CN110548489B - 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用 - Google Patents

一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110548489B
CN110548489B CN201910863327.4A CN201910863327A CN110548489B CN 110548489 B CN110548489 B CN 110548489B CN 201910863327 A CN201910863327 A CN 201910863327A CN 110548489 B CN110548489 B CN 110548489B
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic
mnps
amino
magnetic nanoparticles
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910863327.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110548489A (zh
Inventor
刘姿
马亮
陈学明
刘祥
吴雨晴
朱音谛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui University of Technology AHUT
Original Assignee
Anhui University of Technology AHUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui University of Technology AHUT filed Critical Anhui University of Technology AHUT
Priority to CN201910863327.4A priority Critical patent/CN110548489B/zh
Publication of CN110548489A publication Critical patent/CN110548489A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110548489B publication Critical patent/CN110548489B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在DNA提取中的应用，氨基磁性纳米粒子的制备方法包括以下步骤：(1)Fe3O4磁性纳米颗粒的制备；(2)酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备；(3)乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备。本发明制备的氨基磁性纳米粒子的合成过程无高温高压，且无三废产生，因此具有绿色环保、工艺简单的特点；相对于传统的商品化试剂盒，所需原料易得、价格较为便宜，且合成步骤简单、易于操作；表面带有氨基，呈正电荷状态，有利于与带负电荷DNA的结合，在DNA提取的应用中，磁性纳米粒子体现出较强的DNA结合能力和较高的提取效率，且提取步骤简便，避免氯仿等有毒试剂的使用。

Description

一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在DNA提取中的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料和分子生物学，具体涉及一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在DNA提取中的应用。
背景技术
DNA是生物研究中的重要研究对象，随着对其结构和功能等相关研究的深入，DNA分离纯化技术也成为生物研究上游的首要任务，并且分离纯化所得产物的优劣将直接影响后续的实验研究结果。因此，开发新型高效的DNA分离纯化技术，成为生物分离纯化领域的核心研究内容。传统的DNA提取方法主要有氯化铯超速离心法、离子交换树脂法、聚乙二醇沉淀法、煮沸裂解法和碱裂解法等，但上述方法通常耗时长、提取的DNA纯度不高且使用的试剂有毒。同时，常规商品化的核酸提取方法操作较为繁琐，且成本较高，此外，通常需要多次高速离心，会对DNA产生一定损伤。因此，开发新型高效的DNA提取方法具有重要的应用价值。其中，磁性纳米材料具有在外加磁场下易于分离的特点，且在核酸分离时可避免多次的高速离心操作，有望成为一类有潜力的核酸分离纯化载体。
磁性纳米材料作为一类新型的纳米材料，具有很多优良性能：尺寸为纳米级别、比表面积大，具有较大的DNA吸附容量；分离快、效率高、可重复使用；应用操作过程简单，不需要昂贵精密的仪器；回收率高，并且不会对目标生物分子的活性产生影响。结合磁性纳米材料众多的优点以及开发新型核酸提取方法的迫切需求，因此磁性纳米材料更具有开发价值，并且在核酸分离纯化中有广阔的应用前景。
近几年，常用的分离纯化核酸的磁性纳米材料主要包括氨基磁性纳米材料、羧基磁性纳米材料、SiO2磁性纳米材料以及聚乙烯亚胺磁性纳米材料等。本发明正是研究一种新型的氨基磁性纳米粒子在DNA提取方面的具体应用。由于核酸带有大量的负电荷，而本发明所提供的氨基磁性纳米材料表面带有正电荷，在适当的盐浓度条件下，DNA可以与磁性纳米材料表面的氨基结合，用75％的乙醇洗去蛋白质等杂质后，用适宜的洗脱液即可将DNA从磁性纳米材料上洗脱下来。本发明所用方法不仅操作简单、成本低，而且可避免有毒有机试剂的使用，后续可用于开发高效、低成本、低毒的基于氨基磁性纳米材料的新型DNA分离纯化试剂盒。
发明内容
本发明目的是为了弥补已有技术缺陷，提供一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在DNA提取中的应用，该氨基磁性纳米粒子合成方法简单，原料成本低，DNA提取应用操作简便，无需使用有毒试剂，结合DNA能力强，提取DNA总量和纯度高，提取产物具备良好的生物活性，可用于后续分子生物学实验。
为实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
本发明提供了一种氨基磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)Fe3O4磁性纳米颗粒的制备：先使用氮气对去离子水进行脱气处理20-40min，除去溶剂中溶解的氧；然后，加入FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，以400-500rpm的搅拌转速进行磁力加热搅拌，温度逐渐升至70-90℃，以确保反应体系中的盐成分完全溶解；随后，将NaOH溶液缓慢加到铁盐混合物中，并同时提高搅拌速率至800-1000rpm，在pH为12下，溶液逐渐变为黑色，继续保持20-40min以确保反应完全；最后，用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，再用磁铁进行分离，即得到Fe3O4磁性纳米颗粒MNPs，将其分散在蒸馏水中得到MNPs分散液。
(2)酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备：向烧杯中加入蒸馏水和酒石酸氢钠，搅拌溶解后，加入步骤(1)中制备的MNPs分散液，超声3-5小时，而后使用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤至中性，最后用蒸馏水重悬，即得到酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒SHT-MNPs；
(3)乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备：取上述步骤(2)制备的SHT-MNPs，加入催化剂4-二甲氨基吡啶和反应物乙二胺，40-50℃恒温水浴加热3-5h，使用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤至中性，除去催化剂和未反应的乙二胺，最后加入一定量的蒸馏水重悬，得到产物乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4纳米颗粒EDA-SHT-MNPs，即氨基磁性纳米粒子。
优选地，步骤1中加入的FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的Fe2+和Fe3+离子的比例为2：1。
优选地，步骤1中加入的NaOH溶液浓度为1mol/L。
优选地，MNPs分散液中MNPs的浓度为4.8mg/mL。
优选地，氨基磁性纳米粒子表面带有氨基且带正电荷。
本发明还提供了一种氨基磁性纳米粒子在细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的提取和纯化中的应用。
本发明还提供了一种氨基磁性纳米粒子提取纯化细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的方法，具体操作步骤如下：
S1、裂解：
a、细菌样品裂解液制备：取培养过夜的菌液，离心弃上清。细菌沉淀中加入碱裂解液Ⅰ充分重悬菌体，再加入碱裂解液Ⅱ，温和翻转4-6次，直到形成透亮溶液，最后加入碱裂解液Ⅲ，温和翻转混合6-8次，离心机12000×g离心10min，留上清，得到细菌样品裂解液；
b、哺乳动物样品裂解液制备：于细胞沉淀中加入裂解液，50℃消化过夜，直至消化完全，得到哺乳动物样品裂解液。
S2、结合：先将EDA-SHT-MNPs重悬于结合缓冲液中，分别加入上述步骤S1所述样品裂解液，室温结合4-6min，磁分离，弃上清，用70-80％乙醇清洗两次，稍晾干；
S3、洗脱：用TE缓冲液将DNA从磁性粒子上洗脱下来，60-70℃温育5-10min，磁分离后上清即为所提取DNA。
优选地，结合缓冲液为30％(w/v)PEG8000和1.25mol/L氯化钠的混合溶液。
优选地，步骤a中碱裂解液Ⅰ中加入RNA酶A，碱裂解液Ⅰ、碱裂解液Ⅱ和碱裂解液Ⅲ的体积比为1：1：1.4。
优选地，步骤b中裂解液加入蛋白酶K和RNA酶A。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所述的乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4粒子的合成过程无高温高压，且无三废产生，因此具有绿色环保、工艺简单的特点。
(2)本发明所述的乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4粒子相对于传统的商品化试剂盒，所需原料易得、价格较为便宜，且合成步骤简单、易于操作。
(3)本发明所制备的乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4粒子表面带有氨基，呈正电荷状态，有利于与带负电荷DNA的结合，在具体DNA提取的应用中，磁性纳米粒子体现出较强的DNA结合能力和较高的提取效率，且提取步骤简便，避免氯仿等有毒试剂的使用。
(4)本发明制备的磁性纳米粒子所提取DNA在总量和纯度方面都不低于商品化的试剂盒，且不影响DNA的生物活性，可用于后续酶切、PCR等生物学实研究，因此具有很大的优势以及应用潜力。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的磁性纳米粒子(EDA-SHT-MNPs)50nm的TEM图；
图2是本发明实施例1中制备的EDA-SHT-MNPs和SHT-MNPs的Zeta电位图；
图3是本发明实施例1中制备的EDA-SHT-MNPs的XPS图谱；
图4是本发明实施例2中不同PEG8000浓度对EDA-SHT-MNPs提取质粒DNA效率的柱状图；
图5是本发明实施例2中不同NaCl浓度对EDA-SHT-MNPs提取质粒DNA效率的柱状图；
图6是本发明实施例3中分别应用EDA-SHT-MNPs与Axygen商品化试剂盒提取细菌质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图7是实施例4中应用EDA-SHT-MNPs提取哺乳动物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图8是实施例4中分别应用EDA-SHT-MNPs与商品化试剂盒提取哺乳动物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图9是实施例5中分别应用EDA-SHT-MNPs与Axygen商品化质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA的酶切以及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
EDA-SHT-MNPs的制备及表征
一种氨基磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)Fe3O4磁性纳米颗粒的制备：为了除去溶剂中溶解的氧，使用氮气对100mL去离子水进行脱气处理30分钟；然后，向其中加入FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，以保证Fe2+和Fe3+离子的比例为2：1，以500rpm的搅拌转速进行磁力加热搅拌，使其发生反应。温度逐渐升至80℃，以确保反应体系中的盐成分完全溶解；随后，将浓度为1M的NaOH溶液缓慢加到铁盐混合物中，并同时将搅拌速率提高至1000rpm，在pH约12下，溶液逐渐变为黑色，继续保持30分钟以确保反应完全；最后，用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，用磁铁进行分离，即得到Fe3O4磁性纳米颗粒MNPs，将其分散在蒸馏水中以备用，分散液中MNPs的浓度为4.8mg/mL；
(2)SHT-MNPs的制备：向烧杯中加入10mL蒸馏水和1g酒石酸氢钠，搅拌溶解后，加入10mLFe3O4磁性纳米颗粒，超声4小时，使用磁铁进行固液分离后，用蒸馏水洗涤至中性，最后加入一定量的蒸馏水重悬，得到产物酒石酸氢钠包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒SHT-MNPs；
(3)EDA-SHT-MNPs的制备：取上述步骤(2)制备的SHT-MNPs10mL，加入0.06g催化剂4-二甲氨基吡啶和2mL乙二胺，40℃恒温水浴加热4h，使用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤至中性，最后加入一定量的蒸馏水重悬，得到产物乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe3O4纳米颗粒EDA-SHT-MNPs，即氨基磁性纳米粒子。
由图1中EDA-SHT-MNPs的TEM图可以看出，EDA-SHT-MNPs颗粒分布较均匀，单个粒子的粒径约在20nm左右。
SHT-MNPs以及EDA-SHT-MNPs的Zeta电位如图2所示，由于磁性Fe3O4颗粒表面包裹酒石酸氢钠后，带有很多羧酸根基团，所以SHT-MNPs的电位为负值，-23.4mV；而EDA-SHT-MNPs的Zeta电位为+20.3mV，因乙二胺与SHT-MNPs表面的羧基发生酰胺反应，使EDA-SHT-MNPs表面带有氨基，所以电位为正值。电位的变化表示最终的产物EDA-SHT-MNPs带有大量的正电荷，因此，可以与带负电的核酸结合，为后续的结合实验提供了理论基础，同时也进一步证明SHT-MNPs粒子被乙二胺修饰。
图3为EDA-SHT-MNPs的XPS图谱，(a)表示在结合能710.8eV处为Fe2p的峰，表明EDA-SHT-MNPs具有铁的磁性；(c)表示在结合能399.5eV处为N1s的峰，表明SHT-MNPs成功地被乙二胺修饰，并且表面有很多氨基基团，同时，也对应了EDA-SHT-MNPs的Zeta电位为正值的结果。
实施例2
确定EDA-SHT-MNPs用于分离提取DNA的结合缓冲液
本实施例中，主要探讨结合缓冲液中两种主要成分PEG8000和NaCl对EDA-SHT-MNPs分离捕获质粒DNA的影响，具体实验步骤如下：
分别将结合缓冲液以PEG8000和NaCl的浓度设置梯度，使PEG8000的浓度(w/v)为0％、10％、20％、30％、40％和50％，NaCl的浓度为0mol/L，0.15625mol/L，0.3125mol/L，0.625mol/L，1.25mol/L，2.5mol/L和5mol/L，用于后续质粒DNA的结合和分离实验。
吸取21.6μg磁性纳米材料(EDA-SHT-MNPs)于1.5mLEP管中，磁分离后，弃上清。向上述EP管中加入60μL上述含不同PEG浓度和NaCl浓度的结合缓冲液，振荡混匀，使磁性纳米材料在结合缓冲液中分散均匀。
向上述EP管中加入1.5μg质粒DNA，混合均匀，室温结合5min。然后磁分离，吸取上清液测OD260。向EP管中加入TE洗脱缓冲液65℃洗脱10min。再次磁分离，洗脱液即磁性纳米材料分离得到的DNA。吸附能力(mg/g)按以下公式计算：
Figure BDA0002200492600000071
C0为溶液中总质粒DNA的浓度，C为溶液中磁性材料结合质粒DNA后上清中DNA的浓度，V为溶液的总体积，m为溶液中磁性材料的质量。
从图4可以看出，在含30％PEG8000结合缓冲液中，应用EDA-SHT-MNPs吸附结合质粒DNA的能力最强，且PEG8000浓度过高的情况下明显会影响DNA的结合；图5的实验结果表明，随着NaCl浓度从0.15625增加至1.25mol/L，磁性材料结合DNA的能力逐渐增强，随后有所下降，其中1.25mol/L吸附能力最强。因此，后续实验中应用EDA-SHT-MNPs提取DNA的最佳结合缓冲液为含30％PEG8000和1.25mol/LNaCl的溶液。
实施例3
分别应用EDA-SHT-MNPs与商品化质粒DNA提取试剂盒提取细菌中质粒DNA
本实施例中，以提取细菌中转化的Flag-Hakai质粒为例，比较EDA-SHT-MNPs和商品化质粒DNA提取试剂盒(Axygen)提取DNA的效果。
商品化试剂盒提取DNA的步骤如下：取1mL培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃上清。加入125μL缓冲液S1悬浮细菌沉淀。后加入125μL缓冲液S2，温和充分地上下翻转4-6次，直到形成透亮溶液。加入175μL缓冲液S3，温和地混合6-8次，12000×g离心10min。取离心后的上清液转移到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管放回EP管，加入250μL缓冲液W1，12000×g离心1min，弃去滤液。将制备管放回EP管，加入350μL缓冲液W2，12000×g离心1min，弃去滤液。以同样的方法再洗一次，弃去滤液。将制备管放回EP管中，12000×g离心1min。将制备管放入新的1.5mLEP管中，在制备管的膜中央加入60μLTE洗脱缓冲液(65℃预热)，室温下静置2min，12000×g离心1min。收集滤液即为Axygen试剂盒提取的细菌质粒DNA，4℃保存。
应用EDA-SHT-MNPs提取质粒DNA的方法：取1mL培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃上清。加入125μL碱裂解液Ⅰ(加RNA酶A)悬浮细菌沉淀，悬浮均匀。加入125μL碱裂解液Ⅱ，温和充分地上下翻转4-6次使菌体得到充分裂解，直到形成透亮溶液。加入175μL碱裂解液Ⅲ，温和翻转混合6-8次，12000×g离心10min，留上清。取500μgEDA-SHT-MNPs，磁分离弃上清，加入350μL含30％PEG8000和1.25MNaCl的结合缓冲液，使磁性材料在结合缓冲体系中分散均匀，再加入上述离心后的上清，结合5min，磁分离，弃上清。75％的乙醇洗两次。加入60μLTE洗脱缓冲液65℃洗脱10min。磁分离，洗脱液即为EDA-SHT-MNPs提取的细菌质粒DNA，4℃保存。
配1％的琼脂糖凝胶，上述样品各取10μL进行电泳检测。
结果如图6所示，泳道2为EDA-SHT-MNPs提取的细菌质粒DNA，条带单一，亮度比较强；且与细菌质粒DNA提取试剂盒(泳道1)相比，EDA-SHT-MNPs提取质粒的总量较高，纯度较好。上述结果表明利用磁性材料EDA-SHT-MNPs可以实现对细菌质粒DNA的有效提取，且其制备成本低，操作步骤相对简便。
实施例4
EDA-SHT-MNPs用于提取哺乳动物细胞基因组DNA的检测及与商品化试剂盒(碧云天)提取效果的比较
该实施例以提取人乳腺癌细胞MCF7中的基因组DNA为例，以检测磁性纳米材料提取基因组DNA的效果，具体操作步骤如下：
(1)取对数生长期胰酶消化后的细胞，PBS洗1次，于细胞沉淀中加入500μL样品裂解液(裂解液中加入蛋白酶K和RNA酶A)，50℃消化过夜，留50μL作为总DNA的样品；(2)加入450μL结合缓冲液和500μgEDA-SHT-MNPs，轻轻混匀，室温结合5min；(3)用磁铁进行分离，留一定量上清作为未结合的DNA样品，其余上清弃去。用75％乙醇清洗两次，晾干；(4)加入60μLTE缓冲液，65℃洗脱10min，磁分离，上清即为所提取的DNA；(5)将总DNA样品、未结合DNA和洗脱DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果如图7所示，泳道1为总DNA，泳道2为未结合的DNA，泳道3为洗脱下的DNA，泳道3和泳道1的条带强度相当，且泳道2中几乎未检测到未结合的DNA，说明磁性材料EDA-SHT-MNPs能有效的结合细胞裂解液中的DNA，且可实现基因组DNA的高效洗脱。
商品化试剂盒(哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒，碧云天)的提取方法：(1)取对数生长期胰酶消化后的MCF7细胞，用PBS洗1次，向细胞沉淀中加入500μL样品裂解液(裂解液中加入蛋白酶K和RNA酶A)，50℃水浴消化过夜；(2)加500μLTris平衡苯酚抽提，轻轻地上下颠倒混匀，12000rpm，4℃离心10分钟；(3)吸取上层水层，再用等体积的Tris平衡苯酚抽提一次，轻轻地上下颠倒混匀，12000rpm，4℃离心10分钟；(4)吸取上层水层，用等体积氯仿用同样方法再抽提一次；(5)吸取约250μL上清，加入50μL10M醋酸铵和500μL无水乙醇，颠倒混匀数次，直至白色絮状物产生；(6)10000rpm，4℃离心1分钟去上清，用75％乙醇洗DNA沉淀两次；(7)吸去残留乙醇，待乙醇挥发干后，加入60μLNucleaseFreeWater溶解DNA，4℃保存。
通过琼脂糖凝胶电泳对磁性材料和商品化试剂盒提取的基因组DNA进行电泳检测。
结果如图8所示，与哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒(泳道1)相比，EDA-SHT-MNPs提取哺乳动物基因组DNA(泳道2)的总量较高，无杂带或弥散性条带，具有较好的纯度，且整个提取过程相对简便，省去频繁抽提和低温离心步骤，同时也避免使用氯仿等有毒试剂。
实施例5
对实施例3中所提取的质粒DNA进行生物活性检测
采用限制性核酸内切酶双酶切实验以及聚合酶链式反应(PCR)实验检测实施例3中采用EDA-SHT-MNPs提取的细菌质粒DNA的应用性，并与Axygen试剂盒提取的DNA进行对比。酶切体系见表1，以质粒DNA为模板，利用常用限制性核酸内切酶ClaI酶和KpnI酶在37℃恒温酶切3h，酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表1以EDA-SHT-MNPs和Axygen试剂盒提取质粒DNA为模板进行双酶切
Figure BDA0002200492600000111
PCR体系见表2，反应程序为：95℃，2min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，2min；72℃，10min；16℃，forever。循环数为30。反应结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表2PCR反应体系
Figure BDA0002200492600000112
结果如图9所示，与对照组试剂盒提取的质粒经酶切、PCR的结果相比，EDA-SHT-MNPs提取的质粒DNA同样能进行正常的酶切反应和PCR反应，且酶切和PCR电泳条带清晰，无非特异性杂带，表明采用EDA-SHT-MNPs提取质粒DNA具有良好的生物活性，可正常应用于后续DNA相关的生物学研究。
综上所述，本发明所提供的磁性纳米材料EDA-SHT-MNPs，在结合缓冲液为30％(W/V)PEG8000和1.25mol/LNaCl溶液的条件下，可实现对细菌中质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的高效提取；且与商品化的质粒DNA抽提试剂盒和哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒相比，本发明制备的EDA-SHT-MNPs提取的DNA在总量和纯度方面都较好，后续酶切及PCR实验结果表明，本发明制备的EDA-SHT-MNPs所提取的质粒DNA具备良好的生物活性，可用于后续DNA相关的生物学研究，且该材料的制备过程简单、成本低廉，实际操作过程简便快捷，避免使用有毒试剂，因此具有可观的应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Fe 3O 4磁性纳米颗粒的制备：先使用氮气对去离子水进行脱气处理20-40min，除去溶剂中溶解的氧；然后，加入FeSO 4·7H 2O和FeCl 3·6H 2O，以400-500rpm的搅拌转速进行磁力加热搅拌，温度逐渐升至70-90℃，以确保反应体系中的盐成分完全溶解；随后，将NaOH溶液缓慢加到铁盐混合物中，并同时提高搅拌速率至800-1000rpm，在pH为12下，溶液逐渐变为黑色，继续保持20-40min以确保反应完全；最后，用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，再用磁铁进行分离，即得到Fe 3O 4磁性纳米颗粒MNPs，将其分散在蒸馏水中得到MNPs分散液；
（2）酒石酸氢钠包裹的Fe 3O 4磁性纳米颗粒的制备：向烧杯中加入蒸馏水和酒石酸氢钠，搅拌溶解后，加入步骤（1）中制备的MNPs分散液，超声3-5小时，而后使用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤至中性，最后用蒸馏水重悬，即得到酒石酸氢钠包裹的Fe 3O 4磁性纳米颗粒SHT-MNPs；
（3）乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe 3O 4磁性纳米颗粒的制备：取上述步骤（2）制备的SHT-MNPs，加入催化剂4-二甲氨基吡啶和反应物乙二胺，40-50℃恒温水浴加热3-5h，使用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤至中性，除去催化剂和未反应的乙二胺，最后加入一定量的蒸馏水重悬，得到产物乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的Fe 3O 4纳米颗粒EDA-SHT-MNPs，即氨基磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤（1）中加入的FeSO 4·7H 2O和FeCl 3·6H 2O的Fe2+和Fe3+离子的比例为2：1。
3.根据权利要求1所述的氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤（1）中加入的NaOH溶液浓度为1mol/L。
4.根据权利要求1所述的氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述MNPs分散液中MNPs的浓度为4.8mg/mL。
5.根据权利要求1所述的氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述氨基磁性纳米粒子表面带有氨基且带正电荷。
6.根据权利要求1所述的氨基磁性纳米粒子在细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的提取和纯化中的应用。
7.根据权利要求6所述的氨基磁性纳米粒子提取纯化细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
S1、裂解：a、细菌样品裂解液制备：取培养过夜的菌液，离心弃上清；细菌沉淀中加入碱裂解液Ⅰ充分重悬菌体，再加入碱裂解液Ⅱ，温和翻转4-6次，直到形成透亮溶液，最后加入碱裂解液Ⅲ，温和翻转混合6-8次，离心机12000×g离心10min，留上清，得到细菌样品裂解液；b、哺乳动物样品裂解液制备：于细胞沉淀中加入裂解液，50℃消化过夜，直至消化完全，得到哺乳动物样品裂解液；
S2、结合：先将EDA-SHT-MNPs重悬于结合缓冲液中，分别加入上述步骤S1所述样品裂解液，室温结合4-6min，磁分离，弃上清，用70-80％乙醇清洗两次，稍晾干；
S3、洗脱：用TE缓冲液将DNA从磁性粒子上洗脱下来，60-70℃温育5-10min，磁分离后上清即为所提取DNA。
8.根据权利要求7所述的氨基磁性纳米粒子提取纯化细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的方法，其特征在于，所述结合缓冲液是质量浓为30％的PEG8000和1.25mol/L氯化钠的混合溶液。
9.根据权利要求7所述的氨基磁性纳米粒子提取纯化细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤S1中碱裂解液Ⅰ中加入RNA酶A，碱裂解液Ⅰ、碱裂解液Ⅱ和碱裂解液Ⅲ的体积比为1：1：1.4。
10.根据权利要求7所述的氨基磁性纳米粒子提取纯化细菌质粒DNA和哺乳动物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤S1中裂解液加入蛋白酶K和RNA酶A。
CN201910863327.4A 2019-09-12 2019-09-12 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用 Active CN110548489B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910863327.4A CN110548489B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910863327.4A CN110548489B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110548489A CN110548489A (zh) 2019-12-10
CN110548489B true CN110548489B (zh) 2022-06-24

Family

ID=68740197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910863327.4A Active CN110548489B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110548489B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111454991A (zh) * 2020-03-03 2020-07-28 安徽工业大学 一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用及应用方法
CN111549023A (zh) * 2020-04-22 2020-08-18 杭州医学院 一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组dna中的应用
CN111871381A (zh) * 2020-07-10 2020-11-03 福州大学 一种磁性共价有机框架吸附剂及其对质粒dna分离纯化方法
CN113171755B (zh) * 2021-04-28 2022-10-14 安徽工业大学 一种镍螯合磁性纳米颗粒、制备方法及用于分离纯化组氨酸标签蛋白的用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101628224A (zh) * 2009-08-14 2010-01-20 陕西北美基因股份有限公司 表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途
CN101845435A (zh) * 2010-06-11 2010-09-29 江南大学 一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆dna的方法
CN103007479A (zh) * 2012-12-31 2013-04-03 西安科技大学 一种灭火剂
CN103693626A (zh) * 2013-12-18 2014-04-02 安徽工业大学 一种利用含二氧化碳的硫化氢酸气制备硫氢化钠的方法
CN104212793A (zh) * 2014-08-08 2014-12-17 中国人民解放军疾病预防控制所 磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法
CN104525128A (zh) * 2014-12-30 2015-04-22 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种PSA修饰的超顺磁性纳米微球Fe3O4@SiO2@PSA、制备方法及其用途
CN105126765A (zh) * 2015-08-21 2015-12-09 洛阳理工学院 一种连接三羧甲基乙二胺的金属螯合磁珠制备方法
CN105308185A (zh) * 2013-06-11 2016-02-03 3M创新有限公司 使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8551457B2 (en) * 2008-11-25 2013-10-08 The Procter & Gamble Company Oral care compositions comprising spherical fused silica
KR101646610B1 (ko) * 2015-05-28 2016-08-09 (주)바이오니아 생체 물질 정제용 고활성 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법
US11117117B2 (en) * 2017-07-13 2021-09-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Doped carbonaceous materials for photocatalytic removal of pollutants under visible light, making methods and applications of same

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101628224A (zh) * 2009-08-14 2010-01-20 陕西北美基因股份有限公司 表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途
CN101845435A (zh) * 2010-06-11 2010-09-29 江南大学 一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆dna的方法
CN103007479A (zh) * 2012-12-31 2013-04-03 西安科技大学 一种灭火剂
CN105308185A (zh) * 2013-06-11 2016-02-03 3M创新有限公司 使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法
CN103693626A (zh) * 2013-12-18 2014-04-02 安徽工业大学 一种利用含二氧化碳的硫化氢酸气制备硫氢化钠的方法
CN104212793A (zh) * 2014-08-08 2014-12-17 中国人民解放军疾病预防控制所 磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法
CN104525128A (zh) * 2014-12-30 2015-04-22 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种PSA修饰的超顺磁性纳米微球Fe3O4@SiO2@PSA、制备方法及其用途
CN105126765A (zh) * 2015-08-21 2015-12-09 洛阳理工学院 一种连接三羧甲基乙二胺的金属螯合磁珠制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis of highly hydrophilic magnetic nanoparticles of Fe3O4 for potential usein biologic systems;Marcos R. Mauricio et.al;《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and》;20131231;第417卷;全文 *
磁性纳米颗粒的功能化及其在DNA提取中的应用;李松等;《化工时刊》;20090725(第07期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110548489A (zh) 2019-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110548489B (zh) 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用
US7795041B2 (en) Multi-polymer-coated magnetic nanoclusters
JP2965131B2 (ja) 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
EP1312671B1 (en) Magnetic particles having lower limit critical solution temperature
Perçin et al. Poly (hydroxyethyl methacrylate) based magnetic nanoparticles for plasmid DNA purification from Escherichia coli lysate
US20100129794A1 (en) Magnetic Polymer Particles
CN111330558B (zh) 一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法
CN109215998B (zh) 改进磁性硅颗粒及其用于核酸纯化的方法
Tiwari et al. Magneto-separation of genomic deoxyribose nucleic acid using pH responsive Fe 3 O 4@ silica@ chitosan nanoparticles in biological samples
Sun et al. Capture and release of genomic DNA by PEI modified Fe3O4/Au nanoparticles
JP2022537454A (ja) 生物磁気ミクロスフェア並びにその調製方法および使用方法
Saraji et al. Plasmid DNA purification by zirconia magnetic nanocomposite
CN113186166B (zh) 一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法
Zhang et al. Fabrication of mono-sized magnetic anion exchange beads for plasmid DNA purification
CN114395553A (zh) 磁珠法质粒提取试剂盒、制备方法及质粒提取方法
CN114054002B (zh) 磁性纳米复合材料及其制备方法、应用
CN114093586A (zh) 一种聚合物包覆磁性微球及其制备方法
KR20070018501A (ko) 고순도 및 고용량으로 ｄｎａ를 분리 정제할 수 있는아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의제조방법
CN114906876B (zh) 一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法
KR101800004B1 (ko) 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법
JP2009171853A (ja) 上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子による電荷物質の回収方法及びキット
CN102146369A (zh) 一种基于配位作用的固相介质提取dna的方法
Wang et al. Preparation of lysozyme imprinted magnetic nanoparticles via surface graft copolymerization
Feng et al. A new ion-exchange adsorbent with paramagnetic properties for the separation of genomic DNA
CN112246196A (zh) 一种功能化磁性微球的制备方法、磁性微球及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant