CN102146369A - 一种基于配位作用的固相介质提取dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，属于生物技术的技术领域。包括如下步骤：将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和金属离子溶液混合，吸附后采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，所述的金属离子是Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺或Ce⁴⁺；将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，调节混合溶液的离子强度在0.01～0.5mmol/mL、pH值2.5～4.5，静置15分钟以完成DNA分子的吸附，采取离心或磁吸将吸附了DNA分子的固相介质和溶液分离。本发明的优点在于：对DNA的吸附率高于90％，操作快速便捷。

Description

一种基于配位作用的固相介质提取DNA的方法

技术领域

本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种利用可与DNA分子产生配位作用的固相介质在生物样品中提取DNA的方法。

背景技术

DNA提取是分子生物学研究和生物工程中的一项关键技术，是DNA分析的基础和前提。DNA提取的质量直接关系到PCR扩增、基因测序的后续步骤的成功与否。随着DNA分析技术在分子生物学研究、临床疾病诊断、进出口检验检疫、法医学检验、血液质量控制等领域应用的逐渐深入，对开发高效、快速、简便、低成本的DNA提取技术的需求也与日俱增。

目前常用的几种DNA提取方法包括：苯酚-氯仿法、Chelex-100法和固相提取法等。它们均有各自的特点和适用体系：

苯酚-氯仿法适用范围广，但操作时间长，提取效率较低且因人而异，所用试剂毒性较大，对环境有污染。

Chelex-100法操作简便，提取的DNA可直接用于PCR扩增；但其提取效率低，且对体系有一定选择性。

固相提取法是目前发展较快的一种方法，它采用玻璃珠、氧化硅微粒或氧化硅包覆的磁性微粒为固相提取介质，这些介质表面都有可部分解离的硅羟基，在高盐浓度溶液中，DNA带有负电的磷酸根可以通过盐桥的媒介作用吸附在SiO2粒子表面。该方法提取纯度高，操作简便，尤其是采用氧化硅复合磁性粒子为介质，可实现对样品的快速、高通量的自动化提取。但由于这种提取方法依赖的是氧化硅粒子表面和DNA磷酸根之间的较弱的间接静电相互作用，因此DNA的吸附效率很难进一步提高，通常最高只能达到80％左右。

要想进一步提高固相提取法对DNA的吸附效率，需要对吸附介质表面进行修饰，增强其与DNA分子之间的相互作用。从DNA分子结构看，其链上的磷酸根具有很强的配位能力，可以和多种金属离子发生很强的配位作用。因此，我们可以通过对吸附介质进行表面修饰，使DNA分子和介质表面产生很强的配位作用，从而实现对DNA的吸附和提取。由于配位作用的强度要远大于静电相互作用，这样的设计将有助于进一步提高对DNA的吸附效率。

发明内容

本发明的目的就是提供一种利用DNA分子与固相介质间的配位相互作用实现对生物样品中DNA的高效提取的方法，将DNA吸附效率提高到90％以上，以克服现有提取技术提取效率偏低的缺陷。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和浓度为10～25mmol/mL的金属离子溶液混合，每毫升金属离子溶液加入0.4～0.5毫克固相提取介质，吸附1～2小时后，采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，用高纯水清洗所得固相；

(2)将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，DNA样品与吸附了金属离子的固相介质的质量比在0.009～0.01范围；用NaCl调节混合溶液的离子强度在0.01～0.5mmol/mL范围，在pH值2.5～4.5下将混合溶液静置15分钟以完成DNA分子在固相提取介质表面的吸附；根据所用不同的固相提取介质，采取离心或磁吸等分离方式，将吸附了DNA分子的固相介质和溶液分离。

本发明步骤(1)中所述的固相提取介质包括玻璃珠(尺寸在毫米区间)，无定形氧化硅微粒(形状为球形或无定形，尺寸范围在50μm～100nm)，介孔氧化硅微粒(尺寸范围在50μm～100nm)，无定形氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范围在50μm～100nm，磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe₂O₃，Fe₃O₄或其混合物)和介孔氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范围在50μm～100nm，磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe₂O₃，Fe₃O₄或其混合物)。

本发明步骤(1)中所述的表面修饰改性是指利用硅烷偶联试剂在上述固相介质表面修饰可吸附金属离子的基团，如羧基等。所用硅烷偶联剂为3-环氧基丙基三甲氧基硅烷和氨羧类螯合物反应制得，所用氨羧类螯合物包括亚胺基二乙酸(IDA)、三乙酸胺(NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)、三羧甲基乙二胺(TED)、羧甲基四聚天冬氨酸(CM-TEPA)等。分子结构式分别如下：

本发明步骤(1)中所述的金属离子包括Zn²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Fe³⁺，Ce⁴⁺等，并优选Zn²⁺，Fe³⁺，Ce⁴⁺。

本发明中对固相介质的表面修饰过程可以按现有技术进行，也可以按如下的两步骤进行。

1.将一定量的氨羧类螯合物，如IDA、NTA等溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液将溶液的pH值调至11.0，反应溶液至于0℃冰浴中，缓慢加入等摩尔量的氨羧类螯合物，将反应溶液升温至65℃，搅拌反应6小时。如必要，重复加入氨羧类螯合物继续搅拌反应6小时，即获得末端带有氨羧螯合基团的硅烷偶联剂。

2.取一定量的固相介质，如无定形氧化硅微粒、介孔氧化硅微粒或氧化硅磁性复合微粒等，将其分散在去离子水中，加入一定量步骤1中制备的硅烷偶联剂，调整溶液pH值至3.0，在90℃反应3小时，离心或磁吸分离出修饰后的固相介质，用去离子水和乙醇分别洗涤两次。

本发明的优点在于：

1.对DNA的吸附效率高，吸附率高于90％。

2.操作快速便捷，与现有的固相提取法操作步骤基本相同。

具体实施方法

借助以下实施例对本发明做进一步描述，应理解，以下实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方法。

本发明中所述的DNA吸附率，是固相介质吸附的DNA质量与原溶液中DNA总质量的比值。

实施例1：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后的DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到96.4％。

实施例2：

将20mg表面IDA修饰的200nm介孔氧化硅微粒分散在50ml，10mol/LFeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为3.8，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到91.8％。

实施例3：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅微粒分散在50ml，10mol/L Ce(SO₄)₂溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Ce⁴⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为4.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到97.5％。

实施例4：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到92.5％。

实施例5：

将20mg表面NTA修饰的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为4.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.5mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到94.5％。

实施例6：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，20mol/L ZnSO₄溶液中，30℃下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Zn²⁺的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为3.2，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.5mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到90.2％。

实施例7：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，10mol/L CuSO₄溶液中，30℃下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Cu²⁺的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.3mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到91.2％。

实施例8：

将20mg表面IDA修饰的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，25mol/L NiSO₄溶液中，30℃下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Ni²⁺的200nm无定形氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为3.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.5mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到92.5％。

实施例9：

将20mg表面IDA修饰的玻璃珠分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的玻璃珠分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到92.1％。

实施例10：

将20mg表面IDA修饰的200nm介孔氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，用磁吸分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm介孔氧化硅包覆Fe₃O₄微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为3.2，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.04mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用磁吸分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到93.5％。

实施例11：

将20mg表面TED修饰的200nm无定形氧化硅微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后的DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到95.4％。

实施例12：

将20mg表面CM-ASP修饰的200nm无定形氧化硅微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌1.5小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为2.5，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后的DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到96.8％。

实施例13：

将20mg表面CM-TEPA修饰的200nm无定形氧化硅微粒分散在50ml，10mol/L FeCl₃溶液中，室温下搅拌2小时，离心分离出固相介质，用高纯水洗涤2次。

将2mg吸附了Fe³⁺的200nm无定形氧化硅微粒分散在0.75ml，25ug/mL鲑鱼精DNA水溶液中，调整溶液pH值为3.0，用NaCl溶液调整溶液离子强度为0.01mol/L。混匀后室温下静置15分钟。用2000rpm离心分离出吸附了DNA的固相介质。对比吸附前后的DNA溶液在260nm的吸光度值，可知对DNA吸附率达到97.5％。

Claims (4)

1.一种基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，有如下步骤：

(1)将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和浓度为10～25mmol/mL的金属离子溶液混合，每毫升金属离子溶液加入0.4～0.5毫克固相提取介质，吸附1～2小时后，采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，用高纯水清洗所得固相；

(2)将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，DNA样品与吸附了金属离子的固相介质的质量比在0.009～0.01范围；用NaCl调节混合溶液的离子强度在0.01～0.5mmol/mL范围，在pH值2.5～4.5下将混合溶液静置15分钟以完成DNA分子在固相提取介质表面的吸附；采取离心或磁吸方式，将吸附了DNA分子的固相介质和溶液分离。

2.如权利要求1所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述的利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质，是用3-环氧基丙基三甲氧基硅烷作硅烷偶联剂，和氨羧类螯合物反应制得；所述的氨羧类螯合物，是亚胺基二乙酸、三乙酸胺、羧甲基天冬氨酸、三羧甲基乙二胺或羧甲基四聚天冬氨酸。

3.如权利要求1或2所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述的固相提取介质，是玻璃珠、无定形氧化硅微粒、介孔氧化硅微粒、无定形氧化硅包覆磁性微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒。

4.如权利要求1或2所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述的金属离子是Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺或Ce⁴⁺。