CN111454991A - 一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用及应用方法 - Google Patents

一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，所述载体为三代聚酰胺‑胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒，其表面带正电荷，能够通过静电相互作用与带负电荷的siRNA或质粒DNA结合，形成核酸材料复合物，随后在磁场作用下进入靶细胞，成功实现靶细胞中特定基因的沉默或表达，该载体制备方法简单，操作简便，原料便宜，易实现批量生产，且细胞毒性小、转染效率高。

Description

一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用及应用 方法
技术领域
本发明属于纳米材料和分子生物学技术领域，尤其涉及一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用及应用方法。
背景技术
利用核酸递送技术进行分子水平疗法被认为是治愈人类疾病的有效补救途径。核酸递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体两种类型，虽然病毒载体具有良好的细胞转染能力，但是，它们的使用易引起插入诱变和免疫原性等相关问题。而非病毒递送载体因其可避免病毒系统相关的诸多问题，被认为是病毒核酸载体的有效替代品，在核酸递送以及后续的基因治疗方面体现出很好的应用前景。
在非病毒载体中，多功能纳米粒子在增强核酸稳定性、保护核酸免受核酸酶降解等方面均表现出优异的性能，这些纳米粒子主要包括脂质纳米粒子、量子点、碳纳米管、磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和基于聚合物的纳米粒子等。其中，表面带正电荷的磁性纳米颗粒与其他非病毒核酸递送系统相比具有许多优势，具备代谢酶抵抗力强、核酸携带能力高、穿透能力强、成本低，以及可在外部磁场中驱动目标基因稳定高效表达等特点，且磁转染是一种简单、多用途、高效的基因转移方法，具有广泛的应用前景。但是，单纯的MNPs转染效率低，直接作为核酸递送载体并不合适。
常见的非病毒递送载体中，聚合物因其高转染效率而被认为是有潜力的候选者。阳离子聚合物纳米粒子因其结构和功能较稳定且带有大量正电荷可与带负电荷的核酸发生电荷相互作用，一直以来是核酸递送研究的热点。其中，聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子作为一类合成高分子材料，由于其良好的溶解性、单分散性和具有表面修饰位点等特点，受到越来越多的关注。然而，阳离子聚合物类材料在高效转染的同时，因电荷等原因通常会带来较高的细胞毒性，极大制约了这些材料的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子磁性纳米材料在核酸递送中的应用及应用方法，其具有良好的生物相容性，可实现核酸的高效转染。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明包括一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用。
一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，包括如下步骤：
(a)制备无菌阳离子磁性纳米材料：
将阳离子磁性纳米材料置于乙醇中，固液分离，得无菌阳离子磁性纳米材料；
(b)孵育磁性纳米材料-核酸复合物：
将所述的无菌阳离子磁性纳米材料重悬于无菌水中，分散均匀，加入外源核酸，室温下孵育结合，制备磁性纳米材料-核酸复合物；
(c)检测目的基因的表达效果：
在磁场作用下，将所述的磁性纳米材料-核酸复合物和靶细胞共孵育，48～72小时后提取总蛋白，检测目的基因的表达效果。
所述步骤(a)中，在磁场作用下进行固液分离。
所述步骤(a)中，阳离子磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备第三代聚酰胺-胺树枝状分子：
向容器中依次加入乙二胺、丙烯酸甲酯、甲醇进行反应得产物，所述乙二胺、丙烯酸甲酯的摩尔比为1:4，然后对所述产物进行提纯，最后加入蒸馏水作为溶剂，通过三次重复迈克尔加成反应和酰胺化反应得到第三代聚酰胺-胺树枝状分子；
(2)制备酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒：
将四氧化三铁磁性纳米材料分散于水溶液中，加入酒石酸氢钠溶液，超声4～5小时，然后进行固液分离，再用蒸馏水洗涤后得到酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒；
(3)制备第三代聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒：
将所述的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒分散于水溶液中，加入所述的第三代聚酰胺-胺树枝状分子溶液、4-二甲氨基吡啶，65℃下反应3小时，然后，固液分离得到固体部分，然后对所述固体部分洗涤3～5次，制备得到第三代聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒G3-S-MNPs。
所述的G3-S-MNPs带正电荷，粒径分布在100～120nm。
所述步骤(1)中，通过减压蒸馏对产物进行提纯。
所述步骤(2)中，在磁场作用下进行固液分离。
所述步骤(3)中，用蒸馏水对所述固体部分进行洗涤。
所述步骤(b)中，外源核酸选自质粒DNA或siRNA，无菌磁性纳米材料与外源核酸的质量比为10～25:1。
所述步骤(b)中，室温下孵育结合30分钟，且每10分钟涡旋混匀1次。
所述步骤(c)中，通过免疫印迹法检测目的基因的表达效果。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明用低毒性的第三代聚酰胺-胺树枝状分子对酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒进行表面功能化修饰，合成新型的聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒(G3-S-MNPs)，是没有报道过的，且制备方法简单，操作简便，原料便宜，易实现批量生产；制备的聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒对细胞毒性低，具备较好的生物相容性，表面带有氨基，呈正电荷状态，可与带负电荷的核酸高效结合，且在外部磁场作用下，进一步促进磁性材料携带核酸进入靶细胞，有效实现靶细胞中目的基因的表达，从而提高siRNA、质粒DNA等不同核酸的转染效率。
本发明综合利用MNPs和PAMAM阳离子聚合物在核酸递送方面的优良性能，以低毒性的低代数(3.0代)PAMAM为材料，合成一种新型的聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒(G3-S-MNPs)，并以G3-S-MNPs为原料，制备非病毒载体，开发出高效低毒的核酸递送载体。
附图说明
图1是G3-S-MNPs磁性纳米颗粒的粒径分布图；
图2是G3-S-MNPs磁性纳米颗粒的Zeta电位图，
a-酒石酸氢钠包裹后的MNPs，b-聚酰胺-胺进一步修饰的G3-S-MNPs；
图3是G3-S-MNPs磁性纳米颗粒的细胞毒性实验结果；
图4是G3-S-MNPs磁性纳米颗粒分别与质粒DNA和siRNA的体外结合实验结果，
c-体外DNA结合实验结果，d-siRNA体外结合实验结果；
图5是应用免疫印迹法检测G3-S-MNPs磁性纳米颗粒递送siRNA进入细胞并发挥功能的效果图；
图6是应用免疫印迹法检测G3-S-MNPs磁性纳米颗粒递送质粒DNA进入细胞并表达的效果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的方法均为常规方法，所用的试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例提供一种阳离子磁性纳米材料G3-S-MNPs的制备方法，包括如下步骤：
(1)以乙二胺和丙烯酸甲酯作为原料，甲醇作为溶剂，以乙二胺与丙烯酸甲酯摩尔比为1:4的比例加入反应物，进行迈克尔加成反应。反应完全之后，通过减压蒸馏对产物进行提纯，以除去溶剂以及未反应的反应物，加入蒸馏水作为溶剂，通过三次重复迈克尔加成反应和酰胺化反应得到第三代聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状分子，简称PAMAM-G3；
(2)将四氧化三铁磁性纳米材料分散于水溶液中，湿重约为10％，即四氧化三铁磁性纳米材料与水的质量体积比为10％，加入酒石酸氢钠溶液，超声4小时，使酒石酸氢钠通过物理吸附进行包裹磁性纳米材料，随后在磁场作用下进行固液分离，以除去没有磁性的部分，用蒸馏水洗涤，最后得到酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒；
(3)将酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒分散于水溶液中，加入PAMAM-G3，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，于65℃恒温水浴锅中反应3小时，使包裹在四氧化三铁表面的酒石酸氢钠的羧基与树枝胺表面的氨基发生充分的酰胺化反应，然后，用磁铁进行固液分离，除去体系中没有磁性的部分，再用蒸馏水洗涤3次，以除去过量的PAMAM-G3，最后得到表面带正电荷的第三代聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒(G3-S-MNPs)。
对制备的G3-S-MNPs颗粒分别进行粒径分布和Zeta电位测量，结果如图1和图2。
由图1的粒径分布结果可以看出，G3-S-MNPs颗粒分布较均匀，总体在100nm左右。
Zeta电位如图2所示，经酒石酸氢钠包裹后的MNPs(样品a)的表面电位呈负值，为-25.13mV，这是由于酒石酸氢钠在水溶液中有游离的羧基，所以改变了MNPs的表面电位；经聚酰胺-胺进一步修饰(样品b)之后，电位发生明显的变化，为+38.6mV，这表明，第三代聚酰胺-胺的氨基基团与酒石酸氢钠的羧基发生了酰胺反应，中和了大部分的羧基，并且树枝胺剩余的氨基在水溶液中也显示出了很明显的正电位。
实施例2
本实施例是对实施例1的G3-S-MNPs作为核酸递送载体的细胞毒性进行分析，步骤如下：收集对数生长期的人肺癌A549细胞或人乳腺癌MCF-7细胞，根据每孔5000个细胞的密度接种至96孔板中，每组设置三个重复孔；置于细胞培养箱中培养约24小时至细胞长至70％～80％左右；按浓度梯度(0、5、10、20、30、40、50、75、100μg/mL)加入配制好的材料样品，然后继续培养46小时；每孔加入10μL MTT(5mg/mL)溶液，继续于培养箱中培养2小时；然后吸尽孔内培养液，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，用酶标仪在490nm读取各孔的吸光值。实验独立重复三次，并表示为平均值±标准差，根据吸光值计算细胞的存活率。
细胞存活率(％)＝(实验组的平均OD490－空白组的平均OD490)/(对照组的平均OD490－空白组的平均OD490)×100。
细胞存活率结果如图3所示，在不同浓度的磁性纳米材料处理情况下，细胞的存活率都保持在85％以上，表明G3-S-MNPs制备的核酸递送载体对细胞的毒性小，具有良好的生物相容性。
实施例3
本实施例是对实施例1的G3-S-MNPs作为核酸递送载体的体外核酸结合能力进行检测。
分别以Flag-CHIP质粒(可表达Hsp/Hsc70相互作用蛋白CHIP)DNA及CIP2A基因(蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子)siRNA为目的核酸，以说明G3-S-MNPs磁性纳米材料作为核酸递送载体的效率。
体外DNA结合实验步骤如下：
固定质粒的量为1μg，按照材料与质粒的质量比值为0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1的梯度，结合体系为100μL纯的DMEM培养基，室温条件下孵育30分钟。然后，取10μL样品进行琼脂糖凝胶电泳，设置纯质粒样品作为对照，根据条带的迁移停滞来判断体外结合的效果。
体外siRNA结合实验的步骤同DNA，磁性纳米材料与RNA的比例设置如下：固定siRNA(20mM)的量为0.3μg，按照材料与siRNA的比值为1:1、2.5:1、5:1、10:1、25:1、50:1的梯度，结合体系为100μL的DMEM培养基，室温孵育30分钟，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测结合效果。
图4中，c为体外DNA结合实验结果，图中泳道1为未加入材料的Flag-CHIP质粒DNA对照，泳道2～6分别表示材料与DNA的比例为0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1，所有与磁性材料共同孵育的质粒DNA样品都出现了电泳迁移阻滞现象，材料与质粒比值为5:1开始，迁移阻滞现象变得显著，大部分质粒和材料结合的复合物被停滞在加样孔里；当结合比例达到10:1几乎所有质粒样品都停滞在加样孔里，说明材料具有显著结合DNA的能力。
图4中，d为siRNA体外结合实验结果，图中泳道1为未加入材料的CIP2A基因siRNA对照，泳道2～7分别表示材料与RNA的比例为1:1、2.5:1、5:1、10:1、25:1、50:1，在10:1时开始出现有弥散停滞条带，RNA主带开始减少，且随着G3-S-MNPs量的增加，胶孔中能明显看到siRNA和材料的复合物沉降在孔中，上述结果说明在体外条件下，G3-S-MNPs可以结合siRNA。
实施例4：
由实施例1的G3-S-MNPs制备的质粒DNA和siRNA递送载体的细胞转染效果分析：
设置有磁场和无磁场作用组，以不做任何处理的细胞为对照组，制备核酸递送载体具体操作如下：
(1)将A549细胞以每孔2-3×105的细胞密度接种于六孔培养板中，置CO2培养箱培养约24小时；
(2)将G3-S-MNPs磁性纳米材料置于75％乙醇中，在磁场作用下进行固液分离，即得无菌的G3-S-MNPs磁性纳米材料。将无菌的G3-S-MNPs磁性纳米材料重悬于无菌水中，分散均匀，以无血清培养基成分DMEM为结合缓冲液，按磁性材料与质粒DNA比例为10:1、磁性材料与siRNA比例为25:1配置复合物，于室温孵育结合30分钟，每10分钟轻轻涡旋混匀1次，制备磁性纳米材料和核酸复合物；
(3)A549细胞换成无血清的DMEM培养基，将材料/核酸复合物滴加至每孔中，磁场组将培养皿置于磁板上，37℃孵育1小时，移去磁板；
(4)转染6小时后，全部换成新鲜的有血清DMEM培养基继续培养48～72小时，然后提取蛋白并通过免疫印迹法对基因的表达效果进行检测。
图5是siRNA的递送结果显示，无磁场组细胞中CIP2A表达量和对照组相比有一定的下降，且在磁场组细胞中CIP2A的表达量显著减少，说明G3-S-MNPs可将siRNA递送入细胞并抑制目的基因的表达，且磁场能显著增强这一效果，体现出良好的磁效应。
从图6质粒DNA的递送结果可知，对比对照组和无磁场组，无磁场组可检测到Flag-CHIP蛋白的表达，说明磁性材料可介导质粒DNA进入细胞并表达。对比无磁场组和有磁场组，在磁场作用下，Flag-CHIP的表达量显著增强，说明G3-S-MNPs材料可以作为非病毒载体进行DNA递送，并且外加磁场可以显著提高转染效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用。
2.根据权利要求1所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)制备无菌阳离子磁性纳米材料：
将阳离子磁性纳米材料置于乙醇中，固液分离，得无菌阳离子磁性纳米材料；
(b)孵育磁性纳米材料-核酸复合物：
将所述的无菌阳离子磁性纳米材料重悬于无菌水中，分散均匀，加入外源核酸，室温下孵育结合，制备磁性纳米材料-核酸复合物；
(c)检测目的基因的表达效果：
在磁场作用下，将所述的磁性纳米材料-核酸复合物和靶细胞共孵育，48～72小时后提取总蛋白，检测目的基因的表达效果。
3.根据权利要求2所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(a)中，在磁场作用下进行固液分离。
4.根据权利要求2所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(a)中，阳离子磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备第三代聚酰胺-胺树枝状分子：
向容器中依次加入乙二胺、丙烯酸甲酯、甲醇进行反应得产物，所述乙二胺、丙烯酸甲酯的摩尔比为1:4，然后对所述产物进行提纯，最后加入蒸馏水作为溶剂，通过三次重复迈克尔加成反应和酰胺化反应得到第三代聚酰胺-胺树枝状分子；
(2)制备酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒：
将四氧化三铁磁性纳米材料分散于水溶液中，加入酒石酸氢钠溶液，超声4～5小时，然后进行固液分离，再用蒸馏水洗涤后得到酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒；
(3)制备第三代聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒：
将所述的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒分散于水溶液中，加入所述的第三代聚酰胺-胺树枝状分子溶液、4-二甲氨基吡啶，65℃下反应3小时，然后，固液分离得到固体部分，然后对所述固体部分洗涤3～5次，制备得到第三代聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒G3-S-MNPs。
5.根据权利要求4所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述的G3-S-MNPs带正电荷，粒径分布在100～120nm。
6.根据权利要求4所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，通过减压蒸馏对产物进行提纯。
7.根据权利要求4所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，在磁场作用下进行固液分离。
8.根据权利要求4所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，用蒸馏水对所述固体部分进行洗涤。
9.根据权利要求2所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(b)中，外源核酸选自质粒DNA或siRNA，无菌磁性纳米材料与外源核酸的质量比为10～25:1，室温下孵育结合30分钟，且每10分钟涡旋混匀1次。
10.根据权利要求2所述的一种阳离子磁性纳米材料作为核酸递送载体的应用，其特征在于，所述步骤(c)中，通过免疫印迹法检测目的基因的表达效果。
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