JP2023517394A

JP2023517394A - 結腸直腸新生物をスクリーニングするための方法およびキット

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Publication number: JP2023517394A
Application number: JP2022557094A
Authority: JP
Inventors: リウ，ルイ; ワン，フイ
Original assignee: シングレラ・ヘルス・テクノロジーズ（シャンハイ）・リミテッド
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2023-04-25
Also published as: TW202144586A; IL296453A; AU2021238717A1; WO2021185061A1; EP3911756A4; EP3911756A1; CN114207153A; KR20220156899A; US20230193395A1; CA3173044A1

Abstract

本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法、およびその方法において使用するためのキットが提供される。【選択図】図３

Description

[001]本開示は一般に生物医学分野に関する。特に、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法、およびその方法において使用するためのキットに関する。

[002]前がん状態進行腺腫段階または初期がん段階の結腸直腸新生物の早期検出は、患者死亡率を有意に減少させることが明らかにされている。便／血液試料での大腸内視鏡検査または分子検査を通じての現在の結腸直腸新生物スクリーニングは、観血的であるまたはマーカーが非常に少なく、故に、がんスクリーニングへの患者コンプライアンスおよび検出感度は限定されている。

[003]したがって、生体試料由来の限られた量の無細胞ＤＮＡからエピジェネティクス情報を効率よく読み出すことができ、臨床検査室に容易に配置し頑強に実行することができる方法および／またはキットを開発する必要性が増えている。

[004]一態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[005]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、少なくとも２つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択され、少なくとも２つの標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[006]一部の実施形態では、本開示の標的マーカーのセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個またはそれよりも多い標的マーカーを含む。

[007]一部の実施形態では、本開示のステップ（ＩＩ）は、
（ｉ）ステップ（Ｉ）から得られ処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカーのセットがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ｉｉ）前記サブステップ（ｉ）から得られたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップと
を、含む。

[008]一部の実施形態では、本開示の方法は、ステップ（Ｉ）の前に対象由来の生体試料からＤＮＡを得るステップをさらに含む。

[009]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいてなくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0010]一部の実施形態では、上の方法のステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）での少なくとも１つの標的マーカーは複数の標的マーカーを含み、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む。

[0011]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される、処置に先立って同じ対象から得られる標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0012]一部の実施形態では、上の方法のステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）での少なくとも１つの標的マーカーは複数の標的マーカーを含み、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む。

[0013]一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む。

[0014]一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーは、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域；

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処理対応物
を含む、またはａ）、ｂ）、またはｃ）である。

[0015]一部の実施形態では、ステップ（ａ）から得られた生体試料中のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは循環腫瘍ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは、生体試料に１ｎｇ、０．８ｎｇ、０．６ｎｇ、０．４ｎｇ、０．２ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０８ｎｇ以下または０．０４ｎｇ以下の量で存在している。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは、生体試料に、標的マーカーについての検出アッセイの感度のレベルより下である濃度で存在している。

[0016]一部の実施形態では、サブステップ（ｉ）またはステップ（ｃ）から得られたＤＮＡが、サブステップ（ｉｉ）またはステップ（ｄ）に先立って希釈液で希釈される。

[0017]一部の実施形態では、生体試料は、組織切片、生検、パラフィン包埋組織、体液、結腸流出物、外科切除試料、単離された血球、血液から単離された細胞、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、体液は、全血、血清、血漿、尿、粘液、唾液、腹水、胸腔内液、胸液、滑液、脳脊髄液、胸腔穿刺液、腹部液、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、生体試料は、対象の血漿から得られる。一部の実施形態では、結腸流出物は、大便試料および浣腸洗浄試料からなる群から選択される。

[0018]一部の実施形態では、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬は、ＣｐＧ部位（複数可）で非メチル化シトシン残基（複数可）を選択的に修飾して修飾された残基（複数可）を生成するが、メチル化されたシトシン残基（複数可）を有意に修飾しない。一部の実施形態では、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬は亜硫酸水素塩試薬を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素塩およびその任意の組合せからなる群から選択される。

[0019]一部の実施形態では、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬は、選択的に、残基がメチル化されていない場合はそこで切断するが、残基がメチル化されている場合はそこで切断しない、または選択的に、残基がメチル化されている場合はそこで切断するが、残基がメチル化されていない場合はそこで切断しない。一部の実施形態では、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である。一部の実施形態では、ＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される。

[0020]一部の実施形態では、プレ増幅プライマープールは少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対は、それぞれが厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、標的マーカー（複数可）の１つの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、標的マーカー（複数可）の１つの少なくとも９連続ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む。

[0021]一部の実施形態では、プレ増幅プライマープールは、対照マーカーを増幅するための対照プライマー対をさらに含む。一部の実施形態では、対照マーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される。

[0022]一部の実施形態では、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対は、下の表２に示される、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の対を含む。

[0023]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、少なくとも１つの標的マーカーは、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅される。

[0024]一部の実施形態では、定量化は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ）、核酸シーケンシング、質量ベースの分離（例えば、電気泳動法、質量分析）、または標的捕捉（例えば、ハイブリダイゼーション、マイクロアレー）により実行される。一部の実施形態では、定量化はリアルタイムＰＣＲにより実行され、必要に応じて、リアルタイムＰＣＲは、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲである。

[0025]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用してステップ（ｃ）から得られたＤＮＡを増幅するステップを含み、得られたＤＮＡの少なくとも一部が増幅される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用してステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーを増幅するステップを含む。

[0026]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。

[0027]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）のうちの少なくとも１つは、ステップ（ｃ）のプレ増幅プライマープール中のメチル化特異的プライマー対（複数可）のうちの少なくとも１つと同一である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、ステップ（ｃ）から得たＤＮＡ内の少なくとも一部を増幅するように設計されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカー内の少なくとも一部を増幅するように設計されている。

[0028]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は検出剤の存在下で実行される。一部の実施形態では、検出剤は、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される。一部の実施形態では、蛍光プローブは、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、蛍光プローブは、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端で消光剤（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬまたはＴＡＭＲＡ）で標識される。

[0029]一部の実施形態では、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の標的マーカー（複数可）のＣｔ値（複数可）を参照Ｃｔ値と比較するステップであって、その対応する参照Ｃｔ値と比べて少なくとも１つの標的マーカーの同じまたはより低いＣｔ値が、対象が結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示す；または処置に先立って、その対応するＣｔ値と比べて少なくとも１つの標的マーカーのより高いＣｔ値が、結腸直腸新生物の処置を受けている対象が処置に応答性であることを示すステップを含む。

[0030]一部の実施形態では、プレ増幅は５～３０サイクルの反応を含み、それぞれのサイクルが、４０～８０℃で５秒～５分間の反応前に８５～９９℃で５秒～５分間の反応を含む。

[0031]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡにおける複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化が、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡを複数の画分に分割することにより実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーを複数の画分に分割することにより実施される。

[0032]一部の実施形態では、ステップ（ｅ）の参照レベルは、結腸直腸新生物を有するまたはこれを有するリスクがある個体の群および結腸直腸新生物を有するリスクがないまたは免れている個体の群から得られる臨床試料に基づいて決定される。

[0033]一部の実施形態では、結腸直腸新生物は、結腸直腸がん、大きな結腸直腸腺腫、および／または無茎性鋸歯状ポリープである。一部の実施形態では、結腸直腸新生物は前がん状態である。一部の実施形態では、対象はヒトである。

[0034]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡを処理するための第１の試薬であって、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる第１の試薬；
（ｂ）必要に応じて、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つの標的マーカー中の少なくとも１つの標的配列をプレ増幅するための少なくとも１つのプライマー対を含む第１のプライマープールであって、少なくとも１つのプライマー対が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１の試薬により処理された少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができ；標的配列が少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む第１のプライマープール；ならびに
（ｃ）第２の試薬であって、第１のプライマープールが存在する場合、第２の試薬が、第１のプライマープールによりプレ増幅される少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを定量化するためのものであり、第１のプライマープールが存在しない場合、第２の試薬が、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを定量化するためのものであり、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、第２の試薬；
を含むキットを提供する。

[0035]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、複数の標的マーカーを含み、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む。

[0036]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１のプライマープールによりプレ増幅された少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第２のプライマープールを含む。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第３のプライマープールを含む。

[0037]一部の実施形態では、第２のプライマープール中の定量化プライマー対のうちの少なくとも１つが、第１のプライマープール中のプライマー対のうちの少なくとも１つと同一である。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第２のプライマープールの定量化プライマー対は、第１のプライマープールによりプレ増幅された少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部分を増幅するように設計されている。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第３のプライマープールの定量化プライマー対は、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部分を増幅するように設計されている。

[0038]一部の実施形態では、第１の、第２の、または第３のプライマープールは、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む。

[0039]一部の実施形態では、第１のプライマープールおよび第２のプライマープールは、単一の容器にまたは別々の容器に包装されている。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む。

[0040]一部の実施形態では、キットは検出剤をさらに含む。一部の実施形態では、検出剤は、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される。一部の実施形態では、蛍光プローブは、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、蛍光プローブは、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端で消光剤（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡまたはアイオワブラックダーククエンチャー）で標識される。

[0041]一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、および／または対象由来の生体試料を含有するのに適した容器をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、キット結果の使用および／または解釈のための説明書をさらに含む。

[0042]一部の実施形態では、第１の試薬は、亜硫酸水素塩試薬またはメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素塩およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される。

[0043]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第１のプライマープールは、複数の標的マーカーにおいて少なくとも１つの標的配列をプレ増幅するための複数のプライマー対を含み、複数の標的マーカーはＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含み、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第３のプライマープールは、複数の標的マーカーにおいて少なくとも１つの標的配列を増幅するための複数のプライマー対を含み、複数の標的マーカーはＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含み、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む。

[0044]一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーは、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域；

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処理対応物
を含む、またはａ）、ｂ）またはｃ）である。

[0045]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第１のプライマープールは、下の表２に示される配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含み、必要に応じて、第２のプライマープールは、第１のプライマープール中のプライマー対のうちの少なくとも１つと同一である少なくとも１つのプライマー対を含む。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第３のプライマープールは、下の表２に示される配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含む。

[0046]一部の実施形態では、第１のプライマープール、第２のプライマープール、または必要に応じて、第３のプライマープールは、対照マーカーを増幅するためのプライマー対をさらに含む。一部の実施形態では、対照マーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される。

[0047]一部の実施形態では、キットは、それぞれが第２のプライマープールの画分を受けるための複数の容器をさらに含む。

[0048]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、もしくは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する、または結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターするための診断用キットの製造における本開示のキットの使用を提供する。

[0049]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位（複数可）を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて少なくとも１つの標的マーカーの同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法において使用するためのキットの製造において標的マーカーのメチル化レベルを定量化するための試薬の使用を提供する。

[0050]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位（複数可）を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される、処置に先立って同じ対象から得られる標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法において使用するためのキットの製造において標的マーカーのメチル化レベルを定量化するための試薬の使用を提供する。

[0051]図１は、標的マーカーであるＰＫＮＯＸ２（図１Ａ）と対照マーカーであるＡＣＴＢ（図１Ｂ）のメチル化特異的プライマーの検証を示す。Ｙ軸はΔＲｎ値を示し、これは示されたサイクルでの蛍光強度からベースラインの蛍光強度を差し引くことによって決定される。Ｘ軸はサイクル数を示す。図１Ａに示すように、混合ＤＮＡ組成物において、転換されたメチル化ＤＮＡのパーセンテージが増加するほどＣｔ値は減少し、ＰＫＮＯＸ２のプレ増幅に用いたプライマーはメチル化特異的であることが示された。図１Ｂに示すように、それぞれのＤＮＡ組成物の曲線は重なっており、これは転換されたメチル化ＤＮＡのパーセンテージが増加してもＣｔ値が変わらないことを示し、このことは対照マーカーであるＡＣＴＢのプレ増幅に用いたプライマーがメチル化非特異的であることと一致する。 [0052]図２は、白血球（ＷＢＣ、実線丸「●」で示す）、傍がん組織（ｐａｒａ組織、実線枠「■」で示す）、進行腺腫組織（ＡＡ組織、実線正三角「▲」で示す）、結腸直腸がん組織（ＣＲＣ組織、実線逆三角「▼」で示す）における対照マーカーであるＡＣＴＢ、標的マーカーであるＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２それぞれのメチル化存在量を示す。Ｙ軸はＣｔ値、Ｘ軸は対照マーカーおよび標的マーカーの名称を示す。Ｃｔ値が高いほど、そのマーカーのメチル化存在量が低いことを示す。したがって、図２から、白血球中の標的マーカーのメチル化存在量は、組織試料中よりも有意に低いことがわかった。特に、進行腺腫組織や結腸直腸がん組織に比べ、傍がん組織では標的マーカーのメチル化存在量が低いことがわかった。 [0053]図３は、結腸直腸がん患者集団（ＣＲＣ血漿、実線円「●」で示す）と結腸直腸内視鏡検査陰性集団（健康な血漿、実線正三角「▲」で示す）から得られた生体試料における対照マーカーであるＡＣＴＢと標的マーカーであるＳＡＬＬ１およびＢＣＡＮの分布をそれぞれ示す。Ｙ軸はＣｔ値、Ｘ軸は対照マーカーおよび標的マーカーの名称を示す。Ｃｔ値が低いほど、そのマーカーのメチル化レベルが高いことを示す。したがって、図３から、結腸直腸がん患者集団のそれぞれの標的マーカーのメチル化レベルは、結腸直腸内視鏡検査陰性患者集団のそれよりも有意に高いことがわかる。 [0054]図４は、試験した１３の標的マーカーすべてのＡＵＣ値を示す。Ｙ軸はＡＵＣ値が同じ範囲にある出現数、Ｘ軸はＡＵＣ値である。ＡＵＣ値は０～１であり、ＡＵＣ値が大きいほど分類力が高いことを表す。図に示すように、試験したすべてのマーカー（すなわちＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１）はＡＵＣの範囲が０．８～０．９で、ＣＲＣと対照群を分ける分類力を有していた。 [0055]図５は、マーカーであるＳＡＬＬ１、ＢＣＡＴ１およびＳｅｐｔｉｎ９の組合せのＲＯＣ曲線を示す。Ｙ軸は真陽性率（すなわち感度）を示し、Ｘ軸は偽陽性率（すなわち１－特異度）を示す。実線はＲＯＣ曲線、点線は４５度の対角線を示す。対角線より上の点は良い分類結果（すなわち、ランダムより良い）、線より下の点は悪い結果（すなわち、ランダムより悪い）を表す。したがって、標的マーカーであるＳＡＬＬ１、ＢＣＡＴ１、Ｓｅｐｔｉｎ９の組合せは、結腸直腸新生物の分類において高い感度と高い特異度を持つ。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。 [0056]図６は、標的マーカーの例示的な部分領域の塩基配列を示す。

[0057]以下では、本開示の様々な態様および実施形態を開示するが、当業者は、本願の主題の精神および範囲から逸脱することなく、様々な同等の変更および修正を行うことが可能である。本明細書に開示された様々な態様および実施形態は、例示のためにのみ与えられており、本開示を限定することを意図するものではない。本願の実際の保護範囲は、特許請求の範囲によって定義される。別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本開示において引用されたすべての文献、特許、特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[0058]本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、同じものの複数形を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、複数の試薬を含む。

[0059]本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上特に必要とされない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」または「ｉｎｃｌｕｄｅ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの変形形態は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。

[0060]がんの診断は、従来、単一のマーカー（例えば、遺伝子突然変異）の検出に依存していた。しかし、がんという疾患状態は、単一のマーカーでは多くの病態を検出したり識別したりすることができないのが一般的である。さらに、生体試料中の単一マーカーのレベルは通常非常に限られているため、がんの診断特異度および／または診断感度をさらに低下させる。したがって、単一のマーカーだけを認識するアッセイは、予測的価値が限られていることが示されている。

[0061]本開示の１つの態様は、少なくとも１つの標的マーカー（複数可）の少なくとも一部がプレ増幅されるように、プレ増幅から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化する前に、少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部のプレ増幅を行うことである。このようなプレ増幅ステップは、標的マーカー（複数可）の量（複数可）／レベル（複数可）を増加させると考えられ、結腸直腸新生物の診断特異度および／または診断感度を著しく増加させることが判明している。本開示の別の態様は、結腸直腸新生物の診断特異度および／または診断感度を高めるように、生体試料内の複数の標的マーカーのメチル化レベルを同時に定量化することである。特定の実施形態では、複数の標的マーカーは、定量化される前にプレ増幅されない。特定の実施形態では、複数の標的マーカーは、定量化される前にプレ増幅される。特に、本開示の発明者らは、驚くべきことに、生体試料内の複数の標的マーカーのメチル化レベルの同時定量化、またはプレ増幅ステップと定量化ステップの組合せが、結腸直腸新生物の診断特異度および／または診断感度を著しく高め、例えば前がん性腺腫ステージまたは早期がん性ステージの結腸直腸新生物の早期発見を可能とすることを見出した。当業者であれば理解できるように、診断の文脈では、「感度」は、正しく同定された陽性結果の割合、すなわち、問題となっている疾患を有すると正しく同定された対象のパーセンテージを定義する。一方、「特異度」は、陰性結果のうち正しく同定された割合、すなわち、問題となっている疾患を有していないと正しく同定された対象のパーセンテージを定義する。
方法
[0062]一態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットのうちの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0063]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、少なくとも２つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択され、少なくとも２つの標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットのうちの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物の発病時であるもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0064]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（Ｉ）およびステップ（ＩＩ）を繰り返すことにより定量化される、処置に先立って同じ対象から得られた標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0065]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、少なくとも２つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択され、少なくとも２つの標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得たＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（Ｉ）およびステップ（ＩＩ）を繰り返すことにより定量化される処置に先立つ同じ対象から得られた標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0066]一部の実施形態では、本開示の標的マーカーのセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個またはそれよりも多い標的マーカーを含む。

[0067]一部の実施形態では、本開示のステップ（ＩＩ）は、
（ｉ）ステップ（Ｉ）から得られた処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットのうちの少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカーのセットがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ｉｉ）前記サブステップ（ｉ）から得られたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップと
を含む。

[0068]一部の実施形態では、ステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉ）が存在する。一部の実施形態では、ステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉ）が存在しない。一部の実施形態では、上記方法は、ステップ（Ｉ）の前に対象由来の生体試料からＤＮＡを得るステップをさらに含む。

[0069]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手された生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物の発病時であるもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0070]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される処置に先立って同じ対象から得られる標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法を提供する。

[0071]本明細書で使用される場合、用語「についてスクリーニングする（ｓｃｒｅｅｎｆｏｒ）」および「についてスクリーニングする（ｓｃｒｅｅｎｓｆｏｒ）」または「についてスクリーニングする（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒ）」などの変形とは、結腸直腸新生物の同定などの病理状態、疾患もしくは状態の同定のことであり、または特定の処置レジメンから利益を得うる結腸直腸新生物を有する対象の同定のことである。本開示では、用語「スクリーニングする」、「についてスクリーニングする」、「診断する」および「診断」は互換的に使用しうる。

[0072]本明細書で使用される場合、用語「新生物」は、新生物細胞を含む病変、腫瘍または他の被嚢されたもしくは被嚢されていない塊または他の成長形態に関連するものとして理解されるべきである。「新生物細胞」は、異常な成長を見せる細胞に関連するものとして理解されるべきである。用語「成長」は、その最も広い意味で理解されるべきであり、増殖に関連するものを含む。これに関して、異常な細胞成長の例は、細胞の制御されない増殖である。別の例は、細胞での失敗したアポトーシスであり、したがってその通常の寿命を延長する。新生物細胞は良性細胞または悪性細胞でもよい。一部の実施形態では、対象新生物は腺腫または腺癌である。本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定せずに、腺腫は一般には、上皮組織由来であるまたははっきりと限定された上皮構造を見せる上皮起源の良性腫瘍である。これらの構造は、腺外見を呈する場合がある。腺腫は、良性腺腫または良性新生物病変が悪性腺癌に進む場合に生じるものなど、腺腫内に悪性細胞集団を含むことがある。一部の実施形態では、新生物は癌などの悪性である。一部の実施形態では、新生物は腺腫などの非悪性である。

[0073]本明細書で使用される場合、用語「結腸直腸新生物」とは、結腸、直腸、および／または虫垂に生じる新生物のことである。一部の実施形態では、結腸直腸新生物は、結腸直腸がん、大きな結腸直腸腺腫、および／または無茎性鋸歯状ポリープである。一部の実施形態では、結腸直腸新生物は前がん状態である。

[0074]本明細書で使用される場合、用語「前がん状態」とは、がん発症の増大したリスクと関連のある組織学的変化を示す新生物のことである。そのような状態の例は、結腸直腸細胞増殖性障害という文脈での、高度な異形成、例えば、結腸の腺腫性ポリープを有する細胞増殖性障害を含む。

[0075]本明細書で使用される場合、腺腫または腺癌などの新生物という文脈での用語「発病」は、異形成を見せるその対象の１つまたは複数の細胞に関連するものとして理解されるべきである。これに関して、腺腫または腺癌は、異形成細胞の塊が発症している点で十分発達している場合がある。代わりに、腺腫または腺癌は、診断時に比較的ごくわずかの異常な細胞分裂しか起きていない点で、ごく初期の段階である場合がある。本開示は、結腸直腸がんなどの結腸直腸新生物の発病に対する対象のリスクの評価にも広がる。

[0076]本明細書で使用される場合、用語「評価する（ａｓｓｅｓｓ）」または「アセスメント（ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）」とは、結腸直腸新生物発症に冒されている対象由来の試料と冒されていない対象由来の試料を区別する能力または結腸直腸新生物発症の異なる段階を有する対象由来の試料を区別する能力のことである。一部の実施形態では、アセスメントは、対象の腫瘍が発症段階に入ったかどうかまたは対象の腫瘍が発症段階に入った高い可能性があるかどうかを判定することに関する。一部の実施形態では、アセスメントは、対象の腫瘍の分類（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶ等）に関する。一部の実施形態では、アセスメントは、対象の腫瘍の発症が減少したまたはもっと重大になったかどうかを判定することに関する。一部の実施形態では、アセスメントは、治療からの臨床的有用性の可能性を評価する一助となることができる。一部の実施形態では、アセスメントは、患者が処置、例えば、特定の治療薬での処置に続いて改善するかどうかおよび／またはその可能性に関していてもよい。本開示の評価方法を臨床的に使用すれば、いずれか特定の患者にとって最も適した処置モダリティを選ぶことにより処置決定をすることができる。本開示の評価方法は、例えば、所与の治療薬または組合せの投与、外科的介入、ステロイド処置等を含む、所与の治療レジメンなどの治療レジメンに続いて患者が長期生存の可能性があるかどうかを評価するのに価値のあるツールになることができる。

[0077]当業者が理解している判別することまたは判別は、分析される試料の１００％で正しいことを目指すことはできない。しかし、判別は、分析される試料の統計的に有意な量が正しく分類されることを必要とする。統計的に有意である量は、例えば、信頼区間、ｐ値の決定、スチューデント検定またはフィッシャーの判別関数（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）により、しかしこれらに限定されない異なる統計的ツールの使用により、当業者が確立することができる。詳細はＤｏｗｄｙａｎｄＷｅａｒｄｅｎ、ＳｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９８３年に見られる。ある特定の実施形態では、信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。一部の実施形態では、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１未満である。

[0078]本明細書で使用される場合、用語「発症」とは、遺伝的に決定された経路に沿った細胞形態および生理の変化、例えば、前の、低いまたは初期段階から後のもっと複雑なまたは進行期への物理的な成熟の自然な進行過程のことである。

[0079]本明細書で使用される場合、用語「予後」とは、例えば、疾患（例えば、がん）の再発、再燃、および薬物耐性を含む疾患症状の転帰の見込みを予測することである。この用語は、治療からの臨床的有用性の可能性を予測することでもある。一部の実施形態では、統計的アルゴリズムを使用すれば、対象の疾患の予後が提供される。例えば、予後は、手術、がんの臨床サブタイプ（例えば、結腸直腸がん、メラノーマ、および腎細胞癌等の固形腫瘍）の発症、１つまたは複数の臨床学的因子の発症、または疾患からの回復が可能である。予後は、予後不良（例えば、再発するまたは薬物耐性になる可能性がある）または予後良好になりうる。

[0080]本明細書で使用される場合、用語「応答性」とは、処置に対する対象の有益な応答のことである。処置に対する対象の応答性は、（１）速度低下および完全な停止を含む疾患進行のある程度の阻害；（２）疾患エピソードおよび／もしくは症状の数の減少；（３）病変サイズの減少；（４）隣接する末梢臓器および／もしくは組織中への疾患細胞浸潤の阻害（すなわち、低減、速度低下または完全な停止）；（５）疾患蔓延の阻害（すなわち、低減、速度低下または完全な停止）；（６）障害に関連する１つもしくは複数の症状のある程度の軽減；（７）処置に続く無病提示の長さの増加；（８）自己免疫応答の減少、これは疾患病変の後退または消失、例えば、無進行生存をもたらしうるが、もたらさなくてもよい；（９）増加した全生存；（１０）より高い応答速度；および／または（１１）処置に続く所与の時点での減少した死亡率を含むがこれらに限定されない対象に対する利益を示すいずれかのエンドポイントを使用して評価することができる。用語「利益」または「有益な」は最も広い意味で使用され、任意の望ましい効果のことである。

[0081]本開示では、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）の詳細な記載は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法と結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法の両方に適用される。一方、両方の方法についてのステップ（ｅ）は別に記載される。さらに、本開示では、本開示のステップ（Ｉ）は本開示のステップ（ｂ）と同一であるまたは少なくとも類似している。さらに、本開示のステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉ）は本開示のステップ（ｃ）と同一であるまたは少なくとも類似しており；本開示のステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉｉ）は本開示のステップ（ｄ）と同一であるまたは少なくとも類似している。さらに、本開示のステップ（ＩＩＩ）は本開示のステップ（ｅ）と同一であるまたは少なくとも類似している。したがって、ステップ（Ｉ）とステップ（ｂ）はまとめて下では「ステップ（ｂ）」と呼ばれ、ステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉ）とステップ（ｃ）はまとめて下では「ステップ（ｃ）」と呼ばれ、ステップ（ＩＩ）のサブステップ（ｉｉ）とステップ（ｄ）はまとめて下では「ステップ（ｄ）」と呼ばれ、ステップＩＩＩとステップ（ｅ）はまとめて下では「ステップ（ｅ）」と呼ばれる。
ステップ（ａ）
[0082]本開示に従った方法のステップ（ａ）では、対象由来のＤＮＡを含有する生体試料が入手される。

[0083]本明細書で使用される場合、用語「生体試料」とは、例えば、物理的、生化学的、化学的および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けられるおよび／または同定されることになる細胞および／または他の分子実体（例えば、ＤＮＡ）を含有する目的の対象から入手されるまたはこれに由来する生物学的組成物のことである。生体試料は、当業者であれば知っている任意の方法により入手される対象の細胞、組織、臓器および／または生物学的流体を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、生体試料は、組織切片、生検、パラフィン包埋組織、体液、結腸流出物、外科切除試料、単離された血球、血液から単離された細胞、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、体液は、全血、血清、血漿、尿、粘液、唾液、腹水、胸腔内液、胸液、滑液、脳脊髄液、胸腔穿刺液、腹部液、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、結腸流出物は、大便試料および浣腸洗浄試料からなる群から選択される。本明細書で開示される方法に従って検査するのにどんなタイプの試料が最も適しているかの選択は、状況の性質に依拠する。一部の実施形態では、生体試料は対象の全血から得られる。一部の実施形態では生体試料は対象の血漿から得られる。当業者であれば、全血から血漿を調製する種々の方法を認識している。例えば、一部の実施形態では、血漿は、対象由来の全血の１、２、３、４、５回またはそれよりも多い回数の遠心分離により得られる。

[0084]本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトと非ヒト動物の両方を含む。非ヒト動物は、哺乳動物および非哺乳動物などのすべての脊椎動物を含む。「対象」は、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽およびウマなどの家畜；またはラット、マウスなどの齧歯類；または類人猿、サル、アカゲザルなどの非ヒト霊長類；またはイヌやネコなどの飼育動物でもよい。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象はヒトである。用語「対象」および「個体」は本開示では互換的に使用しうる。

[0085]一部の実施形態では、ＤＮＡは生体試料から単離される。生体試料からのＤＮＡの単離および精製は、市販のキットの使用を含む、当技術分野で公知の種々の方法を使用することにより実施することができる。例えば、ＤＮＡは、一部タンパク質分解酵素を使用して、高度な変性および還元条件下で出発物質を溶解し、フェノール／クロロホルム抽出工程を用いて得た核酸画分を精製し、透析またはエタノール沈殿により水相から核酸を回収することによって、細胞および組織から単離される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．ｉｎＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＣＳＨ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、１９８９年参照）。別の例では、特にアガロースゲルからＤＮＡ断片を精製するための、および溶菌液からプラスミドＤＮＡを単離するための、しかし血液、組織または細胞培養物からもっと長い鎖の核酸（ゲノムＤＮＡ、全細胞ＲＮＡ）も単離するためのいくつかの試薬系が今や存在する。これらの市販の精製系の多くは、異なるカオトロピック塩の存在下で核酸をミネラル担体に結合させるというかなりよく知られている原理に基づいている。これらの系では、細かく粉砕されたガラス粉末、珪藻土またはシリカゲルの懸濁液が担体物質として使用される。生体試料からＤＮＡを単離し精製するためのいくつかの他の方法は、例えば、米国特許第７８８８００６号および欧州特許出願公開第１６２６０８５号に記載されている。方法の選択は、時間、経費および要求されるＤＮＡの量を含むいくつかの要因に影響される。

[0086]一部の実施形態では、生体試料中に含有されるＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、用語「ゲノムＤＮＡ」とは、細胞または生物の完全なゲノム、およびその断片または部分を含有するＤＮＡのことである。ゲノムＤＮＡは、対象に由来するＤＮＡの大きな一片（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または３００ｋｂよりも長い）であり、ＤＮＡメチル化などの天然の修飾物を有することができる。

[0087]一部の実施形態では、生体試料中に含有されるＤＮＡは、細胞ＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、用語「細胞ＤＮＡ」とは、ｉｎｖｉｖｏで細胞に存在するＤＮＡ、または、ＤＮＡが細胞からｉｎｖｉｖｏで取り除かれたのではない限り、ｉｎｖｉｖｏ細胞から得られｉｎｖｉｔｒｏで分離された、単離された、もしくは他の方法で操作されたＤＮＡのことである。

[0088]一部の実施形態では、生体試料中に含有されるＤＮＡは、無細胞ＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、用語「無細胞ＤＮＡ」とは、細胞の外側にｉｎｖｉｖｏで存在するＤＮＡ断片のことである。この用語は、ｉｎｖｉｖｏ細胞外供給源から得られｉｎｖｉｔｒｏで分離された、単離された、または他の方法で操作されたＤＮＡ断片を指すのにも使用できる。無細胞ＤＮＡ中のＤＮＡ断片は、典型的には、約１００～２００ｂｐに及ぶ長さを有し、これはおそらく、ヌクレオソームの周りに巻き付けられたＤＮＡストレッチの長さに関係している。無細胞ＤＮＡは、例えば、無細胞胎児ＤＮＡおよび循環腫瘍ＤＮＡを含む。無細胞胎児ＤＮＡは、妊娠した母親の、血液中などの、身体中で循環し、胎児ゲノムを表し、循環腫瘍ＤＮＡは、がん患者の、血液中などの、身体中を循環する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、対象の細胞ＤＮＡが実質的になくてもよい。例えば、無細胞ＤＮＡは、細胞ＤＮＡの１ｍＬ当たり約１，０００ｎｇ未満、１ｍＬ当たり約１００ｎｇ未満、１ｍＬ当たり約１０ｎｇ未満、または１ｍＬ当たり約１ｎｇ未満を含有しうる。

[0089]無細胞ＤＮＡは、当技術分野で公知の従来の技法を使用することにより調製しうる。例えば、血液試料の無細胞ＤＮＡは、約３～３０分間、約３～１５分間、約３～１０分間、約３～５分間、約２００～２０，０００ｇ、約２００～１０，０００ｇ、約２００～５，０００ｇ、約３００～４，０００ｇ等の速度で血液試料を遠心分離することにより入手しうる。例えば、一部の実施形態では、血液試料の無細胞ＤＮＡは、対象由来の血漿または血清の１、２、３、４、５またはそれよりも多い回数の遠心分離により入手しうる。一部の実施形態では、血液試料は、細胞およびその断片を可溶性ＤＮＡを含む無細胞画分から分離するため精密濾過法により入手しうる。習慣的に、精密濾過法は、０．２２μｍのメンブランフィルターなどのフィルター、例えば、０．１μｍ～０．４５μｍメンブランフィルターを使用して実行しうる。

[0090]一部の実施形態では、分析のための全血、血清または血漿からの無細胞ＤＮＡの抽出は、市販のＤＮＡ抽出製品を使用して実施される。そのような抽出方法は循環ＤＮＡの高回収率（＞５０％）を主張しており、一部の製品（例えば、Ｑｉａｇｅｎにより生産されているＱＩＡａｍｐ循環核酸キット）は小さなサイズのＤＮＡ断片を抽出すると主張されている。使用される典型的な試料量は、血清または血漿の範囲１～５ｍＬである。

[0091]一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは循環腫瘍ＤＮＡを含む。循環腫瘍ＤＮＡ（「ｃｔＤＮＡ））は、体液（例えば、血液、尿、唾液、痰、便、胸腔内液、脳脊髄液等）中の細胞とは関連のない腫瘍由来断片化ＤＮＡである。通常、ｃｔＤＮＡは高度に断片化されており、平均長はおおよそ１５０塩基対である。ｃｔＤＮＡは一般に、体液（例えば、血漿）中にごくわずかな割合の無細胞ＤＮＡを含み、例えば、ｃｔＤＮＡは血漿ＤＮＡの約１０％未満を構成することがある。一般に、このパーセンテージは約１％未満、例えば、約０．５％未満または約０．０１％未満である。さらに、血漿ＤＮＡの総量は一般に非常に低く、例えば、約１０ｎｇ／血漿ｍＬである。ｃｔＤＮＡの量は個体間で変動し、腫瘍のタイプ、その位置、およびがん性腫瘍では、がんステージに依存する。しかし、ｃｔＤＮＡは通常、体液中では極めて希少であり、極端に感度がよく特異的な技法によってのみ検出することができる。ｃｔＤＮＡの検出は、腫瘍を検出し診断する、腫瘍特異的処置を導く、がんの処置をモニターする、がんの寛解をモニターするのに有益になりうる。
ステップ（ｂ）
[0092]本開示に従った方法のステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）から得られる生体試料中のＤＮＡは、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理され、それによって処理されたＤＮＡを得る。

[0093]ＤＮＡメチル化は、メチル基がＤＮＡ分子に（例えば、シトシン塩基またはＤＮＡ分子の塩基に）付加される（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用により）生物学的過程である。哺乳動物では、ＤＮＡメチル化はほとんどシトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドの５’位（すなわち、「ＣｐＧ部位」）に見い出され、これが、遺伝子のプロモーター内または第１エクソン中の５’－ＣｐＧ－３’ジヌクレオチドに見い出される場合、遺伝子のエピジェネティック不活化をもたらす。ＤＮＡメチル化が遺伝子発現、腫瘍発生、ならびに他の遺伝性およびエピジェネティック疾患の制御に重要な役割を果たしていることはよく実証されている。

[0094]本明細書で使用される場合、用語「メチル化シトシン残基」とは、メチル基がシトシン環の炭素原子（例えば、Ｃ５原子）に結合しているシトシン残基の誘導体のことである。用語「非メチル化シトシン残基」とは、「メチル化シトシン残基」とは対照的に、メチル基がシトシン環の炭素原子（例えば、Ｃ５原子）に結合していない非誘導化シトシン残基のことである。シトシン残基がメチル化されているＣｐＧ部位はメチル化ＣｐＧ部位であり、シトシン残基がメチル化されていないＣｐＧ部位は非メチル化ＣｐＧ部位である。

[0095]一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される試薬は、ＤＮＡ中の非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位（複数可）を区別することができ、それによって処理されたＤＮＡを得る。試薬は、選択的に非メチル化シトシン残基（複数可）に作用するがメチル化シトシン残基（複数可）には有意に作用しない場合があり；または試薬は、選択的にメチル化シトシン残基（複数可）に作用するが非メチル化シトシン残基（複数可）には有意に作用しない場合がある。その結果、元のＤＮＡは処理されたＤＮＡにメチル化依存的に転換されるので、処理されたＤＮＡはそのハイブリダイゼーション挙動により元のＤＮＡと区別できると考えられる。

[0096]例えば、一部の試薬は、選択的に非メチル化シトシン残基（複数可）をウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーションに関してシトシンに似ていない別の塩基に転換する場合があり、メチル化シトシン残基（複数可）は非転換のままであった。別の例では、一部の試薬は、選択的に残基がメチル化されている場合にそこで切断することも、または選択的に残基がメチル化されていない場合にそこで切断することもある。

[0097]本明細書で使用される場合、用語「処理されたＤＮＡ」とは、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理されているＤＮＡのことであり、すなわち、ＤＮＡ中のＤＮＡメチル化状態が変化している。

[0098]ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の試薬は、ＣｐＧ部位（複数可）で非メチル化シトシン残基（複数可）を選択的に修飾して、修飾された残基（複数可）を生成するが、メチル化シトシン残基（複数可）を有意に修飾しない。

[0099]一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の試薬は、亜硫酸水素塩試薬を含む。本明細書で使用される場合、用語「亜硫酸水素塩試薬」とは、メチル化と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに本明細書で開示される通りに有用である、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはその任意の組合せを含む試薬のことである。本開示では、亜硫酸水素塩試薬を用いたＤＮＡの処理は、「亜硫酸水素塩反応」または「亜硫酸水素塩処理」とも呼ばれ、これは、メチル化シトシン残基が有意に転換されない亜硫酸水素イオンの存在下での、非メチル化シトシン残基、特に核酸中の非メチル化シトシン残基のウラシル塩基（複数可）、チミン塩基（複数可）またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシン（複数可）に似ていない他の塩基（複数可）への転換のための反応を意味する。言い換えると、亜硫酸水素塩処理はメチル化と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別するのに有用である。

[00100]メチル化シトシン残基の検出のための亜硫酸水素塩反応は、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．ら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９（１９９２）１８２７～３１頁およびＧｒｉｇｇ，Ｇ．ａｎｄＣｌａｒｋ，Ｓ．、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１６（１９９４）４３１～６頁に詳細に記載されている。亜硫酸水素塩反応は、脱アミノ化ステップおよび脱スルホン化ステップを含有する（ＧｒｉｇｇａｎｄＣｌａｒｋ、上記参照）。メチル化シトシン残基は有意に転換されないという記述は、メチル化シトシン残基のごくわずかなパーセンテージしか（例えば、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％未満、１８％未満、１９％未満、２０％未満）ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシン（複数可）に似ていない別の塩基（複数可）に転換されないことを除外できないという事実を考慮に入れるが、この記述は非メチル化シトシン残基だけ独占的に転換することが意図されているものとする。

[00101]当業者であれば、例えば、亜硫酸水素塩処理の主要パラメータを開示しているＦｒｏｍｍｅｒＭ．，ら、上記またはＧｒｉｇｇａｎｄＣｌａｒｋ、上記を参考にすることにより、亜硫酸水素塩処理、特に脱アミノ化ステップおよび脱スルホン化ステップの実施の仕方を承知している。脱アミノ化効率およびＤＮＡ分解に影響を与えるパラメータに対するインキュベーション時間および温度の影響は開示されている。

[00102]一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は市販されており、例えば、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）亜硫酸水素塩転換キット、ＥｐｉＭａｒｋ（商標）亜硫酸水素塩転換キット、ＥｐｉＪＥＴ（商標）亜硫酸水素塩転換キット、ＥＺＤＮＡメチル化－Ｇｏｌｄ（商標）キット等である。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩反応は、キットの使用説明書に従って実施される。

[00103]一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の試薬は、選択的に、残基がメチル化されていない場合はそこで切断するが、残基がメチル化されている場合はそこで切断せず、または選択的に、残基がメチル化されている場合はそこで切断するが、残基がメチル化されていない場合は、そこで切断しない。

[00104]一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の試薬は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である。

[00105]用語「メチル化感受性制限酵素」とは、その認識部位のメチル化状態に依存して核酸を選択的に消化する酵素のことである。認識部位がメチル化もヘミメチル化もされていなければ特異的に切断するそのような制限酵素の場合は、認識部位がメチル化されているならば、切断は起こらないまたは起こっても効率が著しく減少する。認識部位がメチル化されていれば特異的に切断するそのような制限酵素の場合は、認識部位がメチル化されていないならば、切断は起こらないまたは起こっても効率が著しく減少する。一部の実施形態では、メチル化感受性制限酵素の認識配列はＣＧジヌクレオチド（例えば、ｃｇｃｇまたはｃｃｃｇｇｇ）を含有する。一部の実施形態では、メチル化感受性制限酵素の認識配列は、このＣＧジヌクレオチドのシトシン残基が炭素原子Ｃ５でメチル化されている場合切断しない。

[00106]一部の実施形態では、ＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される。

[00107]メチル化感受性制限酵素、または標的領域内でメチル化と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別するメチル化感受性制限酵素を含む一連の制限酵素試薬がメチル化を判定するのに利用される方法、例えば、これに限定されないが、差示的メチル化ハイブリダイゼーション（「ＤＭＨ」）が、当技術分野では公知である。

[00108]一部の実施形態では、ステップ（ａ）のＤＮＡは、メチル化感受性制限酵素を用いた処置に先立って切断されてもよい。そのような方法は当技術分野では公知であり、物理的手段と酵素的手段の両方を含みうる。特に好ましいのは、メチル化感受性ではなく、その認識部位がＡＴ豊富でＣＧジヌクレオチドを含まない１つまたは複数の制限酵素の使用である。そのような酵素の使用により、断片化ＤＮＡ中のＣｐＧ部位およびＣｐＧ豊富な領域の保存が可能になる。一部の実施形態では、そのような制限酵素は、ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、Ｔｒｕ１Ｉ、Ｔｒｕ９Ｉ、ＭａｅＩ．ＸｓｐＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される。
ステップ（Ｃ）
[00109]本開示に従った方法のステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーはプレ増幅プライマープールでプレ増幅され、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅される。本開示では、ステップ（ｃ）はプレ増幅ステップと呼ばれてもよい。いかなる理論にも縛られたくはないが、ステップ（ｃ）は本発明の目的を達成するのに必ずしも必要ではないと考えられる。一部の実施形態では、本開示に従った方法のステップ（ｃ）は存在している。一部の実施形態では、本開示に従った方法のステップ（ｃ）は存在していない。

[00110]標的マーカー（複数可）のプレ増幅の目的の１つは、処理されたＤＮＡ内の標的マーカー（複数可）の量（複数可）を、例えば、低量（複数可）の標的マーカー（複数可）から増やすことである。本明細書で使用される場合、用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」ならびに「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」、「増幅された（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」および「増幅する（ａｍｐｌｉｆｉｅｓ）」などの変形とは一般に、分子または関連する分子のセットのコピー数の増加をもたらす任意の過程のことである。この用語がポリヌクレオチド分子に適用されると、増幅は、典型的には少量のポリヌクレオチドから出発して、ポリヌクレオチド分子、またはポリヌクレオチド分子の一部の複数のコピーを生成することを意味し、そこでは増幅された物質（アンプリコン、ＰＣＲアンプリコン）は典型的には検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的および酵素的過程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（逆転写ＰＣＲ、ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）反応、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）中の鋳型ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は増幅の形態である。

[00111]本明細書で使用される場合、用語「標的マーカー」とは、そのメチル化レベルが結腸直腸新生物（例えば、結腸直腸がん）を示している、または結腸直腸新生物（例えば、結腸直腸がん）の発病もしくは発病に対するリスクを示している、または結腸直腸新生物（例えば、結腸直腸がん）の発症もしくは予後を示している、目的の核酸、または遺伝子領域のことである。用語「マーカー」および「遺伝子」は本開示では互換的に使用しうる。用語「マーカー」および「遺伝子」は、そのすべての転写バリアント（例えば、用語「Ｓｅｐｔｉｎ９」は、例えば、その切断型転写Ｑ９ＨＣ７４を含むものとする）ならびにそのすべてのプロモーターおよび調節エレメントを含むように解釈されるものとする。当業者であれば認識しているように、一部の遺伝子は対象間で対立遺伝子変異または一塩基多型（「ＳＮＰ」）を見せることで知られている。ＳＮＰは、変化するサイズの挿入および欠失ならびにジヌクレオチドおよびトリヌクレオチド反復などの単純な配列反復を包含する。したがって、本開示は、他の任意の突然変異、多型または対立遺伝子変異から生じるあらゆる形態のマーカー／遺伝子まで広がると理解されるべきである。さらに、用語「マーカー」および「遺伝子」は、マーカーまたは遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の配列を含むものとすることを理解されるべきである。

[00112]本明細書で使用される用語「標的マーカー」は、１）生体試料中にまたはゲノムＤＮＡ中に見い出される元のマーカー（特定のメチル化状態で）と２）その処理された配列（例えば、亜硫酸水素塩転換対応物またはＭＳＲＥ処理された対応物）の両方を包含すると広く解釈されている。亜硫酸水素塩転換対応物は、１つまたは複数の非メチル化シトシン残基がウラシル塩基（複数可）、チミン塩基（複数可）またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシン（複数可）に似ていない他の塩基（複数可）に転換される点でゲノミックス配列中の標的マーカーとは異なる。ＭＳＲＥ処理された対応物は、配列が１つまたは複数のＭＳＲＥ切断部位で切断される点でゲノミックス配列中の標的マーカーとは異なる。

[00113]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカー（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８マーカー）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１からなる群から選択される１４マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１からなる群から選択される１３マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１からなる群から選択される１１マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１からなる群から選択される１０マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、およびＴＭＥＦＦ２からなる群から選択される１０マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、およびＴＭＥＦＦ２からなる群から選択される９マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、およびＮＤＲＧ４からなる群から選択される７マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、およびＮＤＲＧ４からなる群から選択される６マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、およびＢＣＡＮからなる群から選択される６マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、およびＢＣＡＮからなる群から選択される５マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、およびＩＲＦ４からなる群から選択される５マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＴ１、およびＳｅｐｔｉｎ９からなる群から選択される３マーカーを含む。

[00114]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、１つまでの標的マーカーが可能である（すなわち、１つのマーカーであるが１つのマーカー以下）。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳｅｐｔｉｎ９である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＴ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＫＺＦ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＮＤＲＧ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＮである。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＫＮＯＸ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＶＡＶ３である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＲＦ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＯＵ４Ｆ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳＡＬＬ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＴＭＥＦＦ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＡＳＣＬ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＦＧＦ１２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１である。

[00115]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは複数の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つまたは３つのマーカーを含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個）の追加のマーカーをさらに含む。

[00116]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９ならびにＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７個）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00117]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＴ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＮＤＲＧ４、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00118]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＫＺＦ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＢＣＡＴ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00119]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00120]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＶＡＶ３ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00121]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＲＦ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＮＤＲＧ４を含む。

[00122]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＫＮＯＸ２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00123]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00124]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＳＡＬＬ１ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00125]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＴＭＥＦＦ２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＮＤＲＧ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00126]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＡＳＣＬ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＮＤＲＧ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00127]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＦＧＦ１２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＮＤＲＧ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00128]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＦＧＦ１２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＮＤＲＧ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00129]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＦＧＦ１２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00130]本開示では、問題となっているマーカー／遺伝子は本明細書では、その名称とその染色体座標の両方を参照することにより記載される。染色体座標は、２００９年２月に公表されたヒトゲノムデータベースバージョンＨｇ１９と一致している（本明細書では「Ｈｇ１９座標」と呼ばれる）。

[00131]本開示では、標的マーカーが遺伝子間領域も含むことが理解されるべきであり、この領域は「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１」、「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２」、「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３」、「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５」と名付けられ、そのそれぞれの染色体座標により定義される。例えば、本開示では、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１とは、ｃｈｒ６：１９６７９８８５～１９６９３９８８により定義される領域のことであり；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２とは、ｃｈｒ１０：１３００８２０３３～１３００８７１４８により定義される領域のことであり；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３とは、ｃｈｒ１０：１３３１０７８８０～１３３１１３９６６により定義される領域のことであり；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４とは、ｃｈｒ７：１５２６２０５８８～１５２６２４６８５により定義される領域のことであり；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５とは、ｃｈｒ８：７０９４５０１４～７０９４９１７７により定義される領域のことである。

[00132]一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーは：ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域：

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処置対応物を含むまたはａ）、ｂ）またはｃ）である。上に収載されるＨｇ１９座標ならびにそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流の特定のヌクレオチド配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、およびＮＣＢＩウェブサイトなどの公開されているデータベースで入手可能である。

[00133]一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーはそのすべてのバリアントも含む。バリアントは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を共有する、すなわち、本明細書に記載されるマーカー／遺伝子領域と比べて１つまたは複数の欠失、付加、置換、逆方向配列等を有する同じ領域由来の核酸配列を含む。したがって、本開示は、実際の核酸配列間の小さな遺伝的変異が対象間に存在している場合があるという事実にもかかわらず、同じ結果を達成するようなバリアントまで広がると理解されるべきである。

[00134]本明細書で使用される場合、用語「パーセント（％）配列同一性」とは、同一アミノ酸（または核酸）の最大数を達成するように配列を整列させる、および必要な場合には、ギャップを導入した後、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージのことである。言い換えると、アミノ酸配列（または核酸配列）のパーセント（％）配列同一性は、その配列が比較されている参照配列と比べて同一であるアミノ酸残基（または塩基）の数を候補配列中のまたは参照配列中の、短いほうならどちらでも、アミノ酸残基（または塩基）の総数で割ることにより計算できる。アミノ酸残基の保存的置換は同一残基と見なしても見なさなくてもよい。パーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ(Ｕ．Ｓ．ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０頁（１９９０）；ＳｔｅｐｈｅｎＦ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５：３３８９～３４０２頁（１９９７）も参照されたい)、ＣｌｕｓｔａｌＷ２(ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで入手可能、ＨｉｇｇｉｎｓＤ．Ｇ．ら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３～４０２頁（１９９６）；ＬａｒｋｉｎＭ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、２３（２１）：２９４７～８頁（２００７）も参照されたい)、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般的に利用可能なツールを使用して、達成することができる。当業者であれば、ツールにより提供されるデフォルトパラメータを使用してもよく、または例えば、適切なアルゴリズムを選択することによりなどの、パラメータをアライメントに適するようにカスタマイズしてもよい。

[00135]本明細書で提供されるステップ（ｃ）では、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅される。ある特定の実施形態では、標的マーカーのプレ増幅された部分は、標的マーカーの部分領域内にある。

[00136]本開示をいずれか１つの理論または作用様式に限定せずに、結腸直腸がんなどの結腸直腸新生物で過剰メチル化されていることが多い高密度のＣｐＧジヌクレオチドを含有する部分領域での標的マーカーのメチル化レベルを測定することは特に有用であると考えられている。この知見により、部分領域は分析のための特に有用な標的になる。なぜならば、この知見は分析を必要とするＤＮＡのもっと短いもっとはっきりと限定された領域と、さらに、これらの領域からの結果は、標的マーカーのＨｇ１９領域全体にわたって分析が実施される場合に得られると考えられるよりも、過剰メチル化の存在、または非存在に関して、有意に決定的な結果を提供するという事実との両方のせいでスクリーニング過程が単純化されるからである。したがって、この知見により、診断、スクリーニング／モニタリング過程が単純化もされ、結腸直腸新生物診断の感度および特異度が増加もする。一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーの部分領域は、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義される配列：

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処置対応物を含むまたはａ）、ｂ）またはｃ）である。

[00137]ある特定の実施形態では、それぞれの標的マーカーの部分領域は、配列番号８６～１１２、１６７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、もしくはその亜硫酸水素塩転換対応物、もしくはそのＭＳＲＥ処置対応物を含むまたは配列番号８６～１１２、１６７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、もしくはその亜硫酸水素塩転換対応物、もしくはそのＭＳＲＥ処置対応物である。ある特定の実施形態では、標的マーカーの部分領域の亜硫酸水素塩転換対応物は、配列番号１１３～１６６、１６８、１６９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むまたは配列番号１１３～１６６、１６８、１６９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列である。それぞれの標的マーカーの部分領域の配列番号は下の表１に示されており、配列は図６で提供されている。

[00138]ある特定の実施形態では、ＮＤＲＧ４の部分領域は配列番号８６、１１３、および１４０から選択される配列を含む；ＢＣＡＴ１の部分領域は配列番号８７、１１４、および１４１から選択される配列を含む；ＩＫＺＦ１の部分領域は配列番号８８、１１５、および１４２から選択される配列を含む；Ｓｅｐｔｉｎ９の部分領域は配列番号８９、１１６、および１４３から選択される配列を含む；ＳＤＣ２の部分領域は配列番号９０、１１７、および１４４から選択される配列を含む；ＶＡＶ３の部分領域は配列番号９１、１１８、および１４５から選択される配列を含む；ＴＭＥＦＦ２の部分領域は配列番号９２、１１９、および１４６から選択される配列を含む；ＳＡＬＬ１の部分領域は配列番号９３、１２０、および１４７から選択される配列を含む；ＢＣＡＮの部分領域は配列番号９４、１２１、および１４８から選択される配列を含む；ＰＯＵ４Ｆ２の部分領域は配列番号９５、１２２、および１４９から選択される配列を含む；ＰＫＮＯＸ２の部分領域は配列番号９６、１２３、および１５０から選択される配列を含む；ＡＳＣＬ４の部分領域は配列番号９７、１２４、および１５１から選択される配列を含む；ＫＣＮＡ６の部分領域は配列番号９８、１２５、および１５２から選択される配列を含む；ＳＯＸ１の部分領域は配列番号９９、１２６、および１５３から選択される配列を含む；ＨＳ３ＳＴ２の部分領域は配列番号１００、１２７、および１５４から選択される配列を含む；ＦＧＦ１２の部分領域は配列番号１０１、１２８、および１５５から選択される配列を含む；ＫＣＴＤ８の部分領域は配列番号１０２、１２９、および１５６から選択される配列を含む；ＨＭＸ１の部分領域は配列番号１０３、１３０、および１５７から選択される配列を含む；ＭＡＲＣＨ１１の部分領域は配列番号１０４、１３１、および１５８から選択される配列を含む；ＣＲＨＢＰの部分領域は配列番号１０５、１３２、および１５９から選択される配列を含む；ＮＫＸ２－６の部分領域は配列番号１０６、１３３、および１６０から選択される配列を含む；ＳＬＣ２４Ａ２の部分領域は配列番号１０７、１３４、および１６１から選択される配列を含む；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１の部分領域は配列番号１０８、１３５、および１６２から選択される配列を含む；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２の部分領域は配列番号１０９、１３６、および１６３から選択される配列を含む；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３の部分領域は配列番号１１０、１３７、および１６４から選択される配列を含む；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４の部分領域は配列番号１１１、１３８、および１６５から選択される配列を含む；ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５の部分領域は配列番号１１２、１３９、および１６６から選択される配列を含む；ならびに／またはＩＲＦ４の部分領域は配列番号１６７、１６８、および１６９から選択される配列を含む。

[00139]一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは、生体試料中に１ｎｇ以下、０．９ｎｇ以下、０．８ｎｇ以下、０．７ｎｇ以下、０．６ｎｇ以下、０．５ｎｇ以下、０．４ｎｇ以下、０．３ｎｇ以下、０．２ｎｇ以下、０．１ｎｇ以下、０．０９ｎｇ以下、０．０８ｎｇ以下、０．０７ｎｇ以下、０．０６ｎｇ以下、０．０５ｎｇ以下、０．０４ｎｇ以下、０．０３ｎｇ以下、０．０２ｎｇ以下、または０．０１ｎｇ以下の量で存在している。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは、生体試料中に０．１％以下、０．２％以下、０．３％以下、０．４％以下、０．５％以下、０．６％以下、０．７％以下、０．８％以下、０．９％以下、１％以下のパーセンテージで存在している。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは、生体試料中に、標的マーカーについての検出アッセイの感度のレベルよりも下である濃度で存在している。「検出アッセイの感度」は、分析物濃度／量のわずかな差を区別する検出アッセイの能力の尺度である。生体試料中に存在する無細胞ＤＮＡの標的マーカーが検出アッセイの感度のレベルよりも下である場合、それにより従来の方法を使用する試料中のどの標的マーカーのメチル化レベルの定量化も妨げられると考えられる。これとは対照的に、本明細書で開示される方法は、試料中のごく低量の標的マーカーを検出するのに有用であり有利である。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中の標的マーカーは生体試料中に０．０８ｎｇ以下または０．０４ｎｇ以下の量で存在する。

[00140]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡは、次のステップ（すなわち、ステップ（ｄ））に先立って希釈液で希釈される。一部の実施形態では、希釈液は、無ヌクレアーゼ水、トリスＥＤＴＡバッファー、およびＰＣＲ阻害がない他の任意のバッファーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）のプレ増幅されたＤＮＡは、前希釈なしで次のステップ（すなわち、ステップ（ｄ））に直接添加される。

[00141]処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーはプレ増幅プライマープールでプレ増幅される。本明細書で使用される場合、用語「プライマー」とは、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および、例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合用の作用薬の存在下で、適切な条件、例えば、バッファーおよび温度下で鋳型依存性ＤＮＡ合成用の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドのことである。プライマーの長さは、どんな所与の場合でも、例えば、プライマーの意図された使用に依存しており、一般には１５～３０ヌクレオチドの範囲に及ぶ。短いプライマー分子は一般には、鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度が必要である。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、そのような鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。プライマー部位は、鋳型のうちプライマーがハイブリダイズする領域である。プライマー対は、増幅される配列の５’末端とハイブリダイズする５’フォワードプライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’リバースプライマーを含むプライマーのセットである。当業者であれば、当技術分野の一般常識に基づいて増幅されるマーカー（複数可）に従ってプライマーを設計することができる（例えば、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮＹ、１９９５年参照）。さらに、様々なアッセイのための最適プローブおよび／またはプライマーを設計するためにはいくつかのソフトウェアパッケージが一般公開されており、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３はｔｈｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡから入手可能である。明らかに、プローブまたはプライマーの潜在的使用をその設計中に検討するべきである。例えば、本発明の目的のために設計されるプライマーは、少なくとも１つのＣｐＧ部位を含んでいてもよく、またはプライマーから得られる増幅産物は、少なくとも１つのＣｐＧ部位を含んでいてもよい。ＤＮＡメチル化状態の検出用のプライマーを設計するためのツール、例えば、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（ＬｉＬＣａｎｄＤａｈｉｙａＲ．ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ：ｄｅｓｉｇｎｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＰＣＲｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２年１１月；１８（１１）：１４２７～３１頁）も当技術分野で入手可能である。本開示では、プレ増幅プライマーをプールとして使用することにより、処理されたＤＮＡ内のいかなる標的マーカー（複数可）でも（標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部または少なくとも１つの標的マーカーの部分領域）プレ増幅することができる。

[00142]本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つまたはそれよりも多いヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）、好ましくは少なくとも５つのヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１０～１５個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５～３０個のヌクレオチド、またはそれよりも長い（例えば、オリゴヌクレオチドは典型的には２００残基長未満である（例えば、１５～１００ヌクレオチド）が、本明細書で使用される場合、この用語はもっと長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図されている）を含む分子として定義される。正確なサイズは多くの要因に依存し、これらの要因は今度はオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドはその長さで呼ばれる場合が多い。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは「２４マー」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによりまたは他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより二次および三次構造を形成することができる。そのような構造は、二重鎖、ヘアピン、十字架型構造（ｃｒｕｃｉｆｏｒｍ）、ベンド、および三重鎖を含むことができるがこれらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、またはその組合せを含むどんなやり方でも生成しうる。

[00143]本明細書で使用される場合、用語「相補的な」または「相補性」とは、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖間またはオリゴヌクレオチドプライマーとシーケンシングされるまたは増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位の間などの、ヌクレオチドまたは核酸間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合のことである。相補的ヌクレオチドは、一般には、ＡとＴ（またはＡとＵ）またはＣとＧである。２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、１つの鎖のヌクレオチドが、最適には整列され、比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有しており、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％～９５％、さらに好ましくは約９８～１００％と対合する場合、相補的であると言われる。代わりに、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が選択的なハイブリダイゼーション条件下でその相補体とハイブリダイズする場合、相補性が存在する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも１４～２５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に生じる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照されたい。前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。

[00144]一部の実施形態では、プレ増幅プライマープールは、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む。一部の実施形態では、プレ増幅プライマープールは、複数のメチル化特異的プライマー対を含む。一部の実施形態では、プレ増幅ステップは、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）により実施され、これはメチル化特異的プライマーを使用するＰＣＲである。この技法（すなわち、ＭＳＰ）は、Ｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ：ａｎｏｖｅｌＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＣｐＧｉｓｌａｎｄｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９６年９月３日；９３（１８）：９８２１～６頁、および米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。

[00145]本明細書で使用される場合、用語「メチル化特異的プライマー対」とは、メチル化の違いを利用して処理されたＤＮＡ内の特定の標的マーカー（複数可）を増幅するためにＣｐＧ部位（複数可）を認識するように特に設計されているプライマー対のことである。プライマーは、特定のメチル化状態にあるまたは特定のメチル化状態にない分子だけに作用する。例えば、プライマーは、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、メチル化のある特定のＣｐＧ部位にメチル化特異的なやり方で特異的にハイブリダイズすることができるが、メチル化のない特定のＣｐＧ部位にハイブリダイズすることはできないオリゴヌクレオチドでもよく、したがって、プライマーは、特定のＣｐＧ部位でメチル化を有する標的マーカーを特異的に増幅すると考えられる。別の例では、プライマーは、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、メチル化のない特定のＣｐＧ部位にメチル化特異的なやり方で特異的にハイブリダイズすることができるが、メチル化のある特定のＣｐＧ部位にハイブリダイズすることはできないオリゴヌクレオチドでもよく、したがって、プライマーは、特定のＣｐＧ部位でメチル化のない標的マーカーを特異的に増幅すると考えられる。それゆえに、本開示では、処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーのプレ増幅のためにメチル化特異的プライマー対（複数可）を使用すれば、メチル化と非メチル化ＣｐＧ部位間の区別が可能になる。本開示のメチル化特異的プライマー対は、亜硫酸水素塩処理ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含有する。したがって、メチル化ＤＮＡに特異的である前記プライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、非メチル化ＤＮＡに特異的である前記プライマーの配列は、ＣｐＧ中のＣ位の位置に「Ｔ」を含有する、および／またはＣｐＧ中のＧ位の位置に「Ａ」を含有する。

[00146]一部の実施形態では、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、標的マーカー（複数可）の（または標的マーカー（複数可）の部分領域の）うちの１つの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列をそれぞれが含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、標的マーカー（複数可）の（または標的マーカー（複数可）の部分領域の）うちの１つの少なくとも９連続ヌクレオチドは、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い）ＣｐＧ部位を含む。

[00147]本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」および「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」または「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」などの変形とは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程を指してもよい。一態様では、得られた二本鎖ポリヌクレオチドは「ハイブリッド」または「二重鎖」であってもよい。「ハイブリダイゼーション条件」は典型的には、おおよそ１Ｍ未満、多くの場合約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満でもよい。「ハイブリダイゼーションバッファー」は、５％ＳＳＰＥなどの緩衝塩溶液、または当技術分野で公知の他のそのようなバッファーを含む。ハイブリダイゼーション温度はわずか５℃が可能であるが、典型的には２２℃よりも高く、さらに典型的には約３０℃よりも高く、典型的には３７℃を上回る。ハイブリダイゼーションは多くの場合、厳密な条件下、すなわち、配列がその標的配列にハイブリダイズするが、他の非相補的配列にはハイブリダイズしない条件下で実施される。厳密な条件は配列依存性であり、状況が異なれば異なる。例えば、断片が長いほうが短いほうの断片よりも特定のハイブリダイゼーションに対してより高いハイブリダイゼーション温度を必要とする場合がある。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションの厳密性に影響を与える場合があるので、パラメータの組合せのほうがいずれか１つのパラメータの絶対尺度だけよりも重要である。一般的に、厳密な条件は、限定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。

[00148]Ｔｍは、二本鎖核酸分子の集団が、半分が解離して一本鎖になる温度であってよい。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの式が当技術分野では周知である。標準基準により示されるように、Ｔｍ値の簡単な推定値は、１ＭのＮａＣｌの水溶液中に核酸がある場合、式、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）により計算しうる（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎａｎｄＹｏｕｎｇ、ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＦｉｌｔｅｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）参照）。他の基準（例えば、ＡｌｌａｗｉａｎｄＳａｎｔａＬｕｃｉａ、Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０５８１～９４頁（１９９７））は、Ｔｍの計算のために構造的および環境的特徴、ならびに配列特徴を考慮に入れる別の計算方法を含む。

[00149]一般には、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は比較的低い厳密性の条件下で実施され、続いて変化するが比較的高い厳密性で洗浄される。例示的な厳密条件は、約７．０～約８．３のｐＨで少なくとも０．０１Ｍ～１Ｍ以下のナトリウムイオン濃度（または他の塩）の塩濃度および少なくとも２５℃の温度を含む。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で）およびおおよそ３０℃の温度の条件がアレル特異的ハイブリダイゼーションに適しているが、適切な温度は、ハイブリダイズされる領域の長さおよび／またはＧＣ含有量に依存する。一態様では、パーセンテージミスマッチを決定する際の「ハイブリダイゼーションの厳密性」は以下の通りが可能である：１）高厳密性：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；２）中間厳密性：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（中等度厳密性とも呼ばれる）；および３）低厳密性：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。等しい厳密性は代わりのバッファー、塩、および温度を使用して達成しうることは理解されている。例えば、中等度に厳密なハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子を相補的な核酸分子に結合させる条件を指すことができる。ハイブリダイズした核酸分子は、一般に、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性のうちの少なくともいずれかを含む、少なくとも６０％同一性を有する。中等度に厳密な条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃での洗浄に等しい条件を指すことができる。高厳密性条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ、６５℃での洗浄により提供することができる。低厳密性ハイブリダイゼーションは、１０％のホルムアミド、５×デンハート液、６×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、２２℃でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、３７℃での洗浄に等しい条件を指すことができる。デンハート液は、１％のフィコール、１％のポリビニルピロリドン、および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）は、３Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、および０．０２５ＭのＥＤＴＡを含有する。他の適切な中等度厳密性および高厳密性ハイブリダイゼーションバッファーならびに条件は当業者には周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第４版、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）に記載されている。

[00150]一部の実施形態では、プレ増幅プライマープールは、対照マーカーを増幅するために対照プライマー対をさらに含む。通常、対照マーカーは、実験標的（例えば、未知の濃度の核酸）と比較して使用するため、既知の特徴（例えば、既知の配列、細胞当たりの既知のコピー数）を有する核酸である。対照は内在性の、好ましくはインバリアント遺伝子でもよく、この遺伝子に対してアッセイでの試験または標的核酸を正規化することができる。例えば、試料処理、アッセイ効率等で生じることがあり、正確な試料間のデータ比較を可能にする試料間の変動に対するそのような正規化対照は、増幅効率およびバイアスを定量化する。

[00151]一部の実施形態では、対照マーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される。一部の実施形態では、対照プライマー対の配列は、下の表２において配列番号５５および５６に示されている。

[00152]一部の実施形態では、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対は、下の表２に示される配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の対を含む。本開示で使用されるプライマー対（複数可）の配列番号は「配列番号ｎ／ｍ」の形で表される。例えば、配列番号１／２とは、下の表２に示されるように、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される核酸配列を有するプライマー対のことである。

[00153]配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１に示されるプライマー対は、それぞれマーカーＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＩＲＦ４を増幅することを目的とする。

[00154]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）では、少なくとも１つの標的マーカーは、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅される。そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Ｙｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：７１４～７２０頁、１９９７年により記載されている。ブロッカー配列は、プレ増幅プライマー対（複数可）と同時に処理されたＤＮＡにハイブリダイズされる。標的マーカーのプレ増幅はブロッカー配列の５’位で終結され、その結果、標的マーカーのプレ増幅はブロッカー配列に相補的な配列が存在するところで抑制される。ブロッカー配列は、処理されたＤＮＡにメチル化状態特異的なやり方でハイブリダイズするように設計しうる。例えば、非メチル化核酸の集団内でのメチル化核酸の検出では、問題の位置で非メチル化されている核酸の増幅の抑制は、メチル化されている核酸の増幅の抑制が望まれる場合の「ＣｐＧ」とは対照的に、問題の位置に「ＣｐＡ」または「ＴｐＡ」を含むブロッカー配列の使用により実行されると考えられる。

[00155]ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ法では、ポリメラーゼ媒介増幅の効率的破壊には、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼにより伸長されないことが必要である。好ましくは、これは、３’－デオキシオリゴヌクレオチド、または３’位で「遊離の」ヒドロキシル基以外のもので誘導体化されているオリゴヌクレオチドであるブロッカーの使用を通じて達成される。例えば、３’－Ｏ－アセチルオリゴヌクレオチドは、好ましいクラスのブロッカー分子の代表である。

[00156]さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介分解は防止されるべきである。好ましくは、そのような防止は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用、または、例えば、ブロッカー分子をヌクレアーゼ抵抗性にするその５’末端にチオレート橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。特定の適用は、ブロッカーのそのような５’修飾を必要としない場合がある。例えば、ブロッカー－およびプライマー結合部位が重複し、それによってプライマーの結合を防止する（例えば、過剰なブロッカーで）場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は実質的に防止される。これは、ポリメラーゼがプライマーをブロッカーのほうに向かっておよびブロッカーの中まで（５’－３’方向で）伸長しないからである。この伸長は、通常、ハイブリダイズされたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらす過程である。

[00157]本開示を目的とし本明細書で実行される、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施形態は、遮断オリゴヌクレオチドとしてのペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。そのようなＰＮＡブロッカーオリゴマーは、分解されないしポリメラーゼにより伸長されないので、理想的に適している。

[00158]ある特定の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、ＤＮＡポリメラーゼでプレ増幅される。本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）からのポリデオキシリボヌクレオチドの合成を触媒し、ＤＮＡ複製、修復、および、一部の場合、細胞分化という最も基本的な機能を果たす酵素のことである。

[00159]原核生物におけるＤＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＤＮＡポリメラーゼＶを含む。ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で知られている。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩはゲノム複製で最も重要であると思われる。ＤＮＡポリメラーゼＩは、成長中の鎖の末端で不対塩基を除去する能力を有するので重要である。レトロウイルスは、ＤＮＡを合成するのにＲＮＡ鋳型を使用する独特のＤＮＡポリメラーゼ、すなわち、逆転写酵素を有する。真核生物に関しては、ＤＮＡポリメラーゼの例は、ポリメラーゼα、β、λ、γ、σ、μ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、θおよびＲｅｖ１である。動物細胞は、核およびミトコンドリアにおいてＤＮＡの複製を担当するＤＮＡポリメラーゼを有する。

[00160]プレ増幅ステップで使用されるＰＣＲ試薬は、処理されたＤＮＡを増幅するために使用できるいかなる市販のＰＣＲミックス（例えば、ＫＡＰＡ２ＧＦａｓｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲＫｉｔ、Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＥｐｉＴｅｃｔＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔＰＣＲＫｉｔ、等）でもよい。代わりに、当業者であれば、実験室においてＭｇ^２＋、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等を含むＰＣＲ試薬を調製してもよい。当業者であれば、その実際の必要に応じて適切なＰＣＲ反応系およびＰＣＲ反応条件も選択してよい。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）のプレ増幅は５～３０サイクルの反応を含み、それぞれのサイクルは、４０～８０℃で５秒～５分間の反応前に、８５～９９℃で５秒～５分間の反応を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）のプレ増幅は１０～２０サイクルの反応を含み、それぞれのサイクルは、４５～６０℃で３０秒～３分間の反応前に、９０～９９℃で１５秒～２分間の反応を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）のプレ増幅は１５サイクルの反応を含み、それぞれのサイクルは、５６℃で６０秒間の反応前に、９５℃で３０秒間の反応を含む。
ステップ（ｄ）
[00161]本開示に記載の方法のステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて、少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化する。本開示において、ステップ（ｄ）は、定量ステップとも指定される場合がある。

[00162]本明細書で使用される場合、「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｅ）」または「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓ）」という用語は、ＤＮＡ領域内の特定のヌクレオチド、またはヌクレオチドにおけるメチル化の存在、非存在、および／または数量を指す。特定のＤＮＡ配列（例えば、本明細書に記載の標的マーカー）のメチル化状態は、配列内のすべての塩基のメチル化状態を示すことができ、または配列内の塩基対のサブセット（例えば、シトシン残基のメチル化状態または１つもしくは複数の特定の制限酵素認識配列のメチル化状態）を示し、または配列内のメチル化が生じる場所の正確な情報を提供せずに配列内の領域のメチル化密度に関する情報を示すことができる。メチル化状態は、必要に応じて、「メチル化レベル」によって表され、または示され得る。メチル化レベルは、例えば、メチル化感受性制限酵素による制限消化後に存在する無傷のＤＮＡの量を定量することによって生成され得る。この例では、ＤＮＡ中の特定の配列が定量的ＰＣＲを用いて定量される場合、偽処理対照とほぼ等しい鋳型ＤＮＡの量は、その配列が高度にメチル化されていないことを示し、一方、偽処理試料に生じるよりも実質的に少ない鋳型の量は、その配列にメチル化ＤＮＡが存在することを示す。したがって、例えば上述した例からのメチル化レベルは、メチル化状態を表し、したがって、メチル化状態の定量的指標として使用され得る。これは、試料中の配列のメチル化状態を閾値レベルと比較することが望ましい場合に、特に有用である。

[00163]ＤＮＡ配列内の１つまたは複数の特定のＣｐＧメチル化部位（それぞれ２つのＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態には、「非メチル化」、「完全メチル化」、「ヘミメチル化」が挙げられる。「ヘミメチル化（ｈｅｍｉ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」または「ヘミメチル化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」という用語は、二本鎖ＤＮＡのメチル化状態のうち、その片方の鎖のみがメチル化された状態を指す。「高メチル化」という用語は、正常な対照ＤＮＡ試料中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５－メチルシトシンの量に対して、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５－メチルシトシンの存在の増加に対応する平均メチル化状態を指す。残基におけるメチル化状態は、例えば、メチル化レベルによって示されるように、定性的または定量的な読み取りであり得る。本開示において、「メチル化状態」および「メチル化レベル」という用語は、互換的に使用される場合がある。本開示によれば、２つ以上の異なるメチル化レベルを同時に決定することが可能である。

[00164]本明細書に記載されるように、ステップ（ｃ）が存在する場合、少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルは、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて個別に定量され；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルは個別に定量され、ここで、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群より選択される１つまたは複数のマーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、およびＢＣＡＮからなる群より選択される５つのマーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、およびＩＲＦ４からなる群より選択される５つのマーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのマーカーを含む。上記ステップ（ｃ）の項の「標的マーカー」に関する詳細な説明（標的マーカーの定義、標的マーカーの特定の組合せ等を含むが、これに限らない）は、ステップ（ｄ）の「ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカー」における「標的マーカー」にも当てはまる（ステップ（ｃ）が存在しない場合について）。ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド配列（例えば、標的マーカー）のメチル化レベル／状態は、当技術分野において様々な既知のアッセイによって決定され得る。

[00165]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の定量化は、ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ）、核酸シーケンシング、質量ベースの分離（例えば、電気泳動法、質量分析）、または標的捕捉（例えば、ハイブリダイゼーション、マイクロアレー）によって実行される。

[00166]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、標的マーカー（複数可）の少なくとも１つのメチル化レベルは、ＭＳＰ（Ｈｅｒｍａｎ前掲参照）を用いることにより、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて個別に定量化される。例えば、中等度におよび／または高度に厳密な条件下で未転換配列に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを用いることにより、鋳型がＣｐＧ部位にメチル化シトシンを含む場合にのみ増幅産物が産生される。

[00167]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の定量化は、リアルタイムＰＣＲによって実施される。リアルタイムＰＣＲの非限定的な例としては、Ｃｏｔｔｒｅｌｌら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３２：ｅ１０、２００３；ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ＰＣＲ、Ｅａｄｓら著、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９：２３０２～２３０６、１９９９；ＨｅａｄｌｏｏｐＰＣＲ、Ｒａｎｄら著、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３：ｅ１２７、２００５によって記載されたＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＰＣＲが挙げられる。

[00168]本明細書で使用される場合、「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＰＣＲ」という用語は、亜硫酸水素塩処理された核酸にメチル化特異的に結合する１つまたは複数の非伸長性核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）ブロッカー（すなわち、ブロッカーは中等度から高度に厳密な条件下で突然変異しないＤＮＡに特異的に結合する）を用いた、当業者に認識されたリアルタイムＰＣＲ技術を指す。増幅反応は、必要に応じてメチル化特異的であるが、１つまたは複数のブロッカーを挟む１つまたは複数のプライマーを用いて行われる。メチル化されていない核酸（すなわち、非突然変異ＤＮＡ）が存在する場合、ブロッカーは結合し、ＰＣＲ産物は産生されない。例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７２７６～７２８０、１９９１に記載されているようなＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを基本的に用いて、試料中の核酸のメチル化レベルを決定する。

[00169]本明細書で使用される場合、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ＰＣＲ」という用語は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと呼ばれる二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブが利用され、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーとの間にあるＣｐＧリッチ配列にハイブリダイズするように設計された、当業者に認識された蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ技術を指す。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合したリンカー部分（例えば、ホスホラミダイト）に共有結合した蛍光性の「レポーター部分」と「クエンチャー部分」を含む。ＰＣＲ増幅時に、ＣｐＧリッチ配列にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎ（商標）プローブがＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、ＰＣＲ反応中にリアルタイムで検出可能なシグナルが生成される。本方法では、検出用プローブとしてＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎを使用することができ、本システムは、使用するＤＮＡポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性に依存しない（ＭｈｌａｎｇａおよびＭａｌｍｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：４６３～４７１、２００１参照）。

[00170]本明細書で使用される場合、「ＨｅａｄｌｏｏｐＰＣＲ」という用語は、標的核酸を選択的に増幅するが、３’ステムループの伸長により非増幅標的バリアントの増幅を抑制し、もはやさらなる増幅のための鋳型を提供できないヘアピン構造を形成する、当業者に認識されたリアルタイムＰＣＲを指す。

[00171]特定の実施形態では、リアルタイムＰＣＲは、多重化リアルタイムＰＣＲである。

[00172]本明細書で使用される場合、「多重」または「多重化」という用語は、複数の標的、例えば複数の核酸配列、の存在および／または量を、それぞれが少なくとも１つの異なる検出特性、例えば、蛍光特性（例えば励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値幅ピーク高）、もしくは蛍光寿命）または固有の核酸もしくはタンパク質配列特性を有するマーカーを複数使用することにより同時にアッセイできるアッセイまたは他の分析方法を指す場合がある。

[00173]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の定量化は、核酸シーケンシングによって実施される。核酸シーケンシングのための例示的な方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１８２７～１８３１、１９９２；Ｃｌａｒｋら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：２９９０～２９９７、１９９４を参照されたい。例えば、亜硫酸水素塩処理をしていない試料を使用して得られた配列や、目的領域の既知の塩基配列と亜硫酸水素塩処理した試料を使用して得られた塩基配列を比較することにより、ＤＮＡ配列中のメチル化シトシン（複数可）の同定を容易にすることができる。亜硫酸水素塩処理した試料では、未処理の試料と比較して、シトシンの部位にチミン残基が検出された場合、亜硫酸水素塩処理による突然変異、すなわちこの部位にメチル化シトシンが存在すると考えてもよい。

[00174]ＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、当技術分野で知られており、例えば、ジデオキシ鎖停止法またはＭａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣＳＨＰ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９８９を参照）、パイロシークエンス法（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３：４０７２～４０７９、２００２を参照）、固相パイロシークエンス法（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．、８（８）：７６９～７７６、１９９８を参照）、固相ミニシークエンス法（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８～１０１７、１９９２を参照）、ＦＲＥＴを用いたミニシークエンス法（例えば、ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５：３４７～３５３、１９９７を参照）、ライゲーションによるシークエンス法、およびウルトラディープシークエンス法（Ｍａｒｇｕｉｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４３７（７０５７）：３７６～８０（２００５）を参照）が挙げられる。

[00175]特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の定量化は、質量ベースの分離（例えば、電気泳動法、質量分析）によって実行される。

[00176]例えば、ＸｉｏｎｇおよびＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５：２５３２～２５３４、２００１に記載されているように，メチル化シトシン残基の存在は，基本的に亜硫酸水素塩制限分析（ＣＯＢＲＡ）により検出される。この方法は、メチル化されていないシトシン残基を選択的に突然変異させる化合物、例えば亜硫酸水素塩で処理した後のメチル化核酸と非メチル化核酸との間の制限酵素認識部位の違いを利用する。例えば、制限エンドヌクレアーゼＴａｑｌは配列ＴＣＧＡを切断するが、非メチル化核酸の亜硫酸水素塩処理後、配列はＴＴＧＡとなり、結果として切断されない。次いで、消化された核酸および／または非消化された核酸は、例えば電気泳動法および／または質量分析など、当技術分野で知られる検出手段を用いて検出される。

[00177]別の例として、非メチル化シトシン残基を選択的に突然変異させる化合物による処理後のヌクレオチド配列および／または二次構造の違いに基づいて、増幅産物中の核酸の違いを検出する異なる技術が使用される。例えば、メチル化特異的一本鎖コンフォメーション解析（ＭＳ－ＳＳＣＡ）（Ｂｉａｎｃｏら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．、１４：２８９～２９３、１９９９）、メチル化特異的変性勾配ゲル電気泳動（ＭＳ－ＤＧＧＥ）（ＡｂｒａｍｓおよびＳｔａｎｔｏｎ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、２１２：７１～７４、１９９２）、およびメチル化特異的変性高速液体クロマトグラフィー（ＭＳ－ＤＨＰＬＣ）（Ｄｅｎｇら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１２：１７１～１９１、２０００）である。

[00178]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の定量化は、標的捕捉（例えば、ハイブリダイゼーション、マイクロアレー）によって実行される。

[00179]ハイブリダイゼーションによる適切な検出方法は、当技術分野で知られており、例えば、サザン、ドットブロット、スロットブロット、その他の核酸ハイブリダイゼーション手段などが挙げられる。（Ｋａｗａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：７４２１～７４２７、１９９４；Ｇｏｎｚａｌｇｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５７：５９４～５９９、１９７）。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブは、検出可能に標識されている。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイ用の核酸ベースのプローブは、非標識である。このような非標識プローブは、マイクロアレーなどの固体支持体上に固定化することができ、検出可能に標識されている標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。

[00180]メチル化特異的マイクロアレーは、シトシン残基（複数可）が転換された配列とシトシン残基（複数可）が転換されていない配列とを区別するのに有効なマイクロアレーの一例である。（Ａｄｏｒｊａｎら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３０：ｅ２１、２００２を参照）。ハイブリダイゼーションベースの解析は、また、メチル化感受性制限酵素で処理した後の核酸に使用され得る。

[00181]さらに別の例として、ＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態は、ＰＣＲ増幅プライマーと同時に亜硫酸水素塩処理ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって確認され得る（ここで、前記プライマーはメチル化特異的または標準のいずれかであってよい）。

[00182]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、検出剤の存在下で実行される。本明細書で使用される場合、「検出剤」という用語は、核酸の存在、非存在または量を検出するために定量化ステップで使用される薬剤である。

[00183]当技術分野で知られている様々な検出剤を、本開示において使用することができる。一部の実施形態では、検出剤は、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される。

[00184]一部の実施形態では、蛍光プローブは、以下の表２に示されるように、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択される。

[00185]一部の実施形態では、蛍光プローブは、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端でクエンチャー（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬまたはＴＡＭＲＡ）で標識される。

[00186]標識には、直接法と間接法がある。直接標識では、標識が試薬に直接（共有結合または非共有結合）連結される。間接標識では、二次試薬が一次試薬に結合（共有結合または非共有結合）される。二次試薬は、一次試薬に特異的に結合しなければならない。前記二次試薬は、適切な標識と連結していてもよく、および／または、二次試薬に結合する三次試薬の標的（受容体）であってもよい。二次試薬、三次試薬、または高次試薬の使用は、シグナル強度を増大させるためであることが多い。適切な二次試薬および高次試薬としては、抗体、二次抗体、および周知のストレプトアビジン－ビオチン系（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などを挙げることができる。試薬または基質はまた、当技術分野で知られているように、１つまたは複数のタグで「タグ付け」されていてもよい。

[00187]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用してステップ（ｃ）から得られたＤＮＡを増幅するステップを含み、得られたＤＮＡの少なくとも一部が増幅される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーを増幅するステップを含む。

[00188]本明細書で使用される場合、「定量化プライマー対（複数可）」という用語は、定量化ステップで使用されるプライマー対（複数可）を指す。

[00189]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８またはそれ以上）が、ステップ（ｃ）のプレ増幅プライマープール中のメチル化特異的プライマー対（複数可））のうちの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８またはそれ以上）と同一である。

[00190]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカー内の少なくとも一部を増幅するように設計されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される定量化プライマー対（複数可）は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡ内の少なくとも一部を増幅するように設計されている、すなわち、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）はネステッドＰＣＲとして設計されている。

[00191]ネステッドＰＣＲは感度と特異度を向上させるために設計されたＰＣＲの改良型である。ネステッドＰＣＲでは２つのプライマーセットを含み、２回の連続したＰＣＲ反応を行う。１回目の増幅は第１のアンプリコンを生成するために行われ、２回目の増幅はプライマーの一方または両方が第１のプライマー対で定義された領域内の部位にアニールするプライマー対を用いて行われる、すなわち、第２のプライマー対は第１のプライマー対の中に「ネスト」されていると考えられる。このようにして、正しい内部配列を含まない第１のＰＣＲ反応由来のバックグラウンド増幅産物は、第２のＰＣＲ反応ではさらに増幅されない。

[00192]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡにおける複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカー（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡでの１つまたは複数のＴｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの１つまたは複数のＴｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡでの１つまたは複数のＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の定量化は、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーでの１つまたは複数のＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む。

[00193]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在する場合、定量化ステップは、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡを複数の画分に分割することにより実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が存在しない場合、定量化ステップは、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーを複数の画分に分割することにより実施される。一部の実施形態では、複数の異なる定量化実験が複数の画分で行われ、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡ（またはステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカー）の異なるセットが画分に存在する場合、複数の画分のうちの１つで定量化される。一部の実施形態では、対照マーカーは、画分のそれぞれにおいて定量される。
ステップ（ｅ）
[00194]対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法のステップ（ｅ）において、ステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較し、その対応する参照レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示す。

[00195]結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法のステップ（ｅ）において、ステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される、処置に先立って同じ対象から得られる標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルとそれぞれ比較し、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示す。

[00196]本開示に記載の方法のステップ（ｅ）は、比較ステップとも呼ばれる場合がある。

[00197]本明細書で使用される場合、「比較する（ｃｏｍｐａｒｅ）」、「比較する（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）」、「比較される（ｃｏｍｐａｒｅｄ）」、または「比較（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」という用語は、分析される試験生体試料に含まれる定量化ステップ由来の標的マーカー（複数可）の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）のメチル化レベルを、それぞれ対応する参照レベルと比較することを指す。本明細書で使用される用語は、対応するパラメータまたは値の比較を指し、例えば、絶対量は絶対参照量と比較される一方、濃度は参照濃度と比較され、または試験試料から得られた強度シグナルは参照試料の同じ種類の強度シグナルと比較されることを理解されたい。比較は、手作業で行ってもよいし、コンピュータの支援で行ってもよい。コンピュータ支援による比較の場合、決定された量の値は、コンピュータプログラムによって、データベースに格納されている適切な参照に対応する値と比較されてもよい。コンピュータプログラムは、さらに、比較の結果を評価し、適切な出力フォーマットで所望の評価を自動的に提供してもよい。定量化ステップからの標的マーカー（複数可）の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）のメチル化レベルと対応する参照レベルとの比較に基づいて、結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあるか、対象を識別することが可能であり、また、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターすることも可能である。

[00198]本明細書で使用される場合、「参照値」という用語は、対象の結腸直腸新生物、または結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクを包含または除外するための閾値、または、結腸直腸新生物の処置を受けている対象の処置応答をモニターするための閾値を指す。

[00199]例えば、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法に関して、試験試料中の１つまたは複数の標的マーカー（複数可）のメチル化レベルが対応する参照レベルと同じまたはより高い場合、対象は結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあると考えられる。一部の実施形態では、試験試料における１つまたは複数の標的マーカー（複数可）のメチル化レベルは、その対応する参照レベルの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上である。本開示では、結腸直腸新生物の診断、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクのスクリーニング、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後の評価のためには、各およびすべての標的マーカーのメチル化レベルが、その対応する参照レベルと同じまたはより高いことは不要である。むしろ、定量化ステップで定量された少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルが、対応する参照レベルと同じまたはより高ければ十分であろう。

[00200]別の例として、結腸直腸新生物の処置を受けている対象における処置応答をモニターする方法に関して、試験試料中の１つまたは複数の標的マーカー（複数可）のメチル化レベルが、結腸直腸新生物の処置前のその対応するメチル化レベルより低い場合、対象は、処置に応答している可能性があると考えられる。一部の実施形態では、結腸直腸新生物の処置後に得られた生体試料中の１つまたは複数の標的マーカー（複数可）のメチル化レベルは、結腸直腸新生物の処置前の対応するメチル化レベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％低下している。本開示では、結腸直腸新生物の処置を受けている対象が処置に応答することを示すためには、それぞれおよびすべての標的マーカーのメチル化レベルが、結腸直腸新生物の処置前の対応するメチル化レベルより低いことは不要である。むしろ、結腸直腸新生物の処置後に得られた生体試料中の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルが、結腸直腸新生物の処置前の対応するメチル化レベルより低ければ十分である。

[00201]標的マーカーのメチル化の参照レベルは、１つまたは複数の参照試料から得てもよく、参照レベルは、目的の試料を試験するための実験と並行して実行された実験から得られる。あるいは、参照レベルは、１つまたは複数の参照試料または疾患参照試料由来のデータ、標準、またはレベルのコレクションを含むデータベースにおいて得られてもよい。一部の実施形態では、そのようなデータ、標準、またはレベルのコレクションは、１つまたは複数の試料由来のデータとの比較目的に使用できるように正規化される。「正規化すること」または「正規化」は、測定生データが、他のそのように正規化されたデータと直接比較され得るデータに変換されるプロセスである。正規化は、アッセイごとに異なる要因、例えば、負荷量のばらつき、結合効率、検出感度、その他の様々な誤差によって引き起こされるアッセイ特異的誤差を克服するために使用される。

[00202]一部の実施形態では、参照データベースは、１つまたは複数の参照試料からの標的マーカーのメチル化レベルおよび／または他の実験室データおよび臨床データを含む。一部の実施形態では、参照データベースは、参照試料と同じ条件下で試験された対照マーカーのメチル化レベルのパーセントとしてそれぞれ正規化された、標的マーカーのメチル化レベルを含む。標的マーカーのそのように正規化されたメチル化レベルと比較するために、試験試料の標的マーカーのメチル化レベルも測定され、試験試料と同じ条件下で試験された対照マーカーのメチル化レベルのパーセントとして計算される。

[00203]一部の実施形態では、参照データベースは、健康な対象、および／または非新生物の対象（すなわち、新生物を有しないことが知られている対象）から得られた参照試料由来の参照レベルデータをコンパイルすることによって確立される。一部の実施形態では、参照データベースは、結腸直腸新生物の処置を受けている個体からの参照試料由来の参照レベルデータをコンパイルすることによって確立される。一部の実施形態では、参照データベースは、例えば、標的マーカーの異なるメチル化レベルによって証明されるように、結腸直腸新生物の異なる段階にある個体からの参照試料由来のデータをコンパイルすることによって確立される。

[00204]参照レベルは、所望の感度および特異度に応じて当業者によって選択される場合がある。適切な参照レベルを決定するための手段は当業者に知られており、例えば、参照レベルは臨床研究から収集されたデータから決定することができる。

[00205]一部の実施形態では、ステップ（ｅ）の参照レベルは、結腸直腸新生物を有するまたはこれを有するリスクがある個体の群および結腸直腸新生物を有するリスクがないまたは免れている個体の群から得られる臨床試料に基づいて決定される。

[00206]当業者は、年齢、性別、病歴、家族歴、症状等の様々な要因に基づいて、個体が結腸直腸新生物を有するか、または有するリスクがあるかを決定することができる。

[00207]一部の実施形態では、標的マーカーのメチル化レベルおよび参照レベルは、サイクル閾値（すなわち、Ｃｔ値）として表される。本明細書で使用される場合、「Ｃｔ値」という用語は、ＰＣＲ産物の蛍光がバックグラウンドシグナルを超えて検出され得る場合のサイクル数を指す。Ｃｔ値は試料中の標的マーカーの量に反比例し、すなわちＣｔ値が低いほど試料中の標的マーカーの量が多いことを意味する。

[00208]例えば、対象の結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法のステップ（ｅ）において、ステップ（ｄ）の標的マーカー（複数可）のＣｔ値（複数可）を参照Ｃｔ値と比較し、その対応する参照Ｃｔ値と比べて少なくとも１つの標的マーカーの同じまたはより低いＣｔ値が、対象が結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示す。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の複数の標的マーカーのうちの少なくとも１つのＣｔ値が、２～１０サイクル（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０サイクル）までにその対応する参照Ｃｔ値より低い場合、対象が結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあると決定される。

[00209]本明細書で使用される場合、「可能性の増加」という用語は、参照試料が得られた対象と比較して、対象が結腸直腸新生物または結腸直腸新生物の予後不良を発症する可能性のレベルにおいて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の全体の増加を指す。

[00210]別の例として、結腸直腸新生物の処置を受けている対象における処置応答をモニターする方法のステップ（ｅ）において、ステップ（ｄ）の標的マーカー（複数可）のＣｔ値（複数可）を参照Ｃｔ値と比較し、処置前の対応するＣｔ値に対する少なくとも１つの標的マーカーのＣｔ値が高い場合、結腸直腸新生物の処置を受けている対象が処置に対して応答していることを示す。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の複数の標的マーカーのうちの少なくとも１つのＣｔ値が、２～１０サイクル（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０サイクル）までに処置前のその対応する参照Ｃｔ値より高い場合、対象は結腸直腸新生物の処置に対して応答していると決定される。
キット
[00211]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡを処理するための第１の試薬であって、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる第１の試薬；
（ｂ）必要に応じて、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つの標的マーカー中の少なくとも１つの標的配列をプレ増幅するための少なくとも１つのプライマー対を含む第１のプライマープールであって、少なくとも１つのプライマー対が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１の試薬により処理された少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができ；標的配列が少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む第１のプライマープール；ならびに
（ｃ）第２の試薬であって、第１のプライマープールが存在する場合、第２の試薬が、第１のプライマープールによりプレ増幅される少なくとも１つの標的マーカー（例えば、それぞれ）のメチル化レベルを定量化するためのものであり、第１のプライマープールが存在しない場合、第２の試薬が、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカー（例えば、それぞれ）のメチル化レベルを定量化するためのものであり、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、第２の試薬；
を含むキットも提供する。

[00212]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、複数の標的マーカーを含み、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つ（例えば、２、３）のマーカーを含む。

[00213]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１のプライマープールによりプレ増幅された少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第２のプライマープールを含む。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第３のプライマープールを含む。

[00214]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第２のプライマープール中の定量化プライマー対のうちの少なくとも１つが、第１のプライマープール中のプライマー対のうちの少なくとも１つと同一である。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第２のプライマープールの定量化プライマー対は、第１のプライマープールによってプレ増幅された少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部分を増幅するように設計されている。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第３のプライマープールの定量化プライマー対は、第１の試薬によって処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部分を増幅するように設計されている。一部の実施形態では、第１の、第２の、または第３のプライマープールは、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む。

[00215]一部の実施形態では、第１のプライマープールおよび第２のプライマープールは、単一の容器にまたは別々の容器に包装されている。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む。

[00216]一部の実施形態では、キットは検出剤をさらに含む。一部の実施形態では、検出剤は、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される。一部の実施形態では、蛍光プローブは、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、蛍光プローブは、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端でクエンチャー（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡまたはアイオワブラックダーククエンチャー）で標識される。

[00217]一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、および／または対象由来の生体試料を含有するのに適した容器をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、キット結果の使用および／または解釈のための説明書をさらに含む。

[00218]一部の実施形態では、キットは、別々の容器に包装された、ＰＣＲなどのポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長に最適化された反応緩衝剤を含んでいてもよい。好ましいのは、対象の生体試料中のＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８またはそれ以上）の標的マーカーのメチル化を決定する手段を収容するのに適した容器をさらに含む、キットである。

[00219]一部の実施形態では、第１の試薬は、亜硫酸水素塩試薬またはメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素塩およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。一部の実施形態では、ＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される。

[00220]一部の実施形態では、第１のプライマープールは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つの標的マーカーにおける少なくとも１つの標的配列をプレ増幅するための少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む。

[00221]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカー（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８マーカー）を含む。

[00222]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは、１つまでの標的マーカーが可能である（すなわち、１つのマーカーであるが１つのマーカー以下）。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳｅｐｔｉｎ９である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＴ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＫＺＦ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＮＤＲＧ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＮである。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＫＮＯＸ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＶＡＶ３である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＲＦ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＯＵ４Ｆ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳＡＬＬ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＴＭＥＦＦ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＡＳＣＬ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＦＧＦ１２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１である。

[00223]一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーは複数の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つまたは３つのマーカーを含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個）の追加のマーカーをさらに含む。

[00224]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９ならびにＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00225]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＴ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＮＤＲＧ４、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00226]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＫＺＦ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＢＣＡＴ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00227]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00228]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＶＡＶ３ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00229]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＲＦ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＮＤＲＧ４を含む。

[00230]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＫＮＯＸ２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00231]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＦＧＦ１２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00232]一部の実施形態では、それぞれの標的マーカーは、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域；

[00233]一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在する場合、第１のプライマープールは、下の表２に示される配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含み、必要に応じて、第２のプライマープールは、第１のプライマープール中のプライマー対のうちの少なくとも１つと同一である少なくとも１つのプライマー対を含む。一部の実施形態では、第１のプライマープールが存在しない場合、第３のプライマープールは、下の表２に示される配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含む。

[00234]一部の実施形態では、第１のプライマープール、第２のプライマープール、または必要に応じて、第３のプライマープールは、対照マーカーを増幅するためのプライマー対をさらに含む。一部の実施形態では、対照マーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される。

[00235]一部の実施形態では、キットは、それぞれが第２のプライマープールの画分を受けるための複数の容器をさらに含む。

[00236]一部の実施形態では、キットは、ＣｐＧ位置特異的メチル化分析を行うための標準試薬をさらに含み、前記分析は、以下の技術、ＭＳ－ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）、ＣＯＢＲＡ、および核酸シーケンシングのうちの１つまたは複数を含む。

[00237]一部の実施形態では、キットは、緩衝剤（例えば、制限酵素、ＰＣＲ、貯蔵または洗浄緩衝剤）；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）およびＤＮＡ回収成分からなる群から選択される追加の試薬を含んでいてもよい。

[00238]一実施形態では、本開示のキットは、
（ａ）亜硫酸水素塩試薬、
（ｂ）必要に応じて、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８またはそれ以上）のマーカーを含む複数の標的マーカー中の少なくとも２つの標的配列をプレ増幅するための複数のメチル化特異的プライマー対を含む第１のプライマープールであって、メチル化特異的プライマー対が、下記の表２に記載の配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも２対を含む、またはからなる、第１のプライマープール、
（ｃ）第２の試薬であって、第１のプライマープールが存在する場合、第２の試薬は、第１のプライマープールによりプレ増幅される複数の標的マーカーの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）のメチル化レベルを定量化するためのものであり、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１のプライマープールによりプレ増幅された複数の標的マーカーの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第２のプライマープールを含み；第１のプライマープールが存在しない場合、第２の試薬は、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを定量化するためのものであり、少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み、第２の試薬は、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、第１の試薬により処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第３のプライマープールを含む、第２の試薬
を含んでもよい。

[00239]本開示のキットは、別々の容器に包装された、ブロッキング、洗浄またはコーティングに適した緩衝剤または溶液などの他の成分を含んでいてもよい。

[00240]本開示のキットは、ＤＮＡ濃縮のために当技術分野で知られている以下の成分：タンパク質成分、メチル化ＤＮＡに選択的に結合する前記タンパク質；三重鎖形成核酸成分、１つまたは複数のリンカー、場合によっては適切な溶液中で；ライゲーションを行うための物質または溶液、例えば、リガーゼ、緩衝剤；カラムクロマトグラフィーを行うための物質または溶液；免疫学ベースの濃縮（例えば免疫沈降）を行うための物質または溶液；核酸増幅を行うための物質または溶液、例えばＰＣＲ；色素または複数の色素、該当する場合カップリング試薬含有、該当する場合溶液中；ハイブリダイゼーションを行うための物質または溶液；および／または洗浄ステップを行うための物質または溶液、の１つまたはいくつかをさらに含んでもよい。
使用
[00241]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、もしくは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する、または結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターするための診断用キットの製造における本開示のキットの使用を提供する。

[00242]別の態様では、本開示は、対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位（複数可）を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法において使用するためのキットの製造において標的マーカーのメチル化レベルを定量化するための試薬の使用を提供する。

[00243]別の態様では、本開示は、結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（ａ）対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した生体試料中のＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位（複数可）を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の少なくとも一部がプレ増幅され、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つ（例えば、それぞれ）の標的マーカーのメチル化レベルを、処置に先立って対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される、処置に先立って同じ対象から得られる標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法において使用するためのキットの製造において標的マーカーのメチル化レベルを定量化するための試薬の使用を提供する。

[00244]一部の実施形態では、上記ステップ（ｃ）の少なくとも１つの標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカー（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８マーカー）を含む。

[00245]一部の実施形態では、上記ステップ（ｃ）の少なくとも１つの標的マーカーは、１つまでの標的マーカーであり得る（すなわち、１つのマーカーであるが、１以下）。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳｅｐｔｉｎ９である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＴ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＫＺＦ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＢＣＡＮである。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＫＮＯＸ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＶＡＶ３である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＲＦ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＮＤＲＧ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＰＯＵ４Ｆ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＳＡＬＬ１である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＴＭＥＦＦ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＡＳＣＬ４である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＦＧＦ１２である。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的マーカーはＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１である。

[00246]一部の実施形態では、上記ステップ（ｃ）の少なくとも１つの標的マーカーは、複数の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つまたは３つのマーカーを含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１、２、３、４、または５つの追加のマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される、１つまたは複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）の追加のマーカーをさらに含む。

[00247]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９ならびにＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00248]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＴ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＮＤＲＧ４、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00249]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＫＺＦ１ならびにＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、および／またはＢＣＡＴ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00250]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＢＣＡＮならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、ＰＫＮＯＸ２、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00251]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＶＡＶ３ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00252]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＩＲＦ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00253]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＰＫＮＯＸ２ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、ＩＲＦ４、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。

[00254]一部の実施形態では、本開示の複数の標的マーカーは、ＮＤＲＧ４ならびに、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＦＧＦ１２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個）の追加の標的マーカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＢＣＡＮ、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、および／またはＩＫＺＦ１を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、または３つ）の追加の標的マーカーは、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、および／またはＩＲＦ４を含む。
実施形態
[00255]すべての実施例で使用した生物材料、各種クローンや発現プラスミド、培地、酵素、緩衝液、各種培養方法、タンパク質の抽出および精製方法、その他の分子生物学的操作方法は、いずれも当業者によく知られている。詳細は、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、１９８９）および「ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ＹａｎＺｉｙｉｎｇら訳、ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）、１９９８）を参照されたい。

実施例１メチル化特異的プライマーの検証
[00256]最初の概念実証のために、本発明者らは、亜硫酸水素塩転換された参照ＤＮＡを選択してプライマー／プローブの特異性を評価した。カスタマイズされたプライマー／プローブセットを、２８の標的マーカー（すなわち、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５を含む、５つの遺伝子間領域）について設計した。概念実証実験として、本発明者らは、すべてのＣｐＧ部位で完全にメチル化されたＤＮＡと完全にメチル化されていないＤＮＡの混合物（１０％、２５％、５０％、１００％）を、４ｎｇを全入力として作製した。これらの混合物について、表２に示す配列を有するプライマー、プローブを用いて、２８の標的マーカーを３連で評価した。実験方法の詳細は以下の通りである。

[00257]亜硫酸水素塩転換された完全メチル化ＤＮＡと亜硫酸水素塩転換された完全非メチル化ＤＮＡはＱｉａｇｅｎ社から購入し（ＥｐｉＴｅｃｔＣｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）、完全非メチル化ＤＮＡ中にそれぞれ１００％、５０％、２５％および１０％の完全メチル化ＤＮＡを含む混合ＤＮＡ組成物を提供するために混合し、ここでそれぞれの混合ＤＮＡ組成物中で、ＤＮＡの総量は４ｎｇであった。

[00258]混合ＤＮＡ組成物を、２８の標的マーカー（すなわち、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２ならびにＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５を含む５つの遺伝子間領域）に特異的なメチル化特異的プライマー対（表２参照）と検出プローブ（表２参照）の存在下でＰＣＲ反応により増幅した。対照マーカーであるＡＣＴＢも、メチル化非特異的プライマー（表２参照）、検出プローブ（表２参照）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。２８の標的マーカーのそれぞれと１つの対照マーカーを、それぞれ別々の検出アッセイで増幅した。異なるマーカーに対する検出プローブを、異なる蛍光（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）および対応するクエンチャー（ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬまたはＴＡＭＲＡ）で標識した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは５００ｎＭの最終濃度であり、それぞれの検出プローブは２００ｎＭの最終濃度であった。

[00259]混合ＤＮＡ組成物（４ｎｇＤＮＡ）１０μＬ、上記のプライマーおよびプローブを含むプレミックス溶液２．５μＬ、ＰＣＲ試薬ミックス（Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬを含むＰＣＲ反応系を調製した。

[00260]ＰＣＲ反応は以下のように、９５℃で５分間、続いて９５℃で１５秒間、５６℃で４０秒間を５０サイクル行った（この間に蛍光が検出される）。ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて、対応する蛍光チャネルで異なる蛍光を検出した。

[00261]結果
[00262]それぞれのＰＣＲ反応についてＣｔ（サイクル閾値）値を算出し、異なる混合ＤＮＡ組成物のそれぞれのマーカーのＰＣＲ反応についてのＣｔ値を解析した。その結果、試験したそれぞれのマーカーについて、ＰＣＲ反応に用いたメチル化特異的プライマー対は、混合ＤＮＡ組成物中の転換されたメチル化ＤＮＡのパーセンテージが増加するにつれて比例的に減少するＣｔ値を与えることが判明した。すべての試験したマーカーにおいて、メチル化された鋳型のパーセンテージは、予想されるＣｔ値と高い相関（すべての試験したマーカーで相関係数Ｒ＞０．９）および直線性を示し、標的マーカーのプレ増幅に使用したプライマーがメチル化特異的であることが示された。この相関は、図１Ｂ（対照マーカーであるＡＣＴＢのメチル化非特異的プライマーで得られたもの）に示す重なった曲線と比較すると、図１Ａ（ＰＫＮＯＸ２のメチル化特異的プライマーで得られたもの）に示す曲線が水平方向にシフトしていることから分かる。ＰＫＮＯＸ２以外のマーカーについて試験した他のメチル化特異的プライマーの結果は、図１Ａと同様であり、ここでは示さなかった。

実施例２異なる組織における標的マーカーのメチル化存在量の比較
[00263]選択した標的マーカーの腫瘍試料における利用可能性と特異度を実証するために、結腸直腸がん患者の結腸直腸がん組織（ＣＲＣ組織）、進行腺腫組織（ＡＡ組織）、傍がん組織（ｐａｒａ組織）と対照として結腸直腸内視鏡検査陰性者の白血球（ＷＢＣ）で２８マーカーの試験を実施した。実験方法の詳細は以下の通りである。

[00264]結腸直腸新生物の診断やスクリーニングにおけるこれらの標的マーカーの可能性を探るため、異なる細胞や組織のＤＮＡ試料における標的マーカーのメチル化存在量を検出した。本実施例で試験した標的マーカーは、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２ならびにＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５を含む５つの遺伝子間領域、が挙げられる。

[00265]その手順は以下のステップを含む。

[00266]１．ＤＮＡ試料は、白血球、傍がん組織、進行腺腫組織、結腸直腸がん組織からそれぞれ取得し、それぞれのタイプの試料について１０個の生体試料を得た（すなわち、合計４０試料）。白血球ＤＮＡはＱｉａｇｅｎＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔで抽出し、組織ＤＮＡはＱｉａｇｅｎＱＩＡａｍｐＤＮＡＦＦＰＥＴｉｓｓｕｅＫｉｔで製造業者の使用説明書に従い抽出した。

[00267]２．上記ステップ１で得られたＤＮＡ試料を亜硫酸水素塩試薬（ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＫｉｔ）で処理し、転換ＤＮＡを得た。

[00268]３．転換されたＤＮＡについて蛍光ＰＣＲを行った。簡単に説明すると、ステップ２で得られた転換ＤＮＡを、ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２ならびにＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５を含む５つの遺伝子間領域に特異的なメチル化特異的プライマー対（表２参照）と検出プローブ（表２参照）の存在下でＰＣＲ反応により増幅させた。対照マーカーであるＡＣＴＢも、メチル化非特異的プライマー（表２参照）、検出プローブ（表２参照）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。異なるマーカーに対する検出プローブを、異なる蛍光で標識した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは５００ｎＭの最終濃度であり、それぞれの検出プローブは２００ｎＭの最終濃度であった。

[00269]転換ＤＮＡ１０μＬ、上記のプライマーおよびプローブを含むプレミックス溶液２．５μＬ、ＰＣＲ試薬ミックス（Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬを含むＰＣＲ反応系を調製した。

[00270]ＰＣＲ反応は以下のように、９５℃で５分間、続いて９５℃で３０秒間、５６℃で６０秒間を１０サイクル行った（この間に蛍光が検出される）。ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて、対応する蛍光チャネルで異なる蛍光を検出した。

[00271]４．白血球、傍がん組織、進行腺腫組織、結腸直腸がん組織から得られた試料について、Ｃｔ値を算出し、統合して比較した。未決定ウェルのＣｔ値は５０とした。

[00272]結果
[00273]その結果、結腸直腸内視鏡検査陰性者の白血球における本開示の標的マーカー（ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＫＮＯＸ２、ＡＳＣＬ４、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１，ＣＲＨＢＰ、ＮＫＸ２－６、ＳＬＣ２４Ａ２、ならびにＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５を含む５つの遺伝子間領域）のメチル化存在量は、ＳＡＬＬ１およびＰＫＮＯＸ２を例にとると、大腸がん患者の組織試料と比較して有意に低い（ｐ＜０．０１）（図２参照）ことがわかった。また、その他の試験した標的マーカーについても、それぞれ有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ここでは結果を示さない。特に、進行腺腫組織や結腸直腸がん組織に比べ、傍がん組織では標的マーカーのメチル化存在量が低いことがわかった。このことから、それぞれの試験した標的マーカーは、白血球試料を用いた結腸直腸新生物の診断やスクリーニングに応用できる可能性があることが示された。

実施例３無細胞ＤＮＡを用いたメチル化標的マーカーの定量化
[00274]ＣＲＣ血漿試料に対するメチル化マーカーの臨床性能を検証するため、本明細書に開示した方法（プレ増幅法ともいう）を用いて、８８の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料と１０７の結腸直腸内視鏡検査陰性の血漿対照試料で１３マーカー（すなわち、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１）を試験した。８８の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料のうち、１５試料はＣＲＣステージＩと診断された対象から、２６試料はＣＲＣステージＩＩと診断された対象から、２８試料はＣＲＣステージＩＩＩと診断された対象から、および１９試料はＣＲＣステージＩＶと診断された対象から得られたものである。

[00275]プレ増幅法
[00276]プレ増幅法には、次のステップが挙げられる。

[00277]１．無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料は、ＱＩＡａｍｐＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１～４ｍｌの血漿試料から得た。

[00278]２．２０ｎｇｃｆＤＮＡを入力として、亜硫酸水素塩試薬（ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＫｉｔ）を用いて亜硫酸水素塩転換し、転換ｃｆＤＮＡを得た。

[00279]３．転換ｃｆＤＮＡ試料を、プレ増幅した。簡単に説明すると、ステップ２で得られた転換ｃｆＤＮＡを、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１に特異的なメチル化特異的プライマー対（表２参照）の存在下でＰＣＲ反応によりプレ増幅した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは２００ｎＭの最終濃度であった。

[00280]２５μＬＰＣＲミックスは、転換ｃｆＤＮＡ１０μＬ、上記のプライマーを含むプレミックス溶液２．５μＬ、ＰＣＲ試薬ミックス（Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬから構成されていた。

[00281]ＰＣＲ反応は以下のように、ＰｒｏＦｌｅｘ（商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、９５℃で３分間、続いて９５℃で３０秒間、５６℃で６０秒間を８サイクル行った。

[00282]４．上記のステップ３から得られた生成物を１０倍に希釈し、次いでＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１に特異的な、いくつかの複数の蛍光ＰＣＲ検出に使用した。

[00283]ｑＰＣＲミックスは、ステップ３で希釈し得られた生成物１０μＬ、プライマー／プローブプール２．５μＬ、ＰＣＲ試薬ミックス（Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬから構成されていた。非ＣｐＧＡＣＴＢ領域はそれぞれの反応ウェルの内部対照として使用した（表２参照）。異なるマーカーに対する検出プローブを、異なる蛍光で標識した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは５００ｎＭの最終濃度であり、それぞれの検出プローブは２００ｎＭの最終濃度であった。

[00284]ＰＣＲ反応は以下のように、９５℃で５分間、続いて９５℃で１５秒間、５６℃で４０秒間を５０サイクル行った（この間に蛍光が検出される）。ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて、対応する蛍光チャネルで異なる蛍光を検出した。

[00285]結果
[00286]増幅シグナルがない試料はＣｔ値を５０とした。それぞれの試験したマーカーには、それぞれ参照Ｃｔ値を設定した。いずれかの試験マーカーのＣｔ値が、対応する参照Ｃｔ値と同じまたはより低い場合、その試料は陽性試料に分類される。図３は、ＣＲＣを有する集団と結腸直腸内視鏡検査陰性集団における標的マーカーＳＡＬＬ１とＢＣＡＮのＣｔ値の分布を示す。図３に示すように、ＣＲＣを有する集団の標的マーカーＳＡＬＬ１とＢＣＡＮのメチル化レベルは、結腸直腸内視鏡検査陰性集団のそれよりも有意に高かった（ＳＡＬＬ１とＢＣＡＮで、それぞれｐ値＝２．１４Ｅ－４と１．０７Ｅ－８）。他の標的マーカーの結果は同様であり（ｐ＜０．０１）、示さなかった。

[00287]以下の表３は、プレ増幅法において５つの標的マーカー（すなわち、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、およびＶＡＶ３）を用いた比較結果を示す。表３に示すように、プレ増幅法はＣＲＣに対して超高感度（８６．４％）、結腸直腸内視鏡検査陰性集団に対して高特異度（９０．７％）を示し、臨床試験試料でＣＲＣに対して４８．２％の感度を持つＳｅｐｔｉｎ９など、既存の商業化されたマーカーを大きく凌駕している（Ｔ．Ｒ．Ｃｈｕｒｃｈら、Ｇｕｔ．；６３：３１７～３２５（２０１４）を参照されたい）。１３の標的マーカーのうち、他のマーカーの組合せ（例えば、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、およびＮＤＲＧ４の組合せ；Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、およびＴＭＥＦＦ２の組合せ、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＢＣＡＮ、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２、ＰＫＮＯＸ２、ＴＭＥＦＦ２、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１の組合せなど）も解析した結果、ＣＲＣに対する感度は８５％を下回らず、結腸直腸内視鏡検査集団陰性の特異度は９０％を下回らないことがわかった。

[00288]また、プレ増幅法とＳｅｐｔｉｎ９単独法のＣＲＣの分類における感度の比較も行った。Ｓｅｐｔｉｎ９単独法は、標的マーカーがＳｅｐｔｉｎ９のみであることを除き、プレ増幅法と同様に実施した。

[00289]表４に示すように、プレ増幅法では、ＣＲＣステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶの感度はそれぞれ７３．３％、８０．８％、８９．３％、１００％であった。一方、Ｓｅｐｔｉｎ９単独法では、ＣＲＣステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶの感度はそれぞれ、２６．７％、６５．４％、７５．０％、７９％であった。したがって、プレ増幅法はＳｅｐｔｉｎ９単独法に比べ、感度が著しく向上している。

[00290]試験した標的マーカーそれぞれのＣｔ値を、ＣＲＣ試料におけるメチル化コピーの有無を同定するために定量化した。あるいは、内部対照であるＡＣＴＢに対する試験した標的マーカーそれぞれのΔＣｔ値は、相対的なメチル化レベルを表すために計算することができる。重要なことは、試験したすべてのマーカーは、ＡＵＣが０．８から０．９の範囲で、ＣＲＣと対照を分離する分類力を有する（図４に示すように）。早期がん検出の分類指標を構築するために、線形判別分析、ＳＶＭ、ランダムフォレスト、線形回帰、ロジスティック回帰などの異なるアルゴリズムが使用された。最適化された性能を達成するために、様々なマーカーの組合せが使用されている。図５には、組合せ（ＳＡＬＬ１、ＢＣＡＴ１、Ｓｅｐｔｉｎ９）の１つのＲＯＣ曲線が示されている。他の組合せのＲＯＣ曲線は図５と同様であり、ここでは示していない。

実施例４プレ増幅法と直接ｑＰＣＲ法との間のＬＯＤの比較
[00291]プレ増幅法と直接ｑＰＣＲ法のＬＯＤを比較するために、本発明者らは、１３の標的マーカー（すなわち、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１）をプレ増幅法と直接ｑＰＣＲ法で共に試験した。直接ｑＰＣＲ法は、プレ増幅のステップがないこと以外は、プレ増幅法と同様に実施した。いずれの方法でも、１３の標的マーカーは同時にプレ増幅／増幅したが、定量化は標的マーカーごとに別々に行った。標的マーカーであるＶＡＶ３について、プレ増幅法と直接ｑＰＣＲ法のＬＯＤ比較を以下に示す。他の１２の標的マーカーについても同様にプレ増幅法と直接ｑＰＣＲ法のＬＯＤ比較を行ったが、ここには示さない。

[00292]簡単に説明すると、ＣＲＣ組織ＤＮＡを血球ＤＮＡに０．５％と０．２％の割合でスパイクし、４０ｎｇのＤＮＡを亜硫酸水素塩処理（ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＫｉｔ）し、半分の転換ＤＮＡをプレ増幅した後ｑＰＣＲに使用（すなわち、プレ増幅法）、残り半分の転換ＤＮＡをｑＰＣＲに直接使用した（すなわち、直接ｑＰＣＲ法）。プレ増幅ステップでの最終プライマー濃度は５０ｎＭであった。２５μＬＰＣＲミックスは、転換ＤＮＡ１０μＬ、上記のプライマーを含むプレミックス溶液２．５μＬ、ＰＣＲ試薬ミックス（Ｌｕｎａ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬから構成されていた。ＰＣＲプログラムは、９５℃で３分間、続いて９５℃で３０秒間、５６℃で６０秒間を８サイクル行った。前増幅ステップ後の得られた生成物を１０倍に希釈し、ｑＰＣＲに使用した。ｑＰＣＲミックスは、鋳型ＤＮＡ１０μＬ、プライマー／プローブプール２．５μＬ、ＬＵＮＡマスターミックス１２．５μＬから構成されていた。ｑＰＣＲプログラムは、９５℃で５分間、続いて９５℃で１５秒間、５６℃で４０秒間を５０サイクル（この間に蛍光が検出される）行い、ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍで実行した。４回の複製を並行して行った。その結果を以下の表５に示す。

[00293]表５に示すように，直接ｑＰＣＲ法と比較して，プレ増幅法はＬＯＤ（０．５０％対０．２０％ＣＲＣＤＮＡパーセンテージ）、安定性、検出感度が向上していることがわかる。他の１２の標的マーカー（すなわち、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１）についてのプレ増幅法は、直接ｑＰＣＲ法と同等の結果を示し、ここでは結果を示さなかった。

実施例５無細胞ＤＮＡを用いたメチル化標的マーカーの定量化、およびプレ増幅法を行わない方法との比較。

[00294]ＣＲＣ血漿試料に対するメチル化マーカーの臨床性能を検証するため、プレ増幅法とプレ増幅がない方法を用いて、３２の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料と２９の結腸直腸内視鏡検査陰性の血漿対照試料で５マーカー（Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３）を試験した。プレ増幅がない方法は、プレ増幅ステップと希釈ステップがないことを除いて、プレ増幅法と同様に実施した。３２の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料のうち、２試料はＣＲＣステージＩと診断された対象から、９試料はＣＲＣステージＩＩと診断された対象から、１３試料はＣＲＣステージＩＩＩと診断された対象から、および５試料はＣＲＣステージＩＶと診断された対象から、３試料はステージ不明と診断された対象から得られたものである。

[00295]その実験は以下のステップを含む。

[00296]１．無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料は、ＱＩＡａｍｐＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、３～５ｍｌの血漿試料から得た。

[00297]２．ＤＮＡが４０ｎｇ未満の場合、ｃｆＤＮＡを２つに分け、亜硫酸水素塩試薬（ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＫｉｔ）を用いた亜硫酸水素塩転換の入力として使用し、プレ増幅法では１０μＬ溶出、もう一方では２０μＬ溶出の２つの反応を並行して行い、転換ｃｆＤＮＡを得た。４０ｎｇ以上のＤＮＡの場合は、２０ｎｇのｃｆＤＮＡを２つの反応に使用し、溶出操作は上記と同じとした。

[00298]３．プレ増幅法では、一方の反応（１０μＬ溶出）における転換ｃｆＤＮＡ試料をプレ増幅した。簡単に説明すると、上記ステップ２の試料から得られた転換ｃｆＤＮＡ試料を、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３に特異的なメチル化特異的プライマー対（表２参照）の存在下でＰＣＲ反応によりプレ増幅した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは２００ｎＭの最終濃度であった。プレ増幅プログラム、希釈およびｑＰＣＲアッセイは、実施例３と同様であった。

[00299]４．プレ増幅がない方法では、もう一方の反応（２０μＬ溶出）における転換ｃｆＤＮＡ試料を用いて、２つの異なるウェルでｑＰＣＲアッセイを行い、それぞれのウェルには転換ＤＮＡを１０μＬずつ入れた。ｑＰＣＲミックスおよびプログラムは、プレ増幅法と同様であった。

[00300]５．非ＣｐＧＡＣＴＢ領域はそれぞれの反応ウェルの内部対照として使用した（表２参照）。異なるマーカーに対する検出プローブを、異なる蛍光で標識した。ＰＣＲ反応系において、それぞれのプライマーは５００ｎＭの最終濃度であり、それぞれの検出プローブは２００ｎＭの最終濃度であった。

[00301]結果
[00302]増幅シグナルがない試料はＣｔ値を５０とした。それぞれの試験したマーカーには、それぞれ参照Ｃｔ値を設定した。いずれかの試験マーカーのＣｔ値が、対応する参照Ｃｔ値と同じまたはより低い場合、その試料は陽性試料に分類される。

[00303]表６は、プレ増幅法およびプレ増幅がない方法において５つの標的マーカー（Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、およびＶＡＶ３）を用いた比較結果を示す。表６に示すように、プレ増幅法はＣＲＣに対して超高感度（９６．９％）、結腸直腸内視鏡検査陰性集団に対して高特異度（９３．１％）を示し、プレ増幅がない方法の感度と特異度はそれぞれ８４．４％、９３．１％であった。また、プレ増幅がない方法の感度は、Ｓｅｐｔｉｎ９単独法よりもはるかに高かった。

[00304]ＣＲＣ血漿試料に対するメチル化マーカーの臨床性能を検証するため、臨床的にＣＲＣと診断された血漿試料と結腸直腸内視鏡検査陰性の血漿対照試料において、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択されたマーカーの任意の組合せを含むより多くのマーカーを、上記のプレ増幅法およびプレ増幅がない方法の両方で試験する。例えば、以下の組合せのうち、いずれか１つを試験する。（１）Ｓｅｐｔｉｎ９、（２）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１；（３）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＩＫＺＦ１；（４）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＮＤＲＧ４；（５）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＢＣＡＮ；（６）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＶＡＶ３；（７）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＩＲＦ４；（８）ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１；（９）ＢＣＡＴ１およびＮＤＲＧ４；（１０）ＢＣＡＴ１およびＢＣＡＮ；（１１）ＢＣＡＴ１およびＶＡＶ３；（１２）ＢＣＡＴ１およびＩＲＦ４；（１３）ＩＫＺＦ１およびＮＤＲＧ４；（１４）ＩＫＺＦ１およびＢＣＡＮ；（１５）ＩＫＺＦ１およびＶＡＶ３；（１６）ＩＫＺＦ１およびＩＲＦ４；（１７）ＮＤＲＧ４およびＢＣＡＮ；（１８）ＮＤＲＧ４およびＶＡＶ３；（１９）ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４；（２０）ＢＣＡＮおよびＶＡＶ３；（２１）ＢＣＡＮおよびＩＲＦ４；（２２）ＶＡＶ３およびＩＲＦ４；（２３）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１；（２４）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＮＤＲＧ４；（２５）ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、およびＢＣＡＮ；（２６）ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＮ、およびＶＡＶ３；（２７）ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、およびＩＲＦ４；（２８）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＮＤＲＧ４；（２９）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＢＣＡＮ；（３０）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＶＡＶ３；（３１）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＲＦ４；（３２）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＢＣＡＮ；（３３）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＶＡＶ３；（３４）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＩＲＦ４。

実施例６無細胞ＤＮＡを用いたＣＲＣメチル化標的マーカー（Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３およびＩＲＦ４）の定量化によるＣＲＣ検出。

[00305]より多くのマーカーの組合せの臨床性能を評価するため、本明細書に開示した方法（プレ増幅法ともいう）を用いて、２８６の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料と１１２の結腸直腸内視鏡検査陰性の血漿対照試料で５マーカー（Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３およびＩＲＦ４）を試験した。２８６の臨床的に診断されたＣＲＣ血漿試料のうち、４８試料はＣＲＣステージＩと診断された対象から、１１３試料はＣＲＣステージＩＩと診断された対象から、１０７試料はＣＲＣステージＩＩＩと診断された対象から、および１８試料はＣＲＣステージＩＶと診断された対象から得られたものである。

[00306]実験方法は、実施例３と同様であった。

[00307]結果
[00308]増幅シグナルがない試料はＣｔ値を５０とした。試験したマーカーには、それぞれ参照Ｃｔ値を設定した。いずれかの試験マーカーのＣｔ値が、対応する参照Ｃｔ値と同じまたはより低い場合、その試料は陽性試料に分類される。

[00309]表７に示すように、プレ増幅法（ＣＲＣメチル化マーカーＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４の定量化）はＣＲＣに対して超高感度（８４．３％）、結腸直腸内視鏡検査陰性集団に対して高特異度（９０．３％）を示した。

[00310]表８に示すように、プレ増幅法（ＣＲＣメチル化マーカーＳｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４の定量化）では、ＣＲＣステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶの感度はそれぞれ６２．５％、８５．８％、８８．８％、１００％であった。

[00311]より多くのマーカーの組合せの臨床性能を評価するため、臨床的にＣＲＣと診断された血漿試料と結腸直腸内視鏡検査陰性の血漿対照試料において、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択されたマーカーの任意の組合せを含むより多くのマーカーを、上記に開示した方法で試験する。例えば、以下の組合せのうち、いずれか１つを試験する。（１）Ｓｅｐｔｉｎ９、（２）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１；（３）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＩＫＺＦ１；（４）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＮＤＲＧ４；（５）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＢＣＡＮ；（６）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＶＡＶ３；（７）Ｓｅｐｔｉｎ９およびＩＲＦ４；（８）ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１；（９）ＢＣＡＴ１およびＮＤＲＧ４；（１０）ＢＣＡＴ１およびＢＣＡＮ；（１１）ＢＣＡＴ１およびＶＡＶ３；（１２）ＢＣＡＴ１およびＩＲＦ４；（１３）ＩＫＺＦ１およびＮＤＲＧ４；（１４）ＩＫＺＦ１およびＢＣＡＮ；（１５）ＩＫＺＦ１およびＶＡＶ３；（１６）ＩＫＺＦ１およびＩＲＦ４；（１７）ＮＤＲＧ４およびＢＣＡＮ；（１８）ＮＤＲＧ４およびＶＡＶ３；（１９）ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４；（２０）ＢＣＡＮおよびＶＡＶ３；（２１）ＢＣＡＮおよびＩＲＦ４；（２２）ＶＡＶ３およびＩＲＦ４；（２３）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１；（２４）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＮＤＲＧ４；（２５）ＩＫＺＦ１、ＮＤＲＧ４、およびＢＣＡＮ；（２６）ＮＤＲＧ４、ＢＣＡＮ、およびＶＡＶ３；（２７）ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、およびＩＲＦ４；（２８）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＮＤＲＧ４；（２９）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＢＣＡＮ；（３０）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＶＡＶ３；（３１）Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＲＦ４；（３２）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＢＣＡＮ；（３３）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＶＡＶ３；（３４）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＩＲＦ４。

Claims

対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーの前記セットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて前記標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、前記対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法。
対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、または結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（Ｉ）生体試料から入手したＤＮＡを、前記ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップであって、少なくとも２つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４およびＩＲＦ４からなる群から選択され、少なくとも２つの標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択されるステップと；
（ＩＩＩ）それぞれステップ（ＩＩ）で定量化された標的マーカーの前記セットの少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて前記標的マーカーの１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、前記対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法。
標的マーカーの前記セットが、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれよりも多い標的マーカーを含む、請求項１または２に記載の方法。
ステップ（ＩＩ）が、
（ｉ）ステップ（Ｉ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、標的マーカーの前記セットが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択されるステップと；
（ｉｉ）前記サブステップ（ｉ）から得られたＤＮＡ内の標的マーカーのセットの個別のメチル化レベルを定量化するステップと
を含む、請求項１または２に記載の方法。
ステップ（Ｉ）の前に対象由来の生体試料からＤＮＡを得るステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する方法であって、
（ａ）前記対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した前記生体試料中のＤＮＡを、前記ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、前記標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つの少なくとも一部がプレ増幅され、前記少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて前記少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、前記少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較するステップであって、その対応する参照レベルと比べて前記標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の同じまたはより高いメチル化レベルが、前記対象が結腸直腸新生物を有する、または結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示すステップと
を含む方法。
結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターする方法であって、
（ａ）前記対象由来のＤＮＡを含有する生体試料を入手するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）から入手した前記生体試料中のＤＮＡを、前記ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる試薬で処理し、それによって処理されたＤＮＡを得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも一部をプレ増幅プライマープールでプレ増幅するステップであって、前記標的マーカー（複数可）のうちの少なくとも１つの少なくとも一部がプレ増幅され、前記少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含み；ステップ（ｃ）が存在するまたは存在しないステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｃ）から得られたＤＮＡに基づいて前記少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化し；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを個別に定量化するステップであって、前記少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含むステップと；
（ｅ）それぞれステップ（ｄ）由来の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを、前記処置に先立って前記対象から得られたＤＮＡを含有する生体試料に関してステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、必要に応じてステップ（ｃ）、およびステップ（ｄ）を繰り返すことにより定量化される、前記処置に先立って同じ対象から得られる前記標的マーカー（複数可）の１つまたは複数の対応するメチル化レベルと比較するステップであって、処置に先立つその対応するメチル化レベルと比べて前記標的マーカー（複数可）の１つまたは複数のより低いメチル化レベルが、前記対象が処置に応答性であることを示すステップと
を含む方法。
前記少なくとも１つの標的マーカーが複数の標的マーカーを含み、前記複数の標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む、請求項６に記載の方法。
前記少なくとも１つの標的マーカーが複数の標的マーカーを含み、前記複数の標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
前記複数の標的マーカーが、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
前記複数の標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記それぞれの標的マーカーが、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域；

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処理対応物
を含む、またはａ）、ｂ）、またはｃ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記無細胞ＤＮＡが循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
前記無細胞ＤＮＡ中の前記標的マーカーが、前記生体試料に１ｎｇ、０．８ｎｇ、０．６ｎｇ、０．４ｎｇ、０．２ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０８ｎｇ以下または０．０４ｎｇ以下の量で存在している、請求項１３または１４に記載の方法。
前記無細胞ＤＮＡ中の前記標的マーカーが、前記生体試料に、前記標的マーカーについての検出アッセイの感度のレベルより下である濃度で存在している、請求項１５に記載の方法。
サブステップ（ｉ）またはステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡが、サブステップ（ｉｉ）またはステップ（ｄ）に先立って希釈液で希釈される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記生体試料が、組織切片、生検、パラフィン包埋組織、体液、結腸流出物、外科切除試料、単離された血球、血液から単離された細胞、およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、粘液、唾液、腹水、胸腔内液、胸液、滑液、脳脊髄液、胸腔穿刺液、腹部液、およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記生体試料が、前記対象の血漿から得られる、請求項１９に記載の方法。
前記結腸流出物が、大便試料および浣腸洗浄試料からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる前記試薬が、ＣｐＧ部位（複数可）で非メチル化シトシン残基（複数可）を選択的に修飾して修飾された残基（複数可）を生成するが、メチル化されたシトシン残基（複数可）を有意に修飾しない、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記試薬が亜硫酸水素塩試薬を含む、請求項２２に記載の方法。
前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素塩およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
前記ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる前記試薬が、選択的に、残基がメチル化されていない場合はそこで切断するが、残基がメチル化されている場合はそこで切断しない、または選択的に、残基がメチル化されている場合はそこで切断するが、残基がメチル化されていない場合はそこで切断しない、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記試薬がメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である、請求項２５に記載の方法。
前記ＭＳＲＥが、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
前記プレ増幅プライマープールが少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む、請求項４～２７のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対が、それぞれが厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、前記標的マーカー（複数可）の１つの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記標的マーカー（複数可）の１つの少なくとも前記９連続ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む、請求項２８に記載の方法。
前記プレ増幅プライマープールが、対照マーカーを増幅するための対照プライマー対をさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
前記対照マーカーが、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
前記少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対が、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の対を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）において、前記少なくとも１つの標的マーカーが、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅される、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記定量化が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ）、核酸シーケンシング、質量ベースの分離（例えば、電気泳動法、質量分析）、または標的捕捉（例えば、ハイブリダイゼーション、マイクロアレー）により実行される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記定量化がリアルタイムＰＣＲにより実行される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記リアルタイムＰＣＲがマルチプレックスリアルタイムＰＣＲである、請求項３５に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用してステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡを増幅するステップを含み、得られた前記ＤＮＡの前記少なくとも一部が増幅され；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、定量化プライマー対（複数可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用してステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーを増幅するステップを含む、請求項６～３６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される前記定量化プライマー対（複数可）が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができ；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される前記定量化プライマー対（複数可）が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーの少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、請求項３７に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される前記定量化プライマー対（複数可）のうちの少なくとも１つが、ステップ（ｃ）の前記プレ増幅プライマープール中の前記メチル化特異的プライマー対（複数可）のうちの少なくとも１つと同一である、請求項３８に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）で使用される前記定量化プライマー対（複数可）が、ステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡ内の少なくとも一部を増幅するように設計されており；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）で使用される前記定量化プライマー対（複数可）が、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカー内の少なくとも一部を増幅するように設計されている、請求項３８に記載の方法。
前記ステップ（ｄ）が検出剤の存在下で実行される、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
前記検出剤が、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
前記蛍光プローブが、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
前記蛍光プローブが、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端で消光剤（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬまたはＴＡＭＲＡ）で標識される、請求項４２または４３に記載の方法。
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の前記標的マーカー（複数可）のＣｔ値（複数可）を参照Ｃｔ値と比較するステップであって、その対応する参照Ｃｔ値と比べて少なくとも１つの標的マーカーの同じまたはより低いＣｔ値が、前記対象が結腸直腸新生物を有する、結腸直腸新生物を発病しているもしくは発病に対するリスクがある、または結腸直腸新生物を発症するもしくはこれを発症する可能性が増加している、または結腸直腸新生物の予後不良であるもしくは予後不良のリスクがあることを示す；または前記処置に先立って、その対応する参照Ｃｔ値と比べて少なくとも１つの標的マーカーのより高いＣｔ値が、結腸直腸新生物の処置を受けている前記対象が前記処置に応答性であることを示す、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。
前記プレ増幅が５～３０サイクルの反応を含み、それぞれのサイクルが、４０～８０℃で５秒～５分間の反応前に８５～９９℃で５秒～５分間の反応を含む、請求項４～４５のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡにおける複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてメチル化レベルを決定するステップを含み；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｂ）から得られる前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーでの複数のＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド、またはＣｐＡジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいて少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを決定するステップを含む、請求項６～４６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含み；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーでの１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの存在またはレベルに基づいてシトシン残基（複数可）のメチル化レベルを決定するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
ステップ（ｃ）が存在する場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｃ）から得られた前記ＤＮＡを複数の画分に分割することにより実施され；ステップ（ｃ）が存在しない場合、ステップ（ｄ）の前記定量化が、ステップ（ｂ）から得られた前記処理されたＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーを複数の画分に分割することにより実施される、請求項６～４８のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｅ）の前記参照レベルが、結腸直腸新生物を有するまたはこれを有するリスクがある個体の群および結腸直腸新生物を有するリスクがないまたは免れている個体の群から得られる前記臨床試料に基づいて決定される、請求項６～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記結腸直腸新生物が、結腸直腸がん、大きな結腸直腸腺腫、および／または無茎性鋸歯状ポリープである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記結腸直腸新生物が前がん状態である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングするまたは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡを処理するための第１の試薬であって、ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位を区別することができる第１の試薬；
（ｂ）必要に応じて、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される少なくとも１つの標的マーカー中の少なくとも１つの標的配列をプレ増幅するための少なくとも１つのプライマー対を含む第１のプライマープールであって、前記少なくとも１つのプライマー対が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、前記第１の試薬により処理された前記少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができ；前記標的配列が少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む第１のプライマープール；ならびに
（ｃ）第２の試薬であって、前記第１のプライマープールが存在する場合、前記第２の試薬が、前記第１のプライマープールによりプレ増幅される前記少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを定量化するためのものであり、前記第１のプライマープールが存在しない場合、前記第２の試薬が、前記第１の試薬により処理された前記ＤＮＡ内の少なくとも１つの標的マーカーのメチル化レベルを定量化するためのものであり、前記少なくとも１つの標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＢＣＡＮ、ＶＡＶ３、ＩＲＦ４、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＰＫＮＯＸ２、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＬＣ２４Ａ２、ＮＤＲＧ４、ＮＫＸ２－６、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＣＲＨＢＰ、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、およびＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、第２の試薬；
を含むキット。
前記少なくとも１つの標的マーカーが複数の標的マーカーを含み、前記複数の標的マーカーが、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＢＣＡＴ１、およびＩＫＺＦ１からなる群から選択される少なくとも２つのマーカーを含む、請求項５４に記載のキット。
前記第１のプライマープールが存在する場合、前記第２の試薬が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、前記第１のプライマープールによりプレ増幅された前記少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第２のプライマープールを含み；前記第１のプライマープールが存在しない場合、前記第２の試薬が、厳密な条件下で、中等度に厳密な条件下で、または高度に厳密な条件下で、前記第１の試薬により処理された前記ＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーの前記少なくとも１つの標的配列の少なくとも９連続ヌクレオチドにハイブリダイズすることができる複数の定量化プライマー対を含む第３のプライマープールを含む、請求項５５に記載のキット。
前記第２のプライマープール中の前記定量化プライマー対のうちの少なくとも１つが、前記第１のプライマープール中の前記プライマー対のうちの少なくとも１つと同一である、請求項５６に記載のキット。
前記第１のプライマープールが存在する場合、前記第２のプライマープールの定量化プライマー対が、前記第１のプライマープールによりプレ増幅された前記少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部を増幅するように設計されており；前記第１のプライマープールが存在しない場合、前記第３のプライマープールの定量化プライマー対が、前記第１の試薬により処理された前記ＤＮＡ内の前記少なくとも１つの標的マーカーの前記少なくとも１つの標的配列内の少なくとも一部を増幅するように設計されている、請求項５６に記載のキット。
前記第１の、第２の、または第３のプライマープールが、少なくとも１つのメチル化特異的プライマー対を含む、請求項５４～５８のいずれかに記載のキット。
前記第１のプライマープールおよび前記第２のプライマープールが、単一の容器にまたは別々の容器に包装されている、請求項５６～５９のいずれか一項に記載のキット。
１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項５５～６０のいずれか一項に記載のキット。
検出剤をさらに含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のキット。
前記検出剤が、蛍光プローブ、挿入色素、発色団標識プローブ、放射性同位元素標識プローブ、およびビオチン標識プローブからなる群から選択される、請求項６２に記載のキット。
前記蛍光プローブが、配列番号５７～８５、１７２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のキット。
前記蛍光プローブが、その５’末端で蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、またはＣｙ５）で標識され、その３’末端で消光剤（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡまたはアイオワブラックダーククエンチャー）で標識される、請求項６３または６４に記載のキット。
ＤＮＡポリメラーゼ、および／または前記対象由来の前記生体試料を含有するのに適した容器をさらに含む、請求項５５～６５のいずれか一項に記載のキット。
キット結果の使用および／または解釈のための説明書をさらに含む、請求項５５～６６のいずれか一項に記載のキット。
前記第１の試薬が、亜硫酸水素塩試薬またはメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）を含む、請求項５５～６７のいずれか一項に記載のキット。
前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素アルミニウム、亜硫酸水素塩およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項６８に記載のキット。
前記ＭＳＲＥが、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩおよびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項６８に記載のキット。
前記複数の標的マーカーが、ＢＣＡＮ、ＰＫＮＯＸ２、ＶＡＶ３、ＮＤＲＧ４、およびＩＲＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む、請求項５５～７０のいずれか一項に記載のキット。
前記複数の標的マーカーが、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＡＬＬ１、ＳＤＣ２、ＡＳＣＬ４、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ１、ＴＭＥＦＦ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ４、ＮＫＸ２－６、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ５、ＳＬＣ２４Ａ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ２、ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣＲＥＧＩＯＮ３、ＫＣＮＡ６、ＳＯＸ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＦＧＦ１２、ＫＣＴＤ８、ＨＭＸ１、ＭＡＲＣＨ１１、およびＣＲＨＢＰからなる群から選択される１つまたは複数の追加のマーカーをさらに含む、請求項７１に記載のキット。
前記それぞれの標的マーカーが、ａ）下に示されるＨｇ１９座標により定義されるそれぞれの領域；

ならびに上記のそれぞれの領域のそれぞれの開始部位の５ｋｂ上流およびそれぞれの末端部位の５ｋｂ下流、またはｂ）ａ）の亜硫酸水素塩転換対応物、またはｃ）ａ）のＭＳＲＥ処理対応物
を含む、またはａ）、ｂ）、またはｃ）である、請求項５４～７２のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のプライマープールが存在する場合、前記第１のプライマープールが、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含み、必要に応じて、前記第２のプライマープールが前記第１のプライマープール中の前記プライマー対のうちの少なくとも１つと同一である少なくとも１つのプライマー対を含み；前記第１のプライマープールが存在しない場合、前記第３のプライマープールが、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４、２５／２６、２７／２８、２９／３０、３１／３２、３３／３４、３５／３６、３７／３８、３９／４０、４１／４２、４３／４４、４５／４６、４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、および１７０／１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１つの対を含むまたはそれからなる少なくとも１つのプライマー対を含む、請求項５５～７３のいずれか一項に記載のキット。
前記第１のプライマープール、前記第２のプライマープール、または必要に応じて前記第３のプライマープールが、対照マーカーを増幅するためのプラーマー対をさらに含む、請求項５６～７４のいずれか一項に記載のキット。
前記対照マーカーが、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＫ１、ＬＤＨＡ、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ１１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＲＰＬ３２、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、およびＶＰＳ２９からなる群から選択される、請求項７５に記載のキット。
それぞれが前記第２のプライマープールの画分を受けるための複数の容器をさらに含む、請求項５４～７６のいずれか一項に記載のキット。
対象において結腸直腸新生物を診断する、結腸直腸新生物の発病もしくは発病に対するリスクについてスクリーニングする、もしくは結腸直腸新生物の発症もしくは予後を評価する、または結腸直腸新生物の処置を受けている対象において処置応答をモニターするための診断用キットの製造における、請求項５４～７７に記載のキットの使用。