CN108350485A - 血浆dna的多重扩增检测测定以及分离和检测 - Google Patents

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Abstract

本文提供的技术涉及经亚硫酸氢盐处理的DNA的基于扩增的检测，具体地涉及但非仅涉及在进一步表征样品DNA之前用于低水平样品DNA的多重扩增的方法和组合物。该技术还提供了从血液或血液产品样品例如血浆样品分离DNA的方法。

Description

血浆DNA的多重扩增检测测定以及分离和检测
相关申请的交叉引用。
本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时申请序列第62/249,097号的优先权，所述美国临时申请序列通过引用并入本文。
发明领域
本文提供的技术涉及核酸的基于扩增的检测，具体地涉及(但非仅涉及)在进一步表征样品DNA之前用于低水平样品DNA的多重扩增的方法和组合物。该技术还提供了从血液或血液产品样品例如血浆样品分离DNA的方法。
背景
定量核酸的方法在分子生物学的许多领域中，特别是对于分子诊断是重要的。在DNA水平上，例如使用此类方法来确定变体等位基因的存在或不存在、在基因组中扩增的基因序列的拷贝数，以及甲基化在基因间或基因内的特定基因座上的量、存在或不存在。另外，使用定量核酸的方法将mRNA的量测定为基因表达的量度。
在检测和定量核酸或核酸序列的多种不同分析方法中，聚合酶链式反应(PCR)的变体已成为最强大和最普遍的技术，其原理已在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,965,188中公开。
检测以低水平存在于样品中的核酸(例如来自疾病基因座，例如肿瘤的DNA，其从远离疾病基因座的样品收集，例如，进入粪便、痰液、尿液、血浆等等中的DNA，“远程DNA样本”)可能很困难，部分原因在于此类样本中发现的许多DNA不仅数量少，而且它们通常也是片段化的。参见，例如，属于Ballhause的WO 2006/113770以及属于Davos的美国专利公开US201110009277 A1，其中的每一篇通过引用整体并入本文。例如，血浆中发现的无细胞DNA(cfDNA)可以是高度片段化的，并且许多可能关注的DNA，例如肿瘤来源的DNA可以非常小，例如长度为200个或更少的核苷酸。由于例如对纯化柱的结合不良或无效的醇沉淀，这种大小的核酸可能在常规纯化过程中损失。
如果需要检测核酸中的多个靶标或基因座，则分析来自这些样品的核酸是特别困难的。例如，具有少量感兴趣的靶标拷贝的收集的样本往往不能被分成足够数量的等分试样来允许测试所有靶标，而不存在单个靶标测试的准确性的风险(例如通过假阴性结果)。
可使用低靶标样品中的靶核酸(例如，基因组DNA、cDNA等)的预扩增来富集样品中的DNA，然后将样品分份以用于进一步的特定靶标分析。例如，使用简单引物(例如，随机六聚体)的全基因组扩增已用于以对任何特定目标靶标非特异的方式增加样品中基本上所有DNA的量。(Sigma-Aldrich's GenomePlex systems,Arneson，等人，Cold SpringHarb.Protoc.；2008；doi:10.1101/pdb.prot4920)。
另一种方法是以半靶向方式扩增一个或多个特别感兴趣的区域，以产生含有将被进一步分析的不同突变或基因座的扩增片段(扩增子)的混合物。使用相同引物的连续轮的扩增易于产生非特异性扩增的高背景，以及产生假象，例如人工重组分子，高度非特异性背景和不同预期靶标的偏倚扩增。因此，此类预扩增PCR通常在特定条件下进行，例如有限数目的循环，和/或使用低浓度的引物(例如，为标准PCR中的1/20至1/10)以避免非特异性背景扩增的增加，因为已显示在多重预扩增中使用超过约160nM的每种引物的浓度增加了阴性对照反应中的扩增背景(参见，例如Andersson等人，Expert Rev.Mol.Diagn.Earlyonline,1–16(2015))。
在多重PCR中进行第一轮扩增之后，通常将预扩增的DNA稀释并等分至新的扩增反应中以用于定量或定性PCR分析，所述定量或定性PCR分析使用标准PCR的常用条件，例如更高浓度的试剂和更大数量的循环，以及通常使用不同的引物对(例如，与预扩增片段内的位点退火而非与扩增子末端处的原始引物位点退火的“嵌套”引物)进行第二扩增。
当要检查DNA的甲基化时，分析因用于制备用于甲基化检测的样品的常用方法通常导致样品DNA的大量损失的事实而进一步复杂化。例如，亚硫酸氢盐处理通常用于将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基，但该方法通常仅导致约30％的输入DNA回收。另外，用亚硫酸氢盐处理后DNA的扩增特别具有挑战性。例如，未甲基化的胞嘧啶的转化降低了DNA序列的复杂性，并且已知处理本身会导致DNA的显著损伤，例如链断裂，这两者都可促成扩增反应的背景增强，尤其是在多重扩增中。
概述
在本文所述方法的开发过程中，已确定可预扩增并扩增来自低靶标样品的经亚硫酸氢盐处理的DNA以用于实时检测，而无需全基因组预扩增，也不需要使用嵌套或半嵌套引物。令人惊讶的是，可以例如在定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增(QuARTS)测定法(参见，例如美国专利第8,361,720号、第8,715,937号和第8,916,344号)中，使用将用于单个靶基因座的第二轮扩增的相同引物对的组合对靶向预扩增进行多重化，所述测定将PCR靶向扩增与FEN-1介导的瓣切割组合以用于信号扩增。
在一些实施方案中，该技术提供了分析样品的方法，使得可以单独检测以低拷贝数存在的多个不同靶标，并降低由于样品分取导致的假阴性结果的风险。例如，在一些实施方案中，该技术提供了分析样品的多个靶核酸的方法，包括：
a)提供具有体积x的样品，所述样品包含疑似含有多个n个不同靶区域中的一个或多个的经亚硫酸氢盐处理的DNA，其中至少一个所述靶区域是低拷贝靶标，如果存在于所述样品中，其以这样的拷贝数存在于所述样品中，使得：
i)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积，所述n个部分中的一个或多个不存在所述低拷贝靶标，或
ii)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积，所述n个部分中的一个或多个中的所述低拷贝靶标低于用于所述低拷贝靶标的检测测定的灵敏度水平；
b)在其中扩增所述n个不同靶区域(如果存在于所述样品中)以形成具有体积y的预扩增的混合物的条件下，将所述样品的所述体积x处理至扩增反应；
c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中，其中每个检测测定反应混合物包含一部分所述预扩增的混合物，所述预扩增的混合物具有y/n或更小的体积，并且其中所述低拷贝靶标，如果在步骤a)中存在于所述样品中，则存在于每个所述检测测定反应混合物中；和
d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定，其中所述不同的靶区域，如果在步骤a)中存在于所述样品中，则在所述检测测定反应混合物中被检测到。
在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐处理的DNA来自人受试者。在某些优选实施方案中，从受试者的体液(优选包含血浆的体液)制备样品。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐处理的DNA是从血浆分离的循环无细胞DNA(cfDNA)，例如长度小于200个碱基对的无细胞DNA。在特别优选实施方案中，通过方法从血浆分离无细胞DNA，所述方法包括将血浆样品与蛋白酶(例如，链霉蛋白酶、蛋白酶K)和包含异硫氰酸胍和非离子去污剂的第一裂解试剂组合以形成混合物(其中蛋白质被蛋白酶消化)，然后在其中DNA与二氧化硅颗粒结合的条件下，添加二氧化硅颗粒和第二裂解试剂，所述第二裂解试剂包含硫氰酸胍、非离子去污剂和异丙醇的混合物。在某些实施方案中，第一裂解试剂和第二裂解试剂中的非离子型去污剂相同或不同，并且选自例如聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Nonidet P-40)和支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(IGEPAL CA-630)。
该方法还包括将从混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒，用含有盐酸胍或硫氰酸胍和乙醇的第一洗涤溶液洗涤具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒，从第一洗涤溶液中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒，并且用包含缓冲液(例如，Tris pH 8.0和乙醇)的第二洗涤溶液洗涤具有结合的DNA的二氧化硅颗粒。在优选实施方案中，用第二洗涤缓冲液洗涤具有结合的DNA的二氧化硅颗粒多次，例如2-6次。在特别优选的实施方案中，每次洗涤使用比先前用该缓冲液的洗涤时的体积更小的体积的第二次洗涤缓冲液。在一些实施方案中，将经洗涤的二氧化硅颗粒从最后一次洗涤缓冲液处理中分离出来，并且例如用洗脱缓冲液诸如10mM Tris-HCl pH 8.0,0.1mM EDTA从二氧化硅颗粒洗脱DNA。在优选实施方案中，在洗脱DNA之前，例如通过加热至约70℃干燥具有结合的DNA的二氧化硅颗粒。
该技术不限于任何特定的样品尺寸，但其在大样品中存在低拷贝靶标的样品中特别适用。例如，在一些实施方案中，从起始体积为至少1mL，优选至少5mL，更优选至少10mL的体液例如血浆样品制备经亚硫酸氢盐处理的DNA，和/或其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA样品的体积x为至少10μl，优选至少25μl，更优选至少50μl，更优选至少100μl。在优选实施方案中，存在于预扩增反应中的经处理的DNA样品的体积为至少5％，优选至少10％-60％，优选15％-55％，更优选约20％-50％的扩增反应的总体积。
本发明不限于样品所分成的特定数量的级分。在一些实施方案中，n(级分数)为至少3，优选至少5，更优选至少10，更优选至少20，更优选至少100。
在一些实施方案中，该技术提供了使用PCR预扩增和PCR-瓣测定来分析样品中的多个靶核酸的方法，所述方法包括：
a)在包含PCR扩增试剂的第一反应混合物中提供包含多个不同靶区域的经亚硫酸氢盐处理的DNA(在优选实施方案中，包含人DNA)，其中所述PCR扩增试剂包含：
i)多个不同的引物对，其用于从所述经亚硫酸氢盐处理的DNA中扩增所述多个不同靶区域(如果存在于所述样品中)；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；和
iv)包含Mg++的缓冲液
b)将所述第一反应混合物暴露于热循环条件，其中多个不同的靶区域(如果存在于样品中)被扩增以产生预扩增的混合物，并且其中所述热循环条件限于将扩增保持在指数范围内的多个热循环，优选少于20个，更优选少于15个，更优选10个或更少的热循环；
c)将所述预扩增的混合物分配到多个PCR-瓣测定反应混合物中，其中每个PCR-瓣测定反应混合物包含：
i)额外量的选自步骤a)i)的所述多个不同引物对的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；
iv)含有Mg++的所述缓冲液
v)瓣核酸内切酶，优选FEN-1核酸内切酶；
vi)瓣寡核苷酸，和
vi)包含与所述瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的发夹寡核苷酸，优选FRET盒寡核苷酸；
和
d)通过检测所述瓣核酸内切酶对所述发夹寡核苷酸的切割，检测在PCR-瓣测定反应期间一个或多个不同的靶区域从所述经亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增。
在优选实施方案中，FEN-1核酸内切酶是热稳定性FEN-1，优选来自古细菌生物体，例如Afu FEN-1。
在一些实施方案中，在分配到PCR-瓣测定反应混合物中之前，用稀释剂稀释上文所述的预扩增的混合物，而在一些实施方案中，将预扩增的混合物直接添加至未预先稀释的PCR-瓣测定反应混合物中。
在一些实施方案中，基本上，以与在第一反应混合物中使用那些特定引物时的浓度相同的浓度使用PCR-瓣分析反应中使用的引物，排除从第一反应中遗留的任何引物。例如，在一些实施方案中，将添加至PCR-瓣测定反应混合物中的额外量的引物对中的引物添加至一定的浓度，使得在PCR-瓣测定中添加的引物(即，不计数来自预扩增的混合物的引物)的浓度基本上与所述PCR扩增试剂中该引物对的引物的浓度相同。在其它实施方案中，将添加至PCR-瓣测定反应混合物中的额外量的引物对中的引物添加至一定浓度，使得PCR-瓣测定中添加的引物的浓度处于比该引物对的引物在第一反应混合物中的浓度低或高的浓度。
尽管该方法不限于在所述第一反应混合物中和PCR-瓣测定反应混合物中使用的缓冲液中的Mg++的特定浓度，但在优选实施方案中，缓冲液包含至少3mM Mg++，优选大于4mMMg++，更优选大于5mM Mg++，更优选大于6mM Mg++，更优选约7mM至7.5mM Mg++。在某些实施方案中，缓冲液含有小于约1mM的KCl。在优选实施方案中，缓冲液包含10mM 3-(n-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液和7.5mM MgCl2。
在一些实施方案中，第一反应混合物和/或所述多个PCR-瓣测定反应混合物包含外源性非靶DNA，优选本体鱼DNA。
在一些实施方案中，热稳定性DNA聚合酶是真细菌DNA聚合酶，优选来自栖热菌属(Thermus)，更优选来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)。在一些实施方案中，修饰DNA聚合酶以用于热启动PCR，例如，通过使用试剂(例如，抗体、化学加合物等)，使得DNA聚合酶在加热时被激活。
在某些实施方案中，经亚硫酸氢盐处理的DNA包含人DNA，并且多个不同的靶区域包含选自由SFMBT2、VAV3、BMP3和NDRG4组成的组的靶区域。在一些实施方案中，多个不同的引物对针对这些靶区域中的至少两个，优选至少三个，更优选全部四个靶区域。
在一些实施方案中，多个不同的靶标区域包含参照靶标区域，并且在某些优选实施方案中，参考靶标区域包含β-肌动蛋白和/或ZDHHC1和/或B3GALT6。
在一些实施方案中，选择多个不同引物对中的至少一个以从靶区域产生长度小于约100个碱基对，优选长度小于约85个碱基对的扩增子。在某些优选实施方案中，选择所有不同的引物对以从靶区域产生长度小于约100个碱基对的扩增子。
在一些实施方案中，本文提供的方法涉及扩增在样品例如体液样品的加工期间产生的基本上所有经亚硫酸氢盐处理的DNA。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐处理的DNA的制备构成第一反应混合物的实质部分，例如在一些实施方案中，第一反应混合物中包含经亚硫酸氢盐处理的DNA的样品的体积构成第一反应混合物的总体积的至少20-50％。例如，在一些实施方案中，第一反应混合物中经亚硫酸氢盐处理的DNA的体积为第一反应混合物的总体积的至少5％，优选至少10％-60％，优选15％-55％，更优选约20％-50％。
在一些实施方案中，本技术的方法提供了使用PCR预扩增和PCR-瓣测定来分析人血浆样品中的多个靶核酸的方法，所述方法包括：
a)在包含PCR扩增试剂的第一反应混合物中提供从至少1mL血浆制备的经亚硫酸氢盐处理的DNA，所述经亚硫酸氢盐处理的DNA包含多个不同的靶区域，其中所述PCR扩增试剂包含：
i)用于扩增所述多个不同靶区域的多个不同引物对，所述靶区域选自SFMBT2、VAV3、BMP3和NDRG4，如果存在于所述样品中，则来自所述经亚硫酸氢盐处理的DNA，其中选择所述多个不同的引物对中的每一个以从靶区域产生长度小于约100个碱基对的扩增子；
ii)来自水生栖热菌的DNA聚合酶；
iii)dNTP；和
iv)包含7.5mM Mg++的缓冲液
b)将所述第一反应混合物暴露于热循环条件，其中将多个不同的靶区域(如果存在于样品中)扩增以产生预扩增的混合物，并且其中所述热循环条件限于将扩增保持在指数范围内的多个热循环，优选少于20个，更优选少于15个，更优选10个或更少的热循环；
c)将所述预扩增的混合物分配到多个PCR-瓣测定反应混合物中，其中每个PCR-瓣测定反应混合物包含：
i)额外量的选自步骤a)i)的所述多个不同引物对的引物对；
ii)来自水生栖热菌的DNA聚合酶；
iii)dNTP；
iv)包含7.5mM Mg++的缓冲液
v)热稳定性FEN-1瓣核酸内切酶；
vi)瓣寡核苷酸，和
vi)包含与所述活瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的FRET盒寡核苷酸；
和
d)在PCR-瓣测定反应期间检测选自SFMBT2、VAV3、BMP3和NDRG4的一种或多种不同靶区域的扩增。
在优选实施方案中，多个不同的靶标区域包含参考靶区域，优选包含β-肌动蛋白和/或ZDHHC1。在某些实施方案中，从图5A-5F中描绘的靶区域和引物对中选择一个或多个靶区域和/或引物对。
本文还提供了用于从血液或血液级分(例如，血浆或血清)中分离DNA(例如，无细胞DNA)的改进方法。例如，实施方案提供了加工血浆样品的方法，所述方法包括将血浆样品与蛋白酶和包含硫氰酸胍和非离子型去污剂的第一裂解试剂组合以形成其中蛋白质被蛋白酶消化的混合物，然后在其中DNA与二氧化硅颗粒结合的条件下，添加可混合的二氧化硅颗粒和第二裂解试剂，所述第二裂解试剂包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和异丙醇的混合物。在某些实施方案中，第一裂解试剂和第二裂解试剂中的非离子型去污剂相同或不同，并且选自例如聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Nonidet P-40)和支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(IGEPAL CA-630)。在某些优选实施方案中，二氧化硅颗粒是磁性颗粒。
该方法还包括从混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒，用包含盐酸胍或硫氰酸胍和乙醇的第一洗涤溶液洗涤具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒，从第一洗涤溶液中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒，并用包含缓冲液(例如，Tris pH 8.0)和乙醇的第二洗涤溶液洗涤具有结合的DNA的二氧化硅颗粒。在优选实施方案中，用第二洗涤缓冲液洗涤具有结合的DNA的二氧化硅颗粒多次，例如2-6次。在特别优选的实施方案中，每次洗涤使用比先前用该缓冲液洗涤时的体积更小的体积的第二洗涤缓冲液。在一些实施方案中，从最后一次洗涤缓冲液处理中分离经洗涤的二氧化硅颗粒，并将DNA从二氧化硅颗粒洗脱，例如用水或用洗脱缓冲液诸如10mM Tris-HCl pH 8.0,0.1mM EDTA洗脱。在优选实施方案中，例如，通过加热(至，例如，37℃至75℃，优选约45℃至70℃，更优选约70℃)将具有结合的DNA的二氧化硅颗粒在最后的洗涤步骤后干燥，然后洗脱DNA。
在该技术的开发过程中，发现使用在该过程中在不同的时间添加的两种不同的裂解试剂，提高了从血浆产生DNA的产率。在优选实施方案中，在已于室温至55℃下温育包含第一裂解试剂和蛋白酶的混合物在例如约5至60分钟，优选30至60分钟后，添加第二裂解试剂的等分试样。在优选实施方案中，将混合物在室温下温育。在某些实施方案中，第一裂解试剂包含硫氰酸胍和非离子型去污剂，第二裂解试剂包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和醇。在优选实施方案中，第一裂解试剂包含约4.3M硫氰酸胍和10％w:v IGEPAL CA-630，并且在一些实施方案中，第二裂解试剂包含4.3M硫氰酸胍和与异丙醇组合的10％w:v IGEPAL CA-630。
在该技术的开发过程中，发现在该过程的不同步骤中使用两种不同的洗涤溶液提高了从血浆产生DNA的产率。在一些实施方案中，如上所述使用的第一洗涤溶液包含盐酸胍或硫氰酸胍和乙醇，并且第二洗涤溶液包含缓冲剂和乙醇。在特别优选的实施方案中，第一洗涤溶液包含约3M盐酸胍或硫氰酸胍和约57％乙醇，并且如上所述使用的第二洗涤溶液包含约80％乙醇和约20％10mM Tris pH8.0缓冲液。
在特别优选的实施方案中，所有裂解步骤和洗涤步骤均在室温下进行。
在一些实施方案中，将血浆样品与DNA处理对照(例如不与被配置来检测血浆样品中发现的DNA的测定法交叉反应的DNA)混合。例如，在一些实施方案中，血浆是人血浆，并且DNA处理对照包含斑马鱼RASSF1序列。在优选实施方案中，DNA处理对照是合成DNA，例如包含斑马鱼RASSF1序列的合成DNA片段。在特别优选实施方案中，DNA处理对照是双链的。在优选实施方案中，在从样品提取DNA之前，例如与第一或第二裂解试剂添加一起，将加工/处理对照添加至血浆样品中。
在一些实施方案中，将本体外源DNA(例如，不与被配置来检测血浆样品中发现的DNA的测定交叉反应的DNA)添加至血浆样品中。例如，在优选实施方案中，血浆是人血浆，并且将本体鱼DNA，例如来自鲑鱼的基因组DNA添加至样品中。
本文提供的方法的实施方案特别适用于处理相对大的血浆样品(例如大于1mL)。在优选实施方案中，血浆样品具有至少2mL，3mL，4mL，5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或至少10mL的体积或其间的任何分数体积。在一些实施方案中，血浆样品的体积大于10mL。
在一些实施方案中，该方法还包括分析分离的DNA样品的特定靶核酸。在优选实施方案中，所述方法包括分析分离的DNA中的多个甲基化的靶核酸，所述方法包括用亚硫酸氢盐处理分离的DNA样品以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA样品，处理经亚硫酸氢盐处理的DNA样品以在其中多个不同的靶区域(例如2个、3个、4个、5个等靶区域)(如果存在于样品中)被扩增以形成扩增的混合物的条件下进行扩增反应。
在某些优选实施方案中，该方法还包括将扩增的混合物分配到多个不同的检测测定反应混合物中，并用检测测定反应混合物进行多个不同的检测测定，其中多个不同的靶区域，如果存在于样品中，则在多个不同的检测测定反应混合物中的一个或多个中被检测到。在优选实施方案中，多个不同的靶区域包括至少5个不同的靶区域。
本文提供了用于进行本文所述方法的试剂盒和系统。在一些实施方案中，该技术提供了用于从血浆中分离DNA的试剂盒，该试剂盒包含，例如：
a)包含硫氰酸胍和非离子型去污剂或用于制备第一裂解试剂的组分的第一裂解试剂；
b)包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和异丙醇或用于制备第二裂解试剂的组分的第二裂解试剂；
c)包含盐酸胍或硫氰酸胍和乙醇或用于制备第一洗涤溶液的组分的第一洗涤溶液；
d)包含Tris缓冲液和乙醇或用于制备第二洗涤溶液的组分的第二洗涤溶液；和
e)二氧化硅颗粒。
在优选实施方案中，非离子型去污剂包含IGEPAL CA-630。在一些实施方案中，二氧化硅颗粒是磁性颗粒，并且在特别优选的实施方案中，试剂盒包含磁体，例如用于在方法的步骤过程中分离颗粒。在一些实施方案中，试剂盒还包含洗脱缓冲液或用于制备洗脱缓冲液的组分。
在一些实施方案中，试剂盒还包含DNA处理对照，例如包含斑马鱼RASSF1序列的DNA处理对照。在一些实施方案中，试剂盒还包含本体鱼DNA的制备物，并且在特别优选的实施方案中，DNA处理对照用于本体鱼DNA的制备。
在一些实施方案中，该技术提供了用于处理血浆样品的系统，该系统包括：
a)包含硫氰酸胍和非离子型去污剂或用于制备第一裂解试剂的组分的第一裂解试剂；
b)包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和异丙醇或用于制备第二裂解试剂的组分的第二裂解试剂；
c)包含盐酸胍或硫氰酸胍和乙醇或用于制备第一洗涤溶液的组分的第一洗涤溶液；
d)包含Tris缓冲液和乙醇或用于制备第二洗涤溶液的组分的第二洗涤溶液；和
e)二氧化硅颗粒。
在优选实施方案中，非离子型去污剂包含IGEPAL CA-630。
在一些实施方案中，该系统还包含洗脱缓冲液或用于制备所述洗脱缓冲液的组分。
在一些实施方案中，该系统还包含DNA处理对照，例如包含斑马鱼RASSF1序列的DNA处理对照。在一些实施方案中，该系统还包含本体鱼DNA的制备物，在特别优选的实施方案中，所述DNA处理对照用于本体鱼DNA的制备。
在一些实施方案中，该系统还包括以下的一种或多种：磁体、用于处理血浆的容器和/或用于接收纯化的DNA的容器或平板。在一些实施方案中，该系统包括用于进行全部或部分步骤的装置，例如诸如STARlet自动化平台的装置。
在一些实施方案中，该系统还包含用于分析从血浆分离的DNA的试剂。例如，在某些实施方案中，该系统包含用于用亚硫酸氢盐处理DNA以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA的试剂，例如亚硫酸氢盐试剂、脱磺酸基试剂和用于纯化经亚硫酸氢盐处理的DNA的材料(例如，二氧化硅珠粒、结合缓冲液、包含牛血清白蛋白和/或酪蛋白的溶液，例如如美国专利第9,315,853号(通过引用并入本文)中所述的)。
在优选实施方案中，该系统还包含DNA分析试剂，例如PCR扩增试剂和/或瓣测定试剂。在特别优选的实施方案中，该系统包含PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含：
i)用于扩增多个不同的靶区域(如果存在于所述血浆中)的多个不同的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；和
iv)包含Mg++的缓冲液
在一些实施方案中，该系统还包含PCR-瓣测定试剂。在某些优选实施方案中，PCR瓣测定试剂包含：
i)用于扩增多个不同的靶区域(如果存在于所述血浆中)的多个不同的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；
iv)包含Mg++的缓冲液
v)瓣核酸内切酶；
vi)瓣寡核苷酸，和
vi)包含与所述瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的发夹寡核苷酸。
在另外的实施方案中，该系统包含用于进行PCR扩增和/或PCR瓣测定反应的热循环仪。在优选实施方案中，所述热循环仪被配置来在用测定试剂进行的扩增反应过程期间检测信号，例如荧光。
基于本文包含的教导，另外的实施方案对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
附图简述
参照以下附图，本技术的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解：
图1提供组合的PCR侵入性切割测定(“PCR-瓣测定”)例如QuARTS测定的示意图。
图2提供与PCR-瓣测定组合的嵌套PCR的示意图，显示了使用外引物进行的第一扩增(或预扩增)，然后使用在外引物的位点内具有结合位点的第二对引物进行的PCR-瓣测定。在第二扩增中产生的较小扩增子显示在底部。未显示反应的FRET盒部分。
图3提供PCR预扩增，随后PCR-瓣测定的示意图，其中预扩增和PCR-瓣测定使用相同的引物对，并产生相同扩增子的拷贝。未显示反应的FRET盒部分。
图4提供多重预扩增的示意图，其中在含有针对不同的靶区域中的每个靶区域的引物对的单个多重PCR反应中扩增样品中的多个不同靶区域，随后进行单个PCR-瓣测定反应，其中每个PCR-瓣测定仅使用对于待在最终的PCR-瓣测定反应中检测的靶基因座是特异的引物对。
图5A-5F显示用于使用亚硫酸氢盐转化、预扩增和PCR-瓣测定法检测的组合分析甲基化的核酸序列。每个图显示在亚硫酸氢盐处理之前的DNA靶区域的一条链以及在用亚硫酸氢盐试剂转化时该区域的预期序列，转化的未甲基化的C残基显示为'T'。将针对外引物和针对PCR-瓣测定内引物的引物结合位点(这可用于嵌套测定设计)加框显示。每个图还显示在转化的序列的片段上进行的PCR-瓣测定引物与瓣探针的比对。图5A-5F分别显示标志物SFMBT2、VAV3、BMP3、NDRG4和参考DNAβ-肌动蛋白和ZDHHC1的靶区域。用于PCR-瓣测定的瓣寡核苷酸上的'臂'如下：臂1是5'-CGCCGAGG-3'；第3臂是5'-GACGCGGAG-3'；第5臂是5'-CCACGGACG-3'。
图6显示比较使用外引物进行不同数量的循环预扩增的，然后使用嵌套(内)引物进行PCR-瓣测定扩增和检测来进行的指定的经亚硫酸氢盐处理的靶DNA的检测的表。比较测定直接对经亚硫酸氢盐处理的DNA使用QuARTS PCR-瓣测定而无需预扩增。
图7比较使用如图5A-5F所示的嵌套或非嵌套扩增引物构型的结果，并且比较了PCR预扩增步骤中不同的引物浓度和不同的缓冲液，如实施例3中所述的。
图8A-8C显示在测定的预扩增阶段使用不同次数的循环的结果。图8A显示针对正常血浆样品中或掺入了已知量的靶DNA的血浆样品中的每种靶标类型所预期的链的数目，不用预扩增或利用5个、10个、20个或25个循环的扩增。图8B比较在显示的条件下每个反应中链数目的检测，如实施例4中所述的。
图9显示对从粪便分离的DNA使用非嵌套多重预扩增的结果，如实施例5中所述的。
图10A-10I.显示对从血浆分离的DNA使用非嵌套多重预扩增的结果，如实施例6中所述的。
图11A-11C显示如实施例8中所述，针对β-肌动蛋白DNA(提取后未处理的和经亚硫酸氢盐转化的)和B3GALT6基因(提取后经亚硫酸氢盐转化的)的产率比较不同血浆分离条件的图。
图12A-12-C显示针对β-肌动蛋白DNA(提取后未处理的和经亚硫酸氢盐转化的)和B3GALT6基因(提取后经亚硫酸氢盐转化的)的产率比较不同血浆分离条件的图，如实施例10中所述的。
图13显示与本文中的实施方案相关的核酸序列的表。
应该理解的是，附图不一定按比例绘制，附图中的物体也不必按彼此相关系的比例来绘制。附图是旨在使本文公开的仪器、系统和方法的各种实施方案清楚和得以理解的描述。只要有可能，在整个附图中将使用相同的标号来指相同或相似的部分。此外，应该理解，附图并不旨在以任何方式限制本教导的范围。
定义
为了有利于理解本技术，下面定义了许多术语和短语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语采用在本文中明确关联的含义。但如本文中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管其可以指相同的实施方案。此外，如在本文中使用的短语“在另一个实施例中”并不一定指不同的实施方案，尽管其可以指不同的实施方案。因此，如下所述，可在不脱离本技术的范围或精神的情况下，容易地组合本技术的各种实施方案。
另外，如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”是包含性的“或”运算符并且等同于术语“和/或”。除非上下文另有明确规定，否则术语“基于”不是排它性的，并且允许基于未描述的另外因素。另外，在整个说明书中，“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”的含义包括复数所指物。“在……中(in)”的含义包括“在……中”和“在……上”。
如在本申请中的权利要求中所用，过渡性短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及那些不会实质性地影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤”，如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA1976)中所论述的。例如，组合物“基本上由例举的元素组成的”组合物可以以一定的水平包含未列举的污染物，使得污染物虽然存在，但与纯组合物(即“由例举的组分组成”的组合物)相比，不改变例举的组合物的功能。
如本文关于非靶DNA所用，术语“外源的”是指从除含有靶DNA的来源或样品外的来源分离和纯化的非靶DNA。例如，纯化的鱼DNA相对于包含人靶DNA的样品是外源DNA，例如如美国专利第9,212,392号(其通过引用并入本文)中所述的。外源DNA不需要来自与靶DNA不同的生物体。例如，如果将商购获得的纯化的鱼DNA添加至被配置来检测来自特定鱼的样品中的靶核酸的反应中，则所述纯化的鱼DNA是外源的。在优选实施方案中，将外源DNA选择为不被被配置来检测和/或定量其中添加了所述外源DNA的反应中的靶核酸的测定法检测到的。
如本文中所用，“DNA片段”或“小DNA”或“短DNA”意指由在长度上不超过约200个碱基对或核苷酸组成的DNA。
术语“引物”是指当置于其中启动引物延伸的条件下时能够充当合成起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在，如在纯化的限制性消化物中，或可以合成产生。在一些实施方案中，将寡核苷酸引物与模板核酸一起使用，并且引物的延伸是模板依赖性的，使得模板的互补链形成。
在核酸的背景下术语“扩增(amplifying)”或“扩增(amplification)”是指通常从少量多核苷酸(例如，单个多核苷酸分子)开始的多拷贝的多核苷酸或多核苷酸的一部分的产生，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促过程。在聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR；参见，例如，美国专利第5,494,810号；通过引用整体并入本文)中，从一个或数个拷贝的靶或模板DNA分子生成多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增的其它类型包括但不限于等位基因特异性PCR(参见，例如美国专利第5,639,611号；通过引用整体并入本文)、装配PCR(参见，例如美国专利第5,965,408号；通过引用整体并入本文)、解旋酶依赖性扩增(参见，例如美国专利第7,662,594号；通过引用整体并入本文)、热启动PCR(参见，例如美国专利第5,773,258号和第5,338,671号；各自通过引用整体并入本文)、序列间特异性PCR、反向PCR(参见，例如Triglia等人，(1988)Nucleic AcidsRes.,16:8186；通过引用整体并入本文)、连接介导的PCR(参见，例如Guilfoyle,R.等人，Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利第5,508,169号；其中的每一篇通过引用整体并入本文)、甲基化特异性PCR(参见，例如Herman等人，(1996)PNAS 93(13)9821-9826；通过引用整体并入本文)、小引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(参见，例如Schouten等人，(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57；通过引用整体并入本文)、多重PCR(参见，例如Chamberlain等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人，(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人，(2008)BMCGenetics 9:80；其中的每一篇通过引用整体并入本文)、嵌套PCR、重叠延伸PCR(参见，例如Higuchi等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367；通过引用整体并入本文)、实时PCR(参见，例如Higuchi等人，(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi等人，(1993)Biotechnology 11:1026-1030；其中的每一篇通过引用整体并入本文)、逆转录PCR(参见，例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193；通过引用整体并入本文)、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR(参见，例如Don等人，Nucleic AcidsResearch(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人，(1996)Biotechniques 20(3)478-485；其中的每一篇通过引用整体并入本文)。多核苷酸扩增也可以使用数字PCR完成(参见，例如Kalinina等人，Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利公开第WO05023091A2号；美国专利申请公开第20070202525号；其中的每一篇通过引用整体并入本文)。
术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis的美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,965,188号的方法，所述专利描述了用于增加基因组或其它DNA或RNA的混合物中靶序列片段浓度而无需克隆或纯化的方法。该扩增靶序列的方法由以下方面组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需靶序列的DNA混合物中，然后在DNA聚合酶存在的情况下进行精确的热循环序列。两个引物与双链靶序列的其各自链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后将引物与它们在靶分子内的互补序列退火。退火后，引物通过聚合酶延伸以形成新的一对互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的所需靶序列的扩增片段。所需靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置决定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。因为靶序列的所需扩增片段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，所以它们被称为“PCR扩增的”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域技术人员将理解术语“PCR”包括使用例如实时PCR、嵌套PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单一引物和任意引发的PCR等的最初描述的方法的许多变型。
如本文中所用，术语“核酸检测测定”是指测定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性切割测定(例如，例如于美国专利第5,846,717号、第5,985,557号、第5,994,069号、第6,001,567号、第6,090,543号和第6,872,816号；Lyamichev等人，Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人，PNAS,USA,97:8272(2000)中以及在组合的PCR/侵入性切割测定(Hologic,Inc.，例如在美国专利公开第2006/0147955号和第2009/0253142号)(其中的每一篇为了所有目的通过引用整体并入本文)中描述的“INVADER”瓣测定或侵入性切割测定(Hologic,Inc.))；酶错配切割方法(例如，Variagenics，美国专利第6,110,684号、第5,958,692号、第5,851,770号，其通过引用整体并入本文)；上述聚合酶链式反应(PCR)；分枝杂交法(例如，Chiron的美国专利第5,849,481号、第5,710,264号、第5,124,246号和第5,624,802号，其通过引用整体并入本文)；滚环复制(例如，美国专利第6,210,884号、第6,183,960号和第6,235,502号，其通过引用整体并入本文)；NASBA(例如，美国专利第5,409,818号，其通过引用整体并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利第6,150,097号，其通过引用整体并入本文)；电子传感器技术(美国专利第6,248,229号、第6,221,583号、第6,013,170号和第6,063,573号，其通过引用整体并入本文)；循环探针技术(例如，美国专利第5,403,711号、第5,011,769号和第5,660,988号，其通过引用整体并入本文)；Dade Behring信号扩增方法(例如，美国专利第6,121,001号、第6,110,677号、第5,914,230号、第5,882,867号和第5,792,614号，其通过引用整体并入本文)；连接酶链式反应(例如，Barany Proc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；和夹心杂交方法(例如，美国专利第5,288,609号，其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，扩增(例如通过PCR)靶核酸并且使用侵入性切割测定同时检测扩增的核酸。被配置来用于进行与扩增测定组合的检测测定(例如，侵入性切割测定)的测定法在美国专利公开第20090253142A1号(申请系列第12/404,240号)(出于所有目的通过引用整体并入本文)中进行了描述，并且如图1所图解的。因为许多拷贝的FRET盒被切割用于所产生的靶扩增子的每个拷贝，所以该测定除了靶扩增以外还被认为产生“信号扩增”。称为QuARTS方法的附加扩增加侵入性切割检测配置描述于美国专利第8,361,720号、第8,715,937号和第8,916,344号(出于所有目的通过引用整体并入本文)中。
如本文中所用，术语“PCR-瓣测定”与术语“PCR-侵入性切割测定”可互换使用，并且是指这样的测定配置，其通过形成包含扩增的靶DNA的第一重叠切割结构和包含来自第一重叠切割结构的切割的5'瓣和称为“FRET盒”的标记的发夹检测寡核苷酸的第二重叠切割结构而组合PCR扩增和扩增的DNA的检测的测定配置。在如本文中使用的PCR-瓣测定中，测定试剂包含含有DNA聚合酶、FEN-1核酸内切酶、包含与靶核酸互补的部分的初级探针和发夹FRET盒的混合物，并且通过PCR扩增靶核酸以及同时检测(即，在靶扩增的过程进行检测)扩增的核酸。PCR-瓣测定包括美国专利第8,361,720号、第8,715,937号和第8,916,344号中描述的QuARTS测定和美国专利第9,096,893号中的扩增测定(例如，如该专利的图1中所图解的)，其中的每一个专利通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“PCR-瓣测定试剂”是指用于在PCR-瓣测定中检测靶序列的一种或多种试剂，所述试剂包含能够参与靶核酸扩增和在含有DNA聚合酶、FEN-1核酸内切酶和FRET盒的混合物中在靶序列存在的情况下形成瓣切割结构的核酸分子。
如本文中所用，术语“瓣测定试剂”或“侵入性切割测定试剂”是指在基底上进行瓣测定或侵入性切割测定所需的所有试剂。如本领域所知，瓣测定一般包括如上所述的侵入性寡核苷酸、瓣寡核苷酸、瓣核酸内切酶和任选的FRET盒。瓣测定试剂可以任选地含有侵入性寡核苷酸和瓣寡核苷酸所结合的靶。
如本文中所用，术语“瓣寡核苷酸”是指在检测测定(诸如侵入性切割测定)中可通过瓣核酸内切酶切割的寡核苷酸。在优选实施方案中，瓣寡核苷酸与其它核酸例如靶核酸和侵入性寡核苷酸形成侵入性切割结构。
如本文中所用，术语“FRET盒”是指含有荧光团部分和猝灭荧光团的邻近猝灭剂部分的发夹寡核苷酸。切割的瓣(例如，来自PCR-瓣测定中的靶特异性探针的切割)与FRET盒杂交产生瓣核酸内切酶例如FEN-1酶的第二底物。一旦形成了该底物，含有5'荧光团的碱基就从该盒中切割下来，从而产生荧光信号。在优选实施方案中，FRET盒包含未配对的3'部分，切割产物(例如，切割的瓣寡核苷酸的一部分)可与其杂交以形成可由FEN-1核酸内切酶切割的侵袭性切割结构。
如本文中所用，核酸“发夹”是指包含双链体(即，碱基配对的)茎和环的单链核酸的区域，该区域是当核酸包含彼此充分互补的两部以形成多个连续碱基对时形成的。
如本文中所用，术语“FRET”是指荧光共振能量转移，一种其中部分(例如，荧光团)将能量例如在其本身之间转移或者从荧光团转移至非荧光团(例如，猝灭剂分子)的方法。在一些情况下，FRET涉及经由短程(例如，约10nm或更小)偶极-偶极相互作用将能量转移至较低能量受体荧光团的激发供体荧光团。在其它情况下，FRET涉及来自供体的荧光能量损失和受体荧光团的荧光增加。在FRET的其它形式中，能量可从激发供体荧光团交换为非发荧光分子(例如，猝灭分子)。FRET对于本领域技术人员是已知的并且已被描述(参见，例如Stryer等人，1978,Ann.Rev.Biochem.,47:819；Selvin,1995,Methods Enzymol.,246:300；Orpana,2004 Biomol Eng 21,45-50；Olivier,2005 Mutant Res 573,103-110，所述文献的每一篇通过引用整体并入本文)。
如本文中所用，关于酶的术语“FEN-1”是指如由FEN-1基因编码的来自真核生物或古细菌生物的非聚合酶瓣核酸内切酶。参见，例如WO 02/070755和Kaiser M.W.等人，(1999)J.Biol.Chem.,274:21387，出于所有目的将所述文献通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“FEN-1活性”是指FEN-1酶的任何酶促活性。
如本文中所用，术语“引物退火”是指允许寡核苷酸引物与模板核酸链杂交的条件。引物退火的条件随着引物的长度和序列而变化，并且通常基于针对引物确定或计算的Tm。例如，涉及热循环的扩增方法中的退火步骤涉及在热变性步骤之后将温度降低至基于引物序列的Tm的温度，持续足够的时间以允许这样的退火。
如本文中所用，术语“可扩增的核酸”用于指可通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增的核酸”通常将包含“样品模板”。
如本文中所用，关于核酸扩增或信号扩增的检测的术语“实时”是指在反应进行时(例如在温育或热循环过程中)检测或测量反应中的产物或信号的积累。此类检测或测定可以连续发生，或其可在扩增反应进行过程中的多个离散点发生，或其可以是组合。例如，在聚合酶链式反应中，检测(例如，荧光的检测)可在全部或部分热循环期间连续发生，或者其可在一个或多个循环期间的一个或多个点瞬时发生。在一些实施方案中，PCR的实时检测通过测定多个循环中的每一个循环中或每个循环中的相同点(例如，循环中的时间点或循环中的温度步骤)处的荧光水平来实现。扩增的实时检测也可被称为“在扩增反应期间”的检测。
如本文中所用，术语“核酸丰度”是指存在于样品或等分试样中的特定靶核酸序列的量。该量通常以质量(例如，μg)、每单位体积的质量(例如，μg/μL)、拷贝数(例如，1000个拷贝，1埃摩尔)或每单位体积的拷贝数(例如1000个拷贝/mL，1埃摩尔/μL)表示。核酸丰度也可表示为相对于已知浓度或拷贝数的标准量的量。核酸丰度的量度可在任何基础上被本领域技术人员理解为是核酸丰度的合适定量表示，包括样品的物理密度、光密度、折射率、染色性质，或基于可检测标记物例如荧光标记物的强度。
术语“扩增子”或“扩增产物”是指通过扩增方法诸如PCR方法生成的核酸(通常是DNA)的片段。所述术语也用于指通过使用RNA聚合酶(诸如NASBA、TMA等)的扩增方法产生的RNA片段
如针对热循环扩增反应所用，术语“扩增曲线”是指指示扩增的信号(例如，荧光信号)对比循环数的曲线图。当针对非热循环扩增方法使用时，扩增曲线通常指作为时间的函数的信号累积的曲线。
如针对扩增曲线使用，术语“基线”是指在温育之前，或在PCR的情况下在初始循环中(其中信号几乎没有变化)来自装配扩增反应的检测到的信号。
如本文中针对在为热循环的扩增反应期间的实时检测所用，术语“Ct”或“阈值循环”是指检测到的信号(例如，荧光)通过固定阈值时的分数循环数。
如本文中针对对照反应所用，术语“无模板对照”和“无靶标对照”(或“NTC”)是指不含模板或靶核酸的反应或样品。其用于验证扩增质量。
如本文中所用，术语“样品模板”是指源自分析其的“靶标”存在的样品的核酸。相反，“背景模板”用于指除样品模板外的可存在于或可以不存在于样品中的核酸。背景模板的存在通常是无意的。这可以是遗留的结果，或者可归因于试图从样品中纯化掉的核酸污染物的存在。例如，来自除待检测的那些生物外的生物的核酸可作为背景存在于测试样品中。
“怀疑含有”核酸的样品可含有或不含有靶核酸分子。
如本文中所用，术语“样品”以其最广泛的含义使用。例如，在一些实施方案中，其意图包括样本或培养物(例如，微生物培养物)，而在其它实施方案中，其意图包括生物和环境样品(例如，怀疑包含靶序列、基因或模板)。在一些实施方案中，样品可包括合成来源的样本。样品可以是未被纯化的，或可以是部分或完全纯化的或以其它方式处理的。
本技术不受使用或分析的生物样品类型限制。本技术可用于各种生物样品，包括但不限于组织(例如，器官(例如，心脏、肝、脑、肺、胃、肠、脾、肾、胰腺和生殖器官)、腺、皮肤和肌肉)、细胞(例如，血细胞(例如，淋巴细胞或红细胞)、肌细胞、肿瘤细胞和皮肤细胞)、气体、体液(例如，血液或其部分，血清、血浆、尿液、精液、唾液等)或从人(例如，成人、婴儿或胚胎)或动物(例如，牛、家禽、小鼠、大鼠、狗、猪、猫、马等)获得的固体(例如，粪便)样品。在一些实施方案中，生物样品可以是固体食物和/或饲料产品和/或成分，诸如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品以及废物。生物样品可以从家畜以及未驯服动物或野生动物的所有不同家族获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、兔类动物、啮齿类动物、鳍足类动物等的动物
生物样品还包括活检组织样品和组织切片(例如，肿瘤、生长、皮疹、感染的活检组织样品或切片或石蜡包埋的切片)、医疗或医院样品(例如，包括但不限于血液样品、唾液、口腔拭子、脑脊液、胸膜液、乳汁、初乳、淋巴液、痰液、呕吐物、胆汁、精液、卵母细胞、宫颈细胞、羊水、尿液、粪便、毛发和汗液)、实验室样品(例如，亚细胞级分)和法医样品(例如，血液或组织(例如，飞沫或残渣)、含有核酸的毛发和皮肤细胞)和考古学样品(例如，化石生物体、组织或细胞)。
环境样品包括但不限于环境材料诸如表面物质、土壤、水(例如，淡水或海水)、藻类、地衣、地质样品、包含含有核酸的材料的空气、晶体和工业样品，以及获自食品和乳品加工设备、仪器、装备、器具、一次性和非一次性物品的样品。
样品可以通过任何期望的或合适的方法来制备。在一些实施方案中，使用美国专利第9,000,146号(其出于所有目的通过引用整体并入本文中)中所述的方法直接从体液、粪便或其它样品分析核酸。
然而，上述实例不被解释为限定可适用于本技术的样品(例如，怀疑包含靶序列、基因或模板(例如，可使用本技术的组合物和方法确定其存在或不存在))。
如本文中所用，术语“核酸序列”和“核酸分子”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。该术语涵盖包括DNA和RNA核苷酸的类似物的序列，所述类似物包括上文所列的那些类似物，并且还包括但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、羟丁氧基核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和吡唑并[3,4-d]嘧啶诸如鸟嘌呤类似物6氨基1H-吡唑并[3,4d]嘧啶4(5H)1(ppG或PPG，亦称Super G)和腺嘌呤类似物4氨基1H-吡唑并[3,4d]嘧啶(ppA或PPA)。还可使用黄嘌呤类似物1H-吡唑并[5,4d]嘧啶-4(5H)-6(7H)-二酮(ppX)。这些碱基类似物，当存在于寡核苷酸中时、可增强杂交并改善错配鉴别。本技术的寡核苷酸缀合物中可包括天然存在的碱基、经修饰的碱基和碱基类似物的所有互变异构形式。可用于本技术的其它经修饰的碱基包括6-氨基-3-丙-1-炔基-5-氢吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮，PPPG；6-氨基-3-(3-羟基丙-1-炔基)-5-氢吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮，HOPPPG；6-氨基-3-(3-氨基丙-1-炔基)-5-氢吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮，NH2PPPG；4-氨基-3-(丙-1-炔基)吡唑并[3,4-d]嘧啶，PPPA；4-氨基-3-(3-羟基丙-1-炔基)吡唑并[3,4-d]嘧啶，HOPPPA；4-氨基-3-(3-氨基丙-1-炔基)吡唑并[3,4-d]嘧啶，NH2PPPA；3-丙-1-炔基吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二氨基，(NH2)2PPPA；2-(4,6-二氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)乙炔-1-醇、(NH2)2PPPAOH；3-(2-氨基乙炔基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺，(NH2)2PPPANH2；5-丙-1-炔基-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮，PU；5-(3-羟基丙-1-炔基)-1,3-二氢嘧啶-2,4-二酮，HOPU；6-氨基-5-丙-1-炔基-3-二氢嘧啶-2-酮，PC；6-氨基-5-(3-羟基基丙-1-炔基)-1,3-二氢嘧啶-2-酮，HOPC；和6-氨基-5-(3-氨基丙-1-炔基)-1,3-二氢嘧啶-2-酮，NH2PC；5-[4-氨基-3-(3-甲氧基丙-1-炔基)吡唑[3,4-d]嘧啶基]-2-(羟基甲基)草脲胺-3-醇，CH3OPPPA；6-氨基-1-[4-羟基-5-(羟基甲基)草脲胺-2-基]-3-(3-甲氧基丙-1-炔基)-5-氢吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮,CH3OPPPG；4,(4,6-二氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-丁-3-炔-1-醇，Super A；6-氨基-3-(4-羟基-丁-1-炔基)-1,5-二氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮；5-(4-羟基-丁-1-炔基)-1H-嘧啶-2,4-二酮，SuperT；3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺((NH2)2PPAI)；3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺((NH2)2PPABr)；3-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺((NH2)2PPACl)；3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺(PPAI)；3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺(PPABr)；和3-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺(PPACl)。
核酸序列或分子可以是基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义链或反义链。因此，核酸序列可以是dsDNA、ssDNA、混合ssDNA、混合dsDNA、制备成ssDNA(例如，通过解链、变性、解旋酶等)的ssDNA、A-、B-或Z-DNA、三链DNA、RNA、ssRNA、dsRNA、混合的ss和dsRNA、制备成ssRNA(例如，通过解链、变性、解旋酶等)的dsRNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、催化性RNA、snRNA、微RNA或蛋白质核酸(PNA)。
本技术不受限于所利用的核酸(例如，序列或分子(例如靶序列和/或寡核苷酸))的类型或来源。例如，核酸序列可以是扩增或生产的序列(例如，通过合成(例如，聚合(例如，引物延伸(例如，RNA-DNA杂交引物技术))和逆转录(例如，RNA至DNA的))和/或扩增(例如,聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、循环探针技术、Q-β复制酶、链置换扩增(SDA)、分支DNA信号扩增(bDNA)、杂交捕获和解旋酶依赖性扩增)。
除非本文另有说明，否则术语“核苷酸”和“碱基”在针对核酸序列使用时可互换使用。“核碱基”是杂环碱基诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤或其杂环衍生物、类似物或互变异构体。核碱基可以是天然存在的或合成的。核碱基的非限制性实例是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-氮杂嘌呤、在8位被甲基或溴取代的嘌呤、9-氧代-N6-甲基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、N4-乙醇胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、N6-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、硫尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷、7,8-二甲基咯嗪、6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、4-甲基-吲哚、亚乙烯基腺嘌呤和在美国专利第5,432,272号和第6,150,510号以及PCT申请WO 92/002258、WO 93/10820、WO 94/22892和WO 94/24144，以及Fasman(“Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology”，第385-394页，1989,CRC Press,Boca Raton,LO)(其全部通过引用整体并入本文)中描述的非天然存在的核碱基。
如本文中所用，术语“寡核苷酸”被定义为包含两个或更多个核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，优选至少5个核苷酸，更优选至少约10-15个核苷酸，更优选至少约15至30个核苷酸或更长的分子(例如，寡核苷酸的长度通常小于200个残基(例如，15至100个核苷酸之间)，然而，如本文中所用，该术语也旨在涵盖更长的多核苷酸链)。确切的大小将取决于许多因素，而这又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸通常以其长度来表示。例如，24个残基的寡核苷酸被称为“24-聚体”。寡核苷酸可通过自我杂交或通过与其他多核苷酸杂交而形成二级和三级结构。此类结构可包括但不限于双链体、发夹、十字形、弯曲和三链体。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。在一些实施方案中，在反应中(例如，通过在酶促延伸反应中延伸引物)生成形成侵入性切割结构的寡核苷酸。
由于以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键联以一个方向附接于其相邻戊糖环的3'氧的方式使单核苷酸反应以产生寡核苷酸，因此如果寡核苷酸末端的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则其被称为“5'末端“，并且如果寡核苷酸末端的3'氧未与随后的单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则其被称为“3'末端”。如本文中所用，即使在更大的寡核苷酸内部，也可以说核酸序列具有5'和3'末端。如果当以5'至3'方向沿着核酸链移动时，第一区域的3'末端位于第二区域的5'末端之前，则认为沿着核酸链的第一区域位于另一区域的上游。
如本文中所用，术语“互补”或“互补性”用于指按照碱基配对法则相关的多核苷酸(例如，两个或更多个核苷酸的序列(例如，寡核苷酸或靶核酸))。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'互补”。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基按照碱基配对法则配对。或者，核酸碱基之间可存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及取决于两条或更多条核酸链的缔合的检测方法中是特别重要的。任一术语也可用于指单个核苷酸，特别是在多核苷酸的情况下。例如，寡核苷酸内的特定核苷酸因其与另一核酸序列(例如，靶序列)内的核苷酸的互补性或因其缺乏而被注意到，与寡核苷酸的其余部分与所述核酸序列之间的互补性相反或相比较。
如本文中所用，核酸序列的互补序列是指当与核酸序列比对使得一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时处于“反平行缔合”中的寡核苷酸。如上所述，核苷酸类似物可以包括在本技术的核酸中，并且包括。互补性不必是完美的；稳定的双链体可以含有错配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据许多变量经验地确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、所述寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。
如本文中所用，术语“标记物”是指可被检测到或可导致可检测的反应的任何部分(例如，化学物质种类)。在一些优选实施方案中，标记物的检测提供了可量化的信息。标记物可以是任何已知的可检测部分，诸如，例如放射性标记物(例如，放射性核素)、配体(例如，生物素或抗生物素蛋白)、发色团(例如，赋予可检测的颜色的染料或颗粒)、半抗原(例如，地高辛)、质量标记物、胶乳珠粒、金属颗粒、顺磁性标记物、发光化合物(例如，生物发光、发磷光或化学发光标记物)或荧光化合物。
可将标记物直接或间接地联接至寡核苷酸或其它生物分子。直接标记可通过将标记物与寡核苷酸连接的键或相互作用(包括共价键或非共价相互作用诸如氢键、疏水和离子相互作用)，或通过形成螯合物或配位络合物发生。间接标记可通过使用桥接部分或“接头”，诸如被直接或间接标记的抗体或另外的寡核苷酸来进行。
标记物可以单独使用或与能够抑制(例如，猝灭)、激发或转移(例如，偏移)标记物(例如，发光标记物)的发射光谱(例如，荧光共振能量转移(FRET))的部分组合使用。
“聚合酶”是通常用于联接3'-OH 5'-三磷酸核苷酸、寡聚体及其类似物的酶。聚合酶包括但不限于模板依赖性DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶和RNA依赖性RNA聚合酶。聚合酶包括但不限于T7 DNA聚合酶、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、DNA聚合酶1、Klenow片段、水生嗜热栖热菌(Thermophilus aquaticus)DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)、Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)、Bst DNA聚合酶大片段、Stoeffel片段、9°N DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、RepliPHI Phi29聚合酶、Tli DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶β、端粒末端转移酶、Therminator聚合酶(NewEngland Biolabs)、KOD HiFi DNA聚合酶(Novagen)、KOD1 DNA聚合酶、Q-β复制酶、末端转移酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、Phi6逆转录酶、HIV-1逆转录酶、通过生物勘测发现的新型聚合酶，以及US 2007/0048748、美国专利第6,329,178号、第6,602,695号和第6,395,524号(通过引用并入)中例举的聚合酶。这些聚合酶包括野生型、突变亚型和遗传工程化变体。
“DNA聚合酶”是从脱氧核苷酸单体(dNTP)产生DNA的聚合酶。如本文中所用，“真细菌DNA聚合酶”是指来自真细菌的Pol A型DNA聚合酶(修复聚合酶)，包括但不限于来自大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶I、来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶和来自栖热菌属(Thermus)以及真细菌种类等的其它成员的DNA Pol I酶。
如本文中所用，术语“靶”是指待检测或表征的核酸物种或核酸序列或结构。
因此，如本文中所用，“非靶标”，例如，如其用于描述核酸(例如DNA)的，是指可存在于反应中但不是通过反应检测或表征的主题的核酸。在一些实施方案中，非靶核酸可以指存在于样品中的不含例如靶核酸的核酸，而在一些实施方案中，非靶标可以指外源核酸，即不是源自含有或怀疑含有靶核酸的样品，并且被添加到反应中，例如以使酶(例如，聚合酶)的活性标准化以减小反应中酶的性能的变化性的核酸。
如本文中所用，术语“扩增试剂”是指除引物、核酸模板和扩增酶外的扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，将扩增试剂连同其它反应组分一起放置并容纳在反应容器中。
如本文中所用，当用于指核酸检测或分析时，术语“对照”是指具有已知特征(例如，已知序列、每细胞的已知拷贝数)的核酸，用于与实验靶标(例如，未知浓度的核酸)比较。对照可以是可针对其标准化测试中的测试核酸或靶核酸的内源的，优选地不变的基因。此类标准化对照用于针对可在例如样品处理、测定效率等中发生的样品间变化，并且允许准确的样品间数据比较。可用于标准化针对人样品的核酸检测测定的基因包括例如β-肌动蛋白、ZDHHC1和B3GALT6(参见，例如，美国专利申请序列第14/966,617和62/364,082，其各自通过引入并入本文)。
对照也可以是外部的。例如，在诸如qPCR、QuARTS等的定量测定中，“校准物”或“校准对照”是具有已知序列(例如具有与实验靶核酸的一部分相同的序列)并具有已知浓度或系列浓度(例如，用于在定量PCR中弯曲的校准生成的连续稀释的对照靶标)的核酸。通常，使用与对实验DNA使用的相同的试剂和反应条件分析校准对照。在某些实施方案中，校准物的测量与实验测定同时进行，例如在相同的热循环仪中进行。在优选实施方案中，多个校准物可以包含在单个质粒中，使得容易以等摩尔量提供不同的校准物序列。在特别优选的实施方案中，质粒校准物例如用一种或多种限制性内切酶消化以从质粒载体释放校准物部分。参见，例如WO 2015/066695，其通过引用并入本文。
如本文中所用，“ZDHHC1”是指编码被表征为位于Chr 16(16q22.1)上的人DNA中且属于DHHC棕榈酰转移酶家族的含有1的DHHC型锌指的蛋白质的基因。
如本文中所用，术语“处理对照”是指外源分子，例如在提取靶DNA之前添加至样品的外源核酸，其可在提取后测量以评估处理的效率并且能够决定成功或失败模式。所用的处理对照核酸的性质通常取决于测定类型和被测物质。例如，如果使用的测定用于检测和/或定量双链DNA或其中的突变，则通常将双链DNA处理对照掺入样品预提取物中。类似地，对于监测mRNA或微RNA的测定，所用的处理对照通常是RNA转录物或合成RNA。参见，例如，2016年7月19日提交的美国专利申请序列第62/364,049号，其通过引用并入本文，并且描述了斑马鱼DNA作为人样品的处理对照的用途。
如本文中所用，术语“斑马鱼DNA”不同于本体“鱼DNA”(例如,纯化的鲑鱼DNA)，并且指从斑马鱼(Danio rerio)分离的DNA，或体外生成(例如，酶促地，合成地)以具有在斑马鱼的DNA中发现的核苷酸的DNA。在优选实施方案中，斑马鱼DNA是作为可检测的对照DNA添加的甲基化DNA，例如用于通过样品处理步骤验证DNA回收的处理对照。具体地，包含至少一部分RASSF1基因的斑马鱼DNA可用作例如人样品的处理对照，如美国专利申请序列第62/364,049号中所述的。
如本文中所用，术语“鱼DNA”与斑马鱼DNA不同，并且指从鱼分离的本体(例如，基因组)DNA，例如如美国专利第9,212,392号中所述的。本体纯化的鱼DNA可商购获得，例如以鳕鱼和/或鲱鱼精子DNA(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)或鲑鱼DNA(USB/Affymetrix)的形式提供。
如本文中所用，术语“颗粒”和“珠粒”可互换使用，并且术语“磁性颗粒”和“磁性珠粒”可互换使用，并且是指对磁场作出响应的颗粒或珠粒。通常地，磁性颗粒包含不具有磁场但在暴露于磁场时形成磁偶极子的材料，例如在磁场存在的情况下能够被磁化但在这种磁场不存在的情况下本身不具有磁性的材料。如在该背景中所用，术语“磁性”包括为顺磁性或超顺磁性材料的材料。如本文中所用，术语“磁性”还涵盖暂时磁性材料，诸如具有低居里温度的铁磁性或亚铁磁性材料，条件是此类暂时磁性材料在根据本方法使用含有此类材料的二氧化硅磁性颗粒分离生物材料时所处的温度范围内是顺磁性的。
如本文中所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在核酸纯化系统和反应测定的背景下，此类递送系统包括允许试剂和装置(例如，在适当的容器中的离液盐、颗粒、缓冲液、变性剂、寡核苷酸、过滤器等)和/或支持材料(例如，样品处理或样品存储容器、用于执行程序的书面说明等)的储存、从一个位置至另一个位置的运输或递送的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如，盒子)。如本文中所用，术语“片段化试剂盒”是指包含两个或更多个分开的容器的递送系统，每个容器包含全部试剂盒组分的子部分。所述容器可以一起或单独地递送到预期的接收者。例如，第一个容器可含有用于样品收集的材料和缓冲液，而第二个容器含有捕获寡核苷酸和变性剂。术语“片段化试剂盒”旨在涵盖包含根据联邦食品，药物和化妆品法案的520(e)节规定的但不限于此的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒。事实上，包含两个或更多个分开的容器(每个容器都包含总试剂盒组分的子部分)的任何递送系统都包括在术语“片段化试剂盒”中。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳每个所需组分的单个盒子中)包含反应测定的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括片段化试剂盒和组合试剂盒。
如本文中所用，术语“系统”是指用于特定目的的物品集合。在一些实施方案中，物品包括使用说明，作为例如在物品上、纸上、可记录介质(例如，软盘、CD、闪存驱动器等)上提供的信息。在一些实施方案中，说明书将用户引导至在线位置，例如用于观看、收听和/或下载指令的网站。在一些实施方案中，说明书或其它信息以移动设备的应用程序(“app”)提供。
发明详述
本文中提供了与核酸的基于扩增的检测相关的技术，并且具体但非排它地涉及用于富集低DNA、亚硫酸氢盐转化的样品以用于分析的方法。
目标生物样品可在其中具有极大不同的量的DNA，并且即使在本体DNA中很丰富，但也可能具有非常低量的目标DNA，例如在正常DNA背景中的非正常DNA，或在微生物DNA背景中的人DNA(或反之亦然)。为了补偿低浓度的靶DNA，有时可以处理大样品以收集足够的DNA用于特定测定。然而，当需要将具有低浓度的靶DNA的样品平行进行多种不同的测定时，必需的样品量可能变得过大。例如，受试者血浆中的循环游离DNA通常非常低，因为其主要通过肝脏从血流中不断清除，并且半衰期仅为10至15分钟。因此，循环DNA的常见水平非常低，例如对于健康个体而言，例如来自目标基因的DNA的特定片段可以以约1,500-2000个拷贝/mL存在，而与肿瘤相关的DNA片段在具有晚期癌症的受试者中可以以约5000个拷贝/mL存在。另外，血浆中的肿瘤来源的cfDNA通常被片段化成例如具有200个或更少的碱基对的短链，(参见例如P.Jiang等人，Proc.Natl Acad Sci.112(11):E1317-E1325(2015)，其通过引用整体并入本文)。此类小DNA特别难以纯化，因为它们可在典型的纯化步骤期间丢失，例如通过沉淀和/或DNA结合纯化步骤中的无效性。
从此类血液级分样品中回收DNA可捕获75％，但通常回收少得多。因此，取决于针对这些靶标的特定测定的灵敏度，来自血浆的多个DNA标志物的分析可能需要大量来自受试者的血浆。通过特定靶区域的靶向预扩增进行富集可增加可使用相同起始样品分析的标志物的数量，即不需要从受试者收集相应较大的样品(例如，血浆或血液)。
本文中提供了用于从血浆样品提取DNA(例如，无细胞循环DNA)的技术的实施方案。在优选实施方案中，本文提供的方法不包括有机萃取(例如，苯酚-氯仿萃取)、醇沉淀或柱的使用，使得所述方法可易于扩展和自动化。在特别优选的实施方案中，基本上整个分离程序-从血浆样品至准备用于洗脱的珠粒结合的纯化DNA-在室温下进行。
本文中提供了特别适合于靶DNA的分析的多重预扩增的技术的实施方案，所述靶DNA以低丰度存在和/或在它们被发现的样品中被片段化并且已用亚硫酸氢盐试剂处理，例如如Leontiou等人，PLoS ONE 10(8):e0135058.doi:10.1371/journal.pone.0135058(2015)中描述的。在某些优选实施方案中，亚硫酸氢盐处理包括使用亚硫酸氢铵，优选在载体结合的DNA上进行脱磺酸基作用，如美国专利第9,315,853号描述的。
本技术的实施方案
1.从血浆中分离无循环细胞DNA
本文中提供了与来自样品(例如血液或血浆样品)的片段化DNA的分离相关的技术。具体地，本文中提供了与使用结合DNA的可混合的颗粒例如二氧化硅颗粒从血浆样品提取低拷贝的小DNA(例如，长度小于约200个碱基对)相关的技术。本文中提供了使用在血浆样品的裂解处理过程中在不同时间添加的两种不同的裂解试剂，并且在结合至颗粒的DNA的处理中使用两种不同洗涤缓冲液的组合的方法。在优选实施方案中，本文中提供的技术包括向要分离以用于进一步分析的DNA中添加本体外源非靶DNA(例如，本体鱼DNA)，所述外源非靶DNA优选在第一颗粒结合步骤之前或在第一颗粒结合步骤中被添加至血浆。
2.用于PCR-瓣测定分析的靶区域的预扩增
本文提供了涉及提供增加量的DNA以用于在PCR-瓣测定(例如，如图1中图解的QuARTS测定)中进行分析的技术。具体地，本文中公开的方法和组合物的实施方案提供使用多重预扩增步骤例如从低靶样品增加目标DNA靶的量，然后进行靶特异性检测以进一步扩增并检测目标靶基因座。
已知先前以靶向方式(例如，靶特异性PCR的扩增子产物的等分试样或稀释物的扩增)扩增的再扩增DNA片段易于产生不希望的假象，例如不希望的DNA产物的高背景。因此，使用连续轮的特异性PCR分析靶核酸通常在特殊条件下进行，例如在连续反应中使用不同的引物对。例如，在“嵌套PCR”中，进行第一轮扩增以产生第一扩增子，并且使用引物对进行第二轮扩增，其中所述引物之一或两者与由初始引物对界定的区域内的位点退火，即，第二引物对被认为是“嵌套”在第一引物对内的。这样，来自第一PCR的不含正确内部序列的背景扩增产物在第二反应中不被进一步扩增。减少不希望的影响的其它策略包括在第一次扩增中使用非常低浓度的引物。
通常使用相对标准的PCR试剂混合物进行多个不同特异性靶序列的多重扩增，例如对于Amplitaq DNA聚合酶，使用包含约50m M KCl、1.5至2.5mM MgCl2和约pH 8.5的Tris-HCl缓冲液的混合物。如上所述，如果要进行第二扩增，引物通常以有限的量存在(Andersson，同上)。对于随后的测定，将扩增的DNA稀释或纯化，然后将小等分试样添加至检测测定(例如PCR-瓣测定)，所述检测测定使用不同于标准PCR的缓冲液和盐条件(例如，包含MOPS、Tris-HCl p H 8.0和7.5mM MgCl2，并且几乎没有或没有添加的KCl或其它单价盐的缓冲液，和由于低的单价盐和相对高浓度的Mg++而通常被认为不利于PCR的条件(参见，例如“Guidelines for PCR Optimization with Taq DNA Polymerase”https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-taq-dna-polymerase，其公开了1.5mM至2.0mM的用于Taq DNA聚合酶的最佳Mg++范围，通过以0.5的增量补充镁浓度至4mM来进行优化))。也参见“Multiplex PCR:CriticalParameters and Step-by-Step Protocol”O.Henegariu等人，BioTechniques 23:504-511(1997年9月)。第一扩增与第二扩增(或其它检测试验)之间的反应条件的变化通常通过纯化来自第一扩增反应的DNA或通过使用足够的稀释物(使得遗留到后续反应中的反应组分的量可以忽略不计)来实现的。
本技术的实施方案涉及组合亚硫酸氢盐修饰、多重PCR扩增和用于检测低拷贝数DNA的PCR-瓣测定法检测。在本文提供的技术的实施方案的开发期间，发现使用具有非常低的KCl且包含升高的Mg++(例如，>6mM，优选>7mM，更优选7.5mM)的PCR-瓣测定缓冲液，对于在瓣测定试剂不存在的情况下(例如，在发夹寡核苷酸和FEN-1核酸内切酶不存在的情况下)进行的多重预扩增和以下PCR-瓣测定，均产生显著更好的信号。另外，出乎意料地确定了：在预扩增和随后的PCR-瓣测定反应中使用相同的引物对扩增靶区域均产生了比使用嵌套排列的引物更好的结果。在初始扩增和PCR-瓣检测中使用PCR-瓣测定引物对具有从非常小的靶DNA片段产生信号的有利方面，诸如可在远程DNA样品中预期的那样。例如，在下文的实施例中产生并检测了约50至85个碱基对的扩增子)。
在一些实施方案中，预扩增和PCR-瓣测定之一或两者在反应混合物中包含外源非靶DNA，如例如在2013年9月25日提交的美国专利申请序列第14/036,649号(其通过引用整体并入本文)中所描述的。在某些优选实施方案中，外源非靶标DNA包含鱼DNA。尽管不将本发明限制为任何特定的作用机制，但已观察到发夹寡核苷酸(例如，如在侵入性切割检测测定的一些实施方案中使用的发夹FRET盒)的存在可对存在于相同容器中的DNA聚合酶具有抑制作用，如通过样品和信号扩增所评估的。参见，例如属于Allawi的美国专利公开2006/0147955，其出于所有目的通过引用并入本文。Allawi等观察到，当将PCR和侵入性切割测定组分组合时，发夹FRET寡核苷酸影响聚合酶的性能，并且纯化的外源非靶DNA，特别是基因组DNA的使用改善了此类测定中产生的信号的一致性。因此，在优选实施方案中，在将样品与酶(诸如聚合酶)接触之前和/或与之同时将纯化的外源非靶DNA添加至样品中。当在测定中使用约0.01至1.0U/μL的酶，例如0.05U/μL的酶(例如，聚合酶诸如Taq聚合酶)时，通常将非靶DNA例如以约2至20ng/μl的反应混合物，优选约6至约7ng/μl的反应混合物的浓度添加至样品或反应混合物中。
可将本文所公开的多重预扩增的实施方案与PCR-瓣测定诸如QuARTS测定一起使用。如图1中所示，QuARTS技术将基于聚合酶的靶DNA扩增方法与基于侵入性切割的信号扩增方法组合。以类似于实时PCR的方式监测由QuARTS反应产生的荧光信号。在每个扩增循环期间，在每个测定孔中进行三个连续的化学反应，其中第一和第二反应发生在靶DNA模板上，第三反应发生在用荧光团和猝灭剂染料标记的合成DNA靶上，从而形成荧光共振能量转移(FRET)供体和受体对。第一反应利用聚合酶和寡核苷酸引物产生扩增的靶标，第二反应使用高度结构特异性的5'-瓣核酸内切酶-1(FEN-1)反应从靶特异性寡核苷酸探针释放5′-瓣序列，所述5′-瓣序列与聚合酶反应的产物结合，形成重叠瓣底物。在第三反应中，切割的瓣与专门设计的含有在FRET对中紧密连接(使得荧光淬灭)的荧光团和猝灭剂的寡核苷酸(FRET盒)退火。释放的探针瓣以形成重叠瓣底物的方式杂交，所述重叠瓣底物允许FEN-1酶切割含有荧光团的5'-瓣，从而将其从猝灭剂分子附近释放。释放的荧光团生成待检测的荧光信号。在第二和第三反应期间，FEN-1核酸内切酶可以对每个靶标切割多个探针，每个靶标生成多个切割的5'-瓣，并且每个切割的5'-瓣可参与许多FRET盒的切割，从而整个反应中产生额外的荧光信号扩增。
在一些配置中，每个测定被设计来检测多个基因，例如报告3种不同荧光染料的3个基因。参见，例如Zou等人，(2012)“Quantification of Methylated Markers with aMultiplex Methylation-Specific Technology”,Clinical Chemistry58:2，其出于所有目的通过引用并入本文。
通过下面提供的说明性实施例进一步理解这些实施方案。
实验性实施例
实施例1
从细胞和血浆中分离DNA以及亚硫酸氢盐转化
DNA分离
对于细胞系，使用“RSC ccfDNA Plasma试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)从细胞条件培养基分离基因组DNA。按照试剂盒方案，使用1mL细胞条件培养基(CCM)替代血浆，并根据试剂盒程序进行处理。洗脱体积为100μL，其中70μL用于亚硫酸氢盐转化。
如下进行从4mL血浆样品中分离DNA的示例性程序：
●向4mL血浆样品中添加300μL蛋白酶K(20mg/mL)并混合。
●向血浆-蛋白酶K混合物中添加3μL 1μg/μL的鱼DNA。
●将2mL血浆裂解缓冲液添加至血浆中。
血浆裂解缓冲液是：
-4.3M硫氰酸胍
-10％IGEPAL CA-630(支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)
(与45mL 4.8M硫氰酸胍组合的5.3g IGEPAL CA-630)
●在以500rpm摇动的条件下，将混合物在55℃下温育1小时。
●添加3mL血浆裂解缓冲液并混合。
●添加200μL磁性二氧化硅结合珠粒[16μg的珠粒/μL]并再次混合。
●添加2mL 100％异丙醇并混合。
●在以500rpm摇动的条件下于30℃下温育30分钟。
●将管置于磁铁上，并让珠粒收集。吸出并弃去上清液。
●将750μL盐酸胍-乙醇(GuHCl-EtOH)洗涤溶液添加至含有结合珠粒的容器中并混合。
GuHCl-EtOH洗液为：
-3M GuHCl
-57％EtOH。
●以400rpm摇动1分钟。
●将样品转移到深孔平板或2mL微量离心管中。
●将管置于磁铁上，并让磁性珠粒收集10分钟。吸出并弃去上清液。
●向珠粒中添加1000μL洗涤缓冲液(10mM Tris HCl，80％EtOH)，并在30℃摇动温育3分钟。
●将管置于磁铁上并让珠粒收集。吸出并弃去上清液。
●将500μL洗涤缓冲液添加至珠粒中，并在30℃下摇动温育3分钟。
●将管置于磁铁上并让珠粒收集。吸出并弃去上清液。
●添加250μL洗涤缓冲液并在30℃下摇动温育3分钟。
●将管置于磁铁上并让珠粒收集。吸出并弃去剩余的缓冲液。
●添加250μL洗涤缓冲液并在30℃下摇动温育3分钟。
●将管置于磁铁上并让珠粒收集。吸出并弃去剩余的缓冲液。
●在70℃下干燥珠粒15分钟，并摇动。
●将125μL洗脱缓冲液(10mM Tris HCl，pH8.0,0.1mM EDTA)添加至珠粒中并在65℃下摇动温育25分钟。
●将管置于磁铁上并让磁性珠粒收集10分钟。
●吸出含有DNA的上清液并将其转移至新的容器或管中。
亚硫酸氢盐转化
I.使用亚硫酸氢铵磺化DNA
1.在每个管中，将64μL DNA，7μL 1N NaOH和9μL含有0.2mg/mL BSA和0.25mg/mL鱼DNA的载体溶液合并。
2.在42℃下温育20分钟。
3.添加120μL的45％的亚硫酸氢铵，并在66℃下温育75分钟。
4.在4℃下温育10分钟。
II.使用磁性珠粒脱磺酸基
材料
磁性珠粒(Promega MagneSil Paramagnetic Particles，Promega目录号AS1050,16μg/μL)。
结合缓冲液：6.5-7M盐酸胍。
转化后洗涤缓冲液：含10mM Tris HCl(pH8.0)的80％乙醇。
脱磺酸基缓冲液：70％异丙醇，0.1N NaOH被选择用于脱磺酸基缓冲液。
使用混合或温育样品的任何适当的装置或技术在基本上如下所述的温度和混合速度下混合样品。例如，可将热混合器(Eppendorf)用于混合或温育样品。示例性脱磺酸基如下：
1.通过将瓶涡旋来彻底混合珠粒1分钟。
2.将50μL珠粒等分至2.0mL管(例如，来自USA Scientific)中。
3.将750μL结合缓冲液添加至珠粒中。
4.添加150μL来自步骤I的磺化DNA。
5.混合(例如，在30℃、1000RPM下持续30分钟)。
6.将管置于磁铁支架上并保持原位5分钟。对于支架上管，取出并弃去上清液。
7.添加1,000μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃、1000RPM下持续3分钟)。
8.将管置于磁铁支架上并保持原位5分钟。对于支架上的管，取出并弃去上清液。
9.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃、1000RPM下持续3分钟)。
10.将管置于磁力架上；1分钟后取出并弃去上清液。
11.添加200μL脱磺酸基缓冲液。混合(例如，在30℃、1000RPM下持续5分钟)。
12.将管置于磁力架上；1分钟后取出并弃去上清液。
13.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃、1000RPM下持续3分钟)。
14.将管置于磁力架上；1分钟后取出并弃去上清液。
15.向管中添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃、1000RPM下持续3分钟)。
16.将管置于磁力架上；1分钟后取出并弃去上清液。
17.将所有管打开盖子在30℃下温育15分钟。
18.从磁力架上取下试管，并将70μL洗脱缓冲液直接添加至珠粒中。
19.用洗脱缓冲液温育珠粒(例如，在40℃、1000RPM下持续45分钟)。
20.将管置于磁力架上约一分钟；取出并保存上清液。
然后如下所述，将转化的DNA用于预扩增和/或瓣核酸内切酶测定。
实施例2
多重预扩增-预扩增的循环
使用嵌套方法，通过对每个靶样品使用外引物对进行5个、7个或10个循环来检查PCR循环数的效果。将使用内引物的PCR-瓣测定用于进一步扩增并分析预扩增的产物。
●实验条件：
1.样品来源：如上所述从HCT116细胞系提取的并经亚硫酸氢盐处理的DNA；
2. 50μL预扩增PCR反应。
3.测试的靶区域：NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白(参见图5)
4.用于预扩增PCR和PCR-瓣测定的反应条件：
7.5mM MgCl2，
10mM MOPS，
0.3mM Tris-HCl，pH8.0，
0.8mM KCl，
0.1μg/μl BSA，
0.0001％Tween-20，
0.0001％IGEPAL CA-630，
250μM dNTP)
0.025U/μl的GoTaq聚合酶(Promega Corp.,Madison,WI)
用于亚硫酸氢盐转化的NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白的引物对，如图5A-5F所示，在预扩增和PCR-瓣测定中每种引物均为500nM。
在每个50μL PCR反应物中使用10μL制备的经亚硫酸氢盐处理的靶DNA。预扩增循环如下所示：
PCR后，将10μL扩增反应物在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至100μL，并将10μL稀释的扩增产物用于标准PCR-瓣测定，如下所述的。比较测定直接对经亚硫酸氢盐处理的DNA使用QuARTS PCR-瓣测定而无需预扩增。
典型的QuARTS反应通常包含约400-600nM(例如，500nM)的每种引物和检测探针，约100nM的侵入性寡核苷酸，约600-700nM的每种FAM(例如，由Hologic商业供应的)，HEX(例如，由BioSearch Technologies,IDT商业供应的)和Quasar 670(例如，由BioSearchTechnologies商业供应)FRET盒，6.675ng/μL FEN-1核酸内切酶(例如，2.0,Hologic,Inc.)，30μl反应体积中的1个单位的Taq DNA聚合酶(例如，DNA聚合酶,Promega Corp.,Madison,WI)，10mM 3-(正-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，7.5mM MgCl2和250μM的每种dNTP。
示例性的QuARTS循环条件如下所示：
数据示于图6中，并且显示与未进行预扩增的PCR-瓣测定相比，预扩增的10个循环给出了最一致的甲基化百分比的测定。
实施例3
嵌套引物对比非嵌套引物；PCR缓冲液对比PCR-瓣测定缓冲液
进行测定以将使用嵌套引物排列与在预扩增和PCR-瓣测定步骤中使用相同的PCR瓣测定引物进行比较，并将在预扩增步骤中使用常见PCR缓冲液与使用PCR-瓣测定缓冲液相比较。使用PCR-瓣测定缓冲液。常见PCR缓冲液是1.5mM MgCl2，20mM Tris-HCl，pH 8,50mM KCl，250μM的每种dNTP；并且PCR-瓣测定缓冲液是7.5mM MgCl2，10mM MOPS，0.3mMTris-HCl，pH 8.0,0.8mM KCl，0.1μg/μL BSA，0.0001％Tween-20,0.0001％IGEPAL CA-630,250μM的每种dNTP。还比较了20nM、100nM和500nM的每种引物的引物浓度。
●实验条件：
1.样品来源：从HCT116细胞系提取和经亚硫酸氢盐处理的DNA；
2. 50μL PCR反应物。
3.测试的靶区域：NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白
4.GoTaq聚合酶，0.025U/μL。
5.如上所述的PCR或PCR-瓣测定缓冲液，
6.用于亚硫酸氢盐转化的NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白的引物对，如图5A-5F所示，每种引物均为20nM、100nM和500nM。
预扩增循环如下所示：
在每个50μL PCR反应物中使用10μL制备的经亚硫酸氢盐处理的靶DNA。PCR后，如实施例2中所述，将10μL预扩增反应物在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至100μL，并将10μL稀释的扩增产物用于标准PCR-瓣测定。
数据示于图7中。上图显示了从起始DNA量计算的预期产率，第二个图显示使用指示的引物和缓冲液条件检测的量。这些数据表明，最高nM浓度的引物产生最高的扩增效率。令人惊讶的是，当用于PCR预扩增时，具有相对高的Mg++和低KCl(分别为7.5mM，0.8mM)的PCR-瓣测定缓冲液相较于使用具有较低Mg++和较高KCl浓度(分别为1.5mM和50mM)的常规PCR缓冲液得到更好的结果。此外，在预扩增PCR中使用PCR-瓣测定引物(“内”引物和图5A-5F中所示的)与在嵌套PCR排列中使用成组的外和内引物对一样好或更好。
实施例4
在瓣测定缓冲液中测试预扩增的循环
进行测定以测定增加预扩增PCR循环的数量对无靶对照样品和含有靶DNA的样品中的背景的影响。
实验条件：
1.样品来源：
i)无靶对照＝20ng/μL鱼DNA和/或10mM Tris，0.1mM EDTA；
ii)从正常患者的血浆分离的亚硫酸氢盐转化的DNA
iii)与从HCT116细胞系提取并经亚硫酸氢盐处理的DNA的组合的从正常患者的血浆分离的亚硫酸氢盐转化的DNA
2. 50μL PCR反应物，
3.测试的靶区域：NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白，
4.用于预扩增和PCR-瓣测定的反应条件：
7.5mM MgCl2，
10mM MOPS，
0.3mM Tris-HCl，pH8.0，
0.8mM KCl，
0.1μg/μL BSA，
0.0001％Tween-20，
0.0001％IGEPAL CA-630，
250μM dNTP)
0.025U/μl的GoTaq聚合酶，
用于亚硫酸氢盐转化的NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白的引物对，如图5A-5F所示，每种引物均为500nM。
预扩增循环如下所示：
PCR后，如实施例1中所述，将10μL扩增反应物在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至100μL，并将10μL稀释的扩增产物用于标准PCR-瓣测定。
数据示于图8A-8C中，并且表明在无靶对照反应中没有产生背景，即使在最高的循环数下也是如此。然而，预扩增20或25个循环的样品在PCR-瓣测定中显示信号明显减少。
实施例5
大体积亚硫酸氢盐转化的DNA的多重靶向预扩增
为了从输入样品中预扩增大部分或全部经亚硫酸氢盐处理的DNA，可在单个大体积多重扩增反应中使用大量的经处理的DNA。例如，如上所述，使用例如Maxwell Promega血液试剂盒#AS1400从细胞系(例如，DFCI032细胞系(腺癌)；H1755细胞系(神经内分泌))中提取DNA。例如，如实施例1中所述，将DNA进行亚硫酸氢盐转化。
在反应混合物中进行预扩增，所述混合物含有7.5mM MgCl2，10mM MOPS，0.3mMTris-HCl，pH 8.0,0.8mM KCl，0.1μg/μL BSA，0.0001％Tween-20，0.0001％IGEPAL CA-630，250μM dNTP(例如，等摩尔量的12个引物对/24个引物，或调整单个引物浓度以平衡不同靶区域的扩增效率)，0.025个单位/μL HotStart GoTaq浓度以及按体积计20至50％的经亚硫酸氢盐处理的靶DNA(例如，将10μL靶DNA添加至50μL反应混合物中，或将50μL靶DNA添加至125μL反应混合物中)。选择热循环时间和温度以适合反应和扩增容器的体积。例如，反应可以如下循环
热循环后，将预扩增反应物的等分试样(例如10μL)在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至500μL。将稀释的预扩增DNA的等分试样(例如10μL)用于QuARTS PCR-瓣测定中，例如，如实施例2所述。
实施例6
来自粪便样品的经亚硫酸氢盐转化的DNA的多重靶向预扩增
针对从人类粪便样品分离的DNA测试上述多重预扩增方法。
样本来源：
i)从粪便样品中捕获的(参见，例如美国专利第9,000,146号)和根据以上实施例1进行亚硫酸氢盐处理的4个DNA样品，所述样品具有以下病状：
ii)无靶对照＝20ng/μL本体鱼DNA和/或10mM Tris，0.1mM EDTA；
2. 50μL PCR反应物，
3.测试的靶区域：NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白，
4.用于预扩增和PCR-瓣测定的反应条件：
7.5mM MgCl2，
10mM MOPS，
0.3mM Tris-HCl，pH8.0，
0.8mM KCl，
0.1μg/μL BSA，
0.0001％Tween-20，
0.0001％IGEPAL CA-630，
250μM dNTP)
0.025U/μl的GoTaq聚合酶，
用于亚硫酸氢盐转化的NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白的引物对，如图5A-5F所示，每种引物均为500nM。
预扩增循环如下所示：
PCR后，如实施例2中所述，将10μL扩增反应物在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至100μL，并将10μL稀释的扩增产物用于标准PCR-瓣测定。
数据示于图9中，并且显示在无靶对照反应中未产生背景。对于其中预期靶标志物不被甲基化的样品(正常样品)，未检测到甲基化的标志物的信号，而在来自具有腺瘤或腺癌的受试者的样品中检测到的甲基化百分比与使用标准非多重QuARTS PCR-瓣测定(即无需单独的预扩增步骤)获得的结果一致。
实施例6
来自血浆样品的重亚硫酸盐转化的DNA的多重靶向预扩增
如实施例1中所述，对从人血浆样品中分离并用亚硫酸氢盐处理的DNA测试上述多重预扩增方法。
实验条件：
1.样品来源：
■来自结直肠癌或胃癌患者或正常患者的提取并经亚硫酸氢盐处理的75个血浆样品-各自2mL。
2. 50μL PCR反应物，
3.测试的靶区域：NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白，
4.用于预扩增和PCR-瓣测定的反应条件：
7.5mM MgCl2，
10mM MOPS，
0.3mM Tris-HCl，pH8.0，
0.8mM KCl，
0.1μg/μL BSA，
0.0001％Tween-20，
0.0001％IGEPAL CA-630，
250μM dNTP)
0.025U/μl的GoTaq聚合酶，
用于亚硫酸氢盐转化的NDRG4、BMP3、SFMBT2、VAV3、ZDHHC1和β-肌动蛋白的引物对，如图5A-5F所示，每种引物均为500nM。
预扩增循环如下所示：
PCR后，如实施例2中所述，将10μL扩增反应物在10mM Tris，0.1mM EDTA中稀释至100μL，并将10μL稀释的扩增产物用于标准PCR-瓣测定。
数据示于图10A-10I中。图10A-10C将使用多重预扩增+PCR-瓣测定的结果与来自其中未进行预扩增的相同样品的结果进行比较。图10D-10F显示使用多重预扩增+PCR-瓣测定针对每个样品计算的甲基化百分比，而图10G-10I显示多重预扩增+PCR-瓣测定中相较于来自使用无预扩增步骤的PCR-瓣测定的相同样品的结果的输入链的回收百分比。对于结直肠癌使用3种标志物(VAV3、SFMBT2、ZDHHC1)，这些数据显示在100％特异性下的92％的灵敏度(23/25)。本文公开的技术的实施方案在检测来自血液的DNA方面提供了相较于使用无预扩增的QuARTS PCR瓣测定的250个拷贝至少100倍或更高的灵敏度，例如来自4mL血浆的2.5拷贝。
实施例7
用于血浆DNA的全血-对-结果分析的示例性方案
在本实施例中提供了从血液样品分离DNA以用于例如检测测定的完整方法的实例。还描述了任选的亚硫酸氢盐转化和检测方法。
I.血液处理
将全血收集在抗凝血剂EDTA或Streck无细胞DNA BCT管中。示例性程序如下：
1.将10mL全血吸入真空采血管(抗凝剂EDTA或Streck BCT)中，收集全容积以确保正确的血液对抗凝血剂比例。
2.收集后，通过将血液翻转8至10次以将血液和抗凝血剂混合来轻轻混合血液，并保持在室温下直至离心，这应在采血后4小时内发生。
3.在室温下，以1500g(±100g)在水平转子(具有摆动头)中离心血液样品10分钟。不要使用制动器来停止离心机。
4.在室温下小心吸出上清液(血浆)并在离心管中合并。确保不要破坏细胞层或转移任何细胞。
5.小心地将4mL等份的上清液转移到冷冻管中。
6.密封瓶盖，每等分一次，立即放在冰上。该过程应在离心1小时的离心内完成。
7.确保冷冻管充分贴上相关信息，包括血液中添加剂的详细信息。
8.在转移到-80℃冰箱之前，可将样品在-20℃冷冻最长48小时。
II.合成处理对照DNA的制备
使用标准DNA合成方法诸如亚磷酰胺添加，在指定的位置处添加5-甲基C碱基，合成具有如下所示序列的甲基化斑马鱼DNA的互补链。使合成链退火以产生用作处理对照的双链DNA片段。
A.浓缩斑马鱼(ZF-RASS F1 180聚体)合成处理对照的退火和制备
1.以1μM的浓度在10mM Tris，pH8.0,0.1mM EDTA中重建冻干的单链寡核苷酸。
2.制备500mM NaCl，200mM Tris-HCl pH 8.0和20mM MgCl2的10X退火缓冲液。
3.使合成链退火
在100μL的总体积中，将等摩尔量的每种单链寡核苷酸在1X退火缓冲液中组合，例如，如下表所示：
4.将退火混合物加热至98℃持续11-15分钟。
5.将反应管从热中取出并短暂旋降以将冷凝液收集至管底部。
6.在室温下温育反应管10至25分钟。
7.添加0.9mL鱼DNA稀释剂(20ng/mL本体DNA于Te(10mM Tris-HCl pH8.0,0.1mMEDTA)中)以将斑马鱼RASSF1 DNA片段的浓度调整至1.0x 1010个拷贝/μl的退火、双链合成斑马鱼RASSF1 DNA(于基因组DNA的载体中)。
8.例如，如下表中所述，用10mM Tris，pH 8.0,0.1mM EDTA将处理对照稀释至所需浓度，并于-20℃或-80℃下储存
B.100x原液处理对照(200ng/μL本体鱼类DNA中的12,000个拷贝/μL斑马鱼RASSF1DNA)的制备
1.解冻试剂
2.涡旋并旋降解冻的试剂
3.将以下试剂添加50mL锥形管中
4.等分至标记的0.5mL管中并在-20℃下储存
C.1x处理对照的原液(2ng/μL鱼DNA中的120个拷贝/μL斑马鱼RASSF1 DNA)的制备
1.解冻试剂
2.涡旋并旋降解冻的试剂
3.将以下试剂添加50mL的锥形管中：
4.将0.3mL等分至标记的0.5mL管中，在-20℃下储存
III.从血浆中提取DNA
1.解冻血浆，准备试剂，标记试管，以及清洗并设置生物安全柜以进行提取
2.将300μL蛋白酶K(20mg/mL)添加至每个样品的一个50mL锥形管中。
3.将2-4mL血浆样本添加至每个50mL锥形管(不要涡旋)。
4.漩涡或用移液管混合，并在室温下静置5分钟。
5.添加4-6mL裂解缓冲液1(LB1)溶液以使体积达到约8mL。
LB1配方：
■0.1mL 120个拷贝/μL的斑马鱼RASSF1 DNA处理对照，如上所述的；
■0.9-2.9mL的10mM Tris,pH 8.0,0.1mM EDTA(例如，对于2mL血浆样品使用2.9mL)
■3mL含10％IGEPAL的4.3M硫氰酸胍(来自与45mL 4.8M硫氰酸胍组合的5.3gIGEPAL CA-630的原液)
6.翻转管3次。
7.在室温下将管置于台式振荡器(室温)上在室温下以500rpm运行30分钟。
8.添加200μL二氧化硅结合珠粒[16μg颗粒/μL]并通过涡旋混合。
9.添加7mL裂解缓冲液2(LB2)溶液并通过涡旋混合。
LB2配方：
■4mL与10％IGEPAL混合的4.3M硫氰酸胍
■3mL 100％异丙醇
(裂解缓冲液2可在二氧化硅结合珠粒之前、之后或同时添加)
10.翻转管3次。
11.在室温下将管置于台式振荡器上以500rpm运行30分钟。
12.将管置于捕获抽吸器上并运行程序，将珠粒磁性收集10分钟，然后抽吸。这将收集珠粒10分钟，然后从管中去除所有液体。
13.添加0.9mL洗涤溶液1(3M盐酸胍或硫氰酸胍，56.8％EtOH)以重悬浮结合珠粒并通过涡旋混合。
14.在室温下将管置于台式摇荡器上以400rpm运行2分钟。
(所有后续步骤都可以在STARlet自动化平台上进行。)
15.通过反复吸取混合，然后将含有珠粒转移至96深孔平板。
16.将平板置于磁力架上10分钟。
17.吸取上清液以废弃。
18.添加1mL洗涤溶液2(80％乙醇，10mM Tris pH8.0)。
19.混合3分钟。
20.将管置于磁力架上10分钟。
21.吸取上清液以废弃。
22.添加0.5mL洗涤溶液2。
23.混合3分钟。
24.将管置于磁力架上5分钟。
25.吸取上清液以废弃。
26.添加0.25mL洗涤溶液2。
27.混合3分钟。
28.将管置于磁力架上5分钟。
29.吸取上清液以废弃。
30.添加0.25mL洗涤溶液2。
31.混合3分钟。
32.将管置于磁力架上5分钟。
33.吸取上清液以废弃。
34.将平板置于70℃的加热块上，摇动15分钟。
35.添加125μL洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0,0.1mM EDTA)。
36.在65℃下摇动温育25分钟。
37.将平板置于磁铁上，使珠粒收集并冷却8分钟。
38.将洗脱液转移至96孔平板并在-80℃下贮存。可回收/可转移体积约为100μL。
IV.亚硫酸氢盐处理前的DNA定量
为了使用ACTB基因测量样品中的DNA并评估斑马鱼处理对照回收，可在进一步处理之前测量DNA。使用以下方案利用10μL提取的DNA设置QuARTS PCR-瓣测定：
1.制备含各自2μM的正向和反向引物、5μM的探针和FRET盒以及各自250μM的dNTP的10X寡聚物混合物。(参见下面的引物、探针和FRET序列)
2.如下制备主混合物：
*20X酶混合物含有1个单位/μL的GoTaq热启动聚合酶(Promega)、292ng/μLCleavase 2.0瓣核酸内切酶(Hologic)。
3.用移液管将10μL的每种样品移入96孔平板的孔中。
4.向平板的每个孔添加20μL主混合物。
5.密封平板并以3000rpm离心1分钟。
6.在ABI7500或Light Cycler 480实时热循环仪上以下列反应条件运行平板
V.亚硫酸氢盐转化和DNA纯化
1.将来自从血浆提取DNA的步骤的所有提取的DNA样品解冻并旋降DNA。
2.试剂制备：
3.在深孔平板(DWP)的每个孔中添加5μL 100ng/μL BSA DNA载体溶液。
4.将80μL的每个样品添加至DWP中。
5.将5μL新鲜制备的1.6N NaOH添加至DWP中的每个孔中。
6.使用移液器小心混合，移液器设置为30-40μL以避免气泡。
7.在42℃温育20分钟。
8.每孔添加120μL BIS SLN。
9.在66℃温育75分钟，同时在前3分钟的过程中混合。
10.添加750μL的BND SLN
11.预先混合二氧化硅珠粒(BND BDS)并将50μL二氧化硅珠粒(BND BDS)添加至DWP的孔中。
12.在30℃下加热器摇床上以1,200rpm混合30分钟。
13.将磁性珠粒收集在平板磁铁上5分钟，然后吸取废液。
14.添加1mL洗涤缓冲液(CNV WSH)，然后将平板移至加热器摇床中并以1,200rpm混合3分钟。
15.将珠粒收集在平板磁铁上5分钟，然后吸取溶液以废弃。
16.添加0.25mL洗涤缓冲液(CNV WSH)，然后将平板移至加热器摇床并以1,200rpm混合3分钟。
17.将珠粒收集在平板磁铁上，然后吸取溶液以废弃。
18.添加0.2mL脱磺酸基缓冲液(DES SLN)并在30℃下以1,200rpm混合7分钟。
19.将珠粒收集在磁铁上2分钟，然后吸取溶液以废弃。
20.添加0.25mL洗涤缓冲液(CNV WSH)，然后将平板移至加热器摇床并以1,200rpm混合3分钟。
21.将珠粒收集在磁铁上2分钟，然后吸取溶液以废弃。
22.添加0.25mL洗涤缓冲液(CNV WSH)，然后将平板移至加热器摇床并以1,200rpm混合3分钟。
23.将珠粒收集在磁铁上2分钟，然后吸取溶液以废弃。
24.通过移至加热器摇床并在70℃下温育15分钟，同时以1,200rpm混合，使平板干燥。
25.在DWP中的所有样品中添加80μL洗脱缓冲液(ELU BFR)。
26.在65℃下温育25分钟，同时以1,200rpm混合。
27.手工将洗脱液转移至96孔平板并于-80℃下贮存
28.可回收/可转移体积约为65μL。
VI.用于甲基化DNA检测和定量的QuARTS-X
A.多重PCR(mPCR)设置：
1.制备含有针对每种目标甲基化标志物的正向和反向引物(每种引物终浓度为750nM)的10X引物混合物。如上述实施例中所述，使用10mM Tris-HCl，pH 8,0.1mM EDTA作为稀释剂。
2.制备含有100mM MOPS，pH 7.5,75mM MgCl2，0.08％Tween 20,0.08％IGEPALCA-630,2.5mM dNTP的10X多重PCR缓冲液。
3.如下制备多重PCR主混合物：
4.解冻DNA并将平板旋降。
5.将25μL主混合物添加至96孔平板中。
6.将50μL的每个样品转移到每个孔中。
7.用铝箔密封件来密封平板(不使用条帽)
8.置于加热盖热循环仪中，并使用以下方案继续循环，进行约5至20个循环，优选约10至13个循环：
9.完成热循环后，如下进行1:10的扩增子的稀释：
a.将180μL的10mM Tris-HCl，pH 8,0.1mM EDTA转移至深孔平板的每个孔中。
b.向每个预填充的孔中添加20μL扩增的样品。
c.通过使用新鲜吸头和200μL移液器反复移液，混合稀释的样品(注意不要生成气溶胶)。
d.用塑料密封件密封稀释的平板。
e.将稀释的平板以1000rpm离心1分钟。
f.用新铝箔密封件密封未被稀释的任何剩余的多重PCR产物。置于-80℃下。
B.多重扩增的DNA的QuARTS测定：
1.解冻鱼DNA稀释剂(20ng/μL)并用于稀释测定中所需的质粒校准物(参见，例如美国专利申请序列第15/033,803号，其通过引用并入本文)。使用下表作为稀释指南：
2.使用下表制备针对标志物A、B和C(例如，目标标志物，加上运行对照和内部对照诸如β-肌动蛋白或B3GALT6(参见，例如美国专利申请序列第62/364,082号，其通过引用并入本文))的10X三重QuARTS寡聚物混合物。
例如，以下可用于检测经亚硫酸氢盐处理的β-肌动蛋白、B3GALT6和斑马鱼RASSF1标志物：
3.使用下表制备QuARTS瓣测定主混合物：
*20X酶混合物含有1个单位/μL的GoTaq热启动聚合酶(Promega)、292ng/μLCleavase 2.0瓣核酸内切酶(Hologic)。
4.使用96孔ABI平板，将20μL QuARTS主混合物移液至每个孔中。
5.添加10μL合适的校准物或稀释的mPCR样品。
6.用ABI透明塑料密封件密封平板。
7.使用3000rpm离心平板1分钟。
8.将平板置于经编程运行以下热程序的ABI热循环仪中，然后启动仪器。
实施例8
第一洗涤溶液中的离液盐的比较
在该技术的开发过程中，比较了在第一洗涤溶液中使用不同的离液盐，例如硫氰酸胍对比盐酸胍的效果。
如实施例7中所述，将硫氰酸胍-乙醇或盐酸胍-乙醇作为第一洗涤溶液(即，含有3M盐酸胍或3M盐酸胍的57％乙醇)，从血浆样品中提取DNA。如实施例7中所述另外处理样品，并且一部分DNA进行亚硫酸氢盐转化。如上所述，使用QuARTS PCR瓣测定通过检测处理对照和β-肌动蛋白(ACTB)来测量所得的未转化的DNA的量，并且如上所述，使用多重预扩增和QuARTS PCR-瓣测定法检测处理对照B3GALT6和β-肌动蛋白(BTACT)来测量亚硫酸氢盐转化的DNA。结果示于图11A-11C(处理对照数据未显示)中。这些数据表明，两种溶液均产生可接受的DNA产率，硫氰酸胍-乙醇产生更高的产率。
实施例9
在第一洗涤步骤中将含有硫氰酸胍或盐酸胍的乙醇与含有缓冲液的乙醇进行比较
在该技术的开发过程中，将在实施例7部分III中所述的血浆DNA提取的第一洗涤步骤中使用乙醇(乙醇)与离液盐溶液(例如，硫氰酸胍(GTC)或盐酸胍(GuHCl))的混合物(即，使用含有3M盐酸胍的57％乙醇(实施例7部分III中的洗涤溶液1)或含有2.4M硫氰酸胍的50％乙醇)的效果，与在第一洗涤步骤中使用含有10mM Tris HCl，pH 8.0的80％的乙醇(实施例7部分III中的洗涤溶液2)的效果相比较。如实施例7中所述，将80％乙醇-Tris缓冲溶液用于随后的洗涤步骤。
对每组洗涤条件进行8次重复。如实施例7中所述另外处理样品，并且DNA不用亚硫酸氢盐处理。如上所述，使用QuARTS PCR瓣测定法检测β-肌动蛋白(ACTB)来测量所得DNA的量。结果(检测到的DNA链的平均值)示于下表中。这些数据表明，在第一次洗涤步骤中使用含有硫氰酸胍或盐酸胍的乙醇，随后用乙醇-缓冲液洗涤液进行另外的洗涤，产生比对于所有洗涤步骤使用乙醇-缓冲液洗涤更高的产率。
洗涤条件 平均值 SD CV
乙醇-Tris缓冲液 1099 50.80 4.62
乙醇-GuHCl 1434 76.49 5.33
乙醇-GTC 1416 189.45 13.38
实施例10
一步或两步添加裂解试剂的测试
在该技术的开发过程中，比较了分离程序中一步或两步添加裂解试剂的效果。使用来自6种不同血浆样品的2mL或4mL的等分试样，第一程序包括如实施例1中所述添加7mL4.3M硫氰酸胍裂解试剂和10％含蛋白酶K的IGEPAL以及处理对照，在55℃下温育血浆/蛋白酶/对照对照混合物60分钟，然后添加异丙醇。第二步骤包括添加一等份的3mL的4.3M硫氰酸胍和含蛋白酶的10％IGEPAL以及处理对照，并在55℃下温育后再添加4mL的等分试样以及添加异丙醇。然后将样品在30℃下进一步温育30分钟，然后如实施例1所述进行处理。如上所述将一部分所得DNA进行亚硫酸氢盐转化。
如上所述，使用QuARTS测定法检测处理对照和β-肌动蛋白(ACTB)来测量所得的未转化的DNA的量，并且如上所述，使用多重预扩增和QuARTS PCR-瓣测定法检测处理对照B3GALT6和β-肌动蛋白(BTACT)来测量亚硫酸氢盐转化的DNA。结果示于图12A-12C(处理对照数据未显示)。以下显示每个测试标志物和处理对照(PC)的平均产率的倍数差异：
这些数据表明，分两步添加(第一次在异丙醇不存在的情况下添加，以及第二次与异丙醇一起添加)裂解试剂产生更高的可检测DNA的产率。
上述说明书中提及的所有出版物和专利均出于所有目的通过引用整体并入本文。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述的各种实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当并入的参考文献中的术语定义似乎不同于本教导中提供的定义时，应当以本教导中提供的定义为准。
在不脱离所描述的技术的范围和精神的情况下，所描述的技术的组成、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然已经结合具体的示例性实施方案描述了本技术，但应该理解，所要求保护的技术不应该不适当地限于此类具体实施方案。事实上，对药理学、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施该技术的所描述的模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 精密科学发展有限责任公司
<120> 血浆DNA的多重扩增检测测定以及分离和检测
<130> EXCT-34562/WO-1/ORD
<150> US 62/249,097
<151> 2015-10-30
<160> 101
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 1
aagggctgct ctccggccag cctgggcgcc ggggacagca gccggcgcgg cgtcctacct 60
ggtgaagttc gtcctgccct cggcgtggac ccaggccccg gtcgccgccc gggagggcac 120
cggcctcgct cgcttgctcg ctcgcccgcc cttgcccgct cgctccccgc ccgccgcctc 180
cctcgcgcgc ccgctccggt cctccggctc ccactacagc tcat 224
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 2
tgccctcggc gtggacccag gccccggtcg ccgcccggga gggcaccggc ctcgctcgct 60
tgctcgctcg cccgcccttg cccgctcgct ccccgcccgc cgcctccctc gcgcgcccgc 120
tccggtcctc cg 132
<210> 3
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 4
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ttcggttttt cg 132
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 5
tgttttcggc gtggatttag g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 6
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<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 8
gtcgtcgttc gagagggta 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 9
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<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 10
ccacggacga tcggtttcgt t 21
<210> 11
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 11
cggccggggc gcacggagag cgcgcgggac tcgctgcagc ggcggccggg tcgcggcgca 60
cccgggccgg gaccggagcc gagcctagcg cggcgcccgc gacccgtcag ccgcggctcc 120
tgctccctcg atcccgcgcg gggaaagggc cggcggctgt tggcgtcggc ggggcgcgga 180
ggaacc 186
<210> 12
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 12
gcgcgcggga ctcgctgcag cggcggccgg gtcgcggcgc acccgggccg ggaccggagc 60
cgagcctagc gcggcgcccg cgacccgtca gccgcggctc ctgctccctc gatcccgcgc 120
ggggaaaggg ccggcggctg ttggc 145
<210> 13
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 13
cggtcggggc gtacggagag cgcgcgggat tcgttgtagc ggcggtcggg tcgcggcgta 60
ttcgggtcgg gatcggagtc gagtttagcg cggcgttcgc gattcgttag tcgcggtttt 120
tgttttttcg atttcgcgcg gggaaagggt cggcggttgt tggcgtcggc ggggcgcgga 180
ggaatt 186
<210> 14
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 14
gcgcgcggga ttcgttgtag cggcggtcgg gtcgcggcgt attcgggtcg ggatcggagt 60
cgagtttagc gcggcgttcg cgattcgtta gtcgcggttt ttgttttttc gatttcgcgc 120
ggggaaaggg tcggcggttg ttggc 145
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 15
cgcgggattc gttgtagc 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 16
caaccgccga ccctttc 17
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 17
tcggagtcga gtttagcgcg gcgttcgcga ttcgttagtc gcggtttttg tt 52
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 18
tcggagtcga gtttagcgc 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 19
aacaaaaacc gcgactaacg a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20
ccacggacgc ggcgttcgcg a 21
<210> 21
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 21
ctgggtcagc gcagcaagtg gggctggccg ctatctcgct gcacccggcc gcgtcccggg 60
ctccgtgcgc cctcgcccca gctggtttgg agttcaaccc tcggctccgc cgccggctcc 120
ttgcgccttc ggagtgtccc gcagcgacgc cgggagccga cgcgccgcgc gggtacctag 180
ccatggctgg ggcgagcagg ctgctctt 208
<210> 22
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 22
gggctccgtg cgccctcgcc ccagctggtt tggagttcaa ccctcggctc cgccgccggc 60
tccttgcgcc ttcggagtgt cccgcagcga cgccgggagc cgacgcgccg cgcgggtacc 120
tagccatggc tggggcga 138
<210> 23
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 23
ttgggttagc gtagtaagtg gggttggtcg ttatttcgtt gtattcggtc gcgtttcggg 60
tttcgtgcgt tttcgtttta gttggtttgg agtttaattt tcggtttcgt cgtcggtttt 120
ttgcgttttc ggagtgtttc gtagcgacgt cgggagtcga cgcgtcgcgc gggtatttag 180
ttatggttgg ggcgagtagg ttgttttt 208
<210> 24
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 24
cgggtttcgt gcgttttcgt tttagttggt ttggagttta attttcggtt tcgtcgtcgg 60
ttttttgcgt tttcggagtg tttcgtagcg acgtcgggag tcgacgcgtc gcgcgggtat 120
ttagttatgg ttggggcga 139
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 25
ggtttcgtgc gttttcgttt tagt 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 26
ccaaccataa ctaaataccc gcg 23
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 27
gtttaatttt cggtttcgtc gtcggttttt tgcgttttcg gagtgtttcg tagcg 55
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 28
gtttaatttt cggtttcgtc gtc 23
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
cgctacgaaa cactccga 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
cgccgaggcg gttttttgcg 20
<210> 31
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
cgcagcgcac ccagcacagt ccgcgcggcg gagcgggtga gaagtcggcg ggggcgcgga 60
tcgaccgggg tgtcccccag gctccgcgtc gcggtccccg ctcgccctcc cgcccgccca 120
ccgggcaccc cagccgcgca gaaggcggaa gccacgcgcg agggaccgcg gtccgtccgg 180
gactagcccc aggcccggca ccgccccgcg ggccgagcgc ccac 224
<210> 32
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 32
gaccggggtg tcccccaggc tccgcgtcgc ggtccccgct cgccctcccg cccgcccacc 60
gggcacccca gccgcgcaga aggcggaagc cacgcgcgag ggaccgcggt c 111
<210> 33
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
cgtagcgtat ttagtatagt tcgcgcggcg gagcgggtga gaagtcggcg ggggcgcgga 60
tcgatcgggg tgttttttag gtttcgcgtc gcggttttcg ttcgtttttt cgttcgttta 120
tcgggtattt tagtcgcgta gaaggcggaa gttacgcgcg agggatcgcg gttcgttcgg 180
gattagtttt aggttcggta tcgtttcgcg ggtcgagcgt ttat 224
<210> 34
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 34
gatcggggtg ttttttaggt ttcgcgtcgc ggttttcgtt cgttttttcg ttcgtttatc 60
gggtatttta gtcgcgtaga aggcggaagt tacgcgcgag ggatcgcggt t 111
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 35
ggtgtttttt aggtttcgcg tc 22
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 36
gatccctcgc gcgtaac 17
<210> 37
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 37
cggttttcgt tcgttttttc gttcgtttat cgggtatttt agtcgcgtag aaggcgg 57
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 38
cggttttcgt tcgttttttc g 21
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 39
ccgccttcta cgcgacta 18
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 40
ccacggacgg ttcgtttatc g 21
<210> 41
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 41
ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 60
ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 120
taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aaga 224
<210> 42
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 42
ctctgcaggt tctatttgct ttttcccaga tgagctcttt ttctggtgtt tgtctctctg 60
actaggtgtc taagacagtg ttgtgggtgt aggtactaac actggctcgt gtgacaaggc 120
catgaggctg gtgtaaagcg gccttggagt gtgtattaag taggtg 166
<210> 43
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 43
ttttgatttg agtttttttt ggaattttgt aggttttatt tgtttttttt tagatgagtt 60
ttttttttgg tgtttgtttt tttgattagg tgtttaagat agtgttgtgg gtgtaggtat 120
taatattggt ttgtgtgata aggttatgag gttggtgtaa agtggttttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg tatagtaggt ttgaatagat tttttatttt aaga 224
<210> 44
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 44
ttttgtaggt tttatttgtt tttttttaga tgagtttttt ttttggtgtt tgtttttttg 60
attaggtgtt taagatagtg ttgtgggtgt aggtattaat attggtttgt gtgataaggt 120
tatgaggttg gtgtaaagtg gttttggagt gtgtattaag taggtg 166
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 45
ttgtaggttt tatttgtttt tttttagatg agttt 35
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 46
ctacttaata cacactccaa aaccact 27
<210> 47
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 47
tttgtttttt tgattaggtg tttaagatag tgttgtgggt gtaggtatta atattggttt 60
gtgtgataag gttatgaggt tggtg 85
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 48
tttgtttttt tgattaggtg tttaaga 27
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 49
caccaacctc ataaccttat c 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 50
gacgcggaga tagtgttgtg g 21
<210> 51
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 51
ccgtggacga gattccagtg gcgcagacgc gcctgggcag cgccgctctg gccgccccgc 60
ggggccgggg ccgacagccc acgctggcgc ggcaggcgcg tgcgcccgcc gttttcgtga 120
gcccgagcag cggcgagccc agggcgccgg gcggccggga ggctggtctg gcttagctgg 180
<210> 52
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 52
gggcagcgcc gctctggccg ccccgcgggg ccggggccga cagcccacgc tggcgcggca 60
ggcgcgtgcg cccgccgttt tcgtgagccc gagcagcggc gagcccaggg cgccgggcgg 120
ccgggaggct ggtctggctt agctgg 146
<210> 53
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 53
tcgtggacga gattttagtg gcgtagacgc gtttgggtag cgtcgttttg gtcgtttcgc 60
ggggtcgggg tcgatagttt acgttggcgc ggtaggcgcg tgcgttcgtc gttttcgtga 120
gttcgagtag cggcgagttt agggcgtcgg gcggtcggga ggttggtttg gtttagttgg 180
<210> 54
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 54
gggtagcgtc gttttggtcg tttcgcgggg tcggggtcga tagtttacgt tggcgcggta 60
ggcgcgtgcg ttcgtcgttt tcgtgagttc gagtagcggc gagtttaggg cgtcgggcgg 120
tcgggaggtt ggtttggttt agttgg 146
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 55
agcgtcgttt tggtcgtttc 20
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 56
gacgccctaa actcgcc 17
<210> 57
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 57
gtcggggtcg atagtttacg ttggcgcggt aggcgcgtgc gttcgtcgtt ttcgtgagtt 60
cgagt 65
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 58
gtcggggtcg atagtttacg 20
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 59
actcgaactc acgaaaacg 19
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 60
gacgcggagg acgaacgcac g 21
<210> 61
<211> 2241
<212> DNA
<213> 斑马鱼
<400> 61
tcagcaaatg aagtctgctc tccgttcgct cctcaaagta ggacagatcg cgccggatta 60
agcgttaatc tgagtcttct gcgcatgcgc atgaacgcgc gctacaagcg gacaaggtgc 120
gcgttcgaag aagaaacgaa ccgagccggt ttcgagcagc gacaacgcga atgaagccca 180
cggagtaccg aaaccttgag gaattcatct ttctgccagc ggaggactgt tttcagttta 240
gttttgagcg taatggaaga tgtttgggca cttttgcgca atccctcatg ttatcgcctc 300
acagacacgc gtcgcgcgcg cagattacgc ttaatttgag cggatttgag gaaacagacg 360
cgtttactgt cagtcgaggc tctactgaag actgaaagtg gcttgtttgg gtttaagatt 420
gacccagatg ctactgaaaa ctgtcaatca agaaggaaac tcttgaagca ataaaaacat 480
catctctgtt atatgaagac tgtcagatcc acacagtgat ccatgtttgt ggatatgcaa 540
acacatcaga acgagacgct aaatttatca gcttgctttg gagtaaacag cgttgcttta 600
aaacactcca cagtcataaa tcatctccag ccctaaccat ggtccactga gccatgccgt 660
tcatcctccc acgatcccaa aatggcaaaa tgtgagctca tcgagttgca ggacttgact 720
ccgaatgacc gtattgagct ggcaccccct agtgtccctc cacccaccgt ggtgcccact 780
ctggacaggt ggagcagagg gaaggtggtg cgcatggtgg gcgagcgcgt gcgcctggag 840
gaccccgatt ggctgacgtg taaaccagga cgaggacatg actttcagcc ctgcagccag 900
acacagctga gctggtgtga cctgtgtgga gagttcatct ggggcctgta cagacagagc 960
ctccgctgca cacactgtaa ctacacttgt cactaccgct gtcaaccctt cattcagctg 1020
gactgcagct ccaacaccga cactatctgc gaacaatcaa actacagcga ggacaccatc 1080
gagacagaca ccaatgtgga tgagcagtct gaagtggact ggaggaaaca ggatctgtct 1140
gtcactgaaa tacagcagaa agtgaaggaa tacaatgctc aggtcaacag taacctcttc 1200
atggttctga atcgtgacgg ctcatacact ggcttcatca aggtccagtt taagctggcg 1260
cgacccgtgt ctcttcctcc tccccgcagc gtctcctcct cctccatctc ctcctcttgt 1320
ttaggatggg atggcggctg tcaggagcga acttccttct acctgcccag agacacagtc 1380
aagcacctgc acatcagctc cagcacccgt gccagagagg tcatccaggc cctgctcaac 1440
aagttcactg tggtggacaa tccggctaaa tattccctgt atgagcgcag ccagcgggac 1500
aatcaagtgt acttaaggaa gttagctgat gatgaatgtc cacttttcct gcgtctgtgt 1560
gctggaccca atgagaaagt cctgagttta gtgcttaaag agaatgaaac cggggaagtg 1620
aattgggatg cgttcagttt tcctgaactc cagaacttcc tgcggattct ccagcgggag 1680
gaagaagatc acgtccggca aatcatacgc cgatacactc tggctcgtga taagatgaaa 1740
gaggctatga agaacttcag caagcctggc tgaatgaatc tgtgtttata cctcacaaac 1800
aagagagatc gaggaggaaa caaggcttat tactgtctga gtccaaagag tgtgtgaaag 1860
agcccttcgt cctactgtgg acataatgag ggttgaaagt gaaatgcagt gagcgagaga 1920
agagatgcgt gtgtttgaag catgactgtt gagtgtgact tcacactgga ggaaatgctg 1980
cgctcgtagc cgtagatcca gtggagagat gtcttcctgt ggagaatcta tatatcagtg 2040
cagattacag agtattttca gcaccattta aacttgtcat aggaaattaa acgaggatta 2100
ttttaatatc tgtatcaaaa tgccacctgt tagtgacaca gtaacttgtc atattttgaa 2160
gctcccatgt atatatttgg atgtttgttg tcaattattc tgaaaataga tacaaataaa 2220
ctatttttcc ctttaaaatg a 2241
<210> 62
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 62
atcagaacga gacgctaaat ttatcagctt gctttggagt aaacagcgtt gctttaaaac 60
actccacagt cataaatcat ctccagccct aaccatggtc cactgagcca tgccgttcat 120
cctcccacga tcccaaaatg gcaaaatgtg agctcatcga gttgcaggac ttgactccga 180
atgaccgtat tgagctggca ccccctagtg tccctccacc caccgtggtg cccactctgg 240
acaggtggag cagagggaag gtggtgcgca tggtgggcga gcgcgtgcgc ctggaggacc 300
ccgattggct gacgtgtaaa ccaggacgag gacatgactt tcagccctgc agccagacac 360
agctgagctg gtgtgacctg tgtggagagt tcatctgggg cctgtacaga cagagcctcc 420
<210> 63
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 63
attagaacga gacgttaaat ttattagttt gttttggagt aaatagcgtt gttttaaaat 60
attttatagt tataaattat ttttagtttt aattatggtt tattgagtta tgtcgtttat 120
ttttttacga ttttaaaatg gtaaaatgtg agtttatcga gttgtaggat ttgatttcga 180
atgatcgtat tgagttggta ttttttagtg tttttttatt tatcgtggtg tttattttgg 240
ataggtggag tagagggaag gtggtgcgta tggtgggcga gcgcgtgcgt ttggaggatt 300
tcgattggtt gacgtgtaaa ttaggacgag gatatgattt ttagttttgt agttagatat 360
agttgagttg gtgtgatttg tgtggagagt ttatttgggg tttgtataga tagagttttc 420
<210> 64
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 64
cgcatggtgg gcgag 15
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 65
acacgtcagc caatcggg 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 66
gacgcggagg cgcgtgcgcc 20
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 67
tgcgtatggt gggcgag 17
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 68
cctaatttac acgtcaacca atcgaa 26
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 69
gacgcggagg cgcgtgcgtt t 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 70
ccacggacgg cgcgtgcgtt t 21
<210> 71
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 71
tccacgtggt gcccactctg gacaggtgga gcagagggaa ggtggtggca tggtggggag 60
ggtggcctgg aggacccgat tggctgagtg taaaccagga gaggacatga ctttcagccc 120
tgcagccaga cacagctgag ctggtgtgac ctgtgtggag agttcatctg g 171
<210> 72
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 72
ccagatgaac tctccacaca ggtcacacca gctcagctgt gtctggctgc agggctgaaa 60
gtcatgtcct gtcctggttt acagtcagcc aatggggtcc tccagggcag gctgcccacc 120
atggcaccac cttccctctg ctccacctgt ccagagtggg caccaggtgg a 171
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 73
ggtttatttt ggttttttga gttttcgg 28
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 74
tccaacctac tatatttacg cgaa 24
<210> 75
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 75
000
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 76
cgccgagggc ggatttaggg 20
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 77
gtgtttgttt ttttgattag gtgtttaaga 30
<210> 78
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 78
ctttacacca acctcataac cttatc 26
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 79
gacgcggaga tagtgttgtg g 21
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 80
agccggtttt ccggctgaga cctcggcg 28
<210> 81
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 81
agccggtttt ccggctgaga cgtccgtgg 29
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 82
agccggtttt ccggctgaga ctccgcgtc 29
<210> 83
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 83
tgccctcggc gtggacccag gccccggtcg ccgcccggga gggcaccggc ctcgctcgct 60
tgctcgctcg cccgcccttg cccgctcgct ccccgcccgc cgcctccctc gcgcgcccgc 120
tccggtcctc cg 132
<210> 84
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 84
tgttttcggc gtggatttag gtttcggtcg tcgttcggga gggtatcggt ttcgttcgtt 60
tgttcgttcg ttcgtttttg ttcgttcgtt tttcgttcgt cgtttttttc gcgcgttcgt 120
ttcggttttt cg 132
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 85
atcggtttcg tt 12
<210> 86
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 86
gtcgtcgttc gggagggtat cggtttcgtt cgtttgttcg ttcgttcgtt tttgttcg 58
<210> 87
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 87
gcgcgcggga ctcgctgcag cggcggccgg gtcgcggcgc acccgggccg ggaccggagc 60
cgagcctagc gcggcgcccg cgacccgtca gccgcggctc ctgctccctc gatcccgcgc 120
ggggaaaggg ccggcggctg ttggc 145
<210> 88
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 88
gcgcgcggga ttcgttgtag cggcggtcgg gtcgcggcgt attcgggtcg ggatcggagt 60
cgagtttagc gcggcgttcg cgattcgtta gtcgcggttt ttgttttttc gatttcgcgc 120
ggggaaaggg tcggcggttg ttggc 145
<210> 89
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 89
cggcgttcgc ga 12
<210> 90
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 90
cgggctccgt gcgccctcgc cccagctggt ttggagttca accctcggct ccgccgccgg 60
ctccttgcgc cttcggagtg tcccgcagcg acgccgggag ccgacgcgcc gcgcgggtac 120
ctagccatgg ctggggcga 139
<210> 91
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 91
cgggtttcgt gcgttttcgt tttagttggt ttggagttta attttcggtt tcgtcgtcgg 60
ttttttgcgt tttcggagtg tttcgtagcg acgtcgggag tcgacgcgtc gcgcgggtat 120
ttagttatgg ttggggcga 139
<210> 92
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 92
cggttttttg cg 12
<210> 93
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 93
gaccggggtg tcccccaggc tccgcgtcgc ggtccccgct cgccctcccg cccgcccacc 60
gggcacccca gccgcgcaga aggcggaagc cacgcgcgag ggaccgcggt c 111
<210> 94
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 94
gatcggggtg ttttttaggt ttcgcgtcgc ggttttcgtt cgttttttcg ttcgtttatc 60
gggtatttta gtcgcgtaga aggcggaagt tacgcgcgag ggatcgcggt t 111
<210> 95
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 95
gttcgtttat cg 12
<210> 96
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 96
ctctgcaggt tctatttgct ttttcccaga tgagctcttt ttctggtgtt tgtctctctg 60
actaggtgtc taagacagtg ttgtgggtgt aggtactaac actggctcgt gtgacaaggc 120
catgaggctg gtgtaaagcg gccttggagt gtgtattaag taggtg 166
<210> 97
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 97
ttttgtaggt tttatttgtt tttttttaga tgagtttttt ttttggtgtt tgtttttttg 60
attaggtgtt taagatagtg ttgtgggtgt aggtattaat attggtttgt gtgataaggt 120
tatgaggttg gtgtaaagtg gttttggagt gtgtattaag taggtg 166
<210> 98
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 98
atagtgttgt gg 12
<210> 99
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 99
gggcagcgcc gctctggccg ccccgcgggg ccggggccga cagcccacgc tggcgcggca 60
ggcgcgtgcg cccgccgttt tcgtgagccc gagcagcggc gagcccaggg cgccgggcgg 120
ccgggaggct ggtctggctt agctgg 146
<210> 100
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 100
gggtagcgtc gttttggtcg tttcgcgggg tcggggtcga tagtttacgt tggcgcggta 60
ggcgcgtgcg ttcgtcgttt tcgtgagttc gagtagcggc gagtttaggg cgtcgggcgg 120
tcgggaggtt ggtttggttt agttg 145
<210> 101
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 101
gacgaacgca cg 12

Claims (68)

1.一种分析多个靶核酸的样品的方法，所述方法包括：
a)提供具有体积x的样品，所述样品包含疑似含有多个n个不同靶区域中的一个或多个的经亚硫酸氢盐处理的DNA，其中至少一个所述靶区域是低拷贝靶标，如果存在于所述样品中，其以这样的拷贝数存在于所述样品中，使得：
i)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积，所述n个部分中的一个或多个不存在所述低拷贝靶标，或
ii)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积，所述n个部分中的一个或多个中的所述低拷贝靶标低于用于所述低拷贝靶标的检测测定的灵敏度水平；
b)在其中在所述n个不同靶区域存在于所述样品中时，扩增所述靶区域以形成具有体积y的预扩增的混合物的条件下，将所述样品的所述体积x处理至扩增反应；
c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中，其中每个检测测定反应混合物包含一部分所述预扩增的混合物，所述预扩增的混合物具有y/n或更小的体积，并且其中所述低拷贝靶标，如果在步骤a)中存在于所述样品中，则存在于每个所述检测测定反应混合物中；
d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定，其中所述不同的靶区域，如果在步骤a)中存在于所述样品中，则在所述检测测定反应混合物中被检测到。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA来自人受试者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中从体液制备所述样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述体液包括血浆。
5.根据权利要求4所述的方法，其中由从血浆分离的无细胞DNA制备所述样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述无细胞DNA的长度小于200个碱基对。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述无细胞DNA通过方法从所述血浆分离而来，所述方法包括：
a)将所述血浆样品与以下试剂组合：
ⅰ)蛋白酶；和
ii)第一裂解试剂，所述第一裂解试剂包含
-硫氰酸胍；和
-非离子型去污剂；
以形成其中蛋白质被所述蛋白酶消化的混合物；
b)在其中DNA与所述二氧化硅颗粒结合的条件下向步骤a)的混合物中添加
iii)二氧化硅颗粒，和
iv)第二裂解试剂，所述第二裂解试剂包含：
-硫氰酸胍；
-非离子型去污剂；和
-异丙醇；
c)从b)的混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；
d)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第一种洗涤溶液，所述第一种洗涤溶液包含：i)盐酸胍或硫氰酸胍，和ii)乙醇；
e)从所述第一洗涤溶液分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；
f)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第二洗涤溶液，所述第二洗涤溶液包含缓冲剂和乙醇；
g)从所述第二洗涤溶液中分离洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；和
h)从所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒洗脱DNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K蛋白酶。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中从至少1mL，优选至少5mL，更优选至少10mL体液制备所述样品，和/或其中所述样品的体积x为至少10μl，优选至少25μl，更优选至少50μl，更优选至少100μl，并且其中步骤b的扩增反应中的所述样品的体积为至少20至50％的扩增反应的总体积。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中n为至少3，优选至少5，更优选至少10，更优选至少20。
11.一种使用PCR预扩增和PCR-瓣测定分析样品中的多个靶核酸的方法，所述方法包括：
a)在包含PCR扩增试剂的第一反应混合物中提供包含多个不同靶区域的经亚硫酸氢盐处理的DNA，其中所述PCR扩增试剂包含：
i)多个不同的引物对，其用于在所述靶区域存在于所述样品中时，从所述经亚硫酸氢盐处理的DNA中扩增所述多个不同的靶区域；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；和
iv)包含Mg++的缓冲液
b)将所述第一反应混合物暴露于热循环条件，其中多个不同的靶区域，如果存在于样品中，被扩增以产生预扩增的混合物，并且其中所述热循环条件限于将扩增保持在指数范围内的多个热循环，优选少于20个，更优选少于15个，更优选10个或更少的热循环；
c)将所述预扩增的混合物分配到多个PCR-瓣测定反应混合物中，其中每个PCR-瓣测定反应混合物包含：
i)额外量的选自步骤a)i)的所述多个不同引物对的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；
iv)所述包含Mg++的所述缓冲液
v)瓣核酸内切酶；
vi)瓣寡核苷酸，和
vi)包含与所述瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的发夹寡核苷酸；
和
d)检测PCR-瓣测定反应期间来自所述经亚硫酸氢盐处理的DNA的一个或多个不同靶区域的扩增。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在所述分配之前用稀释剂稀释所述预扩增的混合物。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中将添加至所述PCR-瓣测定反应混合物中的额外量的引物对中的所述引物添加至一定浓度，使得所述PCR-瓣测定中所添加的引物的浓度基本上与所述PCR扩增试剂中的该引物对的引物浓度相同。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述发夹寡核苷酸包含荧光团部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述发夹寡核苷酸是FRET盒寡核苷酸。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述包含Mg++的缓冲液包含约6至10mM Mg++。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述包含Mg++的缓冲液包含约7.5mM Mg++。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述包含Mg++的缓冲液含有小于1mM的KCl。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中所述包含Mg++的缓冲液包含10mM3-(正-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液和7.5mM MgCl2。
20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物和/或所述多个PCR-瓣测定反应混合物包含外源非靶DNA。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述外源非靶DNA是本体鱼DNA。
22.根据权利要求11-21中任一项所述的方法，其中所述热稳定性DNA聚合酶来自水生栖热菌。
23.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述热稳定性DNA聚合酶被修饰用于热启动PCR。
24.根据权利要求11-23中任一项所述的方法，其中所述瓣核酸内切酶是FEN-1核酸内切酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述FEN-1核酸内切酶来自古细菌生物体。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA包含人DNA。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述多个不同靶区域包含选自由SFMBT2、VAV3、BMP3和NDRG4组成的组的靶区域。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述多个不同靶区域包括参考靶区域。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述参考靶区域包含β-肌动蛋白和/或ZDHHC1和/或B3GALT6。
30.根据权利要求11-29中任一项所述的方法，其中选择所述多个不同引物对中的至少一个以从长度小于约100个碱基对的靶区域产生扩增子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中选择所述多个不同引物对中的每一个以从长度小于约100个碱基，优选长度小于约85个碱基对的靶区域产生扩增子。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在所述预扩增的混合物中或所述第一反应混合物中包含经亚硫酸氢盐处理的DNA的样品的体积为20-50％的所述预扩增的混合物或所述第一反应混合物的总体积。
33.一种处理血浆样品的方法，所述方法包括：
a)将血浆样品与以下试剂组合：
ⅰ)蛋白酶；
ii)第一裂解试剂，所述第一裂解试剂包含
-硫氰酸胍，
-非离子型去污剂；
以形成其中蛋白质被所述蛋白酶消化的混合物；
b)在其中DNA与所述二氧化硅颗粒结合的条件下向步骤a)的混合物中添加
iii)二氧化硅颗粒，和
iv)第二裂解试剂，所述第二裂解试剂包含：
-硫氰酸胍；
-非离子型去污剂；和
-异丙醇；
c)从b)的混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；
d)向具有结合DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加第一种洗涤溶液，所述第一种洗涤溶液包含：i)盐酸胍或硫氰酸胍，和ii)乙醇；
e)从所述第一洗涤溶液分离所述具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；
f)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加第二洗涤溶液，所述第二洗涤溶液包含缓冲剂和乙醇；
g)从所述第二洗涤溶液中分离所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒；和
h)从所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒洗脱DNA以产生分离的DNA样品。
34.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤h)之前重复步骤f)-g)1至3次。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述第一裂解试剂和所述第二裂解试剂中的所述非离子型去污剂相同或不同，并且选自由以下组成的组：聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Nonidet P-40)和支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(IGEPAL CA-630)。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K蛋白酶。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤g)之后且在步骤h)之前干燥所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒的步骤。
38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中步骤a)的混合物还包含DNA处理对照。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述DNA处理对照包含斑马鱼RASSF1序列。
40.根据权利要求8或39所述的方法，其中所述DNA处理对照是合成DNA。
41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，其中步骤a)的所述混合物还包含本体鱼DNA。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所述二氧化硅颗粒是磁性颗粒。
43.根据权利要求33-42中任一项所述的方法，其中所述血浆样品具有至少2mL的体积。
44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述第一裂解试剂包含约4.3M硫氰酸胍和10％w/v IGEPAL CA-630。
45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中所述第二裂解试剂包含4.3M硫氰酸胍和10％w:v的与异丙醇组合的IGEPAL CA-630。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤溶液包含i)约3M盐酸胍或3M硫氰酸胍，和ii)约57％的乙醇。
47.根据权利要求33-46中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤溶液包含约80％的乙醇和约20％的10mM Tris pH 8.0缓冲液。
48.根据权利要求33-47中任一项所述的方法，其中所述洗脱包括在包含10mM Tris-HCl，pH 8.0,0.1mM EDTA的洗脱缓冲液中洗脱所述DNA。
49.根据权利要求33-48中任一项所述的方法，其中所述蛋白质被所述蛋白酶消化时所处的所述条件包括在室温下温育所述混合物30至60分钟。
50.根据权利要求33-49中任一项所述的方法，其中在室温下进行步骤a)-g)。
51.根据权利要求33-50中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述分离的DNA样品的多个靶核酸，所述方法包括：
a)用亚硫酸氢盐处理所述分离的DNA样品以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA样品；
b)在其中在所述靶区域存在于所述样品中时，至少五个不同的所述靶区域被扩增以形成预扩增的混合物的条件下，将所述经亚硫酸氢盐处理的DNA样品处理至扩增反应；
c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中；和
d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定，其中所述至少五个不同的靶区域，如果在步骤a)中存在于所述样品中，则在所述多个不同的检测测定反应混合物中的一个或多个中被检测到。
52.一种用于从血浆中分离DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含硫氰酸胍和非离子型去污剂或用于制备所述第一裂解试剂的组分的第一裂解试剂；
b)包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和异丙醇或用于制备所述第二裂解试剂的组分的第二裂解试剂；
c)包含i)盐酸胍或硫氰酸胍和ii)乙醇或用于制备所述第一洗涤溶液的组分的第一洗涤溶液；
d)包含Tris缓冲液和乙醇或用于制备所述第二洗涤溶液的组分的第二洗涤溶液；和
e)二氧化硅颗粒。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述第一裂解试剂和所述第二裂解试剂中的所述非离子型去污剂相同或不同，并且选自由以下组成的组：聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Nonidet P-40)和支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(IGEPAL CA-630)。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的试剂盒，其中所述二氧化硅颗粒是磁性颗粒。
55.根据权利要求54所述的试剂盒，所述试剂盒还包括磁铁。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括的洗脱缓冲液或用于制备所述洗脱缓冲液的组分。
57.根据权利要求52-55中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含DNA处理对照，优选合成DNA处理对照。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述DNA处理对照包含斑马鱼RASSF1序列。
59.根据权利要求52-58中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含本体鱼DNA的制备物。
60.根据权利要求57或58所述的试剂盒，其中所述DNA处理对照存在于本体鱼DNA的制备物中。
61.一种用于处理血浆样品的系统，所述系统包括：
a)包含硫氰酸胍和非离子型去污剂或用于制备所述第一裂解试剂的组分的第一裂解试剂；
b)包含硫氰酸胍、非离子型去污剂和异丙醇或用于制备所述第二裂解试剂的组分的第二裂解试剂；
c)包含i)盐酸胍或硫氰酸胍和ii)乙醇或用于制备所述第一洗涤溶液的组分的第一洗涤溶液；
d)包含Tris缓冲液和乙醇或用于制备所述第二洗涤溶液的组分的第二洗涤溶液；和
e)二氧化硅颗粒。
62.根据权利要求61所述的系统，其中所述第一裂解试剂和所述第二裂解试剂中的所述非离子型去污剂相同或不同，并且选自由以下组成的组：聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Nonidet P-40)和支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(IGEPAL CA-630)。
63.根据权利要求61或62所述的系统，所述系统还包括以下中的一种或多种：
i)蛋白酶；
ii)洗脱缓冲液或用于制备所述洗脱缓冲液的组分；
iii)DNA处理对照；
iv)本体鱼DNA的制备物；
v)用于处理DNA以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA的试剂；
vi)用于处理血浆的容器；和/或
vii)磁铁。
64.根据权利要求63所述的系统，其中所述DNA处理对照是包含斑马鱼RASSF1序列的合成DNA。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的系统，其中所述DNA处理对照存在于包含本体鱼DNA的溶液中。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的系统，所述系统还包括用于用亚硫酸氢盐处理DNA以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA的试剂。
67.根据权利要求61-66中任一项所述的系统，所述系统还包括PCR扩增试剂。
68.根据权利要求61-66中任一项所述的系统，所述系统还包括PCR扩增试剂和/或PCR瓣测定试剂，其中所述PCR扩增试剂包含：
i)用于在所述靶区域存在于所述血浆中时，扩增多个不同的所述靶区域的多个不同的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；和
iv)包含Mg++的缓冲液；
并且其中所述PCR瓣测定试剂包含：
i)用于在靶区域存在于所述血浆中时，扩增多个不同的所述靶区域的多个不同的引物对；
ii)热稳定性DNA聚合酶；
iii)dNTP；
iv)包含Mg++的缓冲液
v)瓣核酸内切酶；
vi)瓣寡核苷酸，和
vi)包含与所述瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的发夹寡核苷酸。
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