CN105087552B - 一种提取动物组织核酸的方法 - Google Patents

一种提取动物组织核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105087552B
CN105087552B CN201510610875.8A CN201510610875A CN105087552B CN 105087552 B CN105087552 B CN 105087552B CN 201510610875 A CN201510610875 A CN 201510610875A CN 105087552 B CN105087552 B CN 105087552B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
magnetic
animal tissue
magnetic microsphere
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510610875.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105087552A (zh
Inventor
贾松涛
赵林萍
李梦雨
董瑞静
赵市勇
张娟
张丹鹤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHONGBIAO TESTING HENAN SERVICE LTD.
Original Assignee
Luohe Success Testing Service Co Ltd
ZHENGZHOU ZHONGDAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Zhongbiao Testing Henan Service Ltd
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Luohe Success Testing Service Co Ltd, ZHENGZHOU ZHONGDAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd, Zhongbiao Testing Henan Service Ltd, Zhengzhou University filed Critical Luohe Success Testing Service Co Ltd
Priority to CN201510610875.8A priority Critical patent/CN105087552B/zh
Publication of CN105087552A publication Critical patent/CN105087552A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105087552B publication Critical patent/CN105087552B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

一种提取动物组织核酸的方法，包括以下步骤：(1)将动物组织样品、核酸提取液加入到鼓泡床容器中，所述核酸提取液含有能够吸附核酸的磁性微球；所述鼓泡床容器底部设置有微孔板和气体入口；(2)从所述气体入口向鼓泡床容器中通入氮气或惰性气体，使动物组织样品与核酸提取液充分混合、反应，分离出的核酸被磁性微球吸附。根据本发明的提取动物组织核酸的方法，能够对动物组织进行快速解离并高效分离提纯核酸，能够广泛应用到动物疫病检测领域。

Description

一种提取动物组织核酸的方法
技术领域
本发明涉及一种提取动物组织核酸的方法。
背景技术
动物疾病对畜牧业以及人类的食品安全都有着重要的影响，采用分子生物学方法对动物组织进行病原菌诊断能够获得最准确的结果。关键步骤是要从动物组织样品中提取细菌或病毒的DNA。能获取不同种类的细菌DNA或不同种类病毒的DNA，以及基因组的完整性、纯度和浓度，是从动物组织中提取DNA用于动物病原菌诊断的首要目标。
现有的DNA提取过程中常常有污染，并且步骤繁琐，提取过程时间较长。如高氯酸钠法、SDS法和尿素法等提取方法，但这些方法需要样本量较大，并且苯酚类等有机物容易在DNA溶液中残留，特别是在后续的PCR扩增过程中会干扰扩增过程，影响扩增结果，使得该方法的应用受到一定的限制。
磁性微球在外加磁力的作用下，可快速分离纯化核酸DNA，因安全并易于实现自动化而迅速发展。磁性微球核酸提取方法是指以超顺磁性的磁性微球在高盐、低PH溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁性微球表面脱离的原理进行核酸提取的方法。
现有的磁性微球通常是由四氧化三铁或三氧化二铁等磁芯与二氧化硅等材料复合而成的具有一定磁性的球形微粒。中国发明专利(CN1217352)公开了一种二氧化硅包覆四氧化三铁的磁性微球的制备方法，其采用酸化法在四氧化三铁表面沉积二氧化硅。而加入的酸性物质(HCl)会在一定程度上与磁芯四氧化三铁发生反应，从而会对磁性微球的磁性产生不确定性影响，导致产品质量不稳定。
此外，磁性微球在核酸提取液中容易产生团聚和沉淀现象，从而严重影响核酸的提取效率。现有技术中通常采用机械搅拌或超声振荡来克服这一问题，但机械搅拌或超声振荡又会对磁性微球的结构和吸附能力产生一定的破坏作用。
发明内容
本发明的目的是针对上述背景技术中存在的某些和某个问题，提供一种提取动物组织核酸的方法。
根据本发明的提取动物组织核酸的方法，包括以下步骤：
(1)将动物组织样品、核酸提取液加入到鼓泡床容器中，所述核酸提取液含有能够吸附核酸的磁性微球；所述鼓泡床容器底部设置有微孔板和气体入口；
(2)从所述气体入口向鼓泡床容器中通入氮气或惰性气体，使动物组织样品与核酸提取液充分混合、反应，分离出的核酸被磁性微球吸附。
在本发明的具体实施例中，动物组织样品既可以是为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏的匀浆液；也可以是全血、血浆、血清或动物分泌物。
在本发明的优选实施例中，所述核酸提取液含有磁性微球、异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5-5M,盐酸胍的浓度为1.5-3M,碘化钠的浓度为1.2-2.5M,EDTA的浓度为15-30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60-100mM；磁性微球的质量浓度为10-15％。
在本发明的优选实施例中，磁性微球由纳米级磁芯和多孔碳化硅包覆层组成。
在本发明的优选实施例中，其中磁性微球的粒径为10-50μm。
在本发明的优选实施例中，其中微孔板的孔径为3-10μm。
在本发明的优选实施例中，所述鼓泡床容器为直径为15-30mm的圆柱形容器。
在本发明的优选实施例中，气体流速为10-100mL/min。
根据本发明的提取动物组织核酸的方法，能够对动物组织进行快速解离并高效分离提纯核酸，能够广泛应用到动物疫病(如禽流感、口蹄疫、猪瘟、蓝耳病等)检测领域。
附图说明
图1为根据本发明的提取动物组织核酸的装置示意图。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的提取动物组织核酸的方法。本领域技术人员应当理解，下面描述的实施例仅是对本发明的示例性说明，而非用于对其作出任何限制。
根据本发明的提取动物组织核酸的具体过程如下：
一、制备动物组织样品
动物组织样品可以是固体物也可以是液体。固体物可以是动物的心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏，利用粉碎机将待测的固体物粉碎制成匀浆液。液体物可以是动物的全血、血浆、血清或尿液，液体物可以直接用于反应。
二、核酸提取液的制备
(一)磁性微球的制备
(1)将聚碳硅烷固体溶解到有机苯类溶剂中，形成乳液；将纳米级磁性粉体加入到含有表面活性剂的有机醇类溶剂中，搅拌均匀形成悬浮液；将悬浮液加入到乳液中，搅拌均匀，得到混合液；其中聚碳硅烷与磁性粉体的质量比为2-5:1。
有机苯类溶剂选自甲苯、二甲苯和二乙烯基苯中的一种或几种组合。聚碳硅烷与有机苯类溶剂的质量比优选控制在1-1.5:1，在该配比范围内，形成的乳液能够保持适中的粘度，以便于后续的混合。有机醇类溶剂选自乙醇或乙二醇；表面活性剂选自二辛基琥珀酸磺酸钠、十烷基硫酸钠、溴化十烷基三甲基铵或溴化十烷基铵。上述表面活性剂能够与有机醇互溶，从而能够将纳米磁性粉体充分分散并悬浮。其中磁性粉体为铁、钴、镍或它们的合金，也可以为Fe3O4。磁性粉体的粒径优选为1nm-30nm，在该粒径范围内的磁性粉体具有超顺磁性，即当外加磁场撤去后，磁性粉体无剩磁，从而不会发生聚集。磁性粉体与有机醇类溶剂的质量比优选为1-3:1，表面活性剂与有机醇类溶剂的质量比优选为0.05-0.2:1。在这些配比条件下，磁性粉体不仅能够很好地分散，并且具有相对高的浓度，从而为最终产品的磁强度提供的保证。
(2)将混合液通过微孔膜滴入到含有交联剂的温水溶液中，水温保持在60-80℃；使得混合液中聚碳硅烷交联固化在磁性粉体表面；利用减压蒸馏手段将水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球。
交联剂选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺或氨丙啶，这两种交联剂能够与水互溶，交联剂与水的质量比优选为0.05-0.2:1。在该步骤中，微孔膜的孔径优选为1-50μm，更优选为10-30μm。通过微孔膜的液滴进入温水溶液后，形成尺寸均一的水包油球形结构，并且球形结构表面的聚碳硅烷在交联剂和温度促进作用下，迅速发生交联固化，从而均匀包覆住磁性粉体。
(3)将固体微球在500-1000℃下、氮气或惰性气体保护下进行保温1-2小时，从而形成表面多孔的碳化硅包覆纳米磁芯的固体微球。
热处理过程中的升温速率尤为关键，若采用普通的热处理升温速率(5-30℃/min)，聚碳硅烷的裂解速度过快，就会发生发泡和结构崩塌。本发明的发明人在采用0.1-2℃/min的超低升温速率时，意外发现聚碳硅烷的裂解得以缓慢进行，从而形成主要为0.01μm以下孔径的超微孔，这对磁性微球应用过程中吸附核酸具有非常重要的作用。通过热处理，聚碳硅烷裂解后形成主要成分为碳化硅的多孔包覆层，不仅具有较大的比表面积，同时具有较高的结构强度，并且与磁性粉体结合紧密。
(4)采用磁分离手段，对热处理后的磁性微球进行筛选，去除没有磁性或磁性不够要求的不合格磁性微球，最终得到符合磁性要求的合格磁性微球成品。磁性微球的粒径在10-50μm之间。
(二)磁性微球的活化
将步骤(一)中制得的成品磁性微球、催化剂和氨基试剂以1:1-20：5-30的质量比混合，保持pH值为10-13，温度为50-80℃下，搅拌反应5-10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球；其中催化剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，氨基试剂选自氨基苯甲脒或氨基苯基硼酸。通过步骤(二)的活化处理，使磁性微球表面结合有羧基和羟基的活性基团，使其对核酸具有特异性吸附能力。
(三)提取液的配制
将步骤(二)中活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5-5M,盐酸胍的浓度为1.5-3M，碘化钠的浓度为1.2-2.5M，EDTA的浓度为15-30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60-100mM，磁性微球的质量浓度为10-15％。
三、核酸的提取
参见图1，根据本发明的核酸提取装置包括鼓泡床容器1、气瓶4、缓冲瓶5和流量计6。鼓泡床容器1的底部设置有微孔板2和气体入口3，气瓶4通过管路依次与缓冲瓶5、流量计6、开关、以及气体入口3连接。气瓶4中的气体优选为氮气或氩气。鼓泡床容器1为直径为15-30mm的圆柱形容器，其中微孔板的孔径为3-10μm。
将动物组织样品、核酸提取液加入到鼓泡床容器1中，从气体入口3向鼓泡床容器1中通入氮气或惰性气体，使动物组织样品与核酸提取液充分混合、反应，分离出的核酸被磁性微球7吸附。
反应过程中，气体流速保持为10-100mL/min，在该流速下，通过微孔板2的微细气流均匀搅动溶液，既能促进反应充分进行，又不会对磁性微球7的结构产生破坏，并且能防止磁性微球7的团聚和沉淀。
四、核酸的分离提纯
将鼓泡床容器1中反应后的溶液倒入另一容器中，利用外加磁场(例如磁铁)吸住磁性微球7，去除掉溶液。再分别通过洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对磁性微球7进行提纯和洗脱，最终得到所要检测的核酸分子，用于后续的PCR扩增以及基因检测。

Claims (3)

1.一种提取动物组织核酸的方法，包括以下步骤：
(1)将动物组织样品、核酸提取液加入到鼓泡床容器中，所述核酸提取液含有能够吸附核酸的磁性微球；所述鼓泡床容器底部设置有微孔板和气体入口；所述鼓泡床容器为直径为15-30mm的圆柱形容器；其中微孔板的孔径为3-10μm；
其中，所述核酸提取液含有磁性微球、异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5-5M,盐酸胍的浓度为1.5-3M,碘化钠的浓度为1.2-2.5M,EDTA的浓度为15-30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60-100mM；磁性微球的质量浓度为10-15％；磁性微球由纳米级磁芯和多孔碳化硅包覆层组成；磁性微球的粒径在10-50μm之间；
其中磁性微球通过以下方法制得：
(a)将聚碳硅烷固体溶解到有机苯类溶剂中，形成乳液；将纳米级磁性粉体加入到含有表面活性剂的有机醇类溶剂中，搅拌均匀形成悬浮液；将悬浮液加入到乳液中，搅拌均匀，得到混合液；其中聚碳硅烷与磁性粉体的质量比为2-5:1；
(b)将混合液通过微孔膜滴入到含有交联剂的温水溶液中，水温保持在60-80℃；使得混合液中聚碳硅烷交联固化在磁性粉体表面；利用减压蒸馏手段将水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球；
(c)将固体微球在500-1000℃下、氮气或惰性气体保护下进行保温1-2小时，其中升温速率为0.1-2℃/min，从而形成表面多孔的碳化硅包覆纳米磁芯的固体微球；
(d)采用磁分离手段，对热处理后的磁性微球进行筛选，去除没有磁性或磁性不够要求的不合格磁性微球，最终得到符合磁性要求的合格磁性微球成品；
(e)磁性微球的活化：将上述步骤中制得的成品磁性微球、催化剂和氨基试剂以1:1-20：5-30的质量比混合，保持pH值为10-13，温度为50-80℃下，搅拌反应5-10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球；其中催化剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，氨基试剂选自氨基苯甲脒或氨基苯基硼酸；
(2)从所述气体入口向鼓泡床容器中通入氮气或惰性气体，气体流速为10-100mL/min；使动物组织样品与核酸提取液充分混合、反应，分离出的核酸被磁性微球吸附。
2.根据权利要求1所述的提取动物组织核酸的方法，所述动物组织样品为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏的匀浆液。
3.根据权利要求1所述的提取动物组织核酸的方法，所述动物组织样品为全血、血浆、血清或动物分泌物。
CN201510610875.8A 2015-09-23 2015-09-23 一种提取动物组织核酸的方法 Active CN105087552B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510610875.8A CN105087552B (zh) 2015-09-23 2015-09-23 一种提取动物组织核酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510610875.8A CN105087552B (zh) 2015-09-23 2015-09-23 一种提取动物组织核酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105087552A CN105087552A (zh) 2015-11-25
CN105087552B true CN105087552B (zh) 2018-08-17

Family

ID=54568886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510610875.8A Active CN105087552B (zh) 2015-09-23 2015-09-23 一种提取动物组织核酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105087552B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
US20200308569A1 (en) * 2016-06-24 2020-10-01 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for purifying rna
CN106467891A (zh) * 2016-09-22 2017-03-01 苏州百源基因技术有限公司 一种应用于核酸提取仪的气体供给装置及核酸提取仪

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101164700A (zh) * 2006-10-16 2008-04-23 中国科学院过程工程研究所 生化产品磁性吸附与解吸的连续生产设备
CN101613697A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化dna的方法
CN104528725A (zh) * 2015-01-08 2015-04-22 厦门大学 一种磁性碳化硅陶瓷纳米粒子的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101164700A (zh) * 2006-10-16 2008-04-23 中国科学院过程工程研究所 生化产品磁性吸附与解吸的连续生产设备
CN101613697A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化dna的方法
CN104528725A (zh) * 2015-01-08 2015-04-22 厦门大学 一种磁性碳化硅陶瓷纳米粒子的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105087552A (zh) 2015-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108620048B (zh) 聚乙烯亚胺修饰的磁性微球制备方法及应用
Xiao et al. Preparation and highlighted applications of magnetic microparticles and nanoparticles: a review on recent advances
CN101256864B (zh) 一种超顺磁性介孔二氧化硅复合球及其制备方法
Bruce et al. Synthesis, characterisation and application of silica-magnetite nanocomposites
Rios et al. Magnetic (nano) materials as an useful tool for sample preparation in analytical methods. A review
CN110038533B (zh) 高磁性微粒径纳米磁珠及其制备方法
KR101646610B1 (ko) 생체 물질 정제용 고활성 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법
CN106457196B (zh) 磁性物质颗粒的操作方法和磁性物质颗粒操作用装置
Lee et al. Preparation of iron oxide silica particles for Zika viral RNA extraction
CN101792757A (zh) 一种用磁珠分离基因组dna试剂盒及其应用
CN109727761A (zh) 一种单分散超顺磁性纳米磁珠的制备方法和应用
CN105087552B (zh) 一种提取动物组织核酸的方法
CN112779245B (zh) 一种高载量的核酸提取用磁珠及其制备方法与应用
CN109215998A (zh) 改进磁性硅颗粒及其用于核酸纯化的方法
CN113004546A (zh) 一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用
CN110451580A (zh) 一种制备单分散四氧化三铁磁性纳米粒子的方法
CN105561914A (zh) 一种用于核酸纯化的纳米磁珠
CN113893826A (zh) 一种高性能悬浮磁珠的制备方法及应用
CN1970752A (zh) 用磁性纳米复合材料回收dna的方法及试剂盒
CN101153264A (zh) 微通道、用于回收核酸的装置和回收核酸的方法
CN107175064A (zh) 一种磁性微球硅胶及其制备方法
CN102698723A (zh) 一种磁性有机磷农药分子印迹纳米微球制备方法及其应用
CN108593792A (zh) 水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-hplc-紫外检测方法
CN105112404B (zh) 一种动物组织核酸提取液的制备方法
CN104513819B (zh) 一种选择性提取dna的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180702

Address after: 450001 No. 916, No. 1, Changchun Road, No. 11 Changchun Road, Zhengzhou high tech Industrial Development Zone, Henan

Applicant after: ZHONGBIAO TESTING HENAN SERVICE LTD.

Applicant after: Luohe success Testing Service Co., Ltd.

Applicant after: Zhengzhou Zhongdao Biological Technology Co., Ltd.

Applicant after: Zhengzhou University

Address before: 450000 Zhengzhou science and technology zone, Henan 65 science and technology elite Avenue 8106

Applicant before: ZHONGBIAO TESTING HENAN SERVICE LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180927

Address after: 45 001 9/F, 1/F, National University Science Park, 11 Changchun Road, Zhengzhou High-tech Industrial Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province

Patentee after: ZHONGBIAO TESTING HENAN SERVICE LTD.

Address before: 450001 No. 916, No. 1, Changchun Road, No. 11 Changchun Road, Zhengzhou high tech Industrial Development Zone, Henan

Co-patentee before: Luohe success Testing Service Co., Ltd.

Patentee before: ZHONGBIAO TESTING HENAN SERVICE LTD.

Co-patentee before: Zhengzhou Zhongdao Biological Technology Co., Ltd.

Co-patentee before: Zhengzhou University