CN116272903A - 用于提取纯化dna的离子型磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物功能材料技术领域，具有为用于提取纯化DNA的离子型磁珠及其制备方法和应用。本发明的离子型磁珠包括磁性内核、亲水聚合物壳层、金属螯合吸附层；本发明首先利用溶剂热法制备磁性内核，利用回流沉淀聚合亲水聚合物壳层，然后利用含磷酸基团数的功能分子对环氧基团进行开环，修饰上具有强络合能力的磷酸基团，最后利用磷酸基团与多价金属之间的金属磷酸盐化学反应使金属离子固定在微球的表面，络合与核酸具有强相互作用的离子。合成路线简单、易于操作、成本较低，且制得的磁珠具有磁响应速度快、亲水性好、性能稳定等优点，通过磁珠表面的金属离子与DNA结构中磷酸基团之间强相互作用，实现对DNA的高效率、高通量、高质量地提取与纯化。

Description

用于提取纯化DNA的离子型磁珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物功能材料技术领域，具有涉及用于提取纯化DNA的离子型磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
DNA功能的阐明代表了科学上的一次前所未有的革命，对研究生物的方法产生了深远影响。现如今，提取纯化DNA是不同知识领域的重要步骤，例如探究疾病的起源进行诊断扩大人类学研究的范围，开发新的生物技术过程和新药的研发，借助DNA法医研究解决法律问题等。其中，提取的DNA片段的质量和数量是在生物和法医学、药剂学、流行病学、分子诊断学和基因测序等不同领域采用的分子生物学协议成功的关键因素。
目前已经开发了很多不同的策略用于DNA的提取。传统的核酸提取方法主要分为两类：液相提取法和固相提取法。在液相法提取DNA的过程中要使用大量毒性的有机溶剂，例如苯酚、氯仿和异丙醇等，提取过程中需要对样本反复纯化，制备过程繁琐复杂。与液相法提取DNA相比，基于填充基质的固相提取法(多采用硅胶基质作为固相萃取吸附剂)在纯化分离DNA的过程中避免了使用有害溶剂。然而，固相法提取过程中通常需要反复多次地对溶液过滤和离心，以实现吸附剂从溶液中地分离，流程复杂且耗时，目前许多商业试剂盒在对复杂且低丰度样本进行DNA提取地过程中，繁琐的离心可能会导致目标DNA的降解甚至丢失。磁性固相提取法的研究解决了以上诸多问题。它允许通过施加外部磁场实现吸附剂与溶液的相分离，简化了离心沉淀过滤等步骤，易于操作可实现自动化处理，且可以有效避免因离心产生的剪切力而引起的DNA降解。
磁性Fe3O4纳米粒子已被广泛用于磁珠法提取DNA的固相支持物。由于未经修饰的Fe3O4纳米裸球对DNA的提取能力较差，且不耐酸性环境，洗脱较为困难，为克服这些缺点并进一步改善吸附剂的理化性质，其在被用于核酸提取之前往往要先进行表面功能化改性。基于硅羟基和羧基改性地磁珠是DNA提取最广泛应用的两款磁性提取剂，目前已实现商业化的应用。磁珠对DNA的吸附是分子间静电力屏蔽、脱水效应和分子间氢键等多重作用所驱动的结果，磁珠往往要求在高盐离子溶液中吸附，且在低盐离子溶液中洗脱。低盐离子浓度的洗脱条件具有兼容下游PCR等应用的优势，但这类磁珠对DNA的提取效率往往较低(一般不超过70％)。
为提高DNA吸附的效率，近年来，基于阳离子基功能化的磁性复合微球被广泛设计用于核酸提取的吸附剂，包括多价阳离子聚合物(N-甲基咪唑、氨基硅烷偶联剂)和多官能团聚合物(聚多巴胺、聚苯胺和聚乙烯亚胺)改性的Fe3O4磁性复合微球。基于表面的正电性，磁珠与DNA的磷酸基团通过静电相互作用，可实现高效的DNA负载。尽管如此，这些材料在提取纯化DNA方面存在一定的局限性，例如脱附困难，洗脱条件苛刻。极端的洗脱环境会导致DNA的降解甚至失活，造成核酸质量的损失。
在多价金属离子磷酸盐化学中，每一个金属离子不只与一个磷酸基团发生相互作用而每一个磷酸基团同样也不只与一个金属离子发生相互作用。这种极强的结合提供了一个非常稳定的金属离子磷酸盐表面，而固定于微球表面的金属离子还可以进一步与其它暴露的磷酸基团结合，例如DNA中的磷酸基团发生相互作用从而分离提取DNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于提取纯化DNA的离子型磁珠及其制备方法和应用。
本发明提供的用于提取纯化DNA的离子型磁珠，包括磁性内核、亲水聚合物壳层、金属螯合吸附层；
所述磁性内核为表面修饰有稳定剂的纳米团簇，所述纳米团簇为γ-Fe2O3、m-γ-Fe2O3、Fe3O4之一种或几种的混合物；
所述亲水聚合物壳层为带有大量的可反应官能团的功能层，所述官能团选自羧基、羟基和环氧基等；优选壳层功能单体为含环氧基团的丙烯酸-2,3-环氧丙酯、丙烯酸(3,4-环氧环己基)甲酯或甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)；
所述金属螯合吸附层为络合有大量多价金属离子的功能层，所述金属离子如Fe3+、Ce3+、Ti4+、Zr4+或Hf4+等的吸附材料；
所述稳定剂选自聚谷氨酸、柠檬酸钠或聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐；
所述磁珠为壳核结构，总粒径为250～800nm；其中，磁性内核的粒径为150～650nm；亲水聚合物壳层的厚度为50～70nm。
本发明提供的用于提取纯化DNA的离子型磁珠制备方法，具体步骤如下：
步骤1，采用溶剂热法在反应瓶中制备表面稳定剂修饰的磁性纳米团簇，得到磁性内核，为微球形态；
步骤2，在磁性内核外表面修饰一层硅烷偶联剂；
步骤3，利用回流沉淀聚合，所得微球上包覆一层交联的亲水聚合物，作为壳层；
步骤4，利用含磷酸基团的功能分子与壳层相互作用，修饰上具有强络合能力的磷酸基团；
步骤5，利用磷酸基团与多价金属之间的金属磷酸盐化学反应，使多价金属离子固定在微球表面。
优选的，步骤2中，所述硅烷偶联剂为带有双键的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)。
优选的，步骤3中，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)；优选亲水聚合物单体为丙烯酸-2,3-环氧丙酯、丙烯酸(3,4-环氧环己基)甲酯或甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)。
优选的，步骤4中，所述含磷酸基团的功能分子为正磷酸、焦磷酸、多聚磷酸或植酸分子中的一种或多种。
优选的，步骤5中，所述多价金属离子为Fe3+、Ce3+、Ti4+、Zr4+或Hf4+中的一种或多种。
进一步的，步骤1具体过程如下：量取一定量的乙二醇至烧瓶中，并依次加入氯化铁、乙酸钠、PSSMA，通过超声、机械搅拌和加热的方式将其充分分散成均一溶液，之后加入氢氧化钠，50～90℃下继续加热搅拌使完全溶解。将上述溶液迅速升温至180～220℃后恒温反应10～18h，反应结束后通过磁铁吸附分离产物，并用乙醇和水进行多次洗涤，最后将产物分散至去离子水中，由此制得稳定剂修饰的的磁性内核微粒，记为MSPs。
进一步的，步骤1中氯化铁、乙酸钠、PSSMA、氢氧化钠的摩尔比为3～4:32～33:5，乙二醇体积用量为250～300mL。
进一步的，步骤2具体过程如下：将一定量的MSPs分散在含乙醇，去离子水，氨水和MPS的混合溶液中，40～80℃机械搅拌12～24h。磁分离收集反应后的产物，用乙醇和水洗涤多次，所得产物记为MM，将其冷冻干燥备用。
进一步的，步骤2中乙醇、水、氨水、MPS的体积用量比为80:20:3:1～2。
进一步的，步骤3具体过程如下：将一定量MBA、GMA和AIBN溶解在乙腈中，将MM分散在装有上述混合物的烧瓶中。将烧瓶连接到冷凝管上，于85～110℃油浴中反应30～90min。待反应结束后，磁分离收集产物，并用水和乙醇多次洗涤，得到MM@PGMA磁性复合微球。
进一步的，步骤3中MBA、GMA的摩尔比为1:1，AIBN用量为单体总量的2～3wt％，乙腈和MM的用量比为40～50mL:50mg。
进一步的，步骤4具体过程如下：将MM@PGMA磁性复合微球均匀分散在丙酮中。室温下边搅拌边滴加含磷酸基团的功能分子，滴加完毕后继续反应12～24h。磁分离收集产物，并用乙醇和水多次洗涤，得MM@PGMA-PA磁性复合微球。
进一步的，步骤4中MM@PGMA和含磷酸基团的功能分子的用量比为150mg:100～200mg，滴加速度为100～200mg/h。
进一步的，步骤5具体过程如下：将MM@PGMA-PA浸没在金属盐溶液中，室温下反应12～24h，磁分离收集产物，并用去离子水洗涤数次得到MM@PGMA-PA-Ti4+磁珠。
进一步的，步骤5中金属盐可以为FeCl3、Fe2(SO4)3、CeCl3、Ce(SO4)2·4H2O、TiCl4、Ti(SO4)2、ZrCl4、ZrSiO4、HfO8S2或HfCl4的水溶液中的一种或多种，其盐溶液浓度不低于50mM。
本发明制备得磁珠为壳核结构，所述磁珠总粒径为250～800nm。其中，步骤1中所述磁性内核的粒径为150～650nm；步骤3中所述交联聚合物壳层的厚度为50～70nm。
本发明制得的磁珠可用于DNA提取纯化。
典型的，可以用于线性短链鲑鱼精DNA以及小鼠成纤维细胞(L929)的基因组DNA的提取纯化。
线性短链鲑鱼精DNA的提取方法，具体如下：将磁珠与DNA混合在pH＝3的盐酸缓冲液中，DNA的浓度是2～5500mg/L，在45℃下孵育30min；30min后，磁分离去掉上清收集磁珠，加入70％的乙醇，重复清洗磁珠两遍；加入pH＝10的Tris缓冲液洗脱，释放DNA。经磁分离后所得上清液即为磁球最终提取的DNA溶液。
小鼠成纤维细胞(L929)的基因组DNA提取方法，具体如下：将L929细胞进行消化处理，离心沉淀后重悬于含有PBS的离心管中，加入RNase A(100mg/ml)，涡旋混匀，室温放置2min。加入蛋白酶K，立即涡旋混匀。后加入细胞裂解液，涡旋混匀，70℃孵育15min。加入无水乙醇，涡旋混匀。加入离子型磁珠混合，加入pH＝3的盐酸缓冲液，在45℃下孵育30min；30min后，磁分离去掉上清收集磁珠，加入70％的乙醇，重复清洗磁珠两遍；加入pH＝10的Tris缓冲液洗脱，释放DNA。经磁分离后所得上清液即为磁球最终提取的DNA溶液。采用Nanobio200对提取纯化的DNA进行定量测试，利用凝胶电泳辅助表征提取结果。
本发明制得的离子型磁珠可以按照Livzon Mabpharm Inc.提供的人类免疫缺陷病毒1型核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)的说明书进行RT-PCR扩增检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
(1)基于多价金属离子磷酸盐化学反应，可以在温和简便的条件下仅通过调节吸附和脱附液的pH值便可实现DNA的高效提取，避免了苛刻的吸附和洗脱条件对DNA结构的破坏和残留盐溶液对PCR扩增的抑制；
(2)磁珠表面的高亲水性，可以有效避免由于疏水作用产生的非特异吸附；
(3)含多磷酸基团分子的引入，使微球具有高的磷酸官能团密度，可以保证较高量金属离子的固定，从而有利于DNA的高效负载；
(4)磁核表面回流沉淀修饰上聚合物作为连接层，使得磁核本身的非特异性吸附降低，同时也起到保护磁核的作用，提高了磁核的抗性和耐酸碱性；
(5)高的磁响应性使得整个DNA提取过程简单高效，可避免传统离心方法导致的DNA质量的损失及时间浪费。
附图说明
图1为本发明离子型磁珠制备方法流程图。
图2为本发明实施例6制得的MM@PGMA-PA-Ti4+离子型磁珠形貌图和EDS元素分布谱图。
图3为本发明实施例6制备的MM@PGMA-PA-Ti4+离子型磁珠提取纯化鲑鱼精DNA标样和L929细胞的电泳图。
图4为本发明实施例6制备的MM@PGMA-PA-Ti4+离子型磁珠用于人类免疫缺陷病毒1型核酸的PCR扩增图。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图进一步介绍本发明。
实施例1：用于提取纯化DNA的离子型磁珠的制备
磁性内核微粒的制备。量取27.06g乙酸钠至烧瓶中，并依次加入并依次加入5.85g氯化铁、11.25g PSSMA和280mL乙二醇，通过超声、机械搅拌和加热的方式将其充分分散成均一溶液，之后加入5.4g的氢氧化钠，60℃下继续加热搅拌溶解1.5h。将上述溶液迅速升温至190℃后恒温反应12h，反应结束后通过磁铁吸附分离产物，并用乙醇和水进行多次洗涤，最后将产物分散至一定量的去离子水中，由此制得稳定剂修饰的磁性内核微粒，记为MSPs。分析结果表明，该磁核的平均粒径为300nm。
磁性内核表面修饰双键硅烷偶联剂。称取600mg MSPs加入到含80mL乙醇，20mL去离子水，3mL氨水和1.4mL MPS的混合溶液中，将上述体系在60℃下机械搅拌24h。磁分离收集反应后的产物并用乙醇和水多次洗涤，以除去过量的MPS及其他杂质。最后将所得产物磁分离除去上清液后进行冷冻干燥至恒重,记为MM磁球。
磁球表面包覆含环氧基团的功能壳层。100mL单口烧瓶中加入50mg MSP@MPS和40mL乙腈，超声3min使分散均匀。再向烧瓶中依次加入120mg MBA、120μL GMA和4.8mgAIBN，继续超声5min以溶解单体和引发剂。将单口烧瓶连接到冷凝管上，于95℃油浴中反应30min。待反应结束后，磁分离收集产物，并用水和乙醇多次洗涤以除去过量的反应物和均相成核形成的少量聚合物微球，得到MM@PGMA磁性复合微球，壳层包覆厚度为55nm。
磁球表面修饰磷酸基团。将150mg MM@PGMA磁性复合微球分散在80mL丙酮中，于30℃下边搅拌边滴加植酸，控制植酸滴加速度为120mg/h，待1h滴加完毕后继续反应12h。磁分离收集产物并用乙醇和水多次洗涤除去过量的磷酸和残余的溶剂，得到MM@PGMA-PA磁性复合微球。
磁球表面固定金属螯合层。将250mg的MM@PGMA-PA磁性复合微球浸没在100mM的FeCl3水溶液中，室温搅拌24h。磁分离收集产物并用去离子水洗涤数次，最终得离子型磁珠MM@PGMA-PA-Ti4+，磁珠的形貌和元素分布分别见图2(a)和(b)所示。
实施例2：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面修饰磷酸基团的制备过程中，将植酸分子更换为正磷酸，混合溶液中磷酸基团的浓度不变。
实施例3：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面修饰磷酸基团的制备过程中，将植酸分子更换为焦磷酸，混合溶液中磷酸基团的浓度不变。
实施例4：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面修饰磷酸基团的制备过程中，将植酸分子更换为多聚磷酸，混合溶液中磷酸基团的浓度不变。
实施例5：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面固定金属螯合层的制备过程中，将FeCl3水溶液更换为CeCl3水溶液，盐溶液的浓度不变。
实施例6：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面固定金属螯合层的制备过程中，将FeCl3水溶液更换为Ti(SO4)2水溶液，盐溶液的浓度不变。
实施例7：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面固定金属螯合层的制备过程中，将FeCl3水溶液更换为ZrSiO4水溶液，盐溶液的浓度不变。
实施例8：本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：磁球表面固定金属螯合层的制备过程中，将FeCl3水溶液更换为HfCl4水溶液，盐溶液的浓度不变。
实施例9：将实施例6中制得的离子型磁珠用于提取线性短链鲑鱼精DNA
将1mg制备的磁珠与线性短链鲑鱼精DNA混合在1000uL pH＝3的盐酸缓冲液中，DNA的浓度是100mg/L，在45℃下孵育30min；
30min后，磁分离吸附上清并收集磁珠，对上清液采用Nanobio 200进行浓度定量，检测。每个处理组重复3次实验，取结果平均值，各处理组组内3个数据差异不显著。利用差值法测定不同DNA投料浓度下磁球的吸附量，并进一步分析磁球的饱和吸附量。数据见表1。
表1不同DNA投料浓度下磁球对线性短链鲑鱼精DNA的吸附量测试数据
Figure BDA0004143406970000061
在收集的磁珠中加入600uL 70％的乙醇，重复清洗磁珠两遍；
加入50uL pH＝10的Tris缓冲液洗脱，释放DNA。经磁分离后所得上清液即为磁球最终提取的DNA溶液。对DNA初始投料浓度为100mg/L时，磁珠提取的DNA样品进行凝胶电泳测试，结果如图3(a)中Lane 3所示。
由表1不同DNA投料浓度下磁球对线性短链鲑鱼精DNA的吸附量结果可知，随DNA投料量的增加，对磁球对DNA的吸附量逐渐增加，当磁珠吸附达到饱和状态时吸附量基本恒定。通过分析计算可得磁珠的饱和吸附量约为533mg/g，这一结果展现了磁珠较高的吸附容量，且在较短30min内便可达到吸附平衡，具有较高的吸附效率。
进一步的，磁珠提取鲑鱼精DNA的电泳结果(图3(a)中Lane 3)展现了清晰明亮的条带，与线性短链鲑鱼精DNA标样条带(图3(a)中Lane 2)吻合，表明磁珠提取的DNA纯度较高，满足质量的要求。
实施例10：将实施例6中制得的离子型磁珠用于L929细胞中全基因组DNA的提取
将L929细胞进行消化处理，离心沉淀后重悬于含有200uL的PBS的离心管中，加入4uL RNase A(100mg/ml)，涡旋混匀，室温放置2min；
加入20uL蛋白酶K，立即涡旋混匀；
加入200uL细胞裂解液，涡旋混匀，70℃孵育15min；
加入200uL无水乙醇，涡旋混匀；
加入1mg磁珠混合，加入800uL pH＝3的盐酸缓冲液，在35℃下孵育30min；
30min后，磁分离去掉上清收集磁珠；
加入600uL 70％的乙醇，重复清洗磁珠两遍；
加入50uL pH＝10的Tris缓冲液洗脱，释放DNA。经磁分离后所得上清液即为磁球最终提取的DNA溶液。
采用Nanobio200对离子型磁球提取纯化的L929细胞基因组DNA进行定量测试，并与市售的商业DNA提取试剂盒进行对比的结果如表2所示。
表2本发明实施例1制备的离子型磁珠提取纯化L929细胞全基因组DNA的定量分析结果。
Figure BDA0004143406970000071
利用凝胶电泳辅助表征提取效果。利用离子型磁球、商业硅胶膜柱式DNA提取试剂盒和商业硅羟基提取纯化的L929细胞基因组DNA的电泳测试结果分别如图3(b)中Lane 2、Lane 3和Lane 4所示。
从表2对提取的L929细胞全基因组DNA的定量检测结果可以看出，MM@PGMA-PA-Ti4+离子型磁珠对DNA的提取量高达84±4mg/g，远高于市售硅羟基磁珠的11±2μg/mg和市售硅胶膜柱式试剂盒的26±2μg/次，且A260/A280的均值＞1.8，A260/A230的均值＞2.1，表明提取的DNA具有较高的纯度。
进一步的，对比图3Lane 4和Lane 5，MM@PGMA-PA-Ti4+离子型磁珠相比于商用试剂盒，具有更长更亮的电泳条带，表明本发明的磁珠具有更宽的DNA提取范围和更高的DNA提取量，即在满足DNA纯度要求的前提下，能更高效地从复杂样本中进行DNA的提取纯化。
实施例11：将实施例6中制得的离子型磁珠用于人类免疫缺陷病毒1型核酸的扩增检测
根据Livzon Mabpharm Inc.提供的人类免疫缺陷病毒1型核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)的说明书，将MM@PGMA-PA-Ti4+磁珠进行RT-PCR扩增检测。PCR结果如图4所示。
由图4可以看出，MM@PGMA-PA-Ti4+微球提取的DNA被成功扩增，Ct值为30.7，可以较快地达到阈值，说明MM@PGMA-PA-Ti4+微球具有较高的初始DNA提取质量，进一步证明了本发明的磁珠提取纯化DNA的能力和在实际商业应用方面的巨大潜力。

Claims (10)

1.一种用于提取纯化DNA的离子型磁珠，其特征在于，包括磁性内核、亲水聚合物壳层、金属螯合吸附层；其中：
所述磁性内核为表面修饰有稳定剂的纳米团簇，所述纳米团簇为γ-Fe2O3、m-γ-Fe2O3、Fe3O4之一种或几种的混合物；
所述亲水聚合物壳层为带有大量的可反应官能团的功能层，所述官能团选自羧基、羟基和环氧基；
所述金属螯合吸附层为络合有大量多价金属离子的功能层，所述金属离子选自Fe3+、Ce3+、Ti4+、Zr4+或Hf4+的吸附材料；
所述的稳定剂选自聚谷氨酸、柠檬酸钠或聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐；
所述磁珠为壳核结构，总粒径为250~800 nm；其中，磁性内核的粒径为150~650 nm；亲水聚合物壳层的厚度为50~70 nm。
2.根据权利要求1所述的用于提取纯化DNA的离子型磁珠，其特征在于，所述官能团选自壳层功能单体为含环氧基团的丙烯酸-2,3-环氧丙酯、丙烯酸(3,4-环氧环己基)甲酯或甲基丙烯酸环氧丙酯。
3.一种如权利要求1所述的用于提取纯化DNA的离子型磁珠的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1，采用溶剂热法制备表面稳定剂修饰的磁性纳米团簇，得到磁性内核，为微球形态；
步骤2，在磁性内核外表面修饰一层硅烷偶联剂；
步骤3，利用回流沉淀聚合，所得微球上包覆一层交联的聚合物，作为壳层；
步骤4，利用含磷酸基团的功能分子与壳层相互作用，修饰上具有强络合能力的磷酸基团；
步骤5，利用磷酸基团与多价金属之间的金属磷酸盐化学反应，使多价金属离子固定在微球表面。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述硅烷偶联剂为带有双键的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；步骤3中所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）；步骤4中所述含磷酸基团的功能分子为正磷酸、焦磷酸、多聚磷酸或植酸分子中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1具体过程如下：量取一定量的乙二醇至烧瓶中，并依次加入氯化铁、乙酸钠、PSSMA，通过超声、机械搅拌和加热的方式将其充分分散成均一溶液，之后加入氢氧化钠，50~90℃下继续加热搅拌使完全溶解；将上述溶液升温至180~220 ℃后恒温反应10~18 h，反应结束后通过磁铁吸附分离产物，并用乙醇和水进行多次洗涤，最后将产物分散至去离子水中，由此制得稳定剂修饰的的磁性内核微粒，记为MSPs；其中，氯化铁、乙酸钠、PSSMA、氢氧化钠的摩尔比为3~4:32~33:5，乙二醇用量为250~300 mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体过程如下：将MSPs分散在含乙醇、去离子水、氨水和MPS的混合溶液中，40~80 ℃机械搅拌12~24 h；磁分离收集反应后的产物，用乙醇和水洗涤多次，所得产物记为MM，将其冷冻干燥备用；其中，乙醇、水、氨水、MPS的体积用量比为80:20:3:1~2。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3具体过程如下：将一定量 MBA、GMA和AIBN溶解在乙腈中，将MM分散在装有上述混合物的烧瓶中；将烧瓶连接到冷凝管上，于85~110 ℃油浴中反应30~90 min；待反应结束后，磁分离收集产物，并用水和乙醇多次洗涤，得到MM@PGMA磁性复合微球；其中，MBA、GMA的摩尔比为1:1，AIBN用量为单体总量的2~3wt%，乙腈和MM的用量比为40~50mL:50 mg。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤4具体过程如下：将MM@PGMA磁性复合微球均匀分散在丙酮中；室温下边搅拌边滴加含磷酸基团的功能分子，滴加完毕后继续反应12~24 h；磁分离收集产物，并用乙醇和水多次洗涤，得MM@PGMA-PA磁性复合微球；其中，MM@PGMA和含磷酸基团的功能分子的用量比为150 mg:100~200mg，滴加速度为100~200 mg/h；
步骤5具体过程如下：将MM@PGMA-PA浸没在金属盐溶液中，室温下反应12~24 h，磁分离收集产物，并用去离子水洗涤数次得到MM@PGMA-PA-Ti4+磁珠；其中，金属盐为FeCl3、Fe2(SO4)3、CeCl3、Ce(SO4)2·4H2O、TiCl4、Ti(SO4)2、ZrCl4、ZrSiO4、HfO8S2或HfCl4的水溶液中的一种或多种，其盐溶液浓度不低于50 mM。
9.如权利要求1所述的离子型磁珠在DNA提取纯化中的应用。
10.根据权利要求9所述的离子型磁珠在DNA提取纯化中的应用，所述DNA提取纯化为线性短链鲑鱼精DNA以及小鼠成纤维细胞（L929）的基因组DNA的提取纯化。
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