KR20170128392A

KR20170128392A - 핵산의 회수 방법

Info

Publication number: KR20170128392A
Application number: KR1020177027667A
Authority: KR
Inventors: 쇼타 세키구치; 신지로 사와다
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2017-11-22
Also published as: CN107406847A; EP3272866B1; JP6711270B2; EP3272866A4; US20180051274A1; JPWO2016152763A1; KR102488291B1; WO2016152763A1; BR112017017878A2; CA2977347A1; US11118173B2; EP3272866A1

Abstract

본 발명은, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체를 사용한 핵산의 회수 방법, 당해 방법에 사용하는 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 핵산 회수용 담체 및, 핵산 회수용 키트를 제공한다.

Description

핵산의 회수 방법

본 발명은 핵산을 회수하는 방법, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체 및 핵산 회수용의 키트에 관한 것이다.

핵산을 사용한 실험 기술의 발전에 의해 신규 유전자 탐색이나 그의 해석이 가능하게 되었다. 암 등의 질환을 특정하기 위하여 인간의 게놈이 해석되어, 병원체의 감염을 특정하기 위하여 그것들의 게놈이 해석되는 등, 의료 현장에 있어서도 유전자 해석을 이용한 스크리닝 검사나 임상 검사 등이 행해지고 있다.

또한, 유전자 해석의 표적으로서는, 게놈과 같은 장쇄 핵산뿐만 아니라, 단쇄 핵산도 주목받고 있다. 최근 발견된 miRNA는 18 염기 이상 25 염기 이하의 1 본쇄 RNA이고, 60 염기 이상 90 염기 이하의 pre-miRNA로부터 생합성된다. 이들은, 단백질의 합성이나 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖고 있는 점에서 질환과 관련이 있다고 여겨지고, 유전자 해석의 표적으로서 주목받고 있다. 또한, 메타게노믹 진단법과 같이, 임상 검체 중의 병원체 유래에 몇백 염기쌍의 핵산 단편을 차세대 시퀀서로 망라적으로 해석하는 방법도 있고, 신규인 유전자 해석법으로서 주목받고 있다. 현재의 유전자 해석의 표적은, 유전자 탐색이 진행함에 따라서 다양화되고 있다고 할 수 있다. 따라서, 유전자 해석의 표적 다양화에 맞추어, 핵산의 회수 방법도, miRNA와 같은 몇십 염기의 핵산으로부터 게놈과 같은 장쇄의 핵산까지 회수할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

유전자 해석을 하는 데 있어서 먼저 필요해지는 것은, 생물학적 시료로부터 핵산을 회수하는 공정이다. 핵산을 고순도, 고수율로 회수할 수 있으면, 그 후의 검출 반응에 있어서 고감도의 유전자 검출이 가능하게 된다. 핵산의 회수 방법으로서는, 페놀·클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 실리카로의 핵산 흡착 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다.

그 중에서도 가장 범용적인 방법은, 특허문헌 1에 기재되어 있는, 실리카를 포함하는 금속 산화물에 핵산을 흡착, 용출시켜서 회수하는 Boom법이다. 이 방법은, 원심 조작에 의해 핵산의 흡착된 실리카로부터 핵산을 회수하는 동시에 핵산의 농축을 할 수 있는 특징이 있다. 그러나, Boom법은 핵산의 흡착 과정에 있어서 알코올 등의 유기 용매의 사용이 불가결하고, 회수 조작의 번잡화나 용매 폐기의 등의 문제가 있다. 또한, 단리한 핵산에 이들 유기 용매가 혼입되고, 그 후의 검출 반응에 영향을 미치는 문제도 있다.

또한, 특허문헌 2에는, 300 염기쌍 이상 1000 염기쌍 이하의 길이를 갖는 핵산의 실리카에 대한 흡착성은, 그것보다 긴 길이를 갖는 핵산의 흡착성이 떨어지는 것이 기재되어 있고, 또한 짧은 pre-miRNA나 miRNA를 회수하는 것은 곤란한 것이 예상된다. 유전자 해석은 의료 현장에 있어서도 이용되고 있는 점에서, 번잡한 조작이나 유기 용매를 사용하지 않고, 핵산을 회수할 수 있는 방법이 바람직하다.

Boom법 이외의 핵산의 회수 방법으로서는, 특허문헌 3 및 4에, 유기 용매를 이용하지 않는 핵산의 회수 방법이 기재되어 있다. 특허문헌 3에는, 알파 산화알루미늄 입자, 지르코니아 입자, 티타니아 입자 등에, 핵산을 흡착시켜, 효율적으로 회수하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는, 이온 교환 크로마토그래피의 원리를 사용하여, 핵산을 흡착시켜, 회수하는 방법이 기재되어 있고, 음이온 교환 재료로서 산화알루미늄을 이용할 수 있다고 나타나 있다.

한편, 특허문헌 5에는, 핵산을 용해시키는 용액에 의존하여, 알파 산화알루미늄 및 감마 산화알루미늄에 핵산을 견고하게 결합시키거나, 반대로 결합을 저지시키거나 할 수 있다고 기재되어 있다. 또한, 결합한 핵산은, 반복 세정해도, 거의 용출되지 않는다고 기재되어 있다.

미국 특허 제5234809호 명세서 일본 특허 공표 제2011-522529호 공보 국제 공개 제92/18514호 일본 특허 공표 제2013-505719호 공보 일본 특허 공표 제2005-505269호 공보

상기한 바와 같이 특허문헌 3 또는 4에는, 산화알루미늄을 사용하여 핵산을 효율적으로 회수할 수 있는 것이 나타나 있지만, 특허문헌 5에는, 결합한 핵산이 용출되지 않는다고 기재되어 있다. 그래서, 발명자들은, 특허문헌 3에 기재되어 있는 산화알루미늄을 사용한 핵산의 회수 방법을 검토하였다.

후술하는 비교예 1에서는, 특허문헌 3의 실시예 4의 조성에 가능한 한 가까운 산화알루미늄을 준비하고, 특허문헌 3의 조건을 참고로 핵산을 흡착시키고, 그 후, 흡착시킨 핵산을 용출시켜서 회수할 수 있는지를 검토하였다. 그러나, 핵산은 산화알루미늄에 흡착되지만, 핵산의 용출률이 낮고, 핵산을 고수율로 회수할 수 없었다.

본 발명자들은, 이들의 결과로부터, 산화알루미늄에 결합한 핵산의 용출률을 향상시킬 수 있으면, 유기 용매를 사용하지 않는 간편한 방법으로 핵산을 효율적으로 회수할 수 있다고 생각하였다.

본 발명자들은, 산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킴으로써, 핵산의 흡착률을 저하시키지 않고, 핵산의 용출률을 개선시킬 수 있는 것을 알아내었다.

또한, 본 발명을 사용함으로써 miRNA와 같은 매우 짧은 핵산도 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 이하와 같다.

(1) 생물학적 시료로부터 핵산을 회수하는 방법이며, 이하의 공정:

공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 핵산을 포함하는 용액을 혼합하고, 담체에 핵산을 흡착시키는 공정,

공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 용액으로부터, 상기 핵산이 흡착된 담체를 분리하는 공정,

공정 c) 공정 b)에 있어서 분리한 상기 핵산이 흡착된 담체에 용출액을 추가하여 핵산을 회수하는 공정,

을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.

(2) 상기 수용성의 중성 중합체가 pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 핵산의 회수 방법.

(3) 상기 중합체가, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)에 기재된 핵산의 회수 방법.

(4) 상기 용출액이 완충액인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 회수 방법.

(5) 상기 생물학적 시료가, 혈액, 오줌, 타액, 점막, 땀, 배양 세포, 배양 세포의 배양액, 조직 시료 또는 표본인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 회수 방법.

(6) 산화알루미늄의 담체의 표면에 수용성의 중성 중합체가 흡착된 핵산 회수용의 담체.

(7) 상기 수용성의 중성 중합체가 pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 (6)에 기재된 담체.

(8) 상기 수용성의 중성 중합체가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 (6) 또는 (7)에 기재된 담체.

(9) 상기 수용성의 중성 중합체가 산화알루미늄의 담체의 표면 중 7％ 이상을 피복하도록 흡착하고 있는 것을 특징으로 하는 (6) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 담체.

(10) (6) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 담체와 완충액을 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 회수용의 키트.

본 발명에 의해, 산화알루미늄을 담체로서 사용해도, 유기 용매를 사용하지 않고, 간편한 방법으로 핵산을 고수율로 회수하는 것, 또한 지금까지 효율적으로 회수하는 것이 어려웠던 pre-miRNA나 miRNA 등의 매우 짧은 핵산도 고수율로 회수하는 것이 가능해진다.

본 발명에서 사용하는 생물학적 시료는, 핵산을 포함하는 임의의 시료를 사용할 수 있다. 핵산에는, 예를 들어 RNA, DNA, RNA/DNA(키메라) 및 인공 핵산 등을 들 수 있다. DNA에는, cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA 등을 들 수 있다. 또한, RNA에는, total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA 또는 non-coding RNA, 그것들의 전구체 또는 합성 RNA 등을 들 수 있다. 합성 DNA 및 합성 RNA는, 소정의 염기 서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 됨)에 기초하여, 예를 들어 자동 핵산 합성기를 사용하여, 인공적으로 제조할 수 있다.

생물학적 시료로서는, 예를 들어 배양 세포, 배양 세포의 배양액, 조직 시료나 표본 등의 세포 유래 시료, 세균이나 바이러스 등의 미생물 유래 시료, 체액이나 변 등의 인간을 포함하는 동물 유래 시료, 핵산 이외에, 단백질, 당이나 지질 등의 생물학적 기능을 갖는 화합물을 포함하는 용액 등을 이용할 수 있고, 이들에 한정되지 않는다. 상기 생물학적 시료는, 바람직하게는 배양 세포나 체액이고, 더욱 바람직하게는 혈액이다. 혈액에는 전혈, 혈장, 혈청, 혈구 등이 포함된다.

이들의 생물학적 시료가 체액 등의 액체 시료인 경우에는, 채취 후 그대로 본 발명을 적용해도 되고, 채취 후에 용액을 첨가하여 희석해도 된다. 생물학적 시료가 세포 펠릿이나 조직편 등의 고체 시료인 경우에는, 채취 후에 물이나 완충액으로 희석하고 나서 본 발명에 사용해도 된다.

생물학적 시료는, 필요에 따라, 이하와 같은 처리를 해도 된다. 이것은, 핵산이 생물학적 시료에 있어서 세포막, 세포벽, 소포, 리포솜, 미셀, 리보솜, 히스톤, 핵막, 미토콘드리아, 바이러스의 캡시드, 엔벨로프, 엔드솜 또는 엑소솜과 같은 화합물에 내포되어 있거나, 이들이 상호 작용하고 있거나 하는 것이 많기 때문이다. 보다 수율 좋게 핵산을 회수하기 위해서, 이들로부터 유리시키는 것을 목적으로 한 처리를 행해도 된다.

구체적으로는, 대장균이 포함되어 있는 생물학적 시료로부터 핵산의 회수 효율을 높이기 위해서, 이하와 같은 처리를 행할 수 있다. 예를 들어, 대장균이 포함되는 생물학적 시료에 대하여 0.2M의 수산화나트륨과 1％의 SDS의 혼합액을 가할 수 있고(알칼리 변성법), 또한, 10％의 살코신 용액을 추가할 수도 있다(살코신에 의한 비변성법). 또한, 이들의 용액에 리소자임을 첨가해 두어도 된다. 또한, 프로테이나제 K에 의해 37℃에서 1시간 처리를 행할 수도 있다. 다른 방법으로서 초음파 처리를 행할 수도 있다.

생물학적 시료에 대하여, 효모가 포함되어 있는 생물학적 시료로부터 핵산의 회수 효율을 높이기 위해서, 이하와 같은 처리를 행할 수 있다. 예를 들어, 세이가가꾸 고교 가부시키가이샤로부터 시판되고 있는 지몰리아제로 처리한 후에 10％의 SDS를 첨가할 수도 있다.

생물학적 시료에 대하여, 세포가 포함되어 있는 생물학적 시료로부터 핵산의 회수 효율을 높이기 위해서, 이하와 같은 처리를 행할 수 있다. 예를 들어, 1％의 SDS를 첨가할 수 있다. 다른 방법으로서, 4M 이상의 염화 구아니디늄, 구아니딘 티오시안산염 및 요소 등을 첨가할 수 있다. 이 용액에 대하여, 살코신을 0.5％ 이상이 되도록 첨가해도 된다. 또한, 머캅토에탄올을 50mM 이상의 농도가 되도록 첨가해도 된다.

상기의 조작에 있어서, 생물학적 시료에 포함되는 핵산의 분해를 억제하기 위해서, 핵산의 분해 효소의 저해제를 첨가해도 된다. DNA 분해 효소의 저해제로서, EDTA를 1mM 이하의 농도로 첨가할 수 있다. 또한, RNA 분해 효소의 저해제로서 시판되고 있는 RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor(프로메가 가부시키가이샤), Ribonuclease Inhibitor(다카라 바이오 가부시키가이샤), RNase inhibitor(도요보 가부시키가이샤) 등을 사용할 수 있다.

생물학적 시료에 DNA와 RNA가 혼재하고 있는 경우에는, 페놀·클로로포름 추출에 의해 분리할 수도 있다. 예를 들어, 페놀·클로로포름 추출을 산성 조건에서 행하면 RNA는 수층, DNA는 클로로포름층으로 분리되고, 중성 조건에서 행하면 RNA와 DNA는 수상으로 분배된다. 이 성질을 이용하여, 취득하고 싶은 핵산의 종류에 따라 조건을 선택할 수 있다. 상기의 클로로포름은 p-브로모아니솔로 치환할 수도 있다.

페놀·클로로포름 추출은, 시판 시약인 ISOGEN(등록 상표: 가부시키가이샤 닛본진), TRIzol(등록 상표: 라이프 테크놀로지즈 재팬 가부시키가이샤), RNAiso(다카라 바이오 가부시키가이샤), 3D-Gene(등록 상표) RNA extraction reagent from liquid sample kit(도레이 가부시키가이샤)를 이용할 수도 있다. 이상의 처리는, 그의 일 공정만을 행해도 되고, 다른 조작에 있어서의 공정과 조합할 수도 있다. 또한, 그것에 사용하는 용액의 농도는, 필요에 따라서 바꿀 수도 있다.

본 발명에 있어서 핵산을 포함하는 용액으로서는, 핵산, 인공 핵산, 색소나 인산기 등의 수식이 실시된 핵산을 용해시킨 용액이나, 생체 시료를 사용하는 경우에는, 체액 등의 액체 시료나 그 희석액, 세포 펠릿이나 조직편 등의 고체 시료의 희석액을 사용할 수 있다. 또한, 액체 시료나 고체 시료를 포함하는 생물학적 시료에 대하여, 상기의 어느 하나의 처리를 행한 후에 얻어지는 용액을 그대로 사용해도 되고, 필요에 따라 희석해도 된다. 희석하는 용액은 특별히 한정되지 않지만, 물이나 Tris-염산 완충액 등의 핵산을 포함하는 용액에 범용되는 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 핵산을 포함하는 용액은, 예를 들어 4M 이상의 염화구아니디늄, 구아니딘 티오시안산염이나 요소를 첨가한 생물학적 시료가 바람직하다.

본 발명에 있어서, 회수하는 핵산의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 1000 염기쌍 이하인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 종래 기술에서는 어려웠던 300 염기쌍 이하의 핵산도 고수율로 회수할 수 있고, 100 염기쌍 이하의 pre-miRNA나 miRNA도 고수율로 회수할 수 있다.

본 발명은 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체를 사용함으로써, 고수율의 핵산의 회수가 달성된다. 본 발명의 담체는, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체이다. 이후, 본 발명의 담체라고 기재한다.

본 발명의 담체에 흡착된 핵산의 흡착률은, 이하와 같이 구할 수 있다. 처음에 핵산을 포함하는 용액 중의 핵산량을 산출한다. 다음으로 본 발명의 담체와 핵산을 포함하는 용액을 혼합하고, 본 발명의 담체에 핵산이 흡착된 후의 혼합액 중의 핵산량을 산출하여, 핵산을 포함하는 용액 중의 핵산량으로부터의 차를 구한다. 얻어진 값을 본 발명의 담체에 흡착한 핵산량으로 하고, 본 발명의 담체에 흡착된 핵산량을, 핵산을 포함하는 용액 중의 핵산량으로 나눔으로써 핵산의 흡착률을 산출할 수 있다.

본 발명의 핵산 용출률은, 이하와 같이 구할 수 있다. 핵산이 흡착된 본 발명의 담체에 대하여 용출액을 첨가하여, 용출한 후의 용액 중의 핵산량을 산출하고, 핵산의 용출량을 산출한다. 이 핵산의 용출량을 상기에서 산출한 본 발명의 담체에 흡착된 핵산량으로 나누어, 용출률을 산출할 수 있다.

본 발명에 있어서의 핵산의 회수율은, 상기의 방법에 의해 산출된 흡착률과 용출률의 곱으로 산출한다.

핵산량의 정량의 방법으로서는 흡광도 측정, 형광 측정, 발광 측정, 전기 영동, PCR, RT-PCR, 마이크로 어레이를 사용한 해석, 시퀀서를 사용한 해석 등을 들 수 있다. 비수식의 핵산이면, 260nm에 있어서의 흡광도를 측정함으로써 핵산량을 정량할 수 있다. 또한, 형광 색소가 수식된 핵산이면, 그 형광 색소에서 유래되는 형광 강도를, 농도 기지의 용액에 있어서의 형광 강도와 비교함으로써 핵산량을 정량할 수 있다. 그 밖에, 전기 영동에 의해 행할 수 있다. 전기 영동에 의한 회수율의 산출 방법은, 농도 기지의 샘플과 동시에 회수 조작을 행한 샘플을 영동하고, 겔을 염색하여 밴드의 농도를 화상 해석에 의해 비교함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서 중합체는, 기본 단위인 단량체나 단량체라고 불리는 반복 단위가 다수 연결된 화합물의 총칭이다. 본 발명의 담체에 사용하는 중합체는, 1종의 단량체를 포함하는 단독 중합체와 2종류 이상의 단량체를 포함하는 공중합체의 모두가 포함되고, 임의의 중합도의 중합체도 포함된다. 또한, 천연 중합체와 합성 중합체의 모두가 포함된다.

본 발명의 담체에 사용하는 수용성의 중성 중합체는, 물에 대하여 용해 가능한 성질을 갖고, 물에 대한 용해도가, 적어도 0.0001wt％ 이상이고, 바람직하게는 0.001wt％ 이상, 보다 바람직하게는 0.01wt％ 이상, 더욱 바람직하게는 0.1wt％ 이상의 중합체이다.

본 발명의 담체에 사용하는 수용성의 중성 중합체는, 바람직하게는 pH7의 용액 중에서 제타 전위가 -10mV 이상 +10mV 이하의 중합체이다. 보다 바람직하게는 -8mV 이상 +8mV 이하이고, 더욱 바람직하게는 -6mV 이상 +6mV 이하, 특히 바람직하게는 -4.0mV 이상 +1.1mV 이하의 중합체이다.

제타 전위란, 용액 중에 있어서의 콜로이드 계면의 전기적 성질을 나타내는 값의 하나이다. 하전한 콜로이드가 용액에 분산되어 있으면, 콜로이드의 표면에서는 콜로이드의 표면 하전에 대한 반대 이온에 의해 전기 이중층이 형성되어 있다. 이때의 콜로이드 표면의 전위를 표면 전위라고 칭한다. 전기 이중층은, 콜로이드의 표면 전하의 정전 상호 작용에 의해 형성되어 있기 때문에, 콜로이드측일수록 이온이 강하게 고정되어 있다. 전기 이중층 중에서도 정전 상호 작용에 의해 반대 이온이 콜로이드 표면에 강하게 고정되어 있는 층을 고정층, 고정층의 전위를 고정 전위라고 칭한다. 용액에 대하여 콜로이드를 이동시키면 고정층은 콜로이드와 함께 이동한다. 이때, 콜로이드에서 보아 고정층보다도 외측에, 용액이 갖는 점성을 이유로 콜로이드와 함께 이동하는 경계면이 있다. 이것을, 미끄럼면, 또는 전단면이라고 칭한다. 콜로이드에서 충분히 떨어진 지점의 전위를 제로점으로 했을 때의, 이 미끄럼면의 전위는 제타 전위라고 정의되어 있다. 이와 같이, 제타 전위는 콜로이드의 표면 전하에 의존하여 변화하고, 표면 전하는 pH에 의존하는 프로톤의 착탈에 의해 변화하기 때문에, 본 발명에서는 pH7의 용액 중에서의 값을 기준으로 한다. 또한, 일반적으로 콜로이드의 사이즈와 비교하여 미끄럼면까지의 거리는 작으므로, 콜로이드의 표면을 미끄럼면으로 근사적으로 표현할 수도 있다. 본 발명에서 사용하는 수용성의 중성 중합체의 경우도 마찬가지로, 용액 중에 분산된 콜로이드의 표면 전위를 제타 전위로 간주할 수 있다.

제타 전위는 전기 영동, 전기 침투, 역류 전위, 침전 전위 등의 계면 동전 현상을 이용하여 구할 수 있고, 현미경 전기 영동법, 회전 회절 격자법에 의한 전기 영동법, 레이저·도플러 전기 영동법, 초음파 진동 전위법, 동전 음향법 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 이들의 측정은, 제타 전위 측정 장치를 사용함으로써 행할 수 있다. 제타 전위 측정 장치는, 오츠카 덴시 가부시키가이샤, Malvern Instruments Ltd., Ranku Brother Ltd., PenKem Inc. 등에서 시판되고 있다.

상기의 어느 장치를 사용해도, 제타 전위를 측정할 수 있지만, 레이저·도플러 전기 영동법이 일반적이다. 레이저·도플러 전기 영동법은, 광이나 음파가 전기 영동에 의해 운동하고 있는 물체에 부딪혀, 산란 또는 반사하면 그 주파수가 변화하는 도플러 효과를 이용한 측정 방법이다.

중합체의 제타 전위를 측정하는 경우에는, 콜로이드 분산 용액으로서 중합체 용액을 제조하고, 제타 전위를 측정할 수 있다. 중합체를 예를 들어, 인산 완충액이나, 염화나트륨 용액, 시트르산 완충액 등의 전해질에 용해시켜서 중합체 용액을 제조하고, 용액 중에 분산된 중합체의 산란광이나, 반사광을 검출하여 측정을 행한다. 콜로이드의 사이즈가 클수록, 낮은 농도에서 산란광이나 반사광을 검출하는 것이 가능하게 된다.

중합체의 제타 전위를 레이저·도플러 법으로 측정하는 구체적인 조건은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 중합체의 농도를 1wt％ 이상 10wt％ 이하가 되도록 인산 완충액(10mM, pH7)에 용해하여, 이 용액을 측정용 셀에 넣고, 레이저·도플러 전기 영동법을 원리로 하는 제타 전위 측정 장치에 설치하여 실온에서 측정할 수 있다. 제타 전위 측정 장치는 예를 들어, 오츠카 덴시 가부시키가이샤의 ELS-Z 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 담체에 사용하는 수용성의 중성 중합체로서는, 구체적으로는, 이하의 것을 들 수 있다. 예를 들어, 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐피롤리돈 등의 폴리비닐계 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 또는 폴리(N-(히드록시메틸)아크릴아미드 등의 폴리아크릴아미드계 중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리테트라메틸렌에테르글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜계의 중합체, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), (히드록시프로필)메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 2-히드록시에틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기의 중합체가 포함되는 공중합체도 사용할 수 있다.

또한, 피콜, 아가로오스, 키틴 및 덱스트란 등의 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유사체 및 알부민 등의 단백질이나 펩티드도 본 발명의 담체에 사용하는 수용성의 중성 중합체에 포함된다.

수용성의 중성 중합체의 관능기 일부를 이온화시키거나, 양성이나 음성을 나타내는 관능기로 치환하거나, 측쇄에 아세틸기 등 수용성을 발현하는 관능기를 도입해도 된다.

수용성의 중성 중합체의 분자량으로서는, 예를 들어 0.4kD 이상의 중합체를 바람직하게 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 6kD 이상이다.

본 발명의 담체에 사용하는 산화알루미늄은, Al₂O₃의 조성식으로 표시되는 양성 산화물이고, 알루미나라고도 불린다.

산화알루미늄은, 천연으로 산출하는 것을 사용해도 되고, 공업적으로 제조한 것을 사용해도 된다. 산화알루미늄을 제조하는 방법으로서는, 예를 들어 깁사이트를 출발 원료로 하는 바이어법이나, 베마이트 형태의 수산화물을 경유하는 알콕시드법(졸겔법이라고도 불림)·중화법·오일 유적법, 알루미늄염 열 분해법이나 양극 산화법 등을 들 수 있다.

공업적으로 제조한 산화알루미늄은, 시약 메이커나, 촉매 화학 메이커, 일반 사단 법인 촉매 학회의 참조 촉매 부회 등으로부터 입수할 수 있다.

산화알루미늄은, 그것들이 갖는 결정 구조에 의해, 알파 산화알루미늄, 로 산화알루미늄, 카이 산화알루미늄, 카파 산화알루미늄, 에타 산화알루미늄, 감마 산화알루미늄, 델타 산화알루미늄, 세타 산화알루미늄 등으로 분류된다. 본 발명에서는, 고비표면적을 갖는 감마 산화알루미늄이 바람직하다.

산화알루미늄은, 제조 시의 소성 온도에 따라, 산점(Al⁺, Al-OH₂ ⁺)과 염기점(Al-O^-)이 변화한다. 산화알루미늄은 이 산점과 염기점의 수에 따라, 산점이 많으면 산성 알루미나, 염기점이 많으면 염기성 알루미나, 산점과 염기점이 동일 정도인 중성 알루미나로 분류된다. 이 특성의 차이는, pH 지시약인 BTB 용액을 첨가함으로써 확인할 수 있다. BTB 용액을 첨가하여, 산화알루미늄이 황색으로 정색하면 산성 알루미나, 녹색으로 정색하면 중성 알루미나, 청색으로 정색하면 염기성 알루미나인 것을 확인할 수 있다. 이러한 특성상의 차이가 있지만, 본 발명에 있어서는, 어느 쪽의 산화 알루미늄도 사용할 수 있다.

산화알루미늄은 입상의 것이 좋다. 입경은 정렬되어 있어도, 다른 입경을 혼합하여 이용해도 된다. 입경은, 예를 들어 212㎛ 미만의 산화알루미늄을 바람직하게 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 100㎛ 미만의 산화알루미늄을 사용할 수 있다.

입경은, 본 발명에서는 일본 공업 규격에 규격하는 JIS Z-8801-1:2006에 기초한 체 눈 크기의 치수로 정의한다. 예를 들어, 상기 JIS 표준에 의한 눈 크기로 하여 40㎛의 체를 통과하고, 32㎛의 체를 통과할 수 없는 입자는, 32㎛ 이상 40㎛ 미만의 입경이 된다.

본 발명에서 사용하는 용출액은, 본 발명의 담체에 흡착한 핵산을 용출시킬 수 있으면, 특별히 한정되지 않지만, 완충액이 바람직하고, 완충액에는 킬레이트제가 포함되어 있어도 된다. 구체적으로는, 시트르산과 시트르산나트륨을 포함하는 시트르산 완충액, 인산과 인산나트륨을 포함하는 인산 완충액이나, 트리스히드록시아미노메탄과 염산을 포함하는 Tris-염산 완충액에 EDTA를 첨가한 Tris-EDTA 완충액 등을 들 수 있다.

완충액의 pH는 pH4 이상 pH9 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 pH5 이상 pH8 이하이다.

본 발명에서 사용하는 완충액은, 이하와 같이 제조할 수 있다. 예를 들어, 0.5M의 인산 완충액(pH7)의 제조는 이하와 같다. 0.5M의 인산수소이나트륨 수용액과 0.5M의 인산이수소나트륨을 제조한다. 0.5M의 인산수소이나트륨 수용액에 대하여, pH를 측정하면서 인산이수소나트륨 용액을 첨가하고, pH7이 된 곳에서 첨가를 멈춘다. 마찬가지의 방법으로, 다른 pH의 완충액도 제조할 수 있다.

완충액에 포함되는 킬레이트제는, 복수의 배위좌를 갖는 배위자를 갖고 있고, 금속 이온에 결합하여, 착체를 형성하는 물질을 사용할 수 있다.

구체적인 킬레이트제로서는, 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 니트릴로삼아세트산(NTA), 글리콜에테르디아민사아세트산(EGTA), 폴리인산, 메타인산 및/또는 및 그것들의 염 등을 들 수 있다. 킬레이트제의 최종 농도는 특별히 한정되지 않지만, 50mM 이상이면 되고, 바람직하게는 100mM 이상, 더욱 바람직하게는 500mM 이상이다.

또한, 상기 이외의 킬레이트제가 되는 화합물로서, 음이온성의 중합체를 들 수 있다. 카르복실산을 측쇄에 갖는 중합체는 금속 이온을 배위하기 위해서, 이들이 완충액에 포함되어 있어도 된다. 이러한 기능을 갖는 중합체로서, 폴리비닐술폰산 및/또는 그들의 염을 들 수 있다. 그 최종 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1wt％ 이상이면 되고, 바람직하게는 10wt％ 이상이다.

본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산을 회수하는 방법이며, 공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 핵산을 포함하는 용액을 혼합하고, 담체에 핵산을 흡착시키는 공정, 공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 용액으로부터, 상기 핵산이 흡착된 담체를 분리하는 공정, 공정 c) 공정 b)에 있어서 상기 핵산이 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 핵산을 회수하는 공정을 포함한다. 이하, 각각의 공정에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 담체는, 산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킴으로써 제조한다. 중합체에 의한 표면의 피복률은, 7％ 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 20％ 이상, 특히 바람직하게는 30％ 이상, 특히 바람직하게는 40％ 이상이다. 또한, 수용성의 중성 중합체는 균일한 두께로 흡착하고 있지 않아도 된다.

본 발명에 있어서, 중합체에 의한 알루미나의 피복률은, 표면 전위 현미경(별명 켈빈 프로브 포스 현미경; KFM)에 의해 취득한 전위 분포도를 해석함으로써 산출한다. 표면 전위 현미경은 예를 들어, Bruker AXS사의 Digital Instruments제의 NanoScope Iva AFM Dimension 3100 스테이지 AFM 시스템 등을 이용할 수 있다.

표면 전위 현미경으로부터 표면 피복률을 산출하는 데 있어서, 측정의 시야 스케일은, 0.5㎛×1㎛의 범위에서 행한다. 표면 피복률의 산출 방법은, 먼저 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 다음으로 수용성의 중성 중합체의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 그리고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 산화알루미늄만의 피복률을 0％, 수용성의 중성 중합체만의 피복률을 100％로 하고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 평균 전위와 수용성의 중성 중합체의 평균 전위의 비를 취함으로써 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 피복률을 산출한다. 표면 피복률을 구하는 데 있어서, 사용하는 시야 내의 평균 전위는, 본 발명의 단체 입자를 랜덤으로 3개 선택하여, 각각의 측정값의 평균값을 사용한다.

또한, 본 발명에서는, 표면 피복률을 산출할 때의 화상 해석 소프트웨어로서, Adobe사의 Photoshop을 사용할 수 있다. 이 경우, 화상 해석에 있어서, 산화알루미늄의 표면 전위의 평균값을 스케일 하단, 수용성의 중성 중합체의 표면 전위의 평균값을 스케일 상단으로 하고, 하단의 색을 흑색(8bit, RGB값 0), 상단의 색을 적색(R값 255) 또는 녹색(G값 255) 또는 청색(B값 255) 등으로 설정한다. 설정한 스케일로 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 표시하고, R값 또는 G값 또는 B값 중 어느 하나의 값을 255로 나누어, 그 비를 표면 피복률로 한다.

수용성의 중성 중합체를 표면에 흡착시키는 전 단계로서, 미리 산화알루미늄을 물이나 에탄올 등의 용액으로 세정하여, 표면에 흡착하고 있는 불순물을 제거해 두어도 되고, 본 세정 조작을 생략해도 된다.

수용성의 중성 중합체를 산화알루미늄의 표면에 흡착시키는 방법은, 예를 들어 수용성의 중성 중합체를 용해시켜서 수용성의 중성 중합체 용액을 제조하고, 산화알루미늄에 접촉시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 수용성의 중성 중합체 용액에 산화알루미늄을 침지시키거나, 수용성의 중성 중합체 용액을 산화알루미늄에 적하하거나, 수용성의 중성 중합체 용액을 산화알루미늄에 도포하거나, 수용성의 중성 중합체 용액을 안개 상태로 하여 산화알루미늄에 분사하거나 할 수 있다.

수용성의 중성 중합체 용액에, 산화알루미늄을 침지시키는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 피펫팅, 전도 혼합, 교반기, 믹서, 볼텍스, 밀 등의 분산기나 초음파 처리 장치 등으로 교반해도 된다.

수용성의 중성 중합체 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.01wt％ 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1wt％ 이상이다.

교반할 때의 혼합 시간은, 수용성의 중성 중합체와 산화알루미늄이 균일하게 혼합되면, 특별히 혼합 시간은 한정되지 않지만, 볼텍스의 경우 1분 이상, 바람직하게는 5분 이상 교반하는 것이 바람직하다.

또한, 체나, 소쿠리 등을 사용하여 수용성의 중성 중합체를 산화알루미늄에 딥 코팅할 수도 있다. 용액에 침지할 때의 혼합 시간은, 0.1wt％ 이상의 중합체 농도라면 5분 이상이면 되고, 30분 이상인 것이 바람직하다.

수용성의 중성 중합체 용액을 적하하는 경우에는, 스포이트, 적하 깔때기 등을 사용할 수 있다. 중합체 용액을 적하할 때에는, 산화알루미늄을 진동시키거나, 회전시키거나 해도 되고, 스핀 코터 등을 사용해도 된다.

수용성의 중성 중합체 용액을 도포하는 경우에는, 솔, 롤러, 와이어 바를 사용할 수 있다.

수용성의 중성 중합체 용액을 안개 상태로 하여 분사하는 경우에는, 에어 스프레이나 에어 브러쉬 등을 사용할 수 있다.

상기에 예시한 방법으로, 산화알루미늄에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킨 후에는 원심 분리 조작을 행하여, 상청이 되는 중합체 용액을 제거해도 되고, 원심 분리 조작을 행하지 않고 그대로 핵산의 회수에 사용해도 된다. 또한, 중합체 용액을 용매에 용해시키고 있는 경우, 산화알루미늄에 수용성의 중성 중합체를 흡착시켜, 용매를 제거한 후, 건조시켜도 되고, 건조시키지 않고, 핵산의 회수에 사용해도 된다.

얻어진 본 발명의 담체는, 제조하여 보존해 둔 것을 사용해도 되고, 사용 시 제조하여 사용해도 된다.

수용성의 중성 중합체 용액은, 입수한 수용성의 중성 중합체가 고체라면 물이나 유기 용매에 용해함으로써 제조할 수 있고, 용액이면 희석함으로써 제조할 수 있다. 중합체가 용해되기 어려운 경우나, 용액의 점도가 높아 혼합하기 어려운 경우, 가열 처리나 초음파 처리를 행해도 된다. 유기 용매는, 예를 들어 에탄올, 아세토니트릴, 메탄올, 프로판올, tert-부탄올, DMF, DMSO, 아세톤, 에틸렌글리콜, 글리세롤 등, 물과 쌍용성이 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 물에 용해되기 어려운 경우에는, 상기의 유기 용매를 첨가해도 된다.

산화알루미늄과 수용성의 중성 중합체를, 링커 분자 등에 의해 공유 결합시켜서 제조한 담체는, 본 발명의 담체에 해당하지 않는다. 구체적인 링커 분자에는, 실란 커플링제 등을 들 수 있다.

공정 a)는, 상기의 제조 방법에 의해 제조한 본 발명의 담체와, 핵산을 포함하는 용액을 혼합하여, 본 발명의 담체에 핵산을 흡착시키는 공정이다. 본 발명의 담체와 핵산을 포함하는 용액의 혼합 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 피펫팅이나 전도 혼합에 의해 행해도 되고, 믹서, 볼텍스 등의 장치를 사용해도 된다. 혼합 시간은, 특별히 한정되지 않지만 5분 정도이면 되고, 그 이상의 시간 혼합해도 된다. 또한, 본 발명의 담체를 칼럼에 충전하고, 핵산을 포함하는 용액을 통과시켜도 된다.

공정 b)는, 공정 a)에 있어서 혼합한 혼합물로부터, 상기 핵산이 흡착된 담체를 분리하는 공정이다. 분리의 방법으로서는, 공정 a)에서 얻어지는 혼합물을 원심 분리하고, 핵산이 흡착한 담체를 침전시켜, 상청을 제거하는 방법을 들 수 있다. 핵산이 흡착된 담체의 비중은 물보다 무겁기 때문에, 원심 조작에 의해 용이하게 침전시킬 수 있다. 원심 분리의 조건은, 6000G에서 1분간 처리하면 되고, 10000G에서 1분간 처리하는 것이 보다 바람직하다. 다른 분리 방법으로서는, 한외 여과막을 사용하는 방법을 들 수 있다. 핵산이 흡착된 담체의 입경보다 작은 구멍 직경을 갖는 한외 여과막에 대하여, 공정 a)에서 얻어진 혼합물을 통과시켜, 핵산이 흡착된 담체를 분리한다. 이러한 한외 여과막은 키트화되어 있고, 메르크 가부시키가이샤의 울트라프리(상표 등록)나 Pall Corporation의 나노셉(상표 등록)으로 대표되는 원심 여과 키트를 입수하여 이용할 수 있다.

또한, 공정 b)의 조작 후에, 필요에 따라 이하와 같은 처리를 해도 된다. 이것은 공정 a) 후에, 본 발명의 담체 표면에 목적이 되는 핵산 이외의 생물학적 시료 유래물이 흡착되어 있을 가능성이 있기 때문이다. 예를 들어, 보다 고순도로 핵산을 단리하기 위해서, 세정이나 분해의 처리를 행할 수 있다. 구체적으로는, 비특이적으로 흡착된 화합물을 제거하기 위하여 물로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 단백질을 제거하기 위하여 계면 활성제로 세정하는, 이온이나 저분자 화합물을 제거하기 위하여 계면 활성제를 포함하는 용액으로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 소수성 화합물을 제거하기 위하여 유기 용매로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 단백질을 분해하기 위하여 단백질 분해 효소를 첨가하는, DNA만을 단리하기 위하여 RNA 분해 효소를 첨가하는 및 RNA만을 단리하기 위하여 DNA 분해 효소를 첨가하는, 등의 다양한 처리를 할 수 있다.

공정 c)는, 공정 b)에 있어서 분리한 상기 핵산이 흡착된 본 발명의 담체에 용출액을 첨가하여 핵산을 회수하는 공정이다.

상기 용출액을 첨가하여 핵산을 회수하는 데 있어서, 본 발명의 담체와, 핵산을 용출시킨 용액을 분리하고 싶은 경우에는, 공정 c)에 있어서, 핵산이 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 얻어진 혼합물을 원심 분리하고, 본 발명의 담체를 침전시켜, 핵산이 용출하고 있는 상청을 취득하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 담체 비중은 물보다 무겁기 때문에, 원심 조작에 의해 용이하게 침전시킬 수 있다. 원심 분리의 조건은, 6000G에서 1분간 처리하면 되고, 10000G에서 1분간 처리하는 것이 바람직하다.

다른 분리 방법으로서는, 한외 여과막을 사용하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 담체 입경보다 작은 구멍 직경을 갖는 한외 여과막에 대하여, 공정 c)에 있어서 얻어진 혼합물을 통과시켜, 본 발명의 담체를 분리한다. 이러한 한외 여과막은 키트화되어 있고, 메르크 가부시키가이샤의 울트라프리(상표 등록)나 Pall Corporation의 나노셉(상표 등록)으로 대표되는 원심 여과 키트를 입수하여 이용할 수 있다.

회수된 핵산은 필요에 따라, 화학 수식을 행할 수 있다. 화학 수식에는, 핵산의 말단에 대한 형광 색소 수식, 소광제 수식, 비오틴 수식, 아미노화, 카르복실화, 말레이미드화, 숙신이미드화, 인산화 및 탈인산화 등을 들 수 있고, 이외에는 인터칼레이터에 의한 염색을 들 수 있다. 이들의 수식은 화학 반응에 의해 도입되어도 되고, 효소 반응에 의해 도입되어도 된다. 상기 정량 전에 이들의 수식기를 도입하여, 회수된 핵산 자신을 정량하는 것은 아니고, 화학 수식을 거쳐서 도입된 수식기를 정량함으로써, 간접적으로 핵산을 정량할 수 있다. 본 발명에 의해 핵산이 회수되고, 특히 단쇄 핵산에 있어서는 고수율로 회수되기 때문에, 상기 정량에 있어서 고감도로 정량하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 핵산 회수용의 키트는, 생물학적 시료로부터, 핵산을 효율적으로 회수하기 위하여 이용할 수 있다. 본 발명의 핵산 회수용의 키트는, 그 구성 성분으로서, 본 발명의 담체 및 완충액이 포함된다. 키트에는, 이들 이외에 설명서 등이 포함되어 있어도 된다.

본 발명의 핵산 회수용의 키트에 포함되는, 본 발명의 담체는 건조시킨 상태여도 되고, 수용성의 중성 중합체의 용액 중에 침지된 상태여도 된다.

본 발명의 핵산 회수용의 키트에 포함되는 완충액에는, 상기 공정 c)의 용출액에 사용할 수 있는 완충액을 이용할 수 있다.

실시예

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.

<재료와 방법>

폴리에틸렌글리콜은 메르크 가부시키가이샤로부터, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company로부터, 염기성의 감마 산화알루미늄(N613N)은 닛키 촉매 가세이 가부시끼가이샤로부터, 알파 산화알루미늄(CAS.No1344-28-1, Cat.013-23115), 산성의 감마 산화알루미늄(CAS.No1344-28-1, Cat.590-13685), 중성의 감마 산화알루미늄(CAS.No1344-28-1, Cat.013-590-13715)은 와코 준야쿠 가부시키가이샤로부터 구입하였다. 실시예 중에서 사용한 중합체 수용액은, 각각의 농도에 물로 용해하였다. 또한, 실시예 중에서 특별히 언급하지 않는 한, 감마 산화알루미늄은 염기성의 것을 사용하였다. 또한, 특별히 언급하지 않는 한, 산화알루미늄은, 체 분류하는 등 하지 않고 구입한 채로 실험에 사용하였다.

또한, 100bp DNA ladder(Fragment; 200bp, 300bp, 1000bp)는 다카라 바이오 가부시키가이샤로부터, 브롬화에티듐은 나카라이테스크 가부시키가이샤로부터 구입하였다. 또한, let7a의 배열로서 알려지는 22 염기의 핵산을 DNA 배열로 변환하여 합성한 것과 RNA 배열로서 합성한 것을 유로핀 제녹스 가부시키가이샤로부터 구입하였다. 이후 RNA 배열의 합성 핵산에 대해서는 RNA22, DNA 배열의 합성 핵산에 대해서는 DNA22라고 기재한다. 이들의 핵산은, 특별히 정제하지 않고 그대로 사용하였다.

기타의 시약에 대해서는, 와코 준야쿠 가부시키가이샤, 도쿄 카세이 가부시키가이샤, 시그마 알드리치 재팬 고도 가이샤로부터 구입하고, 특별히 정제하지 않고 그대로 사용하였다.

믹서는 도쿄 리카 기카이 가부시키가이샤의 CUTE MIXER CM-1000을, 형광계는 Thermo Fisher Scientific 가부시키가이샤의 Nanodrop3300과 가부시키가이샤 호리바 세이사꾸쇼의 FLUOROMAX-3을, 제타 전위의 측정에는 오츠카 덴시 가부시키가이샤의 ELS-Z를, 전기 영동은 가부시키가이샤 어드밴스의 Mupid-eXU를 사용하였다. 체는 애즈원 가부시키가이샤의 MVS-1을 사용하였다. 염색한 아가로오스 겔은 GE 헬스 케어 재팬 가부시키가이샤의 Typhoon9410을 사용하여 해석하였다. 아가로오스 겔의 화상 해석은, Molecular Dynamics사의 ImageQuant(상표 등록)를 사용하였다. 표면 전위 현미경은, Bruker AXS사의 Digital Instruments제의 NanoScope Iva AFM Dimension 3100 스테이지 AFM 시스템을 사용하였다.

또한, 표면 피복률을 산출할 때의 화상 해석 소프트웨어로서, Adobe사의 Photoshop을 사용하였다. 화상 해석에 있어서, 산화알루미늄의 표면 전위의 평균값을 스케일 하단, 수용성의 중성 중합체의 표면 전위의 평균값을 스케일 상단으로 하고, 하단의 색을 흑색(8bit, RGB값 0), 상단의 색을 적색(R값 255) 또는 녹색(G값 255) 또는 청색(B값 255)으로 설정하였다. 설정한 스케일로 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 표시하고, R값 또는 G값 또는 B값 중 어느 하나의 값을 255로 나누어, 그 비를 표면 피복률로 하였다.

표면 전위 현미경으로부터 표면 피복률을 산출하는 데 있어서, 측정의 시야 스케일은, 0.5㎛×1㎛의 범위에서 행한다. 표면 피복률의 산출 방법은, 먼저 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구하였다. 다음으로 수용성의 중성 중합체의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구하였다. 그리고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 산화알루미늄만의 피복률을 0％, 수용성의 중성 중합체만의 피복률을 100％로 하고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 평균 전위와 수용성의 중성 중합체의 평균 전위의 비를 취함으로써 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 피복률을 산출하였다. 표면 피복률을 구하는 데 있어서, 사용하는 시야 내의 평균 전위는, 본 발명의 단체 입자를 랜덤하게 3개 선택하여, 각각의 측정값의 평균값을 사용하였다.

<비교예 1> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착되어 있지 않은 담체를 사용한 핵산 회수

특허문헌 3(실시예 4, 표 2)에 기재된 산화알루미늄 A와 조성이 가까운 염기성의 감마 산화알루미늄(N613N, 닛키 쇼쿠바이 가세이 가부시끼가이샤), 산화알루미늄 D와 조성이 가까운, 알파 산화알루미늄(와코 준야쿠 가부시키가이샤)을 사용하여, 핵산을 효율적으로 회수할 수 있는지를 검토하였다. 산화알루미늄에 흡착시킨 핵산을 용출시키는 용출액으로서, 특허문헌 3, 4에, 인산 완충액, 또는 Tris-EDTA 완충액을 용출액으로서 이용할 수 있는 것이 기재되어 있고, 특허문헌 5에는, 인산 용액이 핵산과 산화알루미늄과의 결합을 저해하는 취지가 기재되어 있었던 점에서, 인산 완충액(0.5M, pH8) 또는 Tris-EDTA 완충액(0.5M Tris, 0.5M EDTA, pH8)을 용출액으로서, 이하의 실험을 행하였다.

최초에 1.5ml 튜브에, 0.5mg의 알파 산화알루미늄, 또는 감마 산화알루미늄을 측량하였다. 각각에 200μl의 에탄올을 첨가하고, 볼텍스한 후, 원심기로 1분간 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2회 행하여 세정하였다.

계속해서, 이들에 대하여, 100pmol의 DNA22가 용해된 6M 구아니딘 티오시안산염 수용액 100μl를 첨가하여, 5분간 믹서로 교반하였다. 원심(10000G, 1min)하여 상청을 버리고, 0.05％ Tween수를 100μl 첨가하여, 볼텍스하였다. 이 조작을 추가로 2회 행하였다. 그 후, 50μl의 인산 완충액(0.5M, pH8) 또는 Tris-EDTA 완충액(0.5M Tris, 0.5M EDTA, pH8)을 첨가하여 5분간 믹서로 교반하였다. 원심기로 원심(10000G, 1min)하여, 핵산 용액을 회수하였다.

흡착률은 Cy3의 형광 측정에 의해 이하와 같이 산출하였다. 처음에, 알파 산화알루미늄과 감마 산화알루미늄을 첨가하기 전에 100pmol의 DNA22가 용해된 6M 구아니딘티오시안산염 수용액 100μl의 형광 강도를 측정하고, 다음으로 알파 산화알루미늄과 감마 산화알루미늄을 첨가하여 혼합한 후의 형광 강도를 측정하였다. 산화알루미늄을 첨가한 후의 형광 강도를 첨가하기 전의 형광 강도로 나누어, 첨가하기 전의 핵산량(100pmol)의 곱을 취하여 용액 중의 핵산량을 산출하였다. 첨가하기 전의 핵산량(100pmol)으로부터, 이 값의 차를 취하여, 흡착한 핵산량을 산출하였다. 흡착된 핵산량을, 산화알루미늄을 첨가하기 전의 핵산량(100pmol)으로 나누어, 흡착률을 산출하였다.

용출률은 Cy3의 형광 측정에 의해 이하와 같이 산출하였다. 핵산이 흡착한 산화알루미늄에 대하여 50μl의 인산 완충액 또는 Tris-EDTA 완충액을 각각 첨가하고, 용출한 후의 용출액에 대하여 형광 측정을 행하였다. 이어서, 100pmol의 DNA22가 용해된 50μl의 인산 완충액 및 Tris-EDTA 완충액을 제조하고, 이 용액에 대하여 각각 형광 측정을 행하였다. 용출액의 형광 강도를 이 용액의 형광 강도로 나누고, 용출한 핵산량을 산출하였다. 용출한 핵산량을, 흡착한 핵산량으로 나누고, 용출율을 산출하였다. 회수율은, 산출된 흡착률과 용출률의 곱을 취하여 산출하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 중합체가 표면에 흡착되어 있지 않은 감마 산화알루미늄, 또는 알파 산화알루미늄을 담체로서 사용한 핵산의 회수 방법은, 용출률이 낮고, 핵산의 회수율이 낮은 것을 알 수 있었다.

<비교예 2> 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체 제조

1.5ml 튜브에, 0.5mg씩 감마 산화알루미늄을 측량하였다. 이것에 중합체 용액으로서, 폴리아크릴산(PAcA, 5.1kD, 10wt％), 덱스트란황산(DS, 4kD, 10wt％), 폴리비닐술폰산(PVSA, 10wt％), 폴리알릴아민(PAA, 17kD, 10wt％), 폴리-L-리신(PLL, 150kD, 1wt％)을 각각 50μl씩 첨가하여 10분간 믹서로 교반하였다. 원심기로 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 각각의 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 얻었다.

<비교예 3> 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 각 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄을 담체로서 사용한 핵산 회수

1.5ml의 튜브에 비교예 2에서 제조한 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체로서, 폴리아크릴산(PAcA, 5.1kD, 10wt％), 덱스트란황산(DS, 4kD, 10wt％), 폴리비닐술폰산(PVSA, 10wt％), 폴리알릴아민(PAA, 17kD, 10wt％), 폴리-L-리신(PLL, 150kD, 1wt％)이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 0.5mg씩 측량하여 담체로서 사용하였다. 용출액은 Tris-EDTA 완충액(0.5M Tris, 0.5M EDTA, pH8)으로 하고, 그 밖의 조건, 조작은 비교예 1과 동일하게 행하여 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 폴리아크릴산, 폴리비닐술폰산 및 덱스트란황산이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체에 사용한 경우에는, 핵산의 흡착률도 용출률도 낮고, 핵산의 회수율도 낮은 것을 알 수 있었다. 또한, 폴리알릴아민 및 폴리-L-리신이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 경우에는, 핵산의 흡착율은 높게 유지되었지만, 용출율이 저하되고, 회수율도 낮은 결과가 되었다.

<실시예 1> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체 제조

1.5ml 튜브에, 0.5mg씩 감마 산화알루미늄을 측량하였다. 이것에, 중합체 수용액으로서, 수용성의 중성 중합체인 폴리비닐알코올(11％ 아세틸화, PVA, 18kD, 10wt％), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOz, 5kD, 10wt％), 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD, 10wt％), 히드록시프로필메틸셀룰로오스)(HPMC, 10kD, 10wt％), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 10kD, 10wt％)을 각각에 50μl씩 첨가하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 2와 동일하게 행하여, 각각의 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄의 담체를 얻었다.

<실시예 2> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 핵산 회수

1.5ml의 튜브에 실시예 1에서 제조한 각 수용성의 중성 중합체로서, 폴리비닐알코올(11％ 아세틸화, PVA, 18kD, 10wt％), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOz, 5kD, 10wt％), 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD, 10wt％), 히드록시프로필메틸셀룰로오스)(HPMC, 10kD, 10wt％), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 10kD, 10wt％)이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 0.5mg씩 측량하여 담체로서 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여, 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 비교예 3에 비하여, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 경우, 핵산의 흡착률은 높게 유지된 채, 용출률 및 회수율이 향상되는 것을 알 수 있었다.

<비교예 4> 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성 중합체의 제타 전위의 측정

비교예 3에서 사용한 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체인 폴리아크릴산(PAcA, 5.1kD), 덱스트란황산(DS, 4kD), 폴리비닐술폰산(PVSA), 폴리알릴아민(PAA, 17kD), 폴리-L-리신(PLL, 150kD))을 최종 농도가 1wt％ 이상 10wt％ 이하가 되도록 인산 완충액(10mM, pH7)에 용해하고, 오츠카 덴시 가부시키가이샤의 ELS-Z를 사용하여 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3은, 본 측정에 의해 얻어진 제타 전위와, 각각의 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 DNA22의 회수율(비교예 3의 결과)의 상관을 취하여, 제타 전위의 값이 낮은 순서대로 배열한 것이다.

이들의 결과로부터, 비교예 3에서 사용한 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성 중합체의 제타 전위는 -17mV 이하, 또는 +11mV 이상인 것을 알 수 있었다.

<실시예 3> 수용성의 중성 중합체의 제타 전위 측정

최종 농도가 1wt％ 이상 10wt％ 이하가 되도록, 실시예 2에서 사용한 수용성의 중성 중합체인 폴리비닐알코올(11％ 아세틸화, PVA, 18kD), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOz, 5kD), 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC, 10kD), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 10kD)을 인산 완충액(10mM, pH7)에 용해하고, 비교예 4와 동일한 방법으로 제타 전위를 측정하였다.

표 3은, 본 측정에 의해 얻어진 제타 전위와, 각각의 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 DNA22의 회수율(실시예 2의 결과)의 상관을 취하여, 제타 전위의 값이 낮은 순서대로 배열한 것이다.

이들의 결과로부터, 실시예 2에서 핵산의 회수율이 향상된 수용성의 중성 중합체의 제타 전위는, pH7의 용액 중에서 -4mV 이상 +1.1mV 이하이고, -17mV 이하 및 +11mV 이상의 제타 전위를 갖는 수용성의 중합체와 비교하여, 회수율이 향상되는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄의 담체에 흡착된 핵산의 용출

실시예 1을 따라서 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 제조하고, 1.5ml 튜브에 0.5mg씩 측량하였다. 용출액으로서 0.5M 시트르산 완충액(pH5, 6), 0.5M 인산 완충액(pH6, 7, 8), 0.5M Tris-EDTA 완충액(pH8), 10wt％의 최종 농도가 되도록 PVSA를 첨가한 0.5M Tris 완충액(pH8)을 각각 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 1과 동일하게 행하여, 핵산의 흡착률, 용출률, 회수률을 산출하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 어느 완충액을 용출액으로서 사용해도, 핵산을 고수율로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 핵산의 회수율과 핵산 길이의 관계

실시예 1을 따라서 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 제조하고, 1.5ml 튜브에 0.5mg씩 측량하였다. 핵산을 포함하는 용액으로서, 7.5μg의 100bp DNA ladder의 200bp, 300bp, 1000bp가 각각 용해된 6M 구아니딘 티오시안산염 수용액을 100μl 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여 핵산의 회수율을 산출하였다. 결과를 표 5에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 수용성의 중성 중합체인 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 사용함으로써, 어느 길이를 갖는 핵산도 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6> 소 태아혈청으로부터의 핵산 회수

실시예 1을 따라서 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 제조하고, 1.5ml 튜브에 1.5mg씩 측량하였다. 핵산을 포함하는 용액으로서 100pmol의 DNA22가 용해된 6M 구아니딘 티오시안산염 수용액 100μl와 30mg/ml의 단백질 농도를 갖는 소 태아혈청 100μl의 혼합 용액을 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하였다. 동일한 실험을 RNA22에 대해서도 행하였다. 결과를 표 6에 나타내었다. 또한, 회수액 중의 단백질 농도는, Bradford 시험의 검출 한계 이하(0.25mg/ml 이하)였다.

이들의 결과로부터, 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 산화알루미늄을 담체로서 사용함으로써, 혈청으로부터도 DNA22, RNA22 모두 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 7> 핵산 회수에 있어서의 산화알루미늄의 입경 효과

일본 공업 규격에 규격하는 JIS Z-8801-1:2006에 기초하는 체를 사용하여, 감마 산화알루미늄을 입경마다 분획(100㎛ 이상 212㎛ 미만, 40㎛ 이상 100㎛ 미만, 32㎛ 이상 40㎛ 미만, 20㎛ 이상 32㎛ 미만)하였다. 담체는, 실시예 1과 동일하게 하여, 각 입경마다의 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 제조하여 이것을 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여 핵산의 회수율을 산출하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 입경이 212㎛ 미만인 어느 분획에 있어서도, 핵산을 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 8> 핵산 회수에 있어서의 감마 산화알루미늄의 특성 차이

산성의 감마 산화알루미늄, 중성의 감마 산화알루미늄, 염기성의 감마 산화알루미늄을 사용하였다. 담체는, 실시예 1과 동일하게 하고, 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 각각의 산화알루미늄을 제조하여 이것을 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 산성 알루미나, 중성 알루미나, 염기성 알루미나의 어느 것을 사용한 경우에도 핵산을 고수율로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 9> 산화알루미늄에 표면에 흡착시키는 중합체의 분자량 효과

분자량이 6kD, 10kD, 500kD의 폴리에틸렌글리콜과, 분자량이 18kD, 40kD, 150kD(모두 11％ 아세틸화)의 폴리비닐알코올을 각각 10wt％가 되도록 제조하여 중합체 용액으로서 사용하였다. 담체는, 실시예 1과 동일하게 하고, 각 분자량의 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄을 제조하여 이것을 사용하였다. 그 밖의 조건, 조작은 비교예 3과 동일하게 행하여 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 어느 분자량을 갖는 중합체라도, 핵산을 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 10> 본 발명의 담체 제조 방법에 있어서의 수용성의 중성 중합체의 농도와 교반 시간의 관계

1.5ml 튜브에, 0.5mg씩 산화알루미늄을 측량하였다. 이것에, 중합체 수용액으로서, 수용성의 중성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD)을 0.1wt％, 1wt％, 10wt％의 농도로 각각에 50μl씩 첨가하였다. 각 농도에 대하여 믹서로 각각 1분간, 5분간, 30분간 교반하였다. 원심기로 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 산화알루미늄의 표면에 폴리에틸렌글리콜이 흡착된 담체를 얻었다. 또한, 비교예 3과 동일하게 행하여, 핵산의 회수율을 산출하였다. 결과를 표 10에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 어느 조건에서 제조된 담체도, 효율적으로 핵산을 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 11> 본 발명의 담체 제조 방법에 있어서의 수용성의 중성 중합체의 농도와 침지 시간의 관계

1.5ml 튜브에, 0.5mg씩 산화알루미늄을 측량하였다. 이것에, 중합체 수용액으로서, 수용성의 중성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD)을 0.1wt％, 1wt％, 10wt％의 농도로 각각에 50μl씩 첨가하여 각각 5분간, 30분간 정치하였다. 원심기로 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 산화알루미늄의 표면에 폴리에틸렌글리콜이 흡착된 담체를 얻었다. 또한, 비교예 3과 동일하게 행하여, 핵산의 회수율을 산출하였다. 결과를 표 11에 나타내었다.

<실시예 12> 본 발명의 담체 제조에 있어서의 원심 분리 조작의 유무와 핵산의 회수율 관계

1.5ml 튜브에, 0.5mg씩 산화알루미늄을 측량하였다. 이것에, 중합체 수용액으로서, 수용성의 중성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD)을 10wt％의 농도로 50μl 첨가하여 믹서로 10분간 교반하였다. 이 후의 조작으로서, 실시예 2에서는, 원심기에 의한 원심 분리 조작 및 상청을 제거한 조작을 행했지만, 실시예 12에서는 이들의 조작을 행하지 않았다. 이와 같이 하여 제조한 담체를 사용한 것 이외에는, 비교예 3과 동일하게 행하여, 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하고, 결과를 표 12에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 실시예 1에서 제조한 담체를 사용하여 핵산의 회수를 행한 실시예 2의 결과 중, 수용성의 중성 중합체로서, 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우의 핵산 회수율 결과와 비교하면, 어느 쪽의 방법으로 본 발명의 담체를 제조해도, 효율적으로 핵산을 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 13> 본 발명의 담체 제조 방법에 있어서의 수용성의 중성 중합체의 수세에 의한 제거와 회수율의 관계

실시예 1에 따라서 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 산화알루미늄을 제조하였다. 이 후의 조작으로서, 이 담체에 물 200μl 첨가하여 믹서로 1분간 교반하고, 원심기로 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하였다. 이 수세 조작을 1회, 3회 행한 것을 각각 제조하였다. 상기와 같이 하여 제조한 담체를 사용한 것 이외에는, 비교예 3과 동일하게 행하여, 핵산의 흡착률, 용출률, 회수율을 산출하고, 결과를 표 13에 나타내었다.

<실시예 14>본 발명의 담체에 있어서의 중합체에 의한 산화알루미늄의 표면 피복률과 회수율의 관계

실시예 13에서 제조한 담체, 실시예 2에서 제조한 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 산화알루미늄(수세 없음), 중합체가 흡착되어 있지 않은 산화알루미늄, 폴리에틸렌글리콜을 표면 전위 현미경에 의해 분석하고, 전위 분포도를 취득하여 평균 전위를 산출하였다. 측정에 있어서, 담체 시료를 카본 테이프에 살포하고, CoCr 코트 실리콘 캔틸레버를 탐침에 사용하고, 논컨택트 모드에서, 0.5㎛×1㎛의 시야 범위로, 실온, 대기 중에서 측정하였다. 측정값에는, 폴리에틸렌글리콜이 표면에 흡착된 담체의 입자를 랜덤하게 3 입자 선택하여 상정한 값의 평균값을 사용하였다. 중합체가 흡착되어 있지 않은 산화알루미늄만의 피복률을 0％, 폴리에틸렌글리콜만의 피복률을 100％로 하고, 폴리에틸렌글리콜이 흡착된 산화알루미늄의 평균 전위와 폴리에틸렌글리콜의 평균 전위의 비를 취함으로써 표면 피복률을 산출하였다. 표면 피복률과 각 담체를 사용했을 때의 핵산 회수율과의 관계를 표 14에 나타내었다.

이들의 결과로부터, 표면 피복률이 7％ 이상의 담체를 사용하면, 효율적으로 핵산을 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해, 생물학적 시료로부터, 유기 용매를 사용하지 않고, 간편한 방법으로 pre-miRNA나 miRNA와 같은 매우 짧은 핵산으로부터, 1000 염기 이상의 긴 핵산까지 효율적으로 회수하는 것이 가능하게 된다.

Claims

생물학적 시료로부터 핵산을 회수하는 방법이며, 이하의 공정:
공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 핵산을 포함하는 용액을 혼합하고, 담체에 핵산을 흡착시키는 공정,
공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 용액으로부터, 상기 핵산이 흡착된 담체를 분리하는 공정,
공정 c) 공정 b)에 있어서 분리한 상기 핵산이 흡착된 담체에 용출액을 추가하여 핵산을 회수하는 공정,
을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용성의 중성 중합체가 pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중합체가, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출액이 완충액인 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가, 혈액, 오줌, 타액, 점막, 땀, 배양 세포, 배양 세포의 배양액, 조직 시료 또는 표본인 것을 특징으로 하는 핵산의 회수 방법.
산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체가 흡착된 핵산 회수용의 담체.
제6항에 있어서, 상기 수용성의 중성 중합체가 pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 것을 특징으로 하는 담체.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 수용성의 중성 중합체가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 담체.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성의 중성 중합체가 산화알루미늄의 담체의 표면 중 7％ 이상을 피복하도록 흡착하고 있는 것을 특징으로 하는 담체.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 담체와 완충액을 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 회수용의 키트.