CN113004546A - 一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硅羟基磁珠的制备方法,包括步骤:微球制备‑表面改性处理‑聚合物Ⅰ/Fe3O4壳磁体制备‑增加聚合物保护层‑二氧化硅包覆,该制备方法制得到的具有超顺磁性的硅羟基磁珠,能够应用于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测。该硅羟基磁珠通过在壳磁体上增加一层聚合物保护层再进行二氧化硅包覆,形成多层结构将四氧化三铁磁核包裹在中心,防止磁珠在甲基化处理硫化纯化过程中出现磁泄露的现象,表面结构致密均匀无缺陷,粒径均一磁珠结构稳定,超声分散时结构不易被破坏。
Description
技术领域
本发明涉及磁性材料技术领域,更具体地说,它涉及一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
DNA是基本的遗传物质,在蛋白质合成和一系列重大生命的生长和变异过程中起着决定性作用。以DNA为研究对象的生物技术,包括对DNA的提取、克隆、扩增、测序等一系列技术,近年得到飞速发展。
甲基化游离DNA是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法应运而生。从基因组DNA片段中快速分离CpG甲基化DNA。富集的DNA可用于多种下游的应用,比如终点PCR(end point PCR)或实时定量PCR(real time PCR)分析正常或者疾病样本中特定位点的甲基化情况、重亚硫酸盐处理后的克隆和测序或扩增和标记后用于微阵列分析。因此甲基化过程中游离DNA的提取富集,尤其是微量DNA,对于甲基化DNA的研究工作具有重要的意义。
游离DNA是存在于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外DNA,主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞,依据血浆中存在游离DNA的理论,采用磁珠作为固相吸附载体并使用特定设计的试剂体系及提取流程,建立一种简便、高效提取样本中甲基化游离DNA的方法,评价其作为用于样本的甲基化基因检测技术的可行性。游离DNA的提取目前用的比较多的是离心法和磁珠法。现有技术中,硅羟基磁珠可以从全血、组织、植物和微生物等样本中提取基因组DNA;每mg磁珠能从200μL全血中提取4-12μg基因组DNA。
磁珠的制备的传统方法主要有Stober法(即溶胶-凝胶法)和微乳液法等。其中Stober法主要上硅前驱体在磁珠表面水解、聚合形成厚度均匀的硅氧网络结构层,该方法制备的磁珠因具有可调控反应时间、壳结构厚度均匀的特点而被广泛应用。但是该方法制备的磁珠,二氧化硅包覆氧化铁纳米颗粒的核壳结构不均匀,磁响应性能不佳,操作复杂。
公布号为CN110304662A的中国发明专利,公开了一种硅羟基磁珠的制备方法,说明书[0012-0013]:将三氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸钠以及多元醇混合均匀得到混合溶液,采用溶剂热法制备得到Fe3O4纳米粒子;采用原子层沉积法在上述Fe3O4纳米粒子的表面包覆SiO2膜,即得硅羟基磁珠。该法制备的硅羟基磁珠制备程序复杂,磁响应不灵敏,对游离的DNA浓度较低尤其是微量DNA的富集及样本检测误差较大,使用过程中会发生漏磁现象。
公布号为CN112007605A的中国发明专利,公开了一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠及其制备方法,该发明公开了一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠,以超顺磁性氧化铁纳米磁珠为内核,二氧化硅为外壳得到羟基纳米磁珠核壳结构,结构简单磁响应快,但是该磁珠在使用过程中易漏磁。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供硅羟基磁珠的制备方法,该方法工艺流程简单,操作简便,原料成本低,适宜于工业化大批量生产;并提供一种硅羟基磁珠,具有磁响应均匀、灵敏,结构稳定、无漏磁,能够实现对甲基化过程的微量DNA进行纯手工或仪器自动化的高效富集,且避免在甲基化处理硫化纯化过程中的磁泄露。
为实现上述目的,一方面,本发明提供了如下技术方案:
一种硅羟基磁珠的制备方法,包括以下步骤:
步骤(1)微球制备:采用聚合物单体共聚法制备200nm~2μm大小均一的单分散聚合物Ⅰ微球;
步骤(2)表面改性处理:对S1制备的微球进行表面改性处理;
步骤(3)聚合物Ⅰ/Fe3O4壳磁体制备:以原位共沉淀的方法制备壳磁型聚合物Ⅰ/四氧化三铁磁性微球;
步骤(4)聚合物保护层:在壳磁体上包覆一层聚合物Ⅱ;
步骤(5)二氧化硅包覆:将步骤(4)制备的含保护层的磁性微球重新分散,再改性修饰,最后得到硅羟基磁珠。
在本发明的一些实施方案中,步骤(1)中所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种;
在本发明的一些实施方案中,步骤(4)中所述聚合物Ⅱ为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂其中的一种。
在本发明的一些实施方案中,步骤(1)中所述共聚法为分散聚合、乳液聚合、悬浮聚合或溶胀聚合其中的一种。
在本发明的一些实施方案中,步骤(2)中所述表面改性处理为浓硫酸磺酸化、酯类或酸酐类水解其中的一种。
在本发明的一些实施方案中,步骤(3)中所述原位共沉淀的方法可以是氧化共沉淀方法,还可以是混合铁源共沉淀或还原共沉淀。
在本发明的一些实施方案中,步骤(4)中所述增加聚合物保护层的方法为单体聚合法或自组装封闭包覆法。
在本发明的一些实施方案中,在步骤(5)碱性条件下添加硅烷偶联剂进行改性修饰。
在本发明的一些实施方案中,在本发明的一些实施方案中,步骤(5)中将包含所述保护层的磁珠分散在纯化水和极性溶剂的混合液中,碱性条件下添加硅烷偶联剂进行改性修饰,通过控制硅烷偶联剂的添加量,将二氧化硅包覆层的厚度限制在1nm~1μm的范围,并通过调节反应速率,填补二氧化硅包覆层表面的空隙,使磁珠表面致密平整。
在本发明的一些实施方案中,将包含所述保护层的磁珠分散在纯化水和极性溶剂的混合液中,添加氨水溶液调整pH值使反应环境为碱性,进行超声处理后,添加硅烷偶联剂进行改性修饰,30~80℃的温度下,机械搅拌2~8h,除去溶液,所得磁珠洗至中性,即得到硅羟基磁珠。
在本发明的优选实施方式中,所述纯化水和极性溶剂的混合液为极性溶剂和纯化水的体积比=(2~5):1。在本发明的一些实施方案中,极性溶剂为乙醇,还可以为氨水溶液。
在本发明的优选实施方式中,所述硅烷偶联剂可以是正硅酸乙酯,添加量为0.16~4.5mL。进一步地,所述硅烷偶联剂还可以是甲基三氧乙基硅烷、三甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷其中的一种。
为实现本发明的另一个目的,基于以上技术方案制备得到能够应用于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测的硅羟基磁珠。
在本发明的优选实施方式中,所述硅羟基磁珠为超顺磁珠,主要成分为四氧化三铁,二氧化硅的含量为0.05%~28%,表面富含硅羟基。
在本发明的优选实施方式中,所述硅羟基磁珠为粒径大小为300-2000nm。
最后,本发明还提供了一种利用所述硅羟基磁珠在富集甲基化游离DNA中的提取和检测方法。
在本发明的优选实施方式中,所述硅羟基磁珠应用于包括血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测。
本发明方法中的生物样本来源没有特别的限制,可以是选自任何含有DNA的样品,包括但不限于血液或血浆、脑脊液等体液以及这些样品的处理品,任选地生物样本可以来自健康受试者或/和患者,例如肠癌CRC样本。
在本发明的优选实施方式中,血浆或血清、脑脊液等体液中甲基化游离DNA的富集,并配合PCR试剂盒进行检测。
本发明提供的PCR检测试剂盒,包括裂解液、转化试剂、结合液、清洗液和缓冲液等。
其中,本发明的试剂盒中的裂解液是胍盐和/或三羟甲基氨基甲烷和/或乙二胺四乙酸和/或氢氧化钠和/或吐温和/或或异丙醇和/或蛋白酶K的混合物。在本发明的优选实施方式中,裂解液包括但不限于盐酸胍、异硫氰酸胍等盐类溶液,包括但不限于异丙醇等有机溶剂。
本发明的试剂盒中的转化试剂包括但不限于亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐和/或DNA保护液的混合物。
在本发明的优选实施方式中,DNA的转化试剂没有特别的限制,可以是本领域任何使DNA中至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同与胞嘧啶的其他碱基的适当的试剂。
在本发明的优选实施方式中,所述转化试剂为亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐中的一种或多种。例如亚硫酸氢氨溶液,使用前放80℃预热5~10min。
在本发明的优选实施方式中,可以添加促进DNA转化的试剂,即DNA保护液,例如具有DNA保护作用的自由基肼,包括但不限于6-羟基-2,5,7,8四甲基-苯并二氢吡喃-2-羧酸溶液、氢醌、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸中的一种或多种。
本发明中的试剂盒中结合液包括但不限于离液序列高的盐,例如盐酸胍、异硫氰酸胍等盐类溶液。清洗液的pH值应当在6~10之间。
本发明的优选实施例中以血浆为样本进行甲基化游离DNA的富集,并配合PCR试剂盒进行检测,包括以下步骤:
A.血浆游离DNA的提取
A1.裂解:将血浆加入置于磁力架上的离心管中,加入细胞裂解液、所述硅羟基磁珠混匀后放置至所述硅羟基磁珠完全吸附。
A2.提取;加入提取漂洗液、80%乙醇完全混匀,室温放置5~10min,加洗脱液后置于50℃~60℃的水浴锅中。
A3.洗涤:液体澄清后丢弃所述硅羟基磁珠,完成血浆中游离DNA的提取。
B.DNA的硫化纯化
B1.转化;向离心管中加入转化试剂和DNA保护液,水浴锅静置。
B2.结合;加入结合液,再次加入所述硅羟基磁珠至完全吸附后加入纯化漂洗液中,完全混匀、放置至所述硅羟基磁珠完全吸附。
B3.洗脱;加入80%乙醇,室温放置5~10min,加入洗脱液后置于50℃~60℃的水浴锅中。
B4.洗涤:液体澄清后丢弃所述硅羟基磁珠,所得液体即为硫化纯化后的DNA。
根据上述步骤得到的硫化纯化后的DNA可以直接用于下一步的检测或实验研究。
C.PCR检测
将试剂盒组分PCR Mix自然融化;将DNA聚合酶和纯化水微离心后置于冰上;PCRMix和DNA聚合酶配制为混合液,分别加入样品和纯化水;根据待测样品数量和检测位点设计加样布局,并计算需要的反应数和预计损耗量,将混合液依次对应加入八联管或96孔板中,振荡混匀,进行定性/定量检测。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
1、通过在壳磁体上增加一层聚合物保护层再进行二氧化硅包覆,形成多层结构将四氧化三铁磁核包裹在中心,从而防止磁珠在甲基化处理硫化纯化过程中出现磁泄露的现象,且二氧化硅包覆层致密均匀无缺陷,粒径均一磁珠结构稳定,超声分散时结构不易被破坏。
2、先聚合形成微球再重新分散的制备方法,避免了SiO2单独成球长大、Fe3O4包覆不均匀、磁珠颗粒间磁含量不一致等原因导致的磁响应不均匀的缺陷。
3、基于所得硅羟基磁珠配合甲基化检测试剂盒能够实现对甲基化过程的微量游离DNA的纯手工或仪器自动化高效富集和检测。
4、本发明制备的硅羟基磁珠表面富含硅羟基,具有耐高温、适应酸碱环境的特点。
5、本发明制备硅羟基磁珠的方法,采用常规的原料,制备程序简单,易操作。
附图说明
图1为实施例1中所制备的硅羟基磁珠的制备流程示意图。
图2为实施例1中所制备的硅羟基磁珠的扫描电子显微镜图片。
图3为实施例1中所制备硅羟基磁珠在25℃条件下磁性能(VSM)的表征结果。
图4为实施例1中硅羟基磁珠的粒径表征结果。
图5为实施例1中硅羟基磁珠Zeta电位表征结果。
图6为实施例2中硅羟基磁珠检测分析结果。
图7为实施例2中硅羟基磁珠对血浆样本核酸提取结果。
图8A为实施例1中硅羟基磁珠对质控品甲基化游离DNA富集PCR扩增结果。
图8B为实施例2中硅羟基磁珠对质控品甲基化游离DNA富集荧光定量PCR扩增曲线。
图8C为实施例3中硅羟基磁珠对质控品甲基化游离DNA富集荧光定量PCR扩增曲线。
其中,图1中1原位共沉淀;2高聚物修饰;3硅层包覆;A聚合物基质微球;B磁性聚合物微球;C保护层;D硅羟基磁珠。
图3中横轴为磁场强度magnetization[emu/g];纵轴为磁化强度H[Oe]。
图4中横轴为磁珠粒径大小;纵轴为磁珠数量。
图5中Zeta Potential Distribution为Zeta电势分布;apparent ZetaPotential为表面Zeta电势。
图8A中S9为人Septin9基因,ACTB为内参基因。
图8B和图8C中Amplification curve为扩增曲线;纵轴fluorescence为荧光性;横轴cycles为周期。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释,其并不是对本发明的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1硅羟基磁珠多层结构的设计及制备
参阅图1,硅羟基磁珠制备步骤:原位共沉淀1-高聚物修饰2-二氧化硅包覆3,制得具有多层结构的硅羟基磁珠,由内至外依次包括聚合物基质微球A-磁性聚合物微球B-聚合物保护层C-硅羟基磁珠D。
同现有技术中常规的苯乙烯磁性微球及硅基磁球相比,增加了一层保护层的修饰设计,将壳核型的四氧化三铁作为内核包覆起来,有效防止在高温、高盐环境下的磁泄露现象。本实施例设计的硅羟基磁珠,其特殊的多层结构可以有效的避免在甲基化游离DNA在硫化纯化过程磁泄露的非理想情况,对自然条件下来源的质控品或样本的甲基化游离DNA具有卓越的抽提富集能力。
制备步骤包括:(1)共聚法制备微球(2)对微球进行表面改性处理(3)聚合物Ⅰ/Fe3O4磁性壳磁体制备(4)包覆聚合物Ⅱ保护层(5)二氧化硅包覆,得到硅羟基磁珠。
优选地,步骤(1)中微球制备方法为分散聚合、乳液聚合、悬浮聚合或溶胀聚合等其中的一种。
优选地,步骤(1)中共聚法采用的聚合物单体可以是苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种。
优选地,步骤(1)中表面改性处理可以是浓硫酸磺酸化、酯类或酸酐类水解等其中的一种。
优选地,步骤(2)中原位共沉淀法可以是原位氧化共沉淀法、混合铁源共沉淀或原位还原共沉淀中的一种。
优选地,步骤(3)中聚合物Ⅱ保护层为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂等其中的一种。
优选地,步骤(4)中包覆聚合物Ⅱ保护层的方法包括单体聚合法或自组装封闭包覆等。
由本实施例制得的硅羟基磁珠具有超顺磁性,其主要成分为四氧化三铁,二氧化硅的含量为0.05%~28%,粒径大小为300~2000nm,表面富含硅羟基。进一步地,粒径大小为1μm。本发明方法获得的硅羟基磁珠分散稳定性好、磁响应快、特异性强、灵敏度高及对目标物捕获率高。
实施例2原位氧化共沉淀法制备硅羟基磁珠
本实施例包括以下步骤:
(1)苯乙烯微球制备:在三口烧瓶中加入80g纯化水,10g苯乙烯单体(St),超声乳化30min后转移到恒温水浴锅中,加入过硫酸钾引发剂(KPS)1.27g缓慢升温至70℃,搅拌速度300rpm/min,反应时间为7~24h。所得聚苯乙烯经过抽滤洗涤干燥成白色粉末。
(2)微球磺化处理:称取步骤(1)制得的聚苯乙烯白色粉末2g,加入45mL的浓硫酸,超声溶解至颜色变为土黄色,处理时间为3h,后抽滤洗涤得到表面经磺化处理的磺化聚苯乙烯微球。
(3)原位氧化共沉淀:
称取34.77gFeSO4·7H2O,再加入100mL通过氮气1.5h的超纯水,加热搅拌,制得硫酸亚铁溶液。
在1000mL三口烧瓶中分别加入2g步骤(2)中的磺化聚苯乙烯微球、50mL硝酸钾溶液、100mL氢氧化钾溶液和290mL超纯水于,通氮气1.5h。快速加入10mL硫酸亚铁溶液,并将三口烧瓶移至90℃油浴中,保持氮气鼓泡4min后迅速将通氮气的导管拔出液面,采用液封装置并调整N2流量,液封装置有气泡冒出即可。待反应进行4h后,置于冰水浴中5min。最终得到的黑色沉淀磁吸分离并洗涤5-7次至中性,保存于纯化水中。
(4)增加聚合物保护层:在500mL的三口烧瓶中分别加入200ml纯化水、1.15g十六烷基苯磺酸钠(SDS)以及2g步骤(3)中的黑色沉淀物,再将三口烧瓶装置置于恒温水浴锅内。升温至70℃,在转速550rpm/min条件下充分搅拌并通入N2除氧,再向三口烧瓶内加入0.98mL甲基丙烯酸甲酯单体和1.98g过硫酸钾(KPS)保持温度继续搅拌,继续反应6~18h,得到的黑色产物洗涤分离即为聚合物基质四氧化三铁粒子。
(5)二氧化硅包覆:步骤(4)制备的聚合物基质四氧化三铁粒子分散在50mL纯化水与200mL乙醇的混合液中,再加入氨水5mL,调节反应环境至碱性后超声处理30min。用分液漏斗逐滴向混合物中加入20mL的硅酸四乙酯体积分数10%的乙醇溶液,在70℃的温度下反应4h,机械搅拌速度控制为550rpm/min;通过控制硅酸四乙酯的添加量,可将二氧化硅包覆层的厚度限制在从1nm到1μm的范围。之后将温度降至30℃,另外再加入1%的硅酸四乙酯,反应1h,其通过较慢的反应速率,将表面空隙填补完整。所得磁珠清洗至中性,得到硅羟基磁珠。
实施例3原位氧化共沉淀法制备硅羟基磁珠
包括以下步骤:
步骤(1)苯乙烯微球制备:在三口烧瓶中加入80g纯化水,10g苯乙烯单体(St),超声乳化30min后转移到恒温水浴锅中,加入过硫酸钾引发剂(KPS)1.27g缓慢升温至70℃,搅拌速度300rpm/min,反应时间为7~24h。所得聚苯乙烯经过抽滤洗涤干燥成白色粉末。
步骤(2)微球磺化处理:称取步骤(1)制得的聚苯乙烯白色粉末2g,加入45mL的浓硫酸,超声溶解至颜色变为土黄色,处理时间为3h,处理完成后抽滤洗涤得到表面经磺化处理的磺化聚苯乙烯微球。
步骤(3)原位氧化共沉淀:
在转速为550rpm/min条件下,将2.78g硫酸亚铁(Fe2+)和4.06g氯化铁(Fe3+)溶于60mL的0.1mol/L盐酸溶液中,制得铁盐混合溶液。在1000mL三口烧瓶中加入2g步骤(2)的磺化聚苯乙烯微球和100mL的2mol/L氢氧化钠溶液充分搅拌,升温至80℃后并通入N2除氧。将上述铁盐混合溶液倾倒至三口烧瓶内,液体迅速变为黑色。再向三口烧瓶内加入5mL氨水溶液,调节反应环境至碱性后保持温度继续搅拌30min-3h,蒸去多余的氨气,静置得黑色沉淀物。将黑色沉淀物进行磁吸分离并洗涤5~7次至中性,保存于纯化水中。
步骤(4)增加聚合物保护层:
在500mL的三口烧瓶中分别加入200mL纯化水、1.15g十六烷基苯磺酸钠(SDS)及2g步骤(3)中的黑色沉淀物,将三口烧瓶装置并置于恒温水浴锅内。升温至70℃充分搅拌并通入N2除氧。在转速550rpm/min条件下,向三口烧瓶内加入0.98mL甲基丙烯酸甲酯单体,保持温度继续搅拌。称取1.98g过硫酸钾加入到上述的三口烧瓶内混合溶液中,继续反应6~18h,得到的棕黄色产物聚合物基质四氧化三铁粒子,洗涤分离。
步骤(5)二氧化硅包覆:
将步骤(4)制备的聚合物基质四氧化三铁粒子分散在50mL纯化水与200mL乙醇的混合液中,再加入氨水5mL,调节反应环境至碱性,最后进行超声处理30min。用分液漏斗逐滴向上述混合物中加入体积分数为10%的硅酸四乙酯-乙醇溶液,在70℃、机械搅拌速度为550rpm/min的条件下反应4h,通过调节硅酸四乙酯-乙醇溶液的添加量,将二氧化硅包覆层的厚度限制在1nm~1μm的范围。降温至30℃,再加入体积分数为1%的硅酸四乙酯-乙醇溶液,降低反应速率,填补二氧化硅包覆层表面的空隙。最后清洗至中性,即得到硅羟基磁珠。
优选地,步骤(3)中的铁溶液为黄绿色液体,需现配现用,即15min内使用,防止亚铁离子空气接触过久氧化。
实施例4富集及检测甲基化游离DNA
本实施例对甲基化游离DNA样品进行定性或定量分析。
采用实施例2制备的硅羟基磁珠富集甲基化游离DNA,包括以下步骤:
1、血浆游离DNA的提取
将质控品或2mL的血浆加入到15mL的离心管,加入4mL的盐酸胍或尿素裂解液,反复颠倒混匀几次,放旋转仪上15min。加入100μL的实施例2制备的硅羟基磁珠,置于旋转仪上30min后置于磁力架上直至液体澄清,此时硅羟基磁珠完全吸附,弃上清。
加1mL的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液作为提取漂洗液,待硅羟基磁珠完全混匀后转移到2mL的离心管中,加入1mL的80%乙醇,反复颠倒混匀直至硅羟基磁珠完全混匀在80%乙醇中,弃剩余液体后室温放置5-10min。
加100μL洗脱液,56℃的水浴锅10min。将离心管置于磁力架上直至液体澄清,此时硅羟基磁珠已完全吸附,弃磁珠。
2、DNA的硫化纯化
吸取步骤1所得液体放入新的2mL的离心管中,并加入190μL的转化试剂,再加入30μL的DNA保护液,80℃水浴锅放1h。离心管中再加入1.2mL的结合液,反复颠倒混匀几次,再加入50μL的实施例2制备磁珠,放旋转仪上30min。将离心管置于磁力架上放置至磁珠完全吸附,液体澄清,弃上清。
加入0.5mL的纯化漂洗液,将离心管从磁力架上拿下来,反复颠倒混匀几次至磁珠完全混匀在中。重复操作。将2mL的离心管放磁力架上,放置至磁珠完全吸附,液体澄清,弃上清。
离心管中加入0.5mL的80%乙醇,反复颠倒混匀几次至磁珠完全混匀在80%乙醇中,多次重复操作后弃多余液体。室温放置5-10min,加60μL洗脱液,放56℃的水浴锅10min。将2mL的离心管再次放于磁力架上至液体澄清,弃磁珠,所得液体即为硫化纯化后的DNA,可用于PCR检测。
优选地,转化试剂为亚硫酸氢氨溶液,使用前放80℃预热5-10min。
优选地,DNA保护液为6-羟基-2,5,7,8四甲基-苯并二氢吡喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid)溶液。
优选地,结合液为盐酸胍或尿素溶液。
优选地,纯化漂洗液为三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(Tris-HCl buffer),使用前取12mL三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液加入48mL无水乙醇。
至此,DNA完成纯化完成,可以直接用于PCR检测或临床试验。
3、PCR检测
将试剂盒组分PCR Mix插入冰盒中或置于4℃冰箱中,自然融化。将DNA聚合酶和纯化水微离心后置于冰上。其中PCRMix和DNA聚合酶配制的混合液、样品、质控品和纯化水分别加入。根据待测样品数量和检测位点设计加样布局,并计算需要的反应数和预计损耗量,将反应混合液依次对应加入八联管或96孔板中,每孔加入15μL,然后对应加入样品DNA、质控品和纯化水15μL,小心盖上八联管管盖或96孔板膜,振荡混匀后进行定性或定量分析。
本实施例选择Agilen Bioanalyzer 2100以及配套试剂High Sensitivity DNAAnalysis Kit、Qubit便携式检测仪以及配套检测试剂盒、Roche 480PCR分析仪对发明的各实施例制备的硅羟基磁珠富集的性能和效果进行评估。
本实施例中的质控品为Qubit便携式检测仪配套使用的试剂盒内的质控品。
本实施例中不局限于血浆中游离DNA的提取,其他样品如血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA可以通过同样的方法进行提取和检测。
实施例5基础理化性能表征
参阅图2,实施例1所制备的硅羟基磁珠的扫描电子显微镜图片可见,该多层结构的磁性微球大小相对均一,呈现单分散性,电镜测试下的微观粒径大小为1μm。
参阅图3,实施例2制备的硅羟基磁珠在振动样品磁强计中测得的曲线,磁滞回线过原点、剩磁为零,该磁珠为超顺磁性。
参阅图4和图5,通过对磁性微球样品进行动态光散射测试以及Zeta电位分析,水合粒径测试结果为该微球在溶液状态下的尺寸分布在300~2000nm,主要集中在1μm左右,与扫描电镜下测试数据相吻合。此外,由于表面硅羟基修饰作用,Zeta点位值为-48mV,表面样品微球表面带负电荷,不易团聚,易于后续步骤的处理。
实验例6血浆样本的性能对照试验
参阅图6和图7,验证本发明实施例3所述磁珠优异的核酸提取性能,采用江苏为真游离DNA提取试剂盒(磁珠法)开展实验。取2mL血浆样本进行游离DNA提取,并与现有技术中的同类磁珠作比较。本对比实验中对照例为美国Promega生物公司的MD1441磁珠(磁珠名称为Paramagnetic Particles),简称为Promega磁珠。
结果分析,参阅图8A、图8B和图8C,采用实施例2制得的硅羟基磁珠,分别对Septin9甲基化梯度参考品及肠癌CRC样本进行PCR扩增。
其中,Septin9(S9)是一种透过血液对结直肠癌进行检测的特殊生物标记。Septin9基因甲基化是通过检查结直肠癌病人的血浆中Septin9基因的甲基化程度来检测早期癌细胞的DNA。
ACTB基因,即β-Actin,是细胞骨架肌动蛋白之一,作为本实施例的内参基因。
采用罗氏480仪器荧光定量PCR法和江苏为真生物科技有限公司《人Septin9基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)》进行梯度参考品及肠癌CRC样本DNA提取硫化纯化,洗脱后的bisDNA进行3复孔检测。
由图8A可见,YPD-1、YPD-2、YPD-3分别为实施例1、实施例2和实施例3制得的硅羟基磁珠,按《人Septin9基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)》说明书,进行梯度参考品(10%、1%、0.5%)、试剂盒阴性质控品NC及肠癌CRC样本(CRC-1、CRC-2)进行DNA提取硫化纯化,洗脱后的bisDNA进行3复孔检测。
从内参ACTB通道来看,实施例3制备的YPD-3磁珠比Promega磁珠CP值提前,性能更优。从靶标Septin9通道来看,实施例3制备的YPD-3磁珠检测参考品下限0.5%时CP值(36.42、38.95、37.37),并且3孔均出,优于Promega磁珠。
由图8B可见,实施例3制备的YPD-3磁珠与美国Promega磁珠,在检测参考品浓度为10%时靶标Septin9通道扩增曲线图,均有扩增信息。
由图8C可见,实施例3制备的YPD-3磁珠与Promega磁珠,在检测参考品浓度为10%时内参ACTB通道扩增曲线图,均有扩增信息,且呈S型扩增曲线趋势。
实施例7
实施例2、实施例3或实施例4制得的硅羟基磁珠用于血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测。检测方法如实施例5。
Claims (12)
1.一种硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1)微球制备:采用聚合物单体共聚法制备聚合物Ⅰ微球;
步骤(2)表面改性处理:对步骤(1)制备的微球进行表面改性处理;
步骤(3)壳磁体制备:以原位共沉淀的方法制备壳磁型聚合物Ⅰ/四氧化三铁磁性微球;
步骤(4)包覆聚合物保护层:在步骤(3)壳磁体上包覆一层聚合物Ⅱ作为保护层;
步骤(5)包覆二氧化硅外壳:将步骤(4)制备的含聚合物Ⅱ保护层磁性微球改性修饰,得到硅羟基磁珠;
其中,步骤(1)中所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种;
步骤(4)中所述聚合物Ⅱ为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂其中的一种。
2.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述共聚法为分散聚合、乳液聚合、悬浮聚合或溶胀聚合其中的一种。
3.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述聚合物Ⅰ微球为大小均一的单分散微球,粒径为200nm~2μm。
4.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述表面改性处理为浓硫酸磺酸化、酯类或酸酐类水解其中的一种。
5.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤(4)中所述包覆聚合物保护层的方法为单体聚合法或自组装封闭包覆法。
6.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:在步骤(5)中,将包含所述保护层的磁珠分散在纯化水和极性溶剂的混合液中,碱性条件下添加硅烷偶联剂进行改性修饰。
7.根据权利要求6所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:所述硅烷偶联剂为甲基三氧乙基硅烷、三甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷硅酸四乙酯其中的一种。
8.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤(5)中二氧化硅包覆层的厚度为1nm~1μm。
9.根据权利要求1-8任一所述的硅羟基磁珠的制备方法制备得到的硅羟基磁珠。
10.根据权利要求9所述的硅羟基磁珠,其特征在于:主要成分为四氧化三铁,二氧化硅的含量为0.05%~28%,表面含硅羟基。
11.根据权利要求9所述的硅羟基磁珠,其特征在于:粒径大小为300-2000nm,优选地,粒径大小为1μm。
12.根据权利要求9-11任一所述的硅羟基磁珠的应用,包括血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113522229A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-22 | 南京工业大学 | 一种高效吸附环境中胞外dna的磁珠及其制备方法 |
CN113578214A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-02 | 天津博蕴纯化装备材料科技有限公司 | 微米级多孔磁性微球及其制备方法和应用 |
CN115254067A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-01 | 山东博科科学仪器有限公司 | 一种硅羟基磁珠及其合成方法、应用 |
WO2023050156A1 (zh) * | 2021-09-29 | 2023-04-06 | 京东方科技集团股份有限公司 | 一种核酸提取组合物、核酸提取装置和核酸提取方法 |
WO2023125592A1 (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-06 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 磁珠及其制备方法与在核酸提取中的应用 |
CN117024788B (zh) * | 2023-09-01 | 2024-02-20 | 山东微领生物有限公司 | 一种磁性聚合物微球的制备方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100999559A (zh) * | 2007-01-04 | 2007-07-18 | 吉林大学 | 一种磁性粒子/聚合物/二氧化硅结构磁性微球的制备方法 |
CN108046277A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-18 | 苏州纳微科技有限公司 | 一种微米级中空磁性二氧化硅微球的制备方法 |
CN109331753A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-15 | 中翰盛泰生物技术股份有限公司 | 一种羧基磁性微球、制备方法及应用 |
CN110304662A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-08 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 硅羟基磁珠及其制备方法和应用 |
CN112007605A (zh) * | 2019-05-30 | 2020-12-01 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠及其制备方法 |
-
2021
- 2021-03-01 CN CN202110226685.1A patent/CN113004546B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100999559A (zh) * | 2007-01-04 | 2007-07-18 | 吉林大学 | 一种磁性粒子/聚合物/二氧化硅结构磁性微球的制备方法 |
CN108046277A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-18 | 苏州纳微科技有限公司 | 一种微米级中空磁性二氧化硅微球的制备方法 |
CN109331753A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-15 | 中翰盛泰生物技术股份有限公司 | 一种羧基磁性微球、制备方法及应用 |
CN112007605A (zh) * | 2019-05-30 | 2020-12-01 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠及其制备方法 |
CN110304662A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-08 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 硅羟基磁珠及其制备方法和应用 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113522229A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-22 | 南京工业大学 | 一种高效吸附环境中胞外dna的磁珠及其制备方法 |
CN113578214A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-02 | 天津博蕴纯化装备材料科技有限公司 | 微米级多孔磁性微球及其制备方法和应用 |
CN113578214B (zh) * | 2021-08-11 | 2023-08-11 | 天津博蕴纯化装备材料科技有限公司 | 微米级多孔磁性微球及其制备方法和应用 |
WO2023050156A1 (zh) * | 2021-09-29 | 2023-04-06 | 京东方科技集团股份有限公司 | 一种核酸提取组合物、核酸提取装置和核酸提取方法 |
WO2023125592A1 (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-06 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 磁珠及其制备方法与在核酸提取中的应用 |
CN115254067A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-01 | 山东博科科学仪器有限公司 | 一种硅羟基磁珠及其合成方法、应用 |
CN117024788B (zh) * | 2023-09-01 | 2024-02-20 | 山东微领生物有限公司 | 一种磁性聚合物微球的制备方法 |
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