CN114292904A - 一种优化ctDNA检测准确率的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及肿瘤DNA检测领域，具体公开了一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：S1、血液样本处理：将血液样本在采血2h内进行以下操作：将血液样本离心，取上层血浆；S2、ctDNA的抽离：向血浆中加入裂解液、蛋白质酶解剂和二氧化硅，混匀，离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，水浴，取出，在室温下，离心，取上清液作为ctDNA样本，保存；S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本回温至1‑10℃，超声；S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，杂交反应，检测荧光强度。本申请的ctDNA的检测方法具有血浆提取率高，提取时间短，蛋白质水解度大，准确率、灵敏度高。

Description

一种优化ctDNA检测准确率的方法

技术领域

本申请涉及肿瘤DNA检测领域，更具体地说，它涉及一种优化ctDNA检测准确率的方法。

背景技术

ctDNA即循环肿瘤DNA，是指由肿瘤细胞坏死、凋亡或者正常分泌到血液中的DNA片段，其携带了癌症相关的基因变异信息，是一种新型的肿瘤生物标志物。

目前，ctDNA的检测方法主要有无酶PCR反应、DNA测序、基因芯片和酶辅助的PCR扩增，但目前这些方法仍存在一些不足，例如无酶PCR技术易被化学物质影响而产生假阴性或假阳性，而DNA测序法所用仪器设备较为昂贵，且检测时间长，基因芯片的检测成本昂贵，检测灵敏度低，重复性差，酶辅助的PCR扩增法会导致假阳性和非特异性信号，且价格昂贵。

因ctDNA仅占cfDNAde 0.1-5％，呈高度碎片状，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大，因此需要一种超敏感的方法检测在cfDNA中含量较低的ctDNA的含量。

发明内容

为了提高ctDNA检测的准确率和灵敏度，本申请提供一种优化ctDNA检测准确率的方法。

第一方面，本申请提供一种优化ctDNA检测准确率的方法，采用如下的技术方案：一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：

S1、血液样本处理：将血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在1-4℃下，16000-20000g离心，取上层血浆；

S2、ctDNA的抽离：将上清液经裂解液处理后，加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，酶解后，在1-4℃下，2000-2500g离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，于50-56℃下敞口水浴15-20min，取出，在室温下，1800-2000g离心3-6min，取上清液作为ctDNA样本，在-(20～80)℃下保存；

S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以10-20℃/h的升温速率回温至1-10℃，然后每2-3h在1-10℃下超声1次，超声时间为5-10min；

S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在2-8℃下杂交反应，检测荧光强度。

通过采用上述技术方案，因ctDNA浓度低且高度碎片化，所以富集和分离就显得尤为重要，本申请中将血液样本经过先低速再高速的两次离心，以足够的离心力将血液分离出不含细胞成分的上层清液，然后进行游离DNA的抽离，上层清液在裂解液的作用下，可溶性蛋白从上层清液中抽离，然后在蛋白质酶解剂的作用下使蛋白质水解，二氧化硅能使上层清液总血浆纯化，从而最大限度的去除蛋白、色素、脂类等，增大ctDNA的纯度，然后在低温下储存，保持其稳定性。

因为ctDNA的不稳定性，在进行提取时，为保证准确性，需要在同一天进行同一批样本的提取，但即使在同一天，不同时间内由于ctDNA的降解，也会存在检测结果差异较大的情况，因此将低温存储的血液样本在需要对其进行检测时，将血浆样本取出后以缓慢的升温速度，升温至1-10℃，在1-10℃下进行超声，使血浆充分分散，防止有沉淀，并提高ctDNA的待检测稳定性，从而提高检测准确率和灵敏度。因电化学DNA传感器具有高灵敏度、高特异性和低成本等优点，能将DNA识别探针固定在电极上，通过特异性杂交捕获靶标DNA分子，随后将传感器信号转化成电化学信号，进一步改善检测的准确率。

优选的，所述步骤S1中，向抗凝管的内壁上均匀喷涂防粘剂，然后置于60-80℃下干燥，防粘剂包括以下重量份得到组分：3-5份透明质酸钠、2-2.5份烷基磷酸酯二乙醇胺盐、1-1.5份肝素化壳聚糖、0.2-0.5份漂洗蒙脱石粉、10-15份乙醇。

因血液对抗凝管的吸附力较强，容易粘附在抗凝管内壁，且抗凝管为塑料材质，在运输或拿取过程中，会产生静电，造成血液吸附在抗凝管内壁，离心时不能完全使血液从抗凝管内壁剥离，影响细胞分离效果，从而使血浆收率较低。通过采用上述技术方案，在抗凝管的内壁上喷涂防粘剂，透明质酸钠能在抗凝管内壁形成光滑面，防止血液挂壁，烷基磷酸酯二乙醇胺盐能防止抗凝管产生静电，而在漂洗蒙脱石粉的作用下，肝素华壳聚糖能与血小板膜上受体结合释放出收缩酶，促使血液凝块中纤维蛋白网状结构收缩，血块快速离开管壁而收缩析出血清，获得血浆，不仅能防止血液挂壁，还能快速获得血浆，缩短血清和血浆的分离时间。

优选的，所述肝素化壳聚糖的制备方法如下：

以重量份计，将0.4-0.8份肝素钠溶解于1-2份pH值为4.5-4.7的枸橼酸钠缓冲液中，加入0.4-0.8份1-乙基-3(3-二甲基丙胺)，搅拌均匀后，在2-6℃下放置3-5h，将肝素钠溶液加入到1-2份浓度为3-4％的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入3-6份经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥。

通过采用上述技术方案，首先使用枸橼酸钠缓冲液和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)对肝素钠分子上的羧基进行活化，经活化的肝素钠分子上的羧基能与壳聚糖分子链上的氨基形成键合，具有羟基的纳米氧化镧粒子与异氰酸酯硅烷偶联剂反应，即纳米氧化镧粒子表面的羟基与异氰酸酯硅烷偶联剂上的一个-NCO基团发生反应，而异氰酸酯硅烷偶联剂上的另一个-NCO基团能与壳聚糖上的羟基反应，使纳米氧化镧粒子接枝到壳聚糖上，从而提高肝素化壳聚糖的抗凝血作用，延长抗凝血时间，使血液样本在提取后未能及时进行离心处理时，也不会凝结，降低时间因素对血浆提取率的影响，从而提高血浆提取率。

优选的，所述防粘剂的喷涂量为0.4-0.8mL。

通过采用上述技术方案，控制防粘剂的喷涂量，使防粘剂均匀粘附在抗凝管内，不在抗凝管内积存，降低防粘剂对血浆提取率的影响。

优选的，所述步骤S1中，向喷涂了防粘剂的抗凝管中加入分离胶，分离胶由聚硅氧烷、聚丁二烯和二氧化硅在60-80℃下反应3-8h，聚硅氧烷、聚丁二烯和二氧化硅的质量比为1:0.5-1:0.1-0.3。

通过采用上述技术方案，分离胶与抗凝管具有较好的亲和性，能起到隔离作用，在离心机上分离胶能将血液中的液体成分血清和固体成分血浆彻底分开，并聚集在试管中形成屏障，离心后血清中不产生油滴，不会堵塞仪器，提高血浆的提取率。

优选的，所述步骤S4中生物传感器的制备方法如下：

(1)将0.2-0.5重量份壳聚糖溶解于1-2重量份浓度为1-3％的醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将0.1-0.3重量份羧基化石墨烯分散到1-1.5重量份蒸馏水中，形成石墨烯悬浮液；

(2)将步骤(1)制成的石墨烯悬浮液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀后，制成处理液，滴涂在经过预处理的玻碳电极的表面，室温干燥，得到预处理玻碳电极；

(3)将预处理玻碳电极置于0.5-1重量份包括0.2-0.4重量份硫酸铜和0.1-0.3重量份氯铂酸钾的硫酸溶液，在0.25-0.4V的电压下，以50mV/s的电流循环扫描30圈，取出预处理玻碳电极，用蒸馏水洗涤，制得生物传感器。

使用石墨烯作为传感器，由于纳米石墨烯容易聚沉，所以并不能达到预期的效果，通过采用上述技术方案，将采用羧基化石墨烯与壳聚糖结合，因为羧基化石墨烯边缘含有活性基团羧基，能与壳聚糖上的氨基反应，室温下，在玻碳电极上固化形成载体膜，然后在载体膜上通过电沉积，修饰得到负载氧化铜纳米线和铂的生物传感器；该生物传感器既具有石墨烯的导电性、化学稳定性，又兼具壳聚糖的生物亲和性，灵敏度高，稳定性好；且使用循环伏安法沉积铂和铜纳米线，能易于控制所沉积的铂和氧化铜纳米线的载量，并使铂纳米粒和氧化铜纳米线具有更好的分散性，并提高其在载体膜上的负载牢固，氧化铜纳米线负载在载体膜上，具有海绵状的多孔结构，这种多孔结构有利于铂纳米颗粒的填充，从而获得一种氧化铜纳米线镶嵌铂纳米颗粒的结构，既可以和溶液充分接触，又可以和电极保持充分的电接触，而且金属纳米粒子得到纳米纤维的保护，减少了污染而保持高度的电催化活性，氧化铜纳米线和纳米铂能促进电子的传递速率，提高生物传感器的电化学活性。

优选的，所述步骤S2中，蛋白质酶解剂包括以下重量份的组分：0.3-0.6份胰蛋白酶、0.1-0.3份N-糖酰胺酶、1-2份尿囊素、0.5-1份吡咯烷酮羧酸钠和1-2份阴离子表面活性剂。

蛋白质中含有的许多疏水性蛋白质难以水解，内切蛋白酶无法接近这些蛋白质的裂解位点，导致蛋白质水解时间长，速度慢，通过采用上述技术方案，使用尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠降低疏水蛋白质的疏水性，降低疏水蛋白质表面的表面能，增强其亲水效果，更利于胰蛋白酶和N-糖酰胺酶接近蛋白质的裂解位点，然后在阴离子表面活性剂的吸附作用下，胰蛋白酶和N-糖酰胺酶与蛋白质的结合牢度增大，胰蛋白酶和N-糖酰胺酶产生肽的速度加快，提高疏水性蛋白质和肽的溶解度，有助于溶解和展开蛋白质，使蛋白质更容易裂解，缩短蛋白质水解时间，提高酶解率。

优选的，所述阴离子表面活性剂为质量比为1:0.2-0.5:0.05-0.1的十二烷基硫酸钠、2-巯基乙醇和聚氧化乙烯。

通过采用上述技术方案，十二烷基硫酸钠中含有大量的负电荷，且能够使蛋白质变性，特别是在2-巯基乙醇的作用下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与十二烷基硫酸钠完全结合，形成带有负电荷的蛋白质-十二烷基硫酸钠复合物，使蛋白质更易分解；而聚氧化乙烯和十二烷基硫酸钠之间具有疏水相互作用，能形成粘度较强的胶束，而2-巯基乙醇的碳链疏水程度不足，无法增溶到胶束中，对十二烷基硫酸钠和聚氧化乙烯的粘度不会产生较大影响，因此不会影响十二烷基硫酸钠和聚氧化乙烯对胰蛋白酶和N-糖酰胺酶的粘性，以及对蛋白质的吸附力。

优选的，所述蛋白质酶解剂的使用方法为：向裂解后的上清液中加入尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠，在室温下超声10-20min后，加入胰蛋白酶、N-糖酰胺酶和阴离子表面活性剂，超声至蛋白质水解完全。

通过采用上述技术方案，将裂解后的上清液先加入尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠，改善蛋白质的亲水性，增加疏水蛋白质与胰蛋白酶和N-糖酰胺酶的亲和力，再利用阴离子表面活性剂增强胰蛋白酶和N-糖酰胺酶与蛋白质之间的作用力，使蛋白质快速水解。

优选的，所述PCR扩增反应体系包括体积比为1:1-10的水相和油相，油相包括以下重量份的组分：1-2份端羟基硅油、0.1-0.5份聚异丁烯、0.05-0.1份聚乙烯醇、0.2-0.6份二丁基二硫代氨基甲酸镍。

通过采用上述技术方案，一般以矿物油作为油相的体成分，但运动粘度较高，液滴形成和沉降速度偏低，通过采用上述技术方案，使用粘度较低的端羟基硅油，然后采用聚异丁烯进一步降低端羟基硅油的粘度，而聚乙烯醇的加入能使端羟基硅油更易成膜，形成稳定的液滴，而二丁基二硫代氨基甲酸镍能提高端羟基硅油的热氧化稳定性和热循环稳定性。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于本申请采用将血样样本在经过ctDNA提取冷冻保存后，以10-20℃/h的温度升温至1-10℃，然后在1-10℃下每隔2-3h超声一次，经超声后的ctDNA样本稳定性增强，对检测时间要求降低，同一批样本，解冻后即使不在同一天检测，检测结果依然精确。

2、本申请中优选使用防粘剂喷涂在抗凝管内，能防止血浆挂壁，并加速血清和血浆的分离速度，使得血清和血浆分离的更加彻底，缩短血浆分离时间，提高了血浆的收集速度和收集量，另外防粘剂内还添加了具有抗静电作用的烷基磷酸酯二乙醇胺盐，使抗凝管具有抗静电性，防止血液挂壁，进一步提高血浆提取率。

3、本申请中优选使用粘度较低的端羟基硅油作为油相的主体成分，并采用聚异丁烯调节端羟基硅油的粘度，使用二丁基二硫代氨基甲酸镍增强端羟基硅油的热氧化性稳定性和热循环稳定性，而聚乙烯醇能提高端羟基硅油的成膜性，使油相更容易形成稳定的液滴，便于PCR扩增的循环。

4、本申请优选使用羧基化石墨烯和壳聚糖形成载体膜对玻碳电极进行修饰，然后在载体膜上沉寂氧化铜纳米线和铂纳米粒子，作为生物传感器，氧化铜纳米线和铂纳米粒子通过循环伏安法沉积，分散性好，与载体膜的负载牢度强，氧化铜纳米线和纳米铂粒子能促进电子的传递速率，提高生物传感器的电化学活性。

附图说明

图1为检测不同浓度ctDNA的荧光曲线图，图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。

图2为检测不同浓度ctDNA的标准曲线，图中，横坐标为ctDNA浓度，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

肝素化壳聚糖的制备例1-5

制备例1-5中异氰酸酯硅烷偶联剂选自南京全希化工有限公司，货号为QX-225；纳米氧化镧选自郑州诚奥化工产品有限公司，货号为526-98-70，粒径为40nm。

制备例1：将40g肝素钠溶解于100g pH值为4.5的枸橼酸钠缓冲液中，加入40kg 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)，搅拌均匀后，在2℃下放置5h，将肝素钠溶液加入到100g浓度为3％的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入300g经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥，异氰酸酯硅烷偶联剂处理纳米氧化镧的方法为：10g异氰酸酯硅烷偶联剂置于200g去离子水中，加入100g纳米氧化镧，室温超声分散20min，过滤，干燥。

制备例2：将80g肝素钠溶解于200g pH值为4.7的枸橼酸钠缓冲液中，加入80g 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)，搅拌均匀后，在6℃下放置5h，将肝素钠溶液加入到200g浓度为4％的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入300g经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥，异氰酸酯硅烷偶联剂处理纳米氧化镧的方法为：10g异氰酸酯硅烷偶联剂置于200g去离子水中，加入100g纳米氧化镧，室温超声分散20min，过滤，干燥。

制备例3：与制备例1的区别在于，纳米氧化镧未经异氰酸酯硅烷偶联剂处理。

制备例4：与制备例1的区别在于，未使用枸橼酸钠缓冲液和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)对肝素钠进行活化。

制备例5：与制备例1的区别在于，未添加经异氰酸酯偶联剂处理的纳米氧化镧。

一、肝素化壳聚糖的抗凝血时间检测

选取体重为2±0.5kg的日本中大耳白兔，用毛细玻管插入内眦球后静脉丛取血3.6mL，加入由1mg肝素化壳聚糖与100mg乙醇配制成的抗凝血液，空白组加入空白溶剂(乙醇:丙二醇:生理盐水体积比＝1:1:3)，正常组为未添加任何物质，记录血液从采血到出现血凝丝的时间为凝血时间，每个测试均重复6次，结果采用平均值，将检测结果记录于表1中。

表1 凝结时间检测结果

组别	加入剂量(mL)	凝血时间(min)
			制备例1	0.1	19.54
制备例1	0.2	19.57
			制备例2	0.1	19.43
制备例3	0.1	13.21
			制备例4	0.1	14.84
制备例5	0.1	12.45
			空白组	0.1	3.06
正常组	-	3.05

由表1中数据可以看出，制备例1制成的肝素化壳聚糖经过溶解后，以0.1mL的添加量，添加到3.6mL血液中，能使血液凝血时间延长至19.54min，比未添加任何物质的正常组3.05min，延长了16.49min，使血液凝血时间延长，抗凝血效果显著。

制备例1制成的肝素化壳聚糖溶解后，以0.2mL的添加量添加到3.6mL血液中，抗凝血时间与制备例1的效果相差不大，说明添加量增加对凝血时间影响不大。

制备例2制成的肝素化壳聚糖经溶解后，以与制备例1相同的添加量加入到血液中，出现血凝丝的时间为19.43min，与正常组相比，凝血时间明显得到改善。

制备例3在制备肝素化壳聚糖时，未使用异氰酸硅烷酯偶联剂对纳米氧化镧处理，即无法连接纳米氧化镧和壳聚糖，表1内数据显示，制备例3凝血时间为13.21min，与制备例1相比，凝血时间缩短，说明制成的肝素化壳聚糖对血液的抗凝血效果减弱。

制备例4与制备例1相比，在制备肝素化壳聚糖时，未添加枸橼酸钠缓冲液和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)，表1内显示，制备例4的凝血时间为14.84min，凝血时间延长，抗凝血效果减弱，说明使用1-乙基-3(3-二甲基丙胺)和枸橼酸钠缓冲液能活化肝素钠的羧基，增强抗凝血效果。

制备例5中未添加异氰酸酯硅烷偶联剂活化的纳米氧化镧，与制备例3和制备例1相比，抗凝血效果进一步降低，说明使用经过异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，能有效改善肝素化壳聚糖的抗凝血效果。

防粘剂的制备例6-11

制备例6-11中透明质酸钠选自青岛海维森生物科技有限公司，货号为9067-32；烷基磷酸酯二乙醇胺盐选自上虞市斯莫有机化学研究所；蒙脱石粉选自灵寿县恒昌矿产品加工厂，货号为J-009，目数为800目。

制备例6：将30g透明质酸钠、20g烷基磷酸酯二乙醇胺盐、10g肝素化壳聚糖、20g漂洗蒙脱石粉加入到100g乙醇中，超声分散均匀，制得防粘剂，其中肝素化壳聚糖由制备例1制成，漂洗蒙脱石粉由100g蒙脱石与50g KH550硅烷偶联剂和100g乙醇混合浸渍后烘干制成。

制备例7：将50g透明质酸钠、20g烷基磷酸酯二乙醇胺盐、15g肝素化壳聚糖、50g漂洗蒙脱石粉加入到150g乙醇中，超声分散均匀，制得防粘剂，其中肝素化壳聚糖由制备例1制成，漂洗蒙脱石粉由100g蒙脱石与50g KH550硅烷偶联剂和100g乙醇混合浸渍后烘干制成。

制备例8：与制备例6的区别在于，未添加肝素化壳聚糖。

制备例9：与制备例6的区别在于，未添加烷基磷酸酯二乙醇胺盐。

制备例10：与制备例6的区别在于，未添加漂洗蒙脱石粉。

制备例11：与制备例6的区别在于，未添加漂洗蒙脱石粉和肝素化壳聚糖。

分离胶的制备例12-15

制备例12-15中聚二甲基硅氧烷选自广州市壹诺化工科技有限公司，型号为PMX-200；气相二氧化硅选自广州市壹诺化工科技有限公司，型号为A380；聚丁二烯选自南通润丰石油化工有限公司，型号为LCBR。

制备例12：将100g聚硅氧烷、50g聚丁二烯和10g二氧化硅在60℃下，混合反应5h，制成分离胶，二氧化硅为气相二氧化硅，粒径为5000目，聚硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。

制备例13：将100g聚硅氧烷、100g聚丁二烯和30g二氧化硅在80℃下，混合反应3h，制成分离胶，二氧化硅为气相二氧化硅，粒径为5000目，聚硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。

制备例14：与制备例1的区别在于，未添加聚丁二烯。

制备例15：与制备例12的区别在于，未添加二氧化硅。

二、血浆提取量和提取时间检测

(1)血浆提取量检测：选取普通血液收集管40个，随机分为8组，其中6组普通血液收集管的内壁上，对应均匀喷涂0.4mL由制备例6-11制成的防粘剂，1组喷涂由制备例6制成的防粘剂，喷涂量为0.8mL；静脉采集ICR大鼠的血液样本，收集至喷涂防粘剂普通血液7组收集管中，剩余1组普通血液收集管不做任何处理，作为空白组，每个收集管中均收集10mL血液，将血液在4℃下，以离心力16000g离心5min，计量获得的上清液即血浆的获得量，测试结果取每组5个测试结果的平均值，将测量结果记录于表2中。

表2 血浆提取量的检测结果

组别	防粘剂喷涂量/mL	血浆获得量/mL	提取率/％
				制备例6	0.4	5.2	52
制备例6	0.8	5.1	51
				制备例7	0.4	5.0	50
制备例8	0.4	4.8	48
				制备例9	0.4	4.5	45
制备例10	0.4	4.6	46
				制备例11	0.4	4.1	41
空白组	-	3.8	38

由表2内检测结果可以看出，制备例6制成的防粘剂以0.4mL和0.8mL的量喷涂至普通的血液收集管中，血浆获得量为4mL以上，达到血液样本的50％以上，制备例7制成的防粘剂喷涂到血液收集管中，血液收集量为4mL，也达到血液样本的50％，说明本申请制备的防粘剂能显著提高血浆的提取率。

制备例8与制备例6的区别在于，未添加肝素化壳聚糖，对比表2内的结果可以看出，制备例8对于血浆的提取率有所下降，说明肝素化壳聚糖能提高血浆的提取率。

制备例9制成的防粘剂，喷涂在血液收集管中，血浆的提取量为3.5mL，提取率相对于制备例6有所下降，说明添加烷基磷酸酯二乙醇胺盐能提高血浆的提取量。

制备例10中未添加漂白蒙脱石粉，制备例11中未添加漂白蒙脱石粉和肝素化壳聚糖，表2内显示，制备例10中血浆提取率相对于制备例6有所下降，而且制备例11相对于制备例10，血浆提取量为4.1mL，提取率下降明显。

(2)血浆提取时间检测：选取普通血液收集管25个和肝素锂抗凝管5个，普通血液收集管随机分为5组，其中4组均喷涂0.4mL由制备例6制成的防粘剂，剩余一组不做任何处理作为空白组，向5组普通血液收集管中均加入0.8g分离胶，静脉采血收集血液样本，普通血液收集管和肝素锂抗凝管中血液样本收集量为10mL，将血液收集管在4℃下，以16000g的离心力离心，记录离心开始至收集管内上清液量不再增加的时间，并记录血浆获得量，每组检测结果取5个血液收集管的平均值，记录于表3中。

表3 血浆提取时间的检测结果

组别	离心时间/min	血浆获得量/mL	提取率/％
				制备例12	3.4	5.2	52
制备例13	3.6	5.1	51
				制备例14	6.4	4.9	49
制备例15	5.8	5.0	50
				肝素锂抗凝管	3.8	4.1	41
空白组	10.2	3.8	38

由表2和表3中数据可以看出，在喷涂了制备例6制成的防粘剂的血液收集管中加入制备例12和制备例13制成的分离胶，血清和血浆分离时间缩短至3分钟左右，且血浆获得量仍能达到50％以上，说明分离胶的加入显著缩短了血浆的分离时间。

制备例14和制备例15制成的分离胶，在喷涂制备例6制成的防粘剂的血液收集管中，在1600g的离心力下，离心时间延长，血浆提取率不及制备例12。

三、蛋白质水解效率的检测

将采用静脉取血获得的血浆用1600g的离心力离心5min，再用2000g的离心力离心5min，获得上清液，向200μL上清液中加入900μL裂解液，振荡混匀30s，分别使用表4内给出的蛋白质酶解剂进行水解，以胰蛋白酶作为对照组，蛋白质酶解剂与上清液的质量比为1:25，水解一定时间后，过滤，测定滤液中的氨基氮含量，参照pH-Stat法，计算蛋白质的水解度(指上清液中蛋白质被水解的肽键数占上清液蛋白质总肽键数的百分率)，具体方法为水解度(％)＝(N-Nn)/N_tol，其中N为酶解滤液中氨基氮的含量(mmol/g滤液)，Nn为酶解前上清液中氨基氮的含量(mmol/g上清液)，N_tol为上清液中蛋白质肽键总数(mmol/g上清液)，将检测结果记录于表5中，其中蛋白酶酶解剂的使用方法为：将裂解后的上清液加入尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠，在室温下超声10min后，加入胰蛋白酶、N-糖酰胺酶和阴离子表面活性剂，超声。

表4 制备例16-22中蛋白质酶解剂的原料配比

注表4中的原料来源：胰蛋白酶选自夏盛实业集团有限公司，货号为GDG-2009；N-糖酰胺酶选自上海优高玖贸易有限公司，型号为PN1101；尿囊素选自西安百年康生物科技有限公司，型号为FQW-NNS，货号为BNK0199；吡咯烷酮羧酸钠选自广州市利厚贸易有限公司，型号为NL-50；十二烷基硫酸钠选自山东远杭化工有限公司，型号为K12；2-巯基乙醇选自上海宝钛化工有限公司；聚氧化乙烯选自河南汇发化工有限公司，型号为PEO。

表5 蛋白质酶解剂的水解效率检测结果

蛋白质酶解剂的型号	酶解时间/h	酶解温度/℃	水解度/％
				制备例16	4	55	44.53
制备例16	6	55	44.54
				制备例16	4	40	39.27
制备例17	4	55	44.81
				制备例18	4	55	32.41
制备例19	4	55	35.73
				制备例20	4	55	34.48
制备例21	4	55	37.93
				制备例22	4	55	36.56
胰蛋白酶	4	55	28.71

参见表5中的检测结果可以看出，蛋白质酶解剂1在55℃下酶解4h时获得的水解度为44.53％，酶解6h后水解度为44.54％，可见增大酶解时间，对水解度无较大影响，蛋白质酶解剂1在40℃下酶解4h，表5内数据给出，水解度为39.27％，可见酶解温度为55℃，酶解时间为4h，蛋白质的水解度最佳。

蛋白质酶解剂2在55℃下酶解4h后，水解度为44.81％，与蛋白质酶解剂1在55℃下酶解4h后得到的水解度相近。

蛋白质酶解剂3的原料中未添加2-巯基乙醇和聚氧化乙烯，蛋白质酶解剂4和蛋白质酶解剂5分别未添加2-巯基乙醇和聚氧化乙烯，表5内数据显示，在55℃下酶解4h后，蛋白质酶解剂3得到的水解度最差，蛋白质酶解剂5次之，蛋白质酶解剂4相对较好，说明2-巯基乙醇和聚氧化乙烯具有较好的协同效果，能改善蛋白质的水解度。

蛋白质酶解剂6和蛋白质酶解剂7与蛋白质酶解剂1相比，分别未添加尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠，与蛋白质酶解剂1相比，蛋白酶酶解剂6和蛋白酶酶解剂7在55℃下酶解4h获得的水解度下降显著，说明尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠能提高蛋白酶酶解剂对蛋白质的水解程度。

生物传感器的制备例23-27

制备例23：(1)将20g壳聚糖溶解于100g浓度为1％的醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将10g羧基化石墨烯分散到100g蒸馏水中，形成石墨烯悬浮液；羧基化石墨烯的制备方法：将0.1g氧化石墨烯加入到高度浓缩的氢氧化钠溶液中，超声分散2h，加入5g一氯乙酸，继续超声3h，将所得溶液离心过滤去除杂质，超纯水洗涤至中性，得到均相的羧基化石墨烯溶液，真空干燥，得到羧基化石墨烯；

(2)将步骤(1)制成的石墨烯悬浮液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀后，制成处理液，滴涂在经过预处理的玻碳电极的表面，室温干燥，得到预处理玻碳电极；

(3)将预处理玻碳电极置于50g包括20g硫酸铜和10g氯铂酸钾的硫酸溶液，在0.25V的电压下，以50mV/s的电流循环扫描25圈，取出预处理玻碳电极，用蒸馏水洗涤，制得生物传感器。

制备例24：(1)将50g壳聚糖溶解于200g浓度为1％的醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将30g羧基化石墨烯分散到200g蒸馏水中，形成石墨烯悬浮液；羧基化石墨烯的制备方法：将0.1g氧化石墨烯加入到高度浓缩的氢氧化钠溶液中，超声分散2h，加入5g一氯乙酸，继续超声3h，将所得溶液离心过滤去除杂质，超纯水洗涤至中性，得到均相的羧基化石墨烯溶液，真空干燥，得到羧基化石墨烯；

(2)将步骤(1)制成的石墨烯悬浮液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀后，制成处理液，滴涂在经过预处理的玻碳电极的表面，室温干燥，得到预处理玻碳电极；

(3)将预处理玻碳电极置于100g包括40g硫酸铜和30g氯铂酸钾的硫酸溶液，在0.4V的电压下，以50mV/s的电流循环扫描30圈，取出预处理玻碳电极，用蒸馏水洗涤，制得生物传感器。

制备例25：与制备例23的区别在于，步骤(3)中未添加硫酸铜。

制备例26：与制备例23的区别在于，步骤(3)中未添加氯铂酸钾。

制备例27：与制备例23的区别在于，未添加壳聚糖溶液。

实施例

实施例1：一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：

S1、血液样本处理：将10mL血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在1℃下，16000g离心，取上层血浆；

S2、ctDNA的抽离：向血浆中加入裂解液，裂解液加入量为：每200μL加入900μL上清液，振荡摇匀30s，向裂解后的上清液中加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，在55℃下酶解4h，然后在1℃下，2000g离心5min，取下层沉淀物，加入下层沉淀物质量20％的EB缓冲液，于50℃下敞口水浴20min，取出，在室温下，1800g离心6min，取上清液作为ctDNA样本，在-20℃下保存，裂解液为MZA，蛋白质酶解剂为胰蛋白酶，二氧化硅为气相二氧化硅，蛋白质酶解剂、二氧化硅和上清液的质量比为1:5:25；

S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以10℃/h的升温速率回温至1℃，然后每2h在1℃下超声1次，超声时间为10min；

S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在2℃下杂交反应，检测荧光强度，PCR扩增体系包括体积比为1:1的水相和油相，水相包括100ng ctDNA样本、浓度为0.1μm的正反向引物、浓度为0.5mM的脱氧核糖核苷酸三磷酸、浓度为3mM的氯化镁、浓度为0.2mM的三磷酸脱氧尿苷钠盐、浓度为0.5μL的生反向荧光探针和0.1U的Taq Platinum DNA聚合酶；油相包括100g端羟基硅油、10g聚异丁烯、5g聚乙烯醇、20g二丁基二硫代氨基甲酸镍，生物传感器由制备例23制成；

PCR扩增具体步骤：C1、用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内，吸取和转移微滴时需缓慢操作，防止产生气泡，单次操作用时约5s；C2、用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s；C3、完成封膜后，将96孔板置于梯度扩增仪(T100 Thermal Cycler)进行PCR反应，PCR扩增条件为如表6所示。

表6 实施例1和实施例2中PCR循环参数

实施例2：一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：

S1、血液样本处理：将10mL血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在4℃下，20000g离心，取上层血浆；

S2、ctDNA的抽离：向血浆中加入裂解液，裂解液加入量为：每200μL加入900μL上清液，振荡摇匀30s，向裂解后的上清液中加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，在55℃下酶解4h，然后在4℃下，2500g离心3min，取下层沉淀物，加入下层沉淀物质量20％的EB缓冲液，于56℃下敞口水浴15min，取出，在室温下，2000g离心3min，取上清液作为ctDNA样本，在-80℃下保存，裂解液为MZA，蛋白质酶解剂为胰蛋白酶，二氧化硅为气相二氧化硅，蛋白质酶解剂、二氧化硅和上清液的质量比为1:5:25；

S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以20℃/h的升温速率回温至10℃，然后每3h在10℃下超声1次，超声时间为5min；

S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在8℃下杂交反应，检测荧光强度，PCR扩增体系包括体积比为1:10的水相和油相，水相包括100ng ctDNA样本、浓度为0.1μm的正反向引物、浓度为0.5mM的脱氧核糖核苷酸三磷酸、浓度为3mM的氯化镁、浓度为0.2mM的三磷酸脱氧尿苷钠盐、浓度为0.5μL的生反向荧光探针和0.1U的Taq Platinum DNA聚合酶；油相包括200g端羟基硅油、50g聚异丁烯、10g聚乙烯醇、60g二丁基二硫代氨基甲酸镍，生物传感器由制备例23制成；

PCR扩增具体步骤：C1、用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内，吸取和转移微滴时需缓慢操作，防止产生气泡，单次操作用时约5s；C2、用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s；C3、完成封膜后，将96孔板置于梯度扩增仪(T100 Thermal Cycler)进行PCR反应，PCR扩增条件为如表6所示。

实施例3：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例1的区别在于，步骤S1中，向抗凝管的内壁上均匀喷涂防粘剂，防粘剂喷涂量为0.4mL，置于60℃下烘干，然后加入0.8g分离胶，再进行血液样本的收集，防粘剂由制备例6制成，分离胶由制备例12制成。

实施例4：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例3的区别在于，步骤S2种，蛋白质酶解剂使用制备例16中的原料用量，蛋白质酶解剂的使用方法为：将尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠与经过裂解的上清液混合，超声10min后，加入胰蛋白酶、N糖酰胺酶和阴离子表面活性剂混合，超声4h。

实施例5-8：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例4的区别在于，生物传感器的制备例选择如表7所示。

表7 实施例1-8中各物质的制备例选择

实施例	防粘剂	分离胶	蛋白质酶解剂	生物传感器
					实施例1	-	-	胰蛋白酶	制备例23
实施例2	-	-	胰蛋白酶	制备例23
					实施例3	制备例6	制备例12	胰蛋白酶	制备例23
实施例4	制备例6	制备例12	制备例16	制备例23
					实施例5	制备例6	制备例12	制备例16	制备例24
实施例6	制备例6	制备例12	制备例16	制备例25
					实施例7	制备例6	制备例12	制备例16	制备例26
实施例8	制备例6	制备例12	制备例16	制备例27

对比例

对比例1：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例1的区别在于，步骤S1中，血液样本处理的两次离心，均在室温下进行。

对比例2：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例1的区别在于，步骤S3中，在37℃下回温至室温。

对比例3：一种优化ctDNA检测准确率的方法，与实施例1的区别在于，步骤S3中，回温后未进行超声。

性能检测试验

1、选择目标ctDNA为PIK3CA E542K 1624G＞A，序列为TCCTCTCTCTAAAATCACTGAG(SEQIDNO:2)的血液样本，单链探针的序列为5’-TCAGTGATTTTAGAGAGAGGA-3’(SEQIDNO:1)，按照实施例5中方法对不同浓度ctDNA血液样本进行检测，在荧光仪上检测荧光，观察荧光信号的情况，如图1所示。图1中可以看出，激发波长为520nm，加入生物传感器后，荧光强度显著变弱(具有显著差异)，则待测样品中存在于该荧光探针相结合的靶ctDNA，实现对样品中靶ctDNA的定性检测，可以看出，制备例16制成的生物传感器对ctDNA的检测灵敏度更好，对0-5nM的ctDNA能进行准确的检测，0.5nM的ctDNA也能被检测出来，5nM的ctDNA与0nM的空白对照组相比，荧光强度相差1倍以上，检测灵敏度高。

2、选择目标ctDNA为PIK3CA E542K 1624G＞A，序列为TCCTCTCTCTAAAATCACTGAG(SEQIDNO:2)的血液样本，单链探针的序列为5’-TCAGTGATTTTAGAGAGAGGA-3’(SEQIDNO:1)，按照实施例5中方法对不同浓度ctDNA血液样本进行检测，在荧光仪上检测荧光曲线，激发波长为520nm，检测范围可以从0.5nM至5nM，检测线为0.166nM，线性相关系数为0.9988，如图2所示。

3、按照各实施例和对比例中方法对含有目标ctDNA的血液样本进行离心，获得浓度为5nM的ctDNA样本；对照ctDNA样本1浓度为5nM，名称为PIK3CA E542K 1624G＞C，序列为TCCTCTCTCTCAAATCACTGAG(SEQIDNO:3)；对照ctDNA样本2浓度为5nM，名称为PIK3CA E542K1624G＞T，序列为TCCTCTCTCTTAAATCACTGAG(SEQIDNO:4)；对照ctDNA样本3的浓度为5nM，名称为Wild type，序列为TCCTCTCTCTGAAATCACTGAG(SEQIDNO:5)；对照ctDNA样本4的浓度为5nM，名称为PIK3CA E542K deletion，序列为TCCTCTCTCTAAATCACTGAG(SEQIDNO:6)，按照实施例5中的方法检测各样本的荧光强度，激发波长为520nm，检测结果记录于表8中。

表8 本申请对ctDNA检测的单一性

检测样本	荧光强度
		目标ctDNA(1624G＞A)	83.4
对照ctDNA样本1(1624G＞C)	38.5
		对照ctDNA样本2(1624G＞T)	31.6
对照ctDNA样本3(Wild type)	33.8
		对照ctDNA样本4(PIK3CA E542K)	30.4
对照样本5(血清)	28.1

由表8中数据可以看出，本申请中方法对ctDNA具有很强的专一性，具有更好的抗干扰能力，灵敏度更高。

4、按照实施例和对比例中方法对含有目标ctDNA为PIK3CA E542K 1624G＞A，序列为TCCTCTCTCTAAAATCACTGAG(SEQIDNO:2)的血液样本进行检测，记录血浆提取时间、血浆提取率、血浆中蛋白质水解度，然后以520的激发波长记录各实施例和对比例获得的荧光强度，检测数据记录于表9中。

表9 实施例和对比例对ctDNA检测的结果

实施例	血浆提取时间/min	血浆提取量/mL	水解度/％	荧光强度
					实施例1	10.2	3.8	28.32	73.2
实施例2	10.0	3.6	28.27	74.1
					实施例3	3.4	5.3	28.31	73.5
实施例4	3.2	5.2	44.63	78.6
					实施例5	3.4	5.3	44.64	83.7
实施例6	3.5	5.2	44.34	80.6
					实施例7	3.4	5.3	44.43	81.5
实施例8	3.5	5.2	44.28	81.3
					对比例1	10.2	3.7	28.35	72.5
对比例2	10.3	3.6	28.16	71.6
					对比例3	10.5	3.8	27.39	70.8

由表9中数据可以看出，实施例1和实施例2中，采用胰蛋白酶作为蛋白质酶解剂，并且未添加防粘剂和分离胶，在提取血浆时，提取时间长，且提取量低，在水解蛋白质时，蛋白质的水解率不高，但采用制备例16制成的生物传感器，ctDNA样本的荧光强度高，具有较强的稳定性。

实施例3中使用制备例6制成的防粘剂，制备例12制成的分离胶，经过检测，血浆的提取时间缩短，且提取量增大。

实施例4与实施例3相比，还使用制备例16制成的蛋白质酶解剂，表9内数据显示，蛋白质的水解度显著增大。

实施例5与实施例3相比，使用制备例24制成的生物传感器，荧光强度与实施例3相比，有所增大，说明水解度增大，ctDNA的检测荧光强度增加。

实施例6-8分别使用了25-27制成的生物传感器，与实施例5相比，荧光强度减弱，检测精确率下降。

对比例1与实施例1相比，离心在室温下进行，血浆获得的时间和提取量与实施例1相似，但血浆中ctDNA的荧光强度有所下降。

对比例2和对比例3中在血浆冷冻回温时，对比例2采用37℃下回温，对比例3在回温后未进行超声，与实施例1相比，荧光强度下降，检测准确率降低。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、血液样本处理：将血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在1-4℃下，在1-4℃下，16000-20000g离心，取上层血浆；

S2、ctDNA的抽离：将血浆经裂解液处理后，加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，酶解后，在1-4℃下，2000-2500g离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，于50-56℃下敞口水浴15-20min，取出，在室温下，1800-2000g离心3-6min，取上清液作为ctDNA样本，在-（20～80）℃下保存；

S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以10-20℃/h的升温速率回温至1-10℃，然后每2-3h在1-10℃下超声1次，超声时间为5-10min；

S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在2-8℃下杂交反应，检测荧光强度。

2.根据权利要求1所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，向抗凝管的内壁上均匀喷涂防粘剂，然后置于60-80℃下干燥，防粘剂包括以下重量份得到组分：3-5份透明质酸钠、2-2.5份烷基磷酸酯二乙醇胺盐、1-1.5份肝素化壳聚糖、0.2-0.5份漂洗蒙脱石粉、10-15份乙醇。

3.根据权利要求2所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述肝素化壳聚糖的制备方法如下：

以重量份计，将0.4-0.8份肝素钠溶解于1-2份pH值为4.5-4.7的枸橼酸钠缓冲液中，加入0.4-0.8份1-乙基-3（3-二甲基丙胺），搅拌均匀后，在2-6℃下放置3-5h，将肝素钠溶液加入到1-2份浓度为3-4%的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入3-6份经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥。

4.根据权利要求2所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述防粘剂的喷涂量为0.4-0.8mL。

5.根据权利要求2所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述步骤S1中，向喷涂了防粘剂的抗凝管中加入分离胶，分离胶由聚硅氧烷、聚丁二烯和二氧化硅在60-80℃下反应3-8h制成，聚硅氧烷、聚丁二烯和二氧化硅的质量比为1:0.5-1:0.1-0.3。

6.根据权利要求1所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述步骤S4中生物传感器的制备方法如下：

（1）将0.2-0.5重量份壳聚糖溶解于1-2重量份浓度为1-3%的醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将0.1-0.3重量份羧基化石墨烯分散到1-1.5重量份蒸馏水中，形成石墨烯悬浮液；

（2）将步骤（1）制成的石墨烯悬浮液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀后，制成处理液，滴涂在经过预处理的玻碳电极的表面，室温干燥，得到预处理玻碳电极；

（3）将预处理玻碳电极置于0.5-1重量份包括0.2-0.4重量份硫酸铜和0.1-0.3重量份氯铂酸钾的硫酸溶液，在0.25-0.4V的电压下，以50mV/s的电流循环扫描30圈，取出预处理玻碳电极，用蒸馏水洗涤，制得生物传感器。

7.根据权利要求1所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述步骤S2中，蛋白质酶解剂包括以下重量份的组分：0.3-0.6份胰蛋白酶、0.1-0.3份N-糖酰胺酶、0.4-0.8份尿囊素、0.5-1份吡咯烷酮羧酸钠和1-2份阴离子表面活性剂。

8.根据权利要求7所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为质量比为1:0.2-0.5:0.05-0.1的十二烷基硫酸钠、2-巯基乙醇和聚氧化乙烯。

9.根据权利要求7所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述蛋白质酶解剂的使用方法为：向裂解后的上清液中加入尿囊素和吡咯烷酮羧酸钠，在室温下超声10-20min后，加入胰蛋白酶、N-糖酰胺酶和阴离子表面活性剂，超声至蛋白质水解完全。

10.根据权利要求1所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系包括体积比为1:1-10的水相和油相，油相包括以下重量份的组分：1-2份端羟基硅油、0.1-0.5份聚异丁烯、0.05-0.1份聚乙烯醇、0.2-0.6份二丁基二硫代氨基甲酸镍。

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