KR101311776B1 - 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 이를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지 - Google Patents

효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 이를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 그 제조방법, 그리고 이를 이용한 온오프로 전환 가능한 바이오센서 및 바이오연료전지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도당 산화효소 (glucose oxidase)와 같은 효소와 자성나노입자 (magnetic nanoparticles)를 동시에 탄소나노튜브 (carbon nanotube)와 같은 미세튜브에 집적하여 자력에 의해 분리될 수 있는 미세튜브를 제작하고, 이를 이용해 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지를 제작하는 것이다. 본 발명의 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브 전해재를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지는 선택적인 측정 및 검출법에 있어서, 분리의 신속성, 편리성, 안정성을 개선하고, 검출의 민감도와 정확성을 제고하는 효과가 있다.

Description

효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 이를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지 {Electrolytic Material Including Minute Tube Accumulated Enzyme and Magnetic Nanoparticle and Switchable Biosensor and Biofuelcell Using the Same}
본 발명은 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 그 제조방법, 그리고 이를 이용한 온오프로 전환 가능한 바이오센서 및 바이오연료전지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도당 산화효소 (glucose oxidase)와 같은 효소와 자성나노입자 (magnetic nanoparticles)를 동시에 탄소나노튜브 (carbon nanotube)와 같은 미세튜브에 집적하여 자력에 의해 분리될 수 있는 미세튜브를 제작하고, 이를 이용해 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지를 제작하는 것이다. 이를 통해, 종래에 시도되지 않았던 온오프로 전환 가능한 또는 선택적인 바이오센서 및 바이오연료전지를 제작할 수 있다.
센서는 동물이 가지고 있는 감각기관에 대응하여 외계의 어떤 물리적 또는 화학적 양을 전기신호로 변환하여 감지하는 기기를 말한다. 이 중 효소와 같은 생체유래물질 또는 미생물 자체를 이용한 바이오센서(biosensor)는 측정 대상물에 대한 선택성이 탁월하고 감도가 예민하여 분석화학 분야에서 생체 내의 생성물질과 대사물질을 직접 측정할 수 있는 분석장치로서 주목받고 있다.
그리고, 바이오연료전지(biofuelcell)는, 중합체 전해질 막에 의해 분리된 양극 및 음극으로 구성된다는 점에서, 전통적인 중합체 전해질 막 바이오연료전지와 유사하다. 촉매로서 귀금속 대신 효소와 같은 생물학적 분자를 사용하는데, 매우 효율적인 촉매이기는 하나 용액에 함유된 형태의 효소는 수 일 동안만 안정하여 수명이 짧은 문제점이 있었다.
한편, 자성 입자 (magnetic particles)는 다양한 분야에서 응용되고 있다. 특히 자성나노입자는 특정한 목적물질을 타겟팅하고 분리해 내는 분야, 약물전달시스템, 암세포 이미징과 치료 등 생명공학과 의료진단 및 환경 분야에서 널리 사용되는 나노물질이다. 나노물질 중 자성나노입자의 가장 큰 이점은 자력에 의해 선택적으로 분리할 수 있다는 점과 손쉽게 다룰 수 있다는 장점이 있다.
현재까지 제시된 모든 바이오센서 및 바이오연료전지는 항상 반응이 이루어지는 형식이어서 효소의 활성이 지속적으로 감소하고 그 결과 사용수명이 단축되는 문제점이 있었으며, 외부 전원을 이용하지 않은 온오프형 제어가 가능한 형태는 아직까지 제시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 효소 및 자성나노입자를 미세튜브에 집적하고 이를 자석으로 움직여 온오프시키는 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지용 전해재의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 제조방법에 의해 제조된 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지용 전해재를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지용 전해재를 포함한 온오프형 바이오센서를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지용 전해재를 포함한 온오프형 바이오연료전지를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 온오프형(switchable) 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,
(A) 효소 및 자성나노입자 (magnetic nanoparticles)를 미세튜브와 혼합하여 상기 효소 및 자성나노입자가 상기 미세튜브의 표면에 결합된 효소/자성입자-미세튜브를 제조하고, 여기서 상기 미세튜브와 상기 효소의 결합 및 상기 미세튜브와 상기 자성나노입자의 결합은 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴(biotin) 결합, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 커플링, 설프하이드릴아민(sulphhydrylamine) 커플링, 또는 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)-히스티딘 결합에 의해 이루어지는 단계;
(B) 상기 효소, 자성나노입자 및 미세튜브의 혼합물에 염을 첨가하여 상기 효소를 서로 뭉치게 하는 단계; 및
(C) 상기 효소, 자성나노입자 및 미세튜브의 혼합물에 아민 결합 2 관능성 화합물을 첨가하여 상기 효소를 서로 가교결합시켜, 상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브를 제조하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법은 상기 단계 (A) 이전에,
(D) 상기 미세튜브의 표면을 산으로 처리하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법은 상기 단계 (C) 이후에,
(E) 상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브 중 효소, 자성나노입자 또는 미세튜브의 미반응 결합부위를 보호하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법은
단계 (C), 단계 (D), 단계 (E), 단계 (C) 및 단계 (D), 단계 (C) 및 단계 (E), 단계 (D) 및 단계 (E), 또는 단계 (C) 및 단계 (D) 및 단계 (E) 이후에,
세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재는
미세튜브;
상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소; 및
상기 효소에 혼합된 자성나노입자
를 포함하고,
상기 미세튜브와 상기 효소의 결합 및 상기 미세튜브와 상기 자성나노입자의 결합은 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴(biotin) 결합, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 커플링, 설프하이드릴아민(sulphhydrylamine) 커플링, 또는 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)-히스티딘 결합에 의해 이루어지고,
상기 미세튜브 표면에의 효소 집적은 염, 아민 결합 2 관능성 화합물, 또는 염 및 아민 결합 2 관능성 화합물에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 미세튜브는 상기 효소의 집적 전에 산으로 처리된 것이 바람직하다.
또한, 상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브 중 효소, 자성나노입자 또는 미세튜브의 미반응 결합부위는 보호된 것이 바람직하다.
또한, 상기 미세튜브는 탄소나노튜브인 것이 바람직하다.
또한, 상기 효소는 포도당 산화효소인 것이 바람직하다.
또한, 상기 미세튜브 표면에의 효소 집적을 위한 염은 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.
또한, 상기 미세튜브 표면에의 효소 집적을 위한 아민 결합 2 관능성 화합물은 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르), 디이소시아네이트, 디애시드 클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 온오프형 바이오센서는 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 포함하고,
자석에 의해 상기 전해재와 전극 사이의 거리를 변경함으로써 온오프가 전환되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오센서는
자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 상기 전극 쪽으로 이동시키면 스위치 온될 수 있다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오센서는 자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 이동시켰을 때 스위치 온되는 상기 전극이 작용전극일 수 있다.
한편, 본 발명의 온오프형 바이오연료전지는 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 포함하고,
자석에 의해 상기 전해재와 전극 사이의 거리를 변경함으로써 온오프가 전환되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오연료전지는
자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 상기 전극 쪽으로 이동시키면 스위치 온될 수 있다.
또한, 본 발명의 온오프형 바이오연료전지는 자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 이동시켰을 때 스위치 온되는 상기 전극이 음극일 수 있다.
본 발명의 온오프로 전환 가능한 바이오센서 및 바이오연료전지는 미세튜브에 집적된 효소의 안전성과 자성나노입자를 이용한 분리의 신속성을 가장 큰 특징으로 한다. 전환 가능한 선택적인 반응은 자성나노입자의 자력을 통한 분리에 의해 가능하며, 기질첨가에 의한 효소반응을 통한 신호화로 확인될 수 있다.
또한, 상온에서 효소를 방치할 경우 그 활성도가 떨어져 효소반응을 일으키지 못하는 종래의 바이오센서나 바이오연료전지에 비해, 미세튜브에 집적된 효소는 오랜 기간 동안 활성도를 유지할 수 있어 종래의 단점을 극복할 수 있다. 또한 효소분자 한 개가 효소반응을 일으키는 것이 아니라 미세튜브에 집적된 수많은 효소들이 효소반응에 참여함으로써 기존의 효소반응보다 높은 신호를 나타내며 따라서 저 농도에서의 신호발생도 가능하다.
그 결과 본 발명의 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브 전해재를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지는 선택적인 측정 및 검출법에 있어서, 분리의 신속성, 편리성, 안정성을 개선하고, 검출의 민감도와 정확성을 제고하는 효과가 있다. 구체적으로, 바이오센서 및 바이오연료전지를 온오프 형식으로 전환 가능하게 만들면, 위치탐색 및 추적기능에 있어서 당해 과정을 실시간 원격 모니터링하는 것이 가능해진다. 또한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지는 필요한 경우 선택적으로 반응이 일어나게 할 수 있고 이렇게 반응이 일어날 때만 측정이 이루어지므로, 시스템의 신뢰도를 높일 수 있고 전체적으로 소요되는 비용을 줄일 수 있는 경제성이 있으며 보다 효율적이고 편리한 장점이 있다.
도 1a는 온오프로 전환 가능한 바이오센서 및 바이오연료전지에의 사용을 위해 본 발명 일 실시예의 포도당 산화효소와 자성나노입자가 탄소나노튜브 표면에 함께 집적되는 과정을 도시한 개략도이다.
도 1b는 도 1a의 최초 탄소나노튜브 (좌측) 및 효소와 자성나노입자가 집적된 최종 전해재 (우측)를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명 일 실시예의 포도당 산화효소와 자성나노입자가 탄소나노튜브에 집적된 전해재가 자력에 의해 분리됨을 도시한 사진이다.
도 3은 본 발명 일 실시예의 자성나노입자와 함께 탄소나노튜브에 집적된 포도당 산화효소가 종래 유리 효소에 비해 더 높은 안전성을 지닌다는 것을 도시한 도표이다.
도 4a는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오센서의 작동과정을 나타낸 개념도이다.
도 4b는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오센서의 작용전극과 반대전극에서 전환 가능한 신호가 발생됨을 도시한 도표이다.
도 4c는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오센서의 작용전극과 반대전극에서 전환 가능한 신호의 반복 발생이 가능함을 도시한 도표이다.
도 5는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오연료전지의 작동과정을 나타낸 개념도이다.
도 6a는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오연료전지에서 전압과 전류 변화에 대한 분극 곡선이다.
도 6b는 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오연료전지에서 전압과 전류 변화에 대한 출력밀도이다.
도 7은 본 발명 일 실시예의 전해재가 도입된 바이오연료전지에서 온 오프 상태를 반복하여 출력밀도를 계산한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부도면을 이용하여 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자는 효소와 자성나노입자를 미세튜브 표면에 집적함으로서 자력에 의한 분리가 가능하고 이를 이용해 바이오센서 및 바이오연료전지를 온오프로 전환할 수 있음을 발견했다. 아울러, 이러한 바이오센서 및 바이오연료전지는 반응과 검출을 선택적으로 수행할 수 있음도 확인하였으며, 효소의 집적을 통해 나노물질의 안정적인 전해 효과도 확인할 수 있었다.
도 1a는 온오프로 전환 가능한 바이오센서 및 바이오연료전지에의 사용을 위해 본 발명 일 실시예의 포도당 산화효소와 자성나노입자가 탄소나노튜브 표면에 함께 집적되는 과정을 도시한 개략도이다.
본 발명의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조는 먼저 효소 및 자성나노입자를 미세튜브와 혼합하여 상기 미세튜브의 표면에 효소 및 자성나노입자를 결합시키는 단계로부터 시작된다. 여기서 미세튜브란 크기가 밀리미터 단위보다 작고 튜브 형태를 가진 모든 물질을 가리킨다. 본 발명에서는 특히 탄소나노튜브가 바람직하고, 특히 효소를 집적하기 전에 산(acid) 용액에 침지시켰다 꺼내는 산 처리를 거치는 것이 더욱 바람직하다. 그리고, 본 발명의 전해재에 사용되는 효소는 제한이 없으나, 포도당(glucose)을 글루코산(gluconic acid)으로 변환하는 포도당 산화효소 (glucose oxidase)가 바람직하다.
이러한 미세튜브의 표면에 중성 카르복시기(-COOH), 그의 이온(-COO-), 중성 아민기(-NH2), 그의 이온(-NH- 또는 -NH3 +), 중성 티올기(-SH), 및 그의 이온(-S-)으로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 구비하는 것이 바람직한데, 예컨대 미세튜브와 EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 용액을 혼합하여 반응시킴으로써, 상기 미세튜브의 표면에 카르복실기를 작용기로서 구비케 할 수 있다.
그리고, 이렇게 표면에 작용기를 구비한 미세튜브와 효소 및 자성나노입자의 구체적인 결합방법으로는, 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴(biotin) 결합, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 커플링, 설프하이드릴아민(sulphhydrylamine) 커플링, 또는 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)-히스티딘 결합을 들 수 있고, 특히 아마이드 바인딩 (amide binding)이 바람직하다. 상기 아마이드 바인딩은 미세튜브의 카르복실기(-COOH)와 효소의 아민기(-NH2)가 결합함으로써 이루어지는 반응이다.
여기서 상기 미세튜브에 결합된 효소의 양이 적거나 유리된 형태라면, 상기 효소의 활성 저하 내지는 실활시 안정적인 전해를 기재할 수 없다. 특히, 유리 형태의 효소라면 전술한 활성 저하 내지 실활의 가능성이 높아 큰 단점으로 작용한다. 따라서, 본 발명에서는 먼저 미세튜브에 상기 효소를 다량 결합시켰다. 이렇게 미세튜브에 결합된 효소는 유리 형태가 아니어서 안정성이 제고되며, 다량의 효소로 인해 일부 효소가 활성 저해 내지 실활되더라도 충분한 안정적인 전해 효과를 나타낼 수 있고, 분석대상의 농도가 극히 낮더라도 검출이 가능한 장점이 있다.
이처럼 미세튜브에 효소를 다량 결합시키기 위해 본 발명은 특히 효소들 사이를 가교결합시키는 것을 특징으로 한다.
일반적으로, 효소는 물 속에서 한 분자씩 떨어져 존재하나 암모늄 설페이트와 같은 염을 첨가하면 수 개씩 뭉쳐 엉김(aggregation) 내지 침전(precipitation)이 일어나게 된다. 이러한 현상을 일으키는 염 종류에는 전술한 암모늄 설페이트 외에도, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 등을 예로 들 수 있다
뿐만 아니라, 글루타르알데히드와 같이 효소의 아민기와 반응하는 작용기를 2 개 이상 가진 아민 결합 2 관능성 화합물을 첨가하면 효소 사이에 개입하여 양쪽 효소들과 서로 결합함으로써 가교결합을 형성할 수 있다. 이러한 현상을 일으키는 2 관능성 화합물 종류에는 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르), 디이소시아네이트, 디애시드 클로라이드 등을 들 수 있다.
이러한 화합물들을 첨가하면 상기 미세튜브에 효소를 더 많이 집적할 수 있어 보다 안정적인 전해효과를 얻을 수 있다.
한편, 상기 효소 첨가시 자성나노입자를 함께 첨가해 분리가 용이하지 않던 미세튜브에 간편한 자성 분리능을 부여한다. 구체적으로, 효소 첨가시 표면에 아민기(-NH2)를 구비한 자성나노입자를 함께 첨가함으로서 효소가 미세튜브에 결합되는 반응과 동일하게 자성나노입자의 아민기와 미세튜브의 카르복실기가 아마인드 바인딩을 이루게 한다. 여기서 효소와 자성나노입자는 경쟁적으로 미세튜브에 결합하게 되고, 이처럼 자성나노입자가 결함됨으로써 미세튜브는 자력에 의한 분리가 가능해진다. 본 발명의 미세튜브는 효소반응에 의한 신호를 발생시키는 효소와 더불어 이처럼 자성나노입자를 구비함으로써 다기능 튜브로 변환된다. 상기 아민기의 도입은 자성나노입자를 포함한 용매에 예컨대 (3-아미노프로필)트리메톡시실란 (APTES) 등 을 첨가하여 반응시킴으로써 이루어진다.
나아가, 상기 효소 및 자성나노입자 결합 후에 미세튜브 표면 등에 존재하는 미반응 작용기가 이후 반응에 예기치 못한 결과를 야기하는 것을 방지하기 위해 BSA (bovime serum albumin)나 트리스 용액 (Tris buffer, 0.1M, pH 7.4) 등으로 보호 (blocking) 하는 것이 바람직하다.
이렇게 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브는 자력을 이용하여 분리해 내고, 분리된 효소/자성나노입자-미세튜브는 상기 효소 고유의 반응을 통해 안정적인 전해 효과를 달성할 수 있다.
나아가, 본 발명 전해재의 안정적인 전해를 위해 각 단계 이후에 완충액 등으로 세척하는 것이 바람직한데, 특히 상기 미세튜브의 산처리단계, 효소/자성나노입자-미세튜브 제조단계, 자력에 의한 분리단계, 자성나노입자 또는 미세튜브 표면의 미반응 결합부위 보호단계 이후 세척하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 단계 외에도 세척단계를 수행하는 것이 가능함은 물론이다.
한편, 본 발명의 전해재는 바이오센서에 도입함으로써 온오프로 전환이 가능한 특징을 부여할 수 있다.
구체적으로, 작용전극, 반대전극, 기준전극으로 이루어진 전지에 기질인 포도당을 넣어 효소반응을 시키면서 본 발명의 전해재를 자석으로 작용전극 또는 반대전극으로 이동시키면, 스위치를 온 또는 오프시킨 것과 같은 효과를 얻을 수 있는 것이다. 바람직하게는 본 발명의 전해재를 작용전극 쪽으로 이동시켰을 때 스위치 온, 작용전극의 반대쪽으로 이동시켰을 때 스위치 오프로 작동하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 전해재는 자석에 의해 상기 전해재와 전극 사이의 거리를 변경함으로써 온오프 전환이 가능한 바이오연료전지로도 활용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 전해재를 자석으로 양극 또는 음극으로 이동시키면, 스위치를 온 또는 오프시킨 것과 같은 효과를 얻을 수 있는 것이다. 바람직하게는 본 발명의 전해재를 음극 쪽으로 이동시켰을 때 스위치 온, 음극의 반대쪽으로 이동시켰을 때 스위치 오프로 작동하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.
실시예
실시예 1: 전해재의 제조
탄소나노튜브 (다수 벽체형, 외경 30 × 15 nm, 길이 1~5 μm, 순도 > 95 %)를 Nanolab, Inc. (Newton, MA, USA)로부터 구입하고, 상기 탄소나노튜브 100 mg을 H2SO4 (98 %, 7.5 ml) 및 HNO3 (70 %, 2.5 ml)를 함유한 산 용액에 첨가한 후, 실온에서 교반 (100 rpm)하면서 하룻 밤 동안 처리하였다. 상기 처리한 탄소나노튜브를 탈이온수로 세척하고 80 ℃ 진공오븐에서 건조시켰다. 탄소나노튜브 표면에 작용기를 도입하기 위해, 상기 산 처리된 탄소나노튜브 (0.1 mg)를 탈이온수에 현탁시키고, 이어서 MES (2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid) 완충액 (0.1 M, pH 6.5) 0.4 ml, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 용액 (10 mg/ml) 0.2 ml 및 NHS(N-hydroxysuccinimde) 용액 (50 mg/ml) 0.4 ml를 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 교반 (200 rpm)하며 배양했다. 배양 후 EDC 용액 등을 원심분리로 제거하고 나서, PB (phosphate buffer. 0.1 M, pH 7.4)에 재현탁하여 농도를 0.1 mg/ml로 조정하였다. 한편, 상기 탄소나노튜브에 결합하는 자성나노입자의 제조를 위해 출발물질로 Fe(아세틸아세토네이트)3 (97 %, Aldrich), 1,2 헥사데칸디올 (90 %, Aldrich), 올레익산 (90 %, Aldrich), 올레일아민 (oleylamine. 70 %, Aldrich), 옥틸에테르 (99 %, Aldrich)를 사용하였다. Fe(아세틸아세토네이트)3 (0.35 g), 1,2 헥사데칸디올 (1.21 g), 올레익산 (0.8 g), 올레일아민 (0.8 g), 옥틸에테르 (10 mL)를 50 mL 플라스크에 넣고, 질소를 주입하여 질소 분위기를 만든 후 200 ℃에서 2 시간 반응시킨 다음 300 ℃에서 1 시간 동안 환류하고 실온까지 냉각시켰다. 제조된 결과물에 에탄올 20 mL를 첨가하여 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리시켜 과량으로 넣었던 계면활성제 및 용매를 제거하고 침전물을 얻었다. 침전물을 60 ℃의 건조기에서 건조시켜 자성나노입자(Fe3O4) 나노분말을 수득하였다. 나노분말을 실리카 코팅하기 전 폴리옥시에틸렌(5)노닐페닐에테르(Igepal) 0.22 g과 시클로헥산 4.5 mL를 혼합하여 초음파로 분산시켰다. 그 후 합성한 Fe3O4 분말과 시클로헥산을 (1 mg / 1 mL) 비율로 혼합하여 자성나노입자(Fe3O4) 용액을 만들었다. Fe3O4 용액을 160 μL 취득하여 Igepal과 시클로헥산을 혼합한 용액에 투입 후 일정한 속도로 교반하였다. 10분 후 NH4OH 50 μL를 첨가하였다. 15 분 후, TEOS 30 μL를 넣고 빠르게 교반하였다. 반응시간을 6, 24, 72 시간으로 변화시켜 똑같은 양의 용액을 채취하여 각각 메탄올 10 mL를 첨가 후 원심분리기 (10,000 rpm / 10 min) 사용하여 실리카 코팅된 Fe3O4을 얻었다. 수득된 침전물을 5 분 동안 자연 건조한 후 에탄올 5 mL에 넣고 초음파를 통해 분산시켰다. 실리카 코팅된 자성나노입자의 아민기 도입을 위해 (3-아미노프로필)트리메톡시실란을 첨가하고 상온에서 2 시간 동안 교반하여 자성나노입자를 처리하였다. 반응 후에 에탄올과 APTES를 제거하기 위해 진공오븐에서 12 시간 동안 건조시킨 뒤 얻어진 아민기가 도입된 자성나노입자 물질을 물에 분산시켜 사용하였다.
그런 다음, 포도당 산화효소 용액 (10 mg/ml. Sigma-Aldrich. USA) 0.5 ml 및 자성나노입자 (1.8 mg/ml) 0.5 ml를 탄소나노튜브 혼합액 1 ml에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반 (100 rpm)하면서 배양했다. 배양 후, 암모늄 설페이트 65 % 수용액 1.34 ml를 첨가하고 30 분 동안 배양했다. 가교결합을 위해 제조된 효소/자성입자-미세튜브를 글루타르알데히드 70 μl로 처리하고, 4 ℃에서 하룻 밤 동안 교반 (50 rpm)하며 배양했다. 상기 배양된 효소/자성입자-미세튜브를 PB (0.1 M, pH 7.4)로 원심분리를 통하여 세척하고, 0.1 M Tris-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.4)으로 재세척한 후, 30 분 동안 Tris-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.4)으로 교반 (100 rpm)하면서 배양하여 미반응 카르복실기를 보호했다. 최종 효소/자성입자-미세튜브를 자력을 이용하여 PB 완충액 (0.1 M, pH 7.4)으로 3 회 세척하고, 4 ℃에서 보관하였다. 도 1b의 좌측 사진은 도 1a에서 맨 처음 단계의 탄소나노튜브를 SEM (Scanning electron microscope)을 통해 관찰한 결과로서, 효소 및 자성나노입자가 공유결합되기 전의 처음 상태를 보여주는 결과이다. 그리고, 우측 사진은 효소와 자성나노입자가 고정화단계를 거쳐 탄소나노튜브 표면에 두껍게 코팅된 후의 모습을 SEM을 통해 관찰한 결과로서, 좌측 사진에 비해 두께가 많이 두꺼워진 것을 확인할 수 있다. 고정화 전의 탄소나노튜브의 평균 직경은 22.85 ± 4.83 nm이고 고정화 후의 평균 직경은 51.69 ± 11.86 nm으로 2 배 이상 직경이 증가하였다.
실시예 2: 자석을 이용한 온오프형 바이오센서의 제조
본 발명의 바이오센서를 제조하기 위해 금 작용전극, 백금 와이어 (CHI 115) 상대전극, Ag/AgCl (CHI 111) 기준전극으로 구성된 전압전류측정기를 이용하였다. 금 작용전극은 전기화학적 전지 (4 ml)의 바닥에 부착되었다. 산화환원 전자 매질로서의 페로센메탄올 (ferrocenemethanol. FcMeOH) 0.1 mM을 함유한 PB 완충액 (0.1 M, pH 7.4)이 염기성 완충액을 사용되었다. 실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브 (0.5 mg)가 전해액 내에 현탁되었다. 순환 전류측정법을 이용하여 전기화학적 측정을 수행하였다 (Biologic. SP-150 TN. USA). 자석을 이용하여 실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브를 금 작용전극 표면으로 옮겨 놓은 '스위치 온'의 경우와 실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브가 금 작용전극 표면에서 떨어진 '스위치 오프'의 경우에 대한 개념도를 도 4a에 나타내었고, 순환 전압전류를 측정하여 그 결과를 도 4b 및 도 4c에 나타내었다. 실제 전극 위에서 본 발명의 전해재가 이동하는 모습을 표현한 도 4a의 좌측 도면은 자석을 전극의 반대방향에 위치하게 하여 전해재가 전극으로부터 멀리 떨어져 전기화학반응이 일어나지 못하는 '스위치 오프' 상태를 표현한 것이고, 우측 도면은 자석을 전극 아래쪽에 위치시켜 전해재가 전극 표면에 위치하게 되어 전기화학반응이 일어나 '스위치 온' 상태를 표현한 것이다. 측정 결과 본 발명의 효소/자성입자-미세튜브 전해재는 바이오센서의 온오프형 동작을 가능하게 할 뿐만 아니라, 도 4c에 나타난 바와 같이 활성의 저하 없이 온오프 동작의 반복도 가능함을 확인할 수 있다.
실시예 3: 전해재의 안정성 시험
실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브의 안정성 시험을 위해 효소/자성입자-미세튜브 샘플을 PB 완충액 (100 mM. pH 7.4)에 농도가 0.1 mg/ml이 되도록 현탁시킨 후 장시간 상온에 방치시키면서 시간별로 효소/자성입자-미세튜브 10 μl를 채취하여 포도당산화효소의 기질용액인 포도당용액 990 μl에 넣고 효소반응을 진행한 후 포도당산화효소의 활성을 측정하였다. 측정은 분광측광기 (spectrophotometer) (Shimadzu, UV-1800, Japan)를 통해 시간당 흡광도 변화 (abs/min)를 측정함으로써 이루어졌다. 대조군으로는 자성나노입자와 함께 나노튜브에 코팅되지 않은 유리효소를 사용하였다. 포도당산화효소 분말을 PB 완충액 (100 mM. pH 7.4)에 농도가 0.1 mg/ml이 되도록 현탁시킨 후 장시간 상온에 방치시키면서 시간별로 유리효소용액 10 μl를 채취하여 포도당산화효소의 기질용액인 포도당용액 990 μl에 넣고 효소반응을 진행한 후 포도당산화효소의 활성을 측정하였다. 상기 단계에 의해 포도당 산화효소와 자성나노입자가 코팅된 탄소나노튜브는 도 3에 나타낸 것과 같이 코팅되지 않은 포도당 산화효소에 비해 월등한 안정성을 보인다. 100일 동안 상온에 방치하였을 경우 코팅되지 않은 포도당 산화효소는 활성도가 감소함을 보였지만 탄소나노튜브에 코팅된 포도당 산화효소는 그 활성도가 감소하지 않고 유지되는 것을 볼 수 있다. 이를 통해 코팅된 포도당 산화효소의 안정성을 확인 할 수 있다.
실시예 4: 자석을 이용한 온오프형 바이오연료전지의 제조
실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브가 카본페이퍼 상에 구비된 음극 및 공기 공급 백금 양극을 포함하는 양성자 교환막 유형의 전지를 바이오연료전지 키트로서 채용하였다. 온오프형 바이오 연료전지 키트는 2 cm × 2 cm 소형연료전지 (PEM-형)를 사용하였고, 이 키트는 Pt가 양극 (+), 포도당 산화효소와 자성나노입자가 코팅된 나노튜브가 집적된 카본페이퍼가 음극 (-), 양성자 전달막 (proton exchange membrane, Nafion 117)으로 사용되는 MEA (membrane electrode assemblies)로 구성되어 있고, MEA는 Fuel cell store (San Diego, CA, USA)에서 주문제작하여 사용하였다. 양성자 전달막의 면적은 25 cm2이고, 활성면적은 9 cm2이다. 전지 본체는 테프론으로 이루어졌으며, 음극 및 양극 전류 수집기 (current collector)는 티타늄 재질이다. 실리콘개스킷은 바이오연료전지 키트의 샘플이 바깥쪽으로 누출되는 것을 예방하는 역할을 한다. 바이오연료전지의 온오프 테스트를 위해 실시예 1의 포도당산화효소와 자성나노입자가 코팅된 탄소나노튜브 샘플을 산화환원 전자 매질로서 페로센메탄올 0.1 mM를 포함하는 포도당 용액 (20 mM in 0.1 M PB buffer, pH 7.4)에 현탁시킨 뒤 바이오연료전지 키트의 주입구를 통해 키트에 삽입했다. 키트 안에서는 효소/자성입자-미세튜브가 자석에 의해 움직여질 수 있다. 자석을 키트 아래로 내리면 도 5에 도시한 바와 같이, 실시예 1의 효소/자성입자-미세튜브가 카본페이퍼인 음극으로 끌어당겨지고, 이는 바이오연료전지의 '스위치 온'을 의미한다. 반대로 자석을 키트 위로 올리면, 효소/자성입자-미세튜브가 카본페이퍼인 음극에서 멀어지게 되고, 이는 바이오연료전지의 '스위치 오프'를 의미한다. 음극으로 사용되는 카본페이퍼는 1.8 cm × 2.2 cm × 370 ㎛ 의 규격을 사용하고 이는 Fuel cell Store (Fuel cell store, #590437, USA)에서 구입하였다. 실험 결과 본 발명의 효소/자성입자-미세튜브 전해재는 바이오연료전지의 온오프형 동작을 가능하게 할 뿐만 아니라, 활성의 저하 없이 온오프 동작의 반복도 가능함을 확인할 수 있다. 그리고, 전압과 전류의 변화를 통하여 분극 곡선 (도 6a)를 구하여 출력밀도 (도 6b)를 구하였는데, 구체적으로 전기화학적 분석 장비인 Bio-Logic SP-150의 constant load discharge (CLD)모드를 이용하여 분극 곡선을 구할 수 있고 이를 통하여 전력 밀도를 계산할 수 있다. CLD 모드는 바이오연료전지로 일정한 외부 저항을 3 분 간격으로 변화시켜 주도록 설정되었으며, 이에 따른 전압과 전류의 변화를 통하여 분극 곡선과 출력밀도를 구할 수 있었다. 또한, 도 7은 도 6a 및 도 6b를 바탕으로 스위치 온 상태와 스위치 오프 상태의 출력 밀도의 차이가 두드러지는 전류 밀도인 6 μA/cm2에 해당하는 전류를 바이오연료전지에 인가시켜, 온 오프 상태를 반복하여 출력밀도를 계산한 결과이다. 오프 상태에서 바이오연료전지의 출력이 거의 나오지 않는 것을 볼 수 있으며, 온 상태에서는 원할한 전력 생산이 이루어지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 15 번이 넘는 반복 사용에도 불구하고 초기의 출력량에서 눈에 띄는 감소를 보이지 않는 것을 확인하였다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
본 발명은 한국연구재단의 바텔연구소 유치활용을 통한 급성 호흡기 감염 및 중증 패혈증 조기진단용 나노바이오 (해외우수연구기관유치사업. K2060100000209E010000210. 2009/07/01~2010/06/30), 한국연구재단의 바텔연구소 서울유치 및 NBT연구기반조성사업 (세계 유수연구소 유치지원사업. 10920. 2006/03/01~2011/08/31), 중소기업청의 효소코팅된 탄소나노튜브를 이용한 혈당센서의 개발 (산학연공동기술개발사업. 000373050109. 2009/06/01~2010/05/31) 및 한국학술진흥재단의 트립신 가수분해와 바이오연료전지를 위한 나노효소코팅의 안정성 및 활성 기작에 대한 연구 ((이공)일반연구자지원-기본연구. 20090075638. 2009/05/01~2010/04/30)의 지원을 받아 수행되었습니다.

Claims (16)

  1. (A) 효소 및 자성나노입자 (magnetic nanoparticles)를 미세튜브와 혼합하여 상기 효소 및 자성나노입자가 상기 미세튜브의 표면에 결합된 효소/자성입자-미세튜브를 제조하고, 여기서 상기 미세튜브와 상기 효소의 결합 및 상기 미세튜브와 상기 자성나노입자의 결합은 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴(biotin) 결합, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 커플링, 설프하이드릴아민(sulphhydrylamine) 커플링, 또는 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)-히스티딘 결합에 의해 이루어지는 단계;
    (B) 상기 효소, 자성나노입자 및 미세튜브의 혼합물에 염을 첨가하여 상기 효소를 서로 뭉치게 하는 단계; 및
    (C) 상기 효소, 자성나노입자 및 미세튜브의 혼합물에 아민 결합 2 관능성 화합물을 첨가하여 상기 효소를 서로 가교결합시켜, 상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브를 제조하는 단계
    를 포함하고,
    상기 단계 (C) 이후에,
    (E) 상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브 중 효소, 자성나노입자 또는 미세튜브의 미반응 결합부위를 보호하는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (A) 이전에,
    (D) 상기 미세튜브의 표면을 산으로 처리하는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 미세튜브;
    상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소; 및
    상기 효소에 혼합된 자성나노입자
    를 포함하고,
    상기 미세튜브와 상기 효소의 결합 및 상기 미세튜브와 상기 자성나노입자의 결합은 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴(biotin) 결합, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, EDC [N-ethyl-N'-(dimethlaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 커플링, 설프하이드릴아민(sulphhydrylamine) 커플링, 또는 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)-히스티딘 결합에 의해 이루어지고,
    상기 미세튜브 표면에의 효소 집적은 염, 아민 결합 2 관능성 화합물, 또는 염 및 아민 결합 2 관능성 화합물에 의해 이루어지고,
    상기 효소가 상기 미세튜브의 표면에 집적된 효소/자성입자-미세튜브 중 효소, 자성나노입자 또는 미세튜브의 미반응 결합부위는 보호된 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 미세튜브는 상기 효소의 집적 전에 산으로 처리된 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  6. 삭제
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 미세튜브는 탄소나노튜브인 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  8. 청구항 4에 있어서,
    상기 효소는 포도당 산화효소인 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  9. 청구항 4에 있어서,
    상기 미세튜브 표면에의 효소 집적을 위한 염은 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  10. 청구항 4에 있어서,
    상기 미세튜브 표면에의 효소 집적을 위한 아민 결합 2 관능성 화합물은 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르), 디이소시아네이트, 디애시드 클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재.
  11. 바이오센서에 있어서,
    청구항 4, 청구항 5, 또는 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 청구항의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 포함하고,
    자석에 의해 상기 전해재와 전극 사이의 거리를 변경함으로써 온오프가 전환되는 온오프형 바이오센서.
  12. 청구항 11에 있어서,
    자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 상기 전극 쪽으로 이동시키면 상기 바이오센서가 스위치 온되는 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 전극은 작용전극인 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오센서.
  14. 바이오연료전지에 있어서,
    청구항 4, 청구항 5, 또는 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 청구항의 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 포함하고,
    자석에 의해 상기 전해재와 전극 사이의 거리를 변경함으로써 온오프가 전환되는 온오프형 바이오연료전지.
  15. 청구항 14에 있어서,
    자석에 의해 상기 온오프형 바이오센서 또는 바이오연료전지용 전해재를 상기 전극 쪽으로 이동시키면 상기 바이오연료전지가 스위치 온되는 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오연료전지.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 전극은 음극인 것을 특징으로 하는 온오프형 바이오연료전지.
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