。目標標記物VAV3的預擴增方法和直接qPCR方法的LOD的比較如下所示。其他12種目標標記物的預擴增方法和直接qPCR方法的LOD的比較採用類似的操作，未在此處顯示。
簡而言之，將CRC組織DNA以0.5%和0.2%的比率摻入血球DNA中。用亞硫酸氫鹽（MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit）處理40ng DNA，其中將一半轉化的DNA用於預擴增和之後的qPCR（即，預擴增方法），將剩餘另一半轉化的DNA直接用於qPCR（即，直接qPCR方法）。預擴增步驟中的引子的終濃度為50 nM。25μL PCR混合物包含10μL轉化的DNA、2.5μL含有上述引子的預混液，和12.5μL PCR試劑（Luna®Universal Probe qPCR Master Mix（NEB））。PCR程序設定為95℃ 3分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，8個循環。將經過預擴增步驟而獲得的產物稀釋10倍用於qPCR。qPCR混合物由10μL模板DNA、2.5μL引子/探針池和12.5μL LUNA主混合物組成。qPCR在ABI 7500 Real-Time PCR System上運行，程序設定為95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒（採集螢光），50個循環。平行進行4次重複。結果顯示於下表5。
表 5. 預擴增方法的結果和直接 qPCR 方法的結果的比較
預擴增方法 直接 qPCR 方法
CRC DNA 百分比 Ct 值 平均值±標準偏差 Ct 值 平均值±標準偏差
0.50% 25.08 24.91±0.36 35.39 36.31±1.11
24.66 37.07
25.32 35.33
24.56 37.45
0.20% 26.54 25.75±0.58 39.58 NA
25.67 未測定
25.65 43.37
25.12 未測定
如表5所示，與直接qPCR方法相比，預擴增方法顯示出改善的LOD（0.50% vs. 0.20% CRC DNA百分比）、更好的穩定性和更高的檢測靈敏度。其他12種目標標記物（即，NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1）的預擴增方法結果好於或不差於直接qPCR方法，結果未在此處顯示。
實施例 5 ：用細胞外游離 DNA 定量分析目標標記物的甲基化，並與無預擴增方法比較。
為了驗證甲基化標記物對CRC血漿樣品的臨床性能，我們同時採用預擴增法和無預擴增法檢測了32份經臨床診斷為CRC的血漿樣品和29份結腸鏡檢查為陰性的血漿對照樣品中的5個標記物（即，Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN和VAV3）。無預擴增法與預擴增法相似，但不包含預擴增法步驟和稀釋步驟。在32份經臨床診斷為CRC的血漿樣品中，有2份樣品來自診斷為CRC I期的個體，有9份樣品來自診斷為CRC II期的個體，有13份樣品來自診斷為CRC III期的個體，有5份樣品來自診斷為CRC IV期的個體，3份樣品的階段未知。
實驗包括以下步驟：
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)從3-5 ml血漿樣品中獲得無細胞DNA（cfDNA）樣品。
如果DNA少於40 ng，則將cfDNA分為兩份，並用作透過亞硫酸氫鹽試劑（MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit）進行亞硫酸氫鹽轉化的基質，從而在兩個平行反應中獲得轉化的cfDNA，其中一份用作預擴增方法檢測的樣本用10 μL洗脫轉化後DNA，另一份用20 μL的洗脫轉化後DNA。如果DNA多於40 ng，則每個反應均使用20 ng cfDNA，洗脫方式同上述過程。
對於預擴增方法，將一個反應（10 μL洗脫液）中的轉化cfDNA樣品進行預擴增。簡而言之，在存在對Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3特異的甲基化特異性引子對（參見表2）的情況下，透過PCR反應對從上述步驟2獲得的轉化cfDNA樣品進行預擴增。在PCR反應系統中，每種引子的終濃度均為200 nM。擴增前程序、稀釋和qPCR分析方法與實施例3相同。
對於無預擴增方法，將另一個反應中的轉化cfDNA樣品（20 μL洗脫液）用於兩個不同孔中的qPCR分析，每個孔中含10 μL轉化的DNA。qPCR混合物和程序與預擴增方法相同。
非CpG ACTB區域用作每個反應孔的內部對照（參見表2）。用不同的螢光來標記用於不同標記物的檢測探針。在PCR反應系統中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。
結果
將沒有擴增信號的樣品的Ct值設置為50。分別為每個檢測標記物設置一個參考Ct值。如果任一項被檢測的標記物中的Ct值等於或低於其對應的參考Ct值，則該樣品被分類為陽性樣品。
下表6顯示了在預擴增方法和無預擴增方法中使用5種目標標記物（即，Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN和VAV3）的對比結果。如表6所示，預擴增方法顯示出對CRC的超高靈敏度（96.9%）和對結腸鏡檢查為陰性的群體的高特異性（93.1%），無預擴增方法的靈敏度和特異性分別為84.4%和93.1%。無預擴增方法的靈敏度也比單獨Septin9方法高得多。
表 6. 預擴增方法的結果和無預擴增方法的結果的對比
  預擴增方法 無預擴增方法
臨床分類 準確率 陽性數 準確率 陽性數
結直腸癌 96.9% 31 84.4% 27
結腸鏡檢陰性 93.1% 2 93.1% 2
為了驗證甲基化標記物對CRC血漿樣品的臨床性能，我們使用如上所描述的預擴增方法和無預擴增方法在臨床診斷為CRC的血漿樣品和結腸鏡檢查為陰性的血漿對照樣品中測試更多的目標標記物，包括選自下組的標記物的任何組合：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、NDRG4和IRF4。例如，測試以下組合中的任何一種：（1）Septin9；（2）Septin9和BCAT1；（3）Septin9和IKZF1;（4）Septin9和NDRG4；（5）Septin9和BCAN；（6）Septin9和VAV3；（7）Septin9和IRF4；（8）BCAT1和IKZF1；（9）BCAT1和NDRG4；（10）BCAT1和BCAN；（11）BCAT1和VAV3；（12）BCAT1和IRF4；（13）IKZF1和NDRG4；（14）IKZF1和BCAN；（15）IKZF1和VAV3；（16）IKZF1和IRF4；（17）NDRG4和BCAN；（18）NDRG4和VAV3；（19）NDRG4和IRF4；（20）BCAN和VAV3;（21）BCAN和IRF4；（22）VAV3和IRF4；（23）Septin9、BCAT1和IKZF1；（24）BCAT1、IKZF1和NDRG4;（25）IKZF1、NDRG4和BCAN；（26）NDRG4、BCAN和VAV3;（27）BCAN、VAV3和IRF4；（28）Septin9、BCAT1和NDRG4；（29）Septin9、BCAT1和BCAN；（30）Septin9、BCAT1和VAV3；（31）Septin9、BCAT1和IRF4；（32）BCAT1、IKZF1和BCAN；（33）BCAT1、IKZF1和VAV3；（34）BCAT1、IKZF1和IRF4。
實施例 6 ：用細胞外游離 DNA 定量分析 CRC 甲基化目標標記物（ Septin9 、 BCAT1 、 IKZF1 、 VAV3 和 IRF4 ）進行 CRC 檢測。
為了評估更多標記物組合的臨床性能，我們使用本文所揭露的方法（也被稱為預擴增方法）檢測了286份經臨床診斷為CRC的血漿樣品和112份結腸鏡檢查為陰性的血漿對照樣品中的5種標記物（即，Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和IRF4）。在286份經臨床診斷為CRC的血漿樣品中，有48份樣品來自診斷為CRC I期的個體，有113份樣本來自診斷為CRC II期的個體，有107份樣本來自診斷為CRC III期的個體，有18份樣本來自診斷為CRC IV期的個體。
實驗方法與實施例3相似。
結果
將沒有擴增信號的樣品的Ct值設置為50。分別為每個檢測標記物設置一個參考Ct值。如果任一項被檢測的標記物中的Ct值等於或低於其對應的參考Ct值，則該樣品被分類為陽性樣品。
如表7所示，預擴增方法（定量分析CRC甲基化標記物Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和IRF4）顯示出對CRC的超高靈敏度（84.3%），對結腸鏡檢查為陰性的群體具有高特異性（90.3%）。
表 7. 預擴增方法（ Septin9 、 BCAT1 、 IKZF1 、 VAV3 和 IRF4 的甲基化標記物）和結腸鏡檢查之間的結果比較
結腸鏡檢結果 準確率 陽性數 陰性數 總數
結直腸癌 84.3% 241 45 286
結腸鏡檢陰性 90.3% 11 101 112
如表8所示，在預擴增方法（定量分析CRC甲基化標記物Septin9、BCAT1、IKZF1、VAV3和IRF4）中，CRC I期、II期、III期和IV期的靈敏度分別為62.5%、85.8%、88.8%和100%。
表 8. 定量分析 Septin9 、 BCAT1 、 IKZF1 、 VAV3 和 IRF4 的預擴增方法的 CRC 檢測靈敏度
臨床分類 準確率 陽性數 陰性數 總數
I期 62.5% 30 18 48
II期 85.8% 97 16 113
III期 88.8% 95 12 107
IV期 100.0% 18 0 18
為了驗證更多標記物的組合對CRC血漿樣品的臨床性能，我們使用如上所描述的方法在臨床診斷為CRC的血漿樣品和結腸鏡檢查為陰性的血漿對照樣品中測試更多的目標標記物，包括選自下組的標記物的任何組合：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、NDRG4和IRF4。例如，測試以下組合中的任何一種：（1）Septin9；（2）Septin9和BCAT1；（3）Septin9和IKZF1;（4）Septin9和NDRG4；（5）Septin9和BCAN；（6）Septin9和VAV3；（7）Septin9和IRF4；（8）BCAT1和IKZF1；（9）BCAT1和NDRG4；（10）BCAT1和BCAN；（11）BCAT1和VAV3；（12）BCAT1和IRF4；（13）IKZF1和NDRG4；（14）IKZF1和BCAN；（15）IKZF1和VAV3；（16）IKZF1和IRF4；（17）NDRG4和BCAN；（18）NDRG4和VAV3；（19）NDRG4和IRF4；（20）BCAN和VAV3;（21）BCAN和IRF4；（22）VAV3和IRF4；（23）Septin9、BCAT1和IKZF1；（24）BCAT1、IKZF1和NDRG4;（25）IKZF1、NDRG4和BCAN；（26）NDRG4、BCAN和VAV3;（27）BCAN、VAV3和IRF4；（28）Septin9、BCAT1和NDRG4；（29）Septin9、BCAT1和BCAN；（30）Septin9、BCAT1和VAV3；（31）Septin9、BCAT1和IRF4；（32）BCAT1、IKZF1和BCAN；（33）BCAT1、IKZF1和VAV3；（34）BCAT1、IKZF1和IRF4。
無
圖1顯示了對目標標記物PKNOX2（圖1A）和對照標記物ACTB（圖1B）的甲基化特異性引子的驗證。縱座標表示ΔRn值，它是由在特定的循環次數下檢測到的螢光強度值減去螢光強度基準值得到的。橫座標表示循環次數。如圖1A所示，Ct值隨著DNA混合物中轉化的甲基化DNA百分比的增加而降低，這表明用於預擴增PKNOX2的引子是甲基化特異性的。如圖1B所示，每種DNA組合物的曲線重合，這表明儘管轉化的甲基化DNA百分比增加，但是Ct值仍然保持不變，這也與用於預擴增對照標記物ACTB的引子是非甲基化特異性的引子這一事實一致。
圖2分別顯示了白血球（用實心圓「●」表示）、癌旁組織（用實心方塊「■」表示）、高級別腺瘤組織（用實心正三角「▲」表示）、結直腸癌組織（用實心倒三角「▼」表示）中的對照標記物ACTB和目標標記物SALL1、目標標記物PKNOX2的甲基化豐度。縱座標表示Ct值，橫座標表示對照標記物和目標標記物的名稱。Ct值越高表明標記物的甲基化豐度越低。因此，由圖2可以看出，目標標記物在白血球中的甲基化豐度遠遠低於在組織樣本中的甲基化豐度，尤其是目標標記物在癌旁組織中的甲基化豐度低於高級別腺瘤組織和結直腸癌組織中的甲基化豐度。
圖3顯示了分別從患有結直腸癌的群體獲取的生物樣本（結直腸癌個體血漿，用實心圓「●」表示）和從結腸鏡檢查為陰性的群體獲取的生物樣本（健康個體血漿，用實心正三角「▲」表示）的對照標記物ACTB以及目標標記物SALL1和目標標記物PKNOX2的分佈。縱座標表示Ct值，橫座標表示對照標記物和目標標記物的名稱。Ct值越低表明標記物的甲基化含量越高。因此，由圖3可以看出，患有結直腸癌的群體中每個目標標記物的甲基化含量顯著高於結腸鏡檢查為陰性的群體。
圖4顯示了經檢測的全部13個目標標記物的AUC值。縱座標表示在同一AUC值範圍內的出現次數，橫座標表示AUC值。AUC值在0到1之間，AUC值越高表示分類能力越好。如圖所示，所有經檢測的標記物（即NDRG4、Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2和基因間隔區1）均有區分CRC（結直腸癌）和對照的能力，AUC值在0.8-0.9範圍之間。
圖5顯示了標記物SALL1、BCAT1和Septin9的組合的ROC曲線。縱座標表示真陽性率（即，靈敏度），橫座標表示假陽性率（即，1-特異性）。實線表示ROC曲線，虛線表示45度對角線。在對角線以上的點表示較好的分類結果（即，優於隨機），而低於該線的點則表示較差的結果（即，劣於隨機）。因此，目標標記物SALL1、BCAT1和Septin9的組合在給結直腸瘤分類時具有高靈敏度和高特異性。
圖6顯示了目標標記物的示例性亞區域（subregion）的核苷酸序列。
無
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (78)

  1. 一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中所述目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5； 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
  2. 一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： 用試劑處理從生物樣品中獲得的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； 分別定量分析步驟（I）所述的經處理的DNA內的一組目標標記物的甲基化含量，其中至少兩個目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4，並且至少兩個目標標記物選自下組：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP，並且 分別比較步驟（II）中定量分析的所述一組目標標記物中的至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表示所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
  3. 根據請求項1或2所述的方法，其中所述一組目標標記物包括四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個目標標記物。
  4. 根據請求項1或2所述的方法，其中，所述步驟（II）包括： 用預擴增引子庫預擴增從步驟（I）獲得的所述經處理的DNA中的一組目標標記物中的至少一個目標標記物的至少一部分，並且所述一組目標標記物選自下組：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 分別定量分析從所述子步驟（i）獲取的DNA中所述一組目標標記物的甲基化含量。
  5. 根據請求項1或2所述的方法，其進一步包括在所述步驟（I）之前從來自個體的生物樣品中獲得DNA。
  6. 一種在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的方法，所述方法包括如下步驟： (a)           從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； (b)           用試劑處理從步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； (c)           用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； (d)           如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 (e)           分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和相應的參考含量，其中一個或多個目標標記物相對於其相應的參考含量具有相同或更高的甲基化含量表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險。
  7. 一種在接受結直腸瘤治療的個體中監測所述個體對治療的反應的方法，包括如下步驟： (a)           從所述個體獲取含有DNA的生物樣品； (b)           用試劑處理步驟（a）中獲取的所述生物樣品中的DNA，所述試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA； (c)           用預擴增引子庫預擴增從步驟（b）獲取的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的至少一部分，其中至少一個目標標記物的至少一部分被預擴增，並且所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；其中步驟（c）存在或不存在； (d)           如果步驟（c）存在，則基於從步驟（c）獲取的DNA來分別定量分析至少一個目標標記物的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則分別定量分析從步驟（b）獲得的所述經處理的DNA中的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5；並且 (e)           分別比較步驟（d）中的所述至少一個目標標記物的甲基化含量和從治療前的同一個體獲取的一個或多個目標標記物的相應的甲基化含量，所述相應的甲基化含量是透過對治療前從所述個體獲取的含DNA的生物樣品重複步驟（a）、步驟（b）、可選地步驟（c），和步驟（d）來定量分析的，其中一個或多個目標標記物的甲基化含量相比其治療前的相應的甲基化含量更低表明所述個體對治療有反應。
  8. 根據請求項6所述的方法，其中所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
  9. 根據請求項7所述的方法，其中所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
  10. 根據請求項8或9所述的方法，其中所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。
  11. 根據請求項10所述的方法，其中所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
  12. 根據請求項1-11中任一項所述的方法，其中所述各個目標標記物包含或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域： 目標標記物 Hg19 座標 NDRG4 chr16:58496750-58547532 BCAT1 chr12:24964295-25102393 IKZF1 chr7:50343720-50472799 Septin9 chr17:75276651-75496678 SDC2 chr8:97505579-97624000 VAV3 chr1:108113782-108507766 IRF4 chr6:391739-411447 TMEFF2 chr2:192813769-193060435 SALL1 chr16:51169886-51185278 BCAN chr1:156611182-156629324 POU4F2 chr4:147560045-147563626 PKNOX2 chr11:125034583-125303285 ASCL4 chr12:108168162-108170421 KCNA6 chr12:4918342-4960277 SOX1 chr13:112721913-112726020 HS3ST2 chr16:22825498-22927659 FGF12 chr3:191857184-192485553 KCTD8 chr4:44175926-44450824 HMX1 chr4:8847802-8873543 MARCH11 chr5:16067248-16180871 CRHBP chr5:76248538-76276983 NKX2-6 chr8:23559964-23564111 SLC24A2 chr9:19507450-19786926 基因間隔區1 chr6:19679885-19693988 基因間隔區2 chr10:130082033-130087148 基因間隔區3 chr10:133107880-133113966 基因間隔區4 chr7:152620588-152624685 基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
    以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）甲基化敏感限制酶（MSRE）處理後的a）的對應區域。
  13. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述DNA包括基因組DNA或細胞外游離DNA。
  14. 根據請求項13所述的方法，其中所述細胞外游離DNA包括循環腫瘤DNA。
  15. 根據請求項13或14所述的方法，其中所述細胞外游離DNA中的所述目標標記物在所述生物樣品中的數量不超過1ng、0.8ng、0.6ng、0.4ng、0.2ng、0.1ng、0.08ng或不超過0.04ng。
  16. 根據請求項15所述的方法，其中所述細胞外游離DNA中的所述目標標記物在所述生物樣品中的濃度低於用於所述目標標記物的檢測分析的靈敏度含量。
  17. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中子步驟（i）或步驟（c）中獲取的DNA在子步驟（ii）或步驟（d）之前使用稀釋劑稀釋。
  18. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述生物樣品選自下組：組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的組織、體液、結腸流出物、手術切除樣本、分離的血細胞、分離自血液的細胞，及其任意組合。
  19. 根據請求項18所述的方法，其中所述體液選自下組：全血、血清、血漿、尿液、黏液、唾液、腹膜液、胸腔液、胸膜積液、滑液、腦脊髓液、胸腔穿刺液、腹腔積液，及其任意組合。
  20. 根據請求項19所述的方法，其中從所述個體的血漿中獲得所述生物樣品。
  21. 根據請求項18所述的方法，其中所述結腸流出物選自下組：糞便樣品和灌腸洗滌樣品。
  22. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑在CpG位點選擇性地修飾未甲基化的胞嘧啶殘基以產生修飾的殘基，但並不顯著性地修飾甲基化的胞嘧啶殘基。
  23. 根據請求項22所述的方法，其中所述試劑包括亞硫酸氫鹽試劑。
  24. 根據請求項23所述的方法，其中所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。
  25. 根據請求項1-24中任一項所述的方法，其中所述能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點的試劑選擇性地切割未甲基化的殘基但不切割甲基化的殘基，或者選擇性地切割甲基化的殘基但不切割未甲基化的殘基。
  26. 根據請求項25所述的方法，其中所述試劑是甲基化敏感限制酶（MSRE）。
  27. 根據請求項26所述的方法，其中所述MSRE選自下組：Hpa II酶、Sal I酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
  28. 根據請求項4-27中任一項所述的方法，其中所述預擴增引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。
  29. 根據請求項28所述的方法，其中所述至少一個甲基化特異性引子對包含一個正向引子和一個反向引子，所述引子均包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列與所述目標標記物之一的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標標記物之一的至少9個連續核苷酸包含至少一個CpG位點。
  30. 根據請求項28或29所述的方法，其中所述預擴增引子庫進一步包含用於擴增對照標記物的對照引子對。
  31. 根據請求項30所述的方法，其中所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。
  32. 根據請求項28-31中任一項所述的方法，其中所述至少一個甲基化特異性引子對包含一對或多對選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171。
  33. 根據請求項28-32中任一項所述的方法，其中在步驟（c）中，所述至少一個目標標記物在一個或多個封閉寡核苷酸存在的情況下被擴增。
  34. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述定量分析是透過以下方式進行：聚合酶鏈式反應（例如即時聚合酶鏈式反應、數位聚合酶鏈式反應）、核酸定序、基於質量的分離（例如電泳法、質譜法）或標靶捕獲（例如雜交、微陣列）。
  35. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述定量分析是透過即時聚合酶鏈式反應進行的。
  36. 根據請求項35中所述的方法，其中所述即時聚合酶鏈式反應是多重即時聚合酶鏈式反應。
  37. 根據請求項6-36中任一項所述的方法，其中，如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（c）中所獲取的DNA進行擴增；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括使用定量引子對和DNA聚合酶對步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物進行擴增。
  38. 根據請求項37的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）使用的所述定量引子對能夠與步驟（c）中所獲取的DNA的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對能夠與步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
  39. 根據請求項38所述的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）使用的至少一個所述定量引子對和步驟（c）的所述預擴增引子庫的至少一個所述甲基化特異性引子對相同。
  40. 根據請求項38所述的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）使用的所述定量引子對被設計為用於擴增步驟（c）中所獲取的DNA的至少一部分；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）中使用的所述定量引子對被設計為用於擴增步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少一部分。
  41. 根據請求項35-40中任一項所述的方法，其中所述步驟（d）在檢測試劑存在的情況下進行。
  42. 根據請求項41所述的方法，其中所述檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。
  43. 根據請求項42所述的方法，其中所述螢光探針包括選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 57-85和172。
  44. 根據請求項42或43所述的方法，其中所述螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或TAMRA）。
  45. 根據請求項35-44中任一項所述的方法，其中步驟（e）包括比較步驟（d）的所述目標標記物的Ct值和參考Ct值，其中至少一個目標標記物的Ct值與其相應的參考Ct值相同或比其相應的參考Ct值更低表明所述個體患有結直腸瘤，或者所述個體有結直腸瘤形成或形成的風險，或者所述個體有結直腸瘤發展或發展的可能性增加，或者所述個體有結直腸瘤預後不良或預後不良的風險；或者至少一個目標標記物的Ct值比其治療前相應的Ct值更高表明所述正在接受結直腸瘤治療的個體對所述治療有反應。
  46. 根據請求項4-45中任一項所述的方法，其中所述預擴增包括5到30個反應循環，其中每個循環包括在40~80°C下反應5秒 – 5分鐘，之後在85~99°C下反應5秒 - 5分鐘。
  47. 根據請求項6-46中任一項所述的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定其甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的多個CpG二核苷酸、TpG二核苷酸或CpA二核苷酸的存在或其含量來確定至少一個目標標記物的甲基化含量。
  48. 根據請求項47所述的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（c）中所獲取的DNA中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析包括基於步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物中的一個或多個CpG二核苷酸的存在或其含量來確定胞嘧啶殘基的甲基化含量。
  49. 根據請求項6-48中任一項所述的方法，其中如果步驟（c）存在，則步驟（d）的所述定量分析是透過將步驟（c）中所獲取的DNA分成多個部分來進行；如果步驟（c）不存在，則步驟（d）的所述定量分析是透過將步驟（b）中所獲得的經處理的DNA內的至少一個目標標記物分成多個部分來進行。
  50. 根據請求項6-49中任一項所述的方法，其中步驟（e）中的所述參考含量是基於從患有結直腸瘤或具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本和從未患結直腸瘤或不具有患結直腸瘤風險的一組個體中獲取的臨床樣本來確定的。
  51. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述結直腸瘤是結直腸癌、結直腸腺瘤、和/或無蒂鋸齒狀息肉。
  52. 根據請求項1-51中任一項所述的方法，其中所述結直腸瘤是癌前的。
  53. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述個體是人。
  54. 一種用於診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後的試劑盒，其包含： 處理DNA的第一試劑，其中所述第一試劑能夠區分所述DNA中的未甲基化位點和甲基化位點； 任選地第一引子庫，所述第一引子庫包含用於預擴增選自下組的至少一個目標標記物的至少一個目標序列的至少一個引子對：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5，其中所述至少一個引子對可與被所述第一試劑處理後的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交，其中所述目標序列包含至少一個CpG位點；和 第二試劑，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑用於定量分析被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標標記物中的甲基化含量；如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑用於定量分析經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物的甲基化含量，其中所述至少一個目標標記物包含選自下組的一種或多種標記物：Septin9、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3、IRF4、POU4F2、SALL1、PKNOX2、SDC2、ASCL4、TMEFF2、SLC24A2、NDRG4、NKX2-6、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11、CRHBP、基因間隔區1、基因間隔區2、基因間隔區3、基因間隔區4和基因間隔區5。
  55. 根據請求項54所述的試劑盒，其中所述至少一個目標標記物包含多個目標標記物，其中所述多個目標標記物包含選自下組的至少兩種標記物：Septin9、BCAT1和IKZF1。
  56. 根據請求項55所述的試劑盒，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二試劑包含第二引子庫，所述第二引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交；如果所述第一引子庫不存在，則所述第二試劑包括第三引子庫，所述第三引子庫包含多個定量引子對，所述定量引子對能夠與經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物中的至少一個目標序列的至少9個連續核苷酸在嚴格條件下、中等嚴格條件下或高度嚴格條件下雜交。
  57. 根據請求項56所述的試劑盒，其中所述第二引子庫中的至少一個定量引子對和所述第一引子庫中的至少一個引子對相同。
  58. 根據請求項56所述的試劑盒，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第二引子庫中的定量引子對被設計為用於擴增被所述第一引子庫預擴增的所述至少一個目標序列內的至少一部分；如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫的定量引子對被設計為用於擴增經所述第一試劑處理的DNA內的至少一個目標標記物的至少一個目標序列中的至少一部分。
  59. 根據請求項54-58中任一項所述的試劑盒，其中所述第一、第二或第三引子庫包含至少一個甲基化特異性引子對。
  60. 根據請求項56-59中任一項所述的試劑盒，其中所述第一引子庫和所述第二引子庫被包裝在單一容器內或被包裝在獨立容器內。
  61. 根據請求項55-60中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含一個或多個封閉寡核苷酸。
  62. 根據請求項55-61中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含檢測試劑。
  63. 根據請求項62所述的試劑盒，其中所述檢測試劑選自下組：螢光探針、嵌入染料、發色基標記的探針、放射性同位素標記的探針和生物素標記的探針。
  64. 根據請求項63所述的試劑盒，其中所述螢光探針包括選自下組的寡核苷酸序列：SEQ ID NO: 57-85和172。
  65. 根據請求項63或64所述的試劑盒，其中所述螢光探針的5’端標記有螢光染料（例如FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red或Cy5），3’端標記有猝滅劑（例如BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、TAMRA或lowa Black Dark Quenchers）。
  66. 根據請求項55-65中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含DNA聚合酶和/或一個適合存放從所述個體中獲取的所述生物樣品的容器。
  67. 根據請求項55-66中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含使用說明書和/或對試劑盒檢測結果的解釋。
  68. 根據請求項55-67中任一項所述的試劑盒，其中所述第一試劑包括亞硫酸氫鹽試劑或甲基化敏感限制酶（MSRE）。
  69. 根據請求項68所述的試劑盒，其中所述亞硫酸氫鹽試劑選自下組：亞硫酸氫銨、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫鈣、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫鋁、亞硫酸氫根離子，及其任意組合。
  70. 根據請求項68所述的試劑盒，其中所述MSRE選自下組：Hpa II酶、SalI酶、Sal I-HF®酶、ScrF I酶、Bbe I酶、Not I酶、Sma I酶、Xma I酶、Mbo I酶、BstB I酶、Cla I酶、Mlu I酶、Nae I酶、Nar I酶、Pvu I酶、Sac II酶、Hha I酶及其任意組合。
  71. 根據請求項55-70中任一項所述的試劑盒，其中所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：BCAN、PKNOX2、VAV3、NDRG4和IRF4。
  72. 根據請求項71所述的試劑盒，其中所述多個目標標記物進一步包含選自下組的一種或多種額外的標記物：POU4F2、SALL1、SDC2、ASCL4、基因間隔區1、TMEFF2、基因間隔區4、NKX2-6、基因間隔區5、SLC24A2、基因間隔區2、基因間隔區3、KCNA6、SOX1、HS3ST2、FGF12、KCTD8、HMX1、MARCH11和CRHBP。
  73. 根據請求項54-72任一項所述的試劑盒，其中所述各個目標標記物包含或是：a）如下所示的透過Hg19座標定義的各個區域： 目標標記物 Hg19 座標 NDRG4 chr16:58496750-58547532 BCAT1 chr12:24964295-25102393 IKZF1 chr7:50343720-50472799 Septin9 chr17:75276651-75496678 SDC2 chr8:97505579-97624000 VAV3 chr1:108113782-108507766 IRF4 chr6:391739-411447 TMEFF2 chr2:192813769-193060435 SALL1 chr16:51169886-51185278 BCAN chr1:156611182-156629324 POU4F2 chr4:147560045-147563626 PKNOX2 chr11:125034583-125303285 ASCL4 chr12:108168162-108170421 KCNA6 chr12:4918342-4960277 SOX1 chr13:112721913-112726020 HS3ST2 chr16:22825498-22927659 FGF12 chr3:191857184-192485553 KCTD8 chr4:44175926-44450824 HMX1 chr4:8847802-8873543 MARCH11 chr5:16067248-16180871 CRHBP chr5:76248538-76276983 NKX2-6 chr8:23559964-23564111 SLC24A2 chr9:19507450-19786926 基因間隔區1 chr6:19679885-19693988 基因間隔區2 chr10:130082033-130087148 基因間隔區3 chr10:133107880-133113966 基因間隔區4 chr7:152620588-152624685 基因間隔區5 chr8:70945014-70949177
    以及上述每個區域的各個起始位點的上游5kb和各個末端位點的下游5kb；或b）亞硫酸氫鹽轉化後的a）的對應區域；或c）MSRE處理後的a）的對應區域。
  74. 根據請求項55-73中任一項所述的試劑盒，其中如果所述第一引子庫存在，則所述第一引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由選自下組的至少一對核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171，任選地，其中所述第二引子庫包含至少一個與所述第一引子庫中的至少一個引子對相同的引子對；如果所述第一引子庫不存在，則所述第三引子庫包含至少一個引子對，所述至少一個引子對包含或由選自下組的至少一對核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42、43/44、45/46、47/48、49/50、51/52、53/54和170/171。
  75. 根據請求項56-74中任一項所述的試劑盒，其中所述第一引子庫、第二引子庫或可選地第三引子庫進一步包含用於擴增對照標記物的引子對。
  76. 根據請求項75所述的試劑盒，其中所述對照標記物選自下組：ACTB、GAPDH、微管蛋白、ALDOA、PGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、ARHGDIA、RPL32、C1orf43、CHMP2A、EMC7、GPI、PSMB2、PSMB4、RAB7A、REEP5、SNRPD3、VCP和VPS29。
  77. 根據請求項54-76中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含多個容器，每個容器均用於接收所述第二引子庫的組分。
  78. 根據請求項54-77中任一項所述的試劑盒在製造用於在個體中診斷結直腸瘤、篩查結直腸瘤形成或形成的風險或評估結直腸瘤的進展或預後或監測接受結直腸瘤治療的個體對治療的反應的診斷試劑盒中的用途。
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