JP6913908B2 - 磁性体複合粒子およびその製造方法、並びに免疫測定用粒子 - Google Patents

Description

本発明は、免疫測定等において好適に利用可能な磁性体複合粒子およびその製造方法に関し、さらに当該磁性体複合粒子を用いて作製された免疫測定用粒子に関する。

血液等の試料液から、各種のタンパク質、核酸、細胞等の標的物を分離、採集する為に、所定の粒子の表面にそれぞれの標的物質に適した抗体を担持させ、標的物質補足後の粒子を回収して分析を行う抗原抗体測定法が検討されている。
近年では、臨床検査における迅速な測定や分析が要求される用途において、測定時間の短縮のため、抗体を担持した担体であって磁性が付加されたものを用い、標的物質を捕捉した後に外部から磁気を与えることで、前記磁性付加担体を迅速に回収し、標的物質を回収する方法が検討されている。

磁性を付加した固定担体へ高い磁気分離特性を付与する為には、固定担体へ付加する磁性体中に含有される磁性成分の割合を大きくすること、当該磁性体を飽和磁化の高い磁性体とすること（特に、飽和磁化の値が大きな磁性材料を用いること。）が知られている。

特許文献１には、主として免疫診断用に等に用いられる磁性ポリマー粒子であって、平均粒子径が０．２〜４．０μｍ、残留磁化が飽和磁化の１０〜３５％であるものが提案されている。
一方、本発明者らは特許文献２において、磁性を付加した固定担体として、無機酸化物またはポリマーを有するコア粒子の表面に外殻層を配し、当該外殻層にマグネタイト粒子とケイ酸ナトリウムとを共存させることで、体積平均粒径が１０〜５００ｎｍ、数平均粒径のＣＶ値が８％以下、且つ、２５℃における飽和磁化が１５ｅｍｕ／ｇ以上である磁性体内包粒子を開示した。

特開２０００−３０６７１８号公報 特許第５４１９１９９号公報

特許文献２に開示した磁性を付加した固定担体である磁性体内包粒子は、優れた磁気分離特性を発揮した。
しかしながら本発明者らのさらなる研究によると、当該磁性体内包粒子は、磁気を用いた試料液からの分離回収の際に時間を要する場合がある。

さらに、当該磁性体内包粒子は、高い耐自然沈降性を有することも重要であることを知見した。これは、当該磁性体内包粒子の耐自然沈降性が不十分な場合、試料液中において短時間で自然沈降が生じる場合があり、さらなる改良が求められることを知見したものである。
当該磁性体内包粒子の試料液に対する分散性が不十分であると、試料液中における抗原抗体の接触が不十分になることがあるので、試料液中に含まれる標的物質の補足が不完全なものとなる場合がある。この結果、試料液中の重要な標的物質の存在を看過してしまい、誤診につながる可能性が考えられるものである。

本発明は、上述の状況のもとで為されたものであり、その解決しようとする課題は、磁気を用いることで試料液から短時間で分離でき、さらに、試料液に対する分散安定性に優れた磁性体複合粒子を提供することである。

上述の課題を解決するため本発明者らが研究を行った結果、無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、前記外殻には、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とが含有されており、透過型電子顕微鏡により測定される前記磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、動的光散乱法により測定される前記粒子の粒子径（ｄ_ＤＬＳ）の値と前記体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値との比である（ｄ_ＤＬＳ）／（ｄ_ＴＥＭ）の値が２．０以下である磁性体複合粒子に想到した。

当該磁性体複合粒子は、無機酸化物またはポリマーを含む微粒子（本発明において「核粒子」と記載する場合がある。）の表面上に設けられた外殻に、所定量のナノサイズの磁性体（本発明において「磁性ナノ粒子」と記載する場合がある。）を含有させたものである。特に、磁性ナノ粒子をマグネタイトまたはγ酸化鉄で形成したことにより、高い飽和磁化が発現される。さらに、当該磁性体複合粒子の外殻表面を珪素化合物によって被覆して磁性ナノ粒子を含有させたことにより、磁性ナノ粒子の磁性体複合粒子表面からの剥離を抑制することができる。
この結果、当該構成を有する本発明に係る磁性体複合粒子は、磁気を用いて、試料液から短時間で分離できる。さらに、所定の粒子径を有することにより、試料液に対する分散安定性に優れているものと考えられる。

即ち、上述の改題を解決する第１の発明は、
無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
前記外殻には、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とが含有され、
透過型電子顕微鏡により測定される前記磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、
動的光散乱法により測定される前記粒子の粒子径（ｄ_ＤＬＳ）の値と前記体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値との比である（ｄ_ＤＬＳ）／（ｄ_ＴＥＭ）の値が２．０以下である磁性体複合粒子である。

第２の発明は、
前記外殻には、さらにシランカップリング剤が含有されている第１の発明に記載の磁性体複合粒子である。

第３の発明は、
前記外殻に含有される磁性ナノ粒子が、マグネタイトまたはγ酸化鉄である第１または第２の発明に記載の磁性体複合粒子である。

第４の発明は、
球形または略球形の形状を有する第１から第３のいずれかの発明に記載の磁性体複合粒子である。

第５の発明は、
飽和磁化の値が、３０Ａｍ^２／ｋｇ以上２００Ａｍ^２／ｋｇ以下である第１から第４の発明のいずれかに記載の磁性体複合粒子である。

第６の発明は、
無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
前記外殻には、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とが含有され、
透過型電子顕微鏡により測定される前記磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、
磁場の印加／解除によって前記磁性体複合粒子をクラスター状態と分散状態とに、可逆的に制御可能な磁性体複合粒子である。

第７の発明は、
前記磁性体複合粒子のクラスター状態が、鎖状クラスター状態である第６の発明に記載の磁性体複合粒子である。

第８の発明は、
前記鎖状クラスター状態のときの長辺側長さが、０．５μｍ以上５μｍ以下である第７の発明に記載の磁性体複合粒子である。

第９の発明は、
０．１Ｔ以上０．４Ｔ以下の磁場を印加したとき、前記鎖状クラスター状態の磁性体複合粒子が、３μｍ／ｓ以上１５μｍ／ｓ以下の速度で泳動する第７または第８の発明に記載の磁性体複合粒子である。

第１０の発明は、
第１から第９のいずれかに記載の磁性体複合粒子の外殻に、抗体が存在している免疫測定用粒子である。

第１１の発明は、
磁性ナノ粒子の懸濁液を作製する工程と、
無機酸化物またはポリマーを含み、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径の値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である核粒子を作製する工程と、
前記磁性ナノ粒子の懸濁液へ前記核粒子を添加して、ヘテロ凝集粒子の懸濁液を作製する工程と、
ケイ素化合物の水溶液を前記ヘテロ凝集粒子の懸濁液へ添加し、前記ヘテロ凝集粒子の表面にケイ素化合物の層を設け、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下である磁性体複合粒子の、懸濁液を作製する工程と、を有する磁性体複合粒子の製造方法である。

本発明に係る磁性体複合粒子は、試料液に対する分散安定性に優れ、かつ、磁気を用いて試料液から短時間で分離できた。

本発明に係る磁性体複合粒子の模式的な断面図である。 試料液中において凝集している本発明に係る磁性体複合粒子の模式的な断面図である。 磁場を印加する装置の模式的な斜視図である。 磁場を印加する装置の模式的な断面図である。 磁性体複合粒子へ磁場を解除したときの顕微鏡写真である。 磁性体複合粒子へ磁場を印加したときの顕微鏡写真である。

従来技術に従う磁性粒子は、上述の通り試料液からの分離回収の際に時間を要する場合があったり、短時間で磁性粒子が自然沈降してしまったりしたため、得られた測定結果が妥当か否かについての検証が必要になる場合もあり、迅速正確な測定結果が求められる用途には十分に対応できないおそれもあった。
このような状況の下で本発明者らは研究を行い、無機酸化物またはポリマーを含有する核粒子の表面に磁性ナノ粒子を含有する外殻を設けた、コアシェル構造を有する磁性体複合粒子を作製することによって、上述の課題を解決した。
まず、図面を参照しながら本発明に係る磁性体複合粒子について説明する。

図１は、本発明に係る磁性体複合粒子の模式的な断面図である。
本発明に係る磁性体複合粒子１は、中心部に核粒子１１があり当該核粒子１１の表面に磁性ナノ粒子１２が吸着している。さらに、核粒子１１はケイ素化合物の層１３で被覆されている。そして、当該ケイ素化合物の層１３は磁性ナノ粒子１２を含有して外殻１４を構成している。
ここで、１．磁性ナノ粒子、２．核粒子、３．ケイ素化合物の層、４．磁性体複合粒子、５．磁場を印加された際の磁性体複合粒子、６、磁性体複合粒子の合成、の順で説明する。

１．磁性ナノ粒子
磁性ナノ粒子１２は、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）またはγ酸化鉄で形成されており、その平均粒子径は５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。
そして磁性ナノ粒子１２の飽和磁化の値は、０．１Ａｍ^２／ｋｇ以上２００Ａｍ^２／ｋｇ以下、より好ましくは１２０Ａｍ^２／ｋｇ以下、より一層好ましくは８０Ａｍ^２／ｋｇ以下であるのがよい。これは飽和磁化の値が０．１Ａｍ^２／ｋｇ以上であれば磁性体複合粒子１へ十分な磁場応答性を与えることができ、２００Ａｍ^２／ｋｇ以下であれば残留磁化による磁性体複合粒子１の凝集という事態を回避できるからである。
また、磁性体複合粒子１における磁性ナノ粒子１２の担持量は、０．０９５質量％以上９５質量％以下であることが好ましい。これは担持量が０．０９５質量％以上あれば、磁性体複合粒子１の磁場応答速度を担保することができ、９５質量％以下であれば磁性体複合粒子１の密度が過大にならず、試料液への分散性を担保できることによる。

２．核粒子
核粒子１１は、無機酸化物またはポリマーを含んで構成されている。当該核粒子の体積平均粒子径としては、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。ポリマーとしてはポリメチルメタクリレート（本発明において「ＰＭＭＡ」と記載する場合がある。）、ポリスチレン（本発明において「ＰＳｔ」と記載する場合がある。）が例示できる。
無機酸化物としては、シリカ、タルク、カオリン石、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウムなどが例示できる。

これらポリマー、無機酸化物が備える性質として、密度が５．０ｇ／ｃｍ^３以下、好ましくは４．０ｇ／ｃｍ^３以下、一層好ましくは３．０ｇ／ｃｍ^３以下のものとするのが良い。この範囲の密度を有する核粒子を選択することにより、試料液中の分散時における浮力と核粒子自体の重量とが均衡し、試料液中の分散性を改善することができるので好適である。ただし、浮力が過剰であると核粒子が試料液上に浮遊してしまう場合がある。当該事態を回避する観点から、供試される試料液の比重にも拠るが、核粒子の密度が０．３ｇ／ｃｍ^３以上、好ましくは０．５ｇ／ｃｍ^３以上のものを選択するのが良い。

尚、本発明において、核粒子１１の表面に磁性ナノ粒子１２が吸着して凝集した状態の粒子を「ヘテロ凝集粒子」と記載する場合がある。

３．ケイ素化合物の層
ケイ素化合物の層１３は、例えば、テトラエチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣ_２Ｈ_５）_４）（本発明において「ＴＥＯＳ」と記載する場合がある。）といったケイ素酸化物の重合体にて構成されていることが好ましい。さらに、当該ケイ素化合物の層１３は、例えば、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（本発明において「ＭＰＴＭＳ」と記載する場合がある。）といったシランカップリング剤も含み、２種類以上のケイ素化合物原料を用いて重合されていることがさらに好ましい。これは、分子内に重合性官能基を導入し、かつ、抗体の足場となる水酸基（−ＯＨ）を導入できるからである。

以上の観点から、ケイ素化合物の層１３中におけるシランカップリング剤の量は、例えばヘテロ凝集粒子の濃度が０．０１容量％以上１．０容量％以下の場合において、０．００１ｍｏｌ／ｍ^３以上１ｋｍｏｌ／ｍ^３以下であることが好ましい。
シランカップリング剤の量が０．００１ｍｏｌ／ｍ^３以上あれば、シランカップリング剤としての効果が発揮され、１ｋｍｏｌ／ｍ^３以下であれば、シランカップリング剤分子同士の自己縮合を回避できるからである。

磁性ナノ粒子１２を含有したケイ素化合物の層１３である外殻１４は、磁性ナノ粒子１２が核粒子１１の表面から剥離するのを抑止する効果を奏する。

４．磁性体複合粒子
磁性体複合粒子１は、球形または略球形の形状を有することが好ましいが、その体積平均粒子径は、例えば、磁性体複合粒子１の透過型電子顕微鏡像からノギス等で計測し、算出することができる。本発明において、透過型電子顕微鏡像から算出した体積平均粒子径を（ｄ_ＴＥＭ）と記載する。
尚、「磁性体複合粒子１は、球形または略球形の形状を有する」とは、当該磁性体複合粒子の断面が円形または略円形であり、当該断面におけるアスペクト比が、例えば１．３以下であることをいう。

本発明に係る磁性体複合粒子１は、飽和磁化の値が３０Ａｍ^２／ｋｇ以上２００Ａｍ^２／ｋｇ以下であることが好ましい。飽和磁化の値が３０Ａｍ^２／ｋｇ以上であると、永久磁石等の磁気を用いることで、磁性体複合粒子１を試料液中から容易に短時間で分離できるからである。一方、２００Ａｍ^２／ｋｇ以下であれば残留磁化による磁性体複合粒子の凝集という事態を回避できる。

図２は、試料液中において凝集している本発明に係る磁性体複合粒子１の模式的な断面図である。
試料液中において、本発明に係る磁性体複合粒子１は、単独で分散している場合もあるが、２個以上の複数の粒子が凝集している場合もある。図２は、磁性体複合粒子１が、例えば３個凝集している状態の模式的な断面図である。

この試料液中において凝集している磁性体複合粒子１の粒子径は、例えば、動的光散乱法で計測し、算出することができる。本発明において、動的光散乱法から算出した粒子径を（ｄ_ＤＬＳ）と記載する。尚、当該（ｄ_ＤＬＳ）を、流体力学的径と考えることもできる。

磁性体複合粒子１の（ｄ_ＴＥＭ）は、３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、（ｄ_ＤＬＳ）と（ｄ_ＴＥＭ）との比である（ｄ_ＤＬＳ）／（ｄ_ＴＥＭ）の値が２以下である。
（ｄ_ＤＬＳ）／（ｄ_ＴＥＭ）の値が２以下であるとは、試料液中において一体のものとして存在する粒子径と本来の体積平均粒子径とがほぼ同じ、または極めて近似していることを示す。すなわち、磁性体複合粒子は、凝集せずに単分散に近い形態を担保したまま試料液中で存在していることになる。このことから、磁性体複合粒子１は試料液中において分散安定性に優れているということができる。

以上説明した本発明に係る磁性体複合粒子へ所望の抗体を吸着させて用いることで、試料液中において、磁場中での応答性の良い免疫測定用粒子を得ることができた。この結果、試料液中に存在する抗原を余すことなく捕捉することができるようになると考えられ、誤診のリスクを低減することも可能になると考えられる。

５．磁場を印加された際の磁性体複合粒子
所定の溶媒中に分散している本発明に係る磁性体複合粒子に対して磁場を印加（ＯＮ）すると、各磁性体複合粒子は凝集して、当該磁場方向に対してクラスター状態となる。そして、当該磁場を解除（ＯＦＦ）すると、前記クラスター状態は崩壊して、磁性体複合粒子は単分散に近い分散状態に戻る。即ち、本発明に係る磁性体複合粒子は、磁場の印加／解除によって磁性体複合粒子をクラスター状態と分散状態とに、可逆的に制御可能な磁性体複合粒子である。
そして、当該クラスター状態は、磁場方向に対して鎖状のクラスター状態（本発明において「クラスター鎖」と記載する場合がある。）であることも判明した。
一方、従来の技術に係る磁性体複合粒子においても、磁場を印加すると鎖状または塊状のクラスター状態となる。しかし、当該磁場を解除しても鎖状または塊状のクラスター状態を維持しているものであった。

本発明に係る磁性体複合粒子は、クラスター鎖状態と分散状態とを可逆的に制御可能である。この特徴を活かして、例えば、磁気分離操作の際にはクラスター鎖状態とすることで分離を容易にできるようにし、磁場を解除した際には分散状態とさせることができる。すなわち、所定の供試液中の標的成分を高収率で回収することが可能であり、当該供試液からの当該磁性体複合粒子の回収を迅速に行うことができるようになるので好ましい。
言い換えれば、製造段階でも液中で生成した磁性体複合粒子をロスすること無く回収できるので、収率が向上し、使用時には高分散な供試薬が得られる。本磁性体複合粒子の使用時の効能としては、磁場のない状態であれば満遍なく液中に分散するので供試液中に存在する標的成分の取りこぼしも少なくなる。また、供試液に作用させて標的成分を回収した後に、標的成分が包合した磁性粒子ごと磁場をかけて回収することができ、迅速かつ確実な判定に寄与できる。

上述した磁場の印加／解除に対する、本発明に係る磁性体複合粒子と従来の技術に係る磁性体複合粒子との挙動の差違は、両者の粒径の違いに起因すると考えられる。即ち、本発明に係る磁性体複合粒子は、従来の技術に係るものと比較して粒径が小さい為、ブラウン運動の影響を大きく受け、磁場の解除によりクラスター状態が崩壊するものと考えられる。この結果、本発明に係る磁性体複合粒子は、磁場の印加／解除によって磁性体複合粒子をクラスター状態と単分散に近い形態とに、可逆的に制御可能な磁性体複合粒子となっているものと考えられる。

本発明に係る磁性体複合粒子は粒径が小さい為、所定の溶媒中に分散している際は、移動速度が小さい。この結果、例えば、磁性体複合粒子回収の際は長時間を要することが懸念された。ところが、上述したように磁場の印加により磁性体複合粒子をクラスター鎖の状態にできるので、磁気泳動による移動速度が向上する効果が得られた。
具体例としては、０．１Ｔ以上０．４Ｔ以下の磁場を印加したとき、クラスター鎖の状態の磁性体複合粒子は３μｍ／ｓ以上１５μｍ／ｓ以下の移動速度で泳動する。

６．磁性体複合粒子の合成
本発明に係る磁性体複合粒子の合成について、１）磁性ナノ粒子の合成、２）核粒子の合成、３）ヘテロ凝集粒子の合成、４）磁性体複合粒子の合成、の順に説明する。

１）磁性ナノ粒子の合成
磁性粒子である磁性ナノ粒子は、一般に共沈法と呼ばれる方法で合成した。この手法は、Ｆｅ^２＋とＦｅ^３＋とを１：２の割合で含む混合溶液に、塩基性の溶液を添加するだけで、マグネタイトの磁性ナノ粒子が生成する合成法である。一方、γ酸化鉄（マグヘマイト）は、例えば、上述の方法にて得られたマグネタイトを大気中にて乾燥させた後、低温（３５０℃程度）にて加熱酸化することによって得られる。
さらに、生成した磁性ナノ粒子の表面に正電荷を与えて、分散安定化させるため、カップリング剤の添加による表面修飾を行うことも好ましい。
尚、磁性ナノ粒子を構成する物質の結晶構造は、例えば上述した液をプレパラート上に塗布し自然乾燥させた後に、Ｘ線回折を用いて分析することに拠り同定することができる。

２）核粒子の合成
体積平均粒子径５０ｎｍ程度の核粒子の素材として、ＳｔモノマーとＭＭＡモノマーとの混合物へ過硫酸カリウムや過硫酸アンモニウムを添加して重合させ、重合粒子を作製することができる。
また、体積平均粒子径１００ｎｍ程度の核粒子の素材として、ＭＭＡモノマーを用いたソープフリー乳化重合法により、ＰＭＭＡの重合粒子を作製することができる。
さらに生成した重合粒子の表面に、磁性ナノ粒子との親和性を高め、また、反応の基点となり得る官能基を導入することを目的として、重合開始後に重合性シランカップリング剤ＭＰＴＭＳを添加し共重合させ、体積平均粒子径５０ｎｍ程度から１００ｎｍ程度の核粒子を得た。

３）ヘテロ凝集粒子の合成
ヘテロ凝集粒子は、磁性ナノ粒子と核粒子とを振とう撹拌して混合することで行なった。

４）磁性体複合粒子の合成
磁性体複合粒子の合成は、ヘテロ凝集粒子の分散液からヘテロ凝集粒子を採取し、ケイ素化合物液と混合し、振とう撹拌することで行なった。

以下、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は当該実施例により限定されるものではない。

（実施例１）
実施例１においては、体積平均粒子径４７ｎｍのポリマー粒子を核粒子とし、その表面に形成された外殻に磁性ナノ粒子としてＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子、ケイ素化合物としてＴＥＯＳおよびＭＰＴＭＳを含む磁性体複合粒子を合成し、その特性を評価した。
以下、実施例１に係る磁性体複合粒子について、１．磁性ナノ粒子の合成、２．核粒子の合成、３．ヘテロ凝集粒子の合成、４．磁性体複合粒子の合成、５．磁性体複合粒子の特性評価、の順に説明する。

１．磁性ナノ粒子の合成
本発明の実施例１に係る磁性ナノ粒子の合成について、１）磁性ナノ粒子の原料、２）磁性ナノ粒子の合成、の順に説明する。

１）磁性ナノ粒子の原料
実施例１に係る磁性ナノ粒子であるＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子のＦｅ源の一つとしてＦｅＣｌ_２（高純度化学研究所製、純度９９．９％）を準備した。また、もう一つのＦｅ源としてＦｅＣｌ_３（和光純薬工業製）を準備した。
そして、当該磁性ナノ粒子の分散安定剤および正電荷付与の為のカップリング剤としてＮ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロリド（ＧＥＬＥＳＴ Ｉｎｃ．製、５０％メタノール溶液）（本発明において「ＴＳＡ」と記載する場合がある。）を準備した。
また、当該磁性ナノ粒子を合成する際のｐＨ調整剤としてアンモニア水（和光純薬工業製、試薬特級２８質量％水溶液）を準備した。
さらに、当該磁性ナノ粒子を合成する際の反応溶媒として電気抵抗値１８．２ＭΩｃｍの脱イオン水を準備した。

２）磁性ナノ粒子の合成
反応容器として内径７．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのセパラブルフラスコを用いた。攪拌機として翼径５ｃｍ、傾斜角４５°の４枚ピッチパドルを用い、攪拌速度は３００ｒｐｍとした。

窒素バブリングにより溶存酸素を除去した脱イオン水１８６ｃｍ^３を反応容器に投入し、２ｋｍｏｌ／ｍ^３のＦｅＣｌ_２水溶液５ｃｍ^３と、１ｋｍｏｌ／ｍ^３のＦｅＣｌ_３水溶液２０ｃｍ^３を加え３５℃にて撹拌を開始した。反応容器内に窒素を充填し、窒素バブリングを３０分間行った。
反応容器へアンモニア水１１．７ｃｍ^３を投入し、反応開始とした。反応開始から３０秒後にＴＳＡ２．１ｃｍ^３を投入して３時間撹拌を継続し、生成した磁性ナノ粒子の表面修飾を行った。

得られた所定量の磁性ナノ粒子の懸濁液に対して、２倍重量のエタノールを加えて十分に混合し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）を行って上澄み液を除去した後、脱イオン水を加えて、実施例１に係る磁性ナノ粒子濃度１．０質量％の懸濁液を得た。得られた懸濁液中の磁性ナノ粒子の体積平均粒子径は８ｎｍであった。また磁性ナノ粒子の飽和磁化は５８ｅｍｕ／gであった。

２．核粒子の合成
本発明の実施例１に係る核粒子の合成について、１）核粒子の原料、２）核粒子の合成、の順に説明する。

１）核粒子の原料
実施例１に係る核粒子を形成するモノマーとして、スチレン（Ｓｔ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度９９％）、メチルメタアクリレート（ＭＭＡ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度９８％）を準備した。
また、陰イオン活性剤としてオクタデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ社 ＭＡ、米国）を準備した。
その際、当該Ｓｔ、ＭＭＡに含有される重合禁止剤のヒドロキノンを除去するため、当該Ｓｔ、ＭＭＡを、重合禁止剤除去剤（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）が充填されたガラス製カラムを通過させた。

実施例１に係る核粒子合成時の重合開始剤として、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度９８％）を準備した。

実施例１に係る核粒子合成時の重合性シランカップリング剤として、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）（信越化学工業製、試薬特級、純度９５％）を準備した。

２）核粒子の合成
反応には内容積５００ｃｍ^３、内径７．５ｃｍの円筒形密閉式ガラス反応器を用い撹拌は４枚羽のパドルを使用した。
まず反応器へＳＯＳの脱イオン水溶液を投入し３０分間窒素バブリングした後、窒素フローへ切り替えた。ここへ、ＳｔとＭＭＡのモノマーを添加して２０分間撹拌し、ＡＰＳを添加して重合を開始した。撹拌速度は３６０ｒｐｍとした。撹拌を継続しながら７０℃、６時間の重合反応を行って核粒子を含む懸濁液を得た。このとき、重合開始４０分後にＭＰＴＭＳ１．４０ｇを添加した。
このとき、当該重合反応の反応体積は、純水は２５０ｇ、Ｓｔは３．９ｇ、ＭＭＡは３．７５ｇ、ＳＯＳは０．０３７３ｇ、ＡＰＳは１．１４ｇとした。

重合反応終了後、得られた懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）して、上澄みを除去して核粒子を採取し、これを脱イオン水中へ超音波照射により再分散させて遠心洗浄を行った。当該遠心洗浄を３回実施し、実施例１に係る核粒子を脱イオン水中に分散させた。得られた核粒子の体積平均粒子径は、４７ｎｍであった。

３．ヘテロ凝集粒子の合成
容積５０ｃｍ^３の遠沈管へ「２．核粒子の合成」で合成した核粒子および「１．磁性ナノ粒子の合成」で合成した実施例１に係る磁性ナノ粒子の懸濁液を加え、振とう撹拌を１分間行ってヘテロ凝集粒子を合成した。
このとき、懸濁液の容量は２０ｃｍ^３、核粒子は０．０６９容量％、磁性ナノ粒子は０．０５８容量％とした。

当該ヘテロ凝集粒子を含有する懸濁液へ１２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上澄みと浮遊する粒子を除去した。当該遠心分離によるヘテロ凝集粒子の洗浄を３回実施し、実施例１に係るヘテロ凝集粒子の懸濁液を得た。

４．磁性体複合粒子の合成
得られた実施例１に係るヘテロ凝集粒子の懸濁液を遠心分離してヘテロ凝集粒子を採取して、ここへ水を添加し、１．５時間の超音波分散を実施して懸濁液を得た。ここへエタノール、２８％アンモニア水０．４１ｃｍ^３、ＴＥＯＳ、ＭＰＴＭＳの順に添加して、室温２４時間の振とう撹拌を行い、ヘテロ凝集粒子へケイ素化合物層を設けた。
このとき、ヘテロ凝集粒子は０．１２容量％、ＴＥＯＳは１０ｍｏｌ／ｍ^３、ＭＰＴＭＳは１０ｍｏｌ／ｍ^３、水は３〜１３ｋｍｏｌ／ｍ^３、アンモニアは０．３ｍｏｌ／ｍ^３とし、反応液の容量は２０ｃｍ^３とした。

得られた懸濁液へ１２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を採取して水へ再分散させて、実施例１に係る磁性体複合粒子の懸濁液を得た。

５．磁性体複合粒子の特性評価
得られた実施例１に係る磁性体複合粒子について、磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）をＴＥＭにより測定し、磁性体複合粒子の（ｄ_ＤＬＳ）を動的光散乱光度計により測定し、併せて、分散性の確認を行った。
そして磁性体複合粒子の磁気特性として飽和磁化を測定し、その結果を表１に記載した。
尚、各測定方法を以下に説明する。

１）ＴＥＭによる体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）の測定
実施例１に係る生成粒子である磁性体複合粒子の懸濁液の数滴を、それぞれコロジオン膜張付きメッシュ（日本電子製２００メッシュ）上に展開し、十分に乾燥させて測定試料とした。
当該測定試料をＳＴＥＭ装置（日立製 ＨＤ−２７００）に装填し、得られたＴＥＭ像からノギス（ミツトヨ製）を用いて、磁性体複合粒子の体積平均粒子径を直接測定した。
具体的には、１試料につき２００個程度の粒径を測定し、式１により体積平均粒子径を求め、これをＴＥＭ像から求めた磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）とした。
なお、磁性ナノ粒子ならびに核粒子の体積平均粒子径についても、前記の磁性体複合粒子の体積平均粒子径と同様の方法により測定することができる。

２）磁性体複合粒子の（ｄ_ＤＬＳ）の測定
実施例１に係る磁性体複合粒子の懸濁液における磁性体複合粒子の（ｄ_ＤＬＳ）測定を動的光散乱光度計によって行った。
具体的には、実施例１に係る磁性体複合粒子の懸濁液を希釈して、磁性体複合粒子の濃度を０．００１容量％に調整して（ｄ_ＤＬＳ）測定用の懸濁液試料を得、ここへ超音波を１００分間照射した試料を動的光散乱光度計（大塚電子製、ＥＬＳＺ−２）へ装填し、（ｄ_ＤＬＳ）を測定した。

３）分散性の確認方法
前記（ｄ_ＤＬＳ）測定用の懸濁液試料を１日静置し、目視にて確認した。
磁性体複合粒子が高い分散性を示す場合は、その懸濁状態が変化することなく保たれる。この分散性を「高」と評価した。実施例１に係る磁性複合粒子は「高」の分散性であった。
一方、分散性が十分に保たれない場合は、懸濁液上部に上澄み（透明な層）が生じる。この分散性を「中」と評価した。
さらに、分散性が保たれない場合は、濃い茶色の固形成分が容器の下に沈降した状態になる。この分散性を「低」と評価した。
一方、複数の懸濁液試料の分散性を比較して確認する場合は、懸濁液上部の上澄みである透明な層の厚みを比較することにより実施することができる。

４）飽和磁化（σｓ）の測定
実施例１に係る磁性体複合粒子の懸濁液試料を、１２時間以上真空乾燥させて粉末試料を得た。当該粉末試料２ｍｇを振動試料型磁力計（ＶＳＭ、東栄科学産業製、ＰＶ−Ｍ２０−５）に装填した。そして、測定範囲を−１００００〜＋１００００Ｏｅとし、−１００００Ｏｅと＋１００００Ｏｅにおける、実施例１に係る磁性体複合粒子の磁化の絶対値の算術平均を求めて飽和磁化とした。
以上の結果を表１に記載した。

（実施例２）
実施例２においては、体積平均粒子径１０６ｎｍのポリマー粒子を核粒子とし、実施例１と同様に、その表面に磁性ナノ粒子としてＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子を有するヘテロ凝集粒子を得、さらにケイ素化合物層としてＴＥＯＳおよびＭＰＴＭＳを含む、磁性体複合粒子を合成し、その特性を評価した。
以下、実施例２に係る磁性体複合粒子について、１．磁性ナノ粒子の合成、２．核粒子の合成、３．ヘテロ凝集粒子の合成、４．磁性体複合粒子の合成、５．磁性体複合粒子の特性評価、の順に説明する。

１．磁性ナノ粒子の合成
上述した、本発明の実施例１に係る磁性ナノ粒子の合成と同様である。

２．核粒子の合成
本発明の実施例２に係る核粒子の合成について、１）核粒子の原料、２）核粒子の合成、の順に説明する。

１）核粒子の原料
実施例２に係る核粒子を形成するモノマーの一つとして、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度９８％）を準備した。その際、当該ＭＭＡに含有される重合禁止剤のヒドロキノンを除去するため、当該ＭＭＡを、重合禁止剤除去剤（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を充填したガラス製カラムを通過させた。

実施例２に係る核粒子を形成するイオン性コモノマーの一つとして、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度８０％）を準備した。

実施例２に係る核粒子合成時の重合開始剤として、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬工業製、試薬特級、純度９５％）を準備した。

実施例２に係る核粒子合成時の重合性シランカップリング剤として、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）（信越化学工業製、試薬特級、純度９５％）を準備した。

実施例２に係る核粒子合成時の反応溶媒として、上述した実施例１と同様の脱イオン水を準備した。

２）核粒子の合成
反応には内容積１１０ｃｍ^３の円筒形密閉式ガラス反応器を用い、撹拌はマグネチックスターラーを使用した。
まず反応器へ脱イオン水を投入し３０分間窒素バブリングした後、窒素フローへ切り替えた。ここへ、ＭＭＡおよびＮａＳＳを添加して２０分間撹拌し、ＫＰＳを添加して重合を開始した。撹拌を継続しながら６５℃、２時間の重合反応を行って核粒子を含む懸濁液を得た。このとき、重合開始４０分後にＭＰＴＭＳを添加した。
このとき、当該重合反応の反応体積は３０ｃｍ^３、ＭＭＡの濃度は２００ｍｏｌ／ｍ^３、ＮａＳＳの濃度は１．０ｍｏｌ／ｍ^３、ＭＰＴＭＳの濃度は６．４ｍｏｌ／ｍ^３、ＫＰＳの濃度は４．０ｍｏｌ／ｍ^３とした。

重合反応終了後、得られた懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）して、上澄みを除去して核粒子を採取し、これを脱イオン水中へ超音波照射により再分散させて遠心洗浄を行った。当該遠心洗浄を３回実施し、実施例２に係る核粒子を脱イオン水中に分散させた。

３．ヘテロ凝集粒子の合成
本発明の実施例２に係るヘテロ凝集粒子合成は、核粒子として実施例２に係る核粒子を使用した以外は、実施例１に係るヘテロ凝集粒子合成と同様の操作を実施した。
そして、実施例２に係るヘテロ凝集粒子の懸濁液を得た。
このとき、懸濁液の容量は２０ｃｍ^３、核粒子は０．０９４容量％、磁性ナノ粒子は０．０２９容量％とした。

４．磁性体複合粒子の合成
得られた実施例２に係るヘテロ凝集粒子の懸濁液を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行って、実施例２に係る磁性体複合粒子を合成した。
このとき、ヘテロ凝集粒子は０．１２容量％、ＴＥＯＳは５ｍｏｌ／ｍ^３、ＭＰＴＭＳは５ｍｏｌ／ｍ^３、水は３〜１３ｋｍｏｌ／ｍ^３、アンモニアは０．３ｍｏｌ／ｍ^３とし、反応液の容量は２０ｃｍ^３とした。

５．磁性体複合粒子の特性評価
得られた実施例２に係る磁性体複合粒子について、実施例１と同様の操作を行って、磁性体複合粒子の粒子径をＴＥＭにより測定し、磁性体複合粒子の（ｄ_ＤＬＳ）を動的光散乱光度計により測定し、併せて、分散性の確認を行った。そして磁性体複合粒子の磁気特性として飽和磁化を測定した。
以上の結果を表１に記載した。

（実施例３）
実施例１で得られた磁性体複合粒子へ電磁場装置を用い、磁場を印加／解除した際の動作について説明する。
尚、図３は、本実施例で用いた磁場を印加する電磁場装置の模式的な斜視図であり、図４は模式的な断面図である。

溶媒として水を選択し、１ｍｌの水に対して実施例１で得られた磁性体複合粒子の懸濁液（１０質量%）を１μｌ添加し分散させて、０．０１質量％の分散液を得た。この分散液２３を図３、４に示す電磁場装置のスライドガラス２１とカバーガラス２４間に封入した。液温は室温（２５℃）とした。尚、スライドガラス２１とカバーガラス２４間にはスペーサー２２が設置されており、スライドガラス２１とカバーガラス２４ともＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）により親水化処理を行ってある。
当該状態の分散液中における磁性体複合粒子の顕微鏡像を図５に示す。

次に、電磁場装置の電磁石２５へ電流を流し、分散液へ０．３８Ｔの磁場を印加した。
このとき、実施例１に係る磁性体複合粒子の泳動状態を光学顕微鏡で観察し、分散液２３中における磁性体複合粒子の顕微鏡像を図６に示す。そして、当該磁性体複合粒子が形成するクラスター鎖長および泳動速度を測定した。尚、当該磁性体複合粒子が形成するクラスター鎖長は、顕微鏡像から算出した。一方、泳動速度はトラッキングソフト（ＮＩＳＡ Ｏｂｊｅｃｔ Ｔｒａｃｋｉｎｇ、ニコン社製）により、所定の磁性体複合粒子を追跡することで測定した。

その結果、前記分散液２３へ磁場を印加した際における、当該磁性体複合粒子が形成する長辺側のクラスター鎖の長さは０．５〜５μｍであった。そして、当該磁性体複合粒子が形成するクラスター鎖の泳動速度は、長辺側のクラスター鎖長と相関する傾向が見られ、クラスター鎖長が長い程、泳動速度が増大する傾向があることが判明した。
具体的には、長辺側のクラスター鎖長が２μｍを超える条件では、後述する比較例４に係る市販の磁性体複合粒子と同等程度（概ね、９μｍ／ｓ）の泳動速度を示した。

上述した泳動速度測定後に、磁場を解除したところクラスター鎖は崩壊し、磁性体複合粒子は単分散に近い分散状態へ戻った。

（比較例１）
体積平均粒子径２１７ｎｍのポリマー粒子を核粒子とし、実施例１と同様に、その表面に形成された外殻に磁性ナノ粒子としてＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子、ケイ素酸化物としてＴＥＯＳおよびＭＰＴＭＳを含む比較例１に係る磁性体複合粒子を合成し、その特性を評価した。
尚、比較例１に係る磁性体複合粒子については、「２．核粒子の合成、における２）核粒子の合成」を除き、１．磁性ナノ粒子の合成、２．核粒子の合成、３．ヘテロ凝集粒子の合成、４．磁性体複合粒子の合成、５．磁性体複合粒子の特性評価は、実施例２と同様である。

比較例１に係る「２．核粒子の合成、における２）核粒子の合成」は、使用する原料は実施例と同様である。そして、核粒子の合成条件を適宜に調整して径が２１７ｎｍの核粒子を得た。

そして、得られた比較例１に係る磁性体複合粒子について、実施例１と同様の操作を行って、磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_ＴＥＭ）をＴＥＭにより測定し、磁性体複合粒子の（ｄ_ＤＬＳ）を動的光散乱光度計により測定し、併せて、分散性の確認を行った。そして磁性体複合粒子の磁気特性として飽和磁化を測定した。
以上の結果を表１に記載した。

（比較例２）
「４．磁性体複合粒子の合成」において、市販の磁性体複合粒子（名称：Sera-Mag Magnetic Streptavidin-coated）の１０ｍｇ／ｍｌ粒子懸濁液を、１ｍｌの水に対して１μｌ添加し、ＴＥＯＳを１０ｍｏｌ／ｍ^３、ＭＰＴＭＳを１０ｍｏｌ／ｍ^３添加する代わりに、ＴＥＯＳのみを３０ｍｏｌ／ｍ^３添加した以外は、実施例１と同様の操作を行って比較例２に係る磁性体複合粒子を合成し、その特性を評価した。そして磁性体複合粒子の磁気特性として飽和磁化を測定した。
以上の結果を表１に記載した。

（比較例３）
「４．磁性体複合粒子の合成」において、ＴＥＯＳを５ｍｏｌ／ｍ^３、ＭＰＴＭＳを５ｍｏｌ／ｍ^３添加する代わりに、ＴＥＯＳのみを１５ｍｏｌ／ｍ^３添加した以外は、実施例２と同様の操作を行って比較例３に係る磁性体複合粒子を合成し、その特性を評価した。そして磁性体複合粒子の磁気特性として飽和磁化を測定した。
以上の結果を表１に記載した。

（比較例４）
実施例１で得られた磁性体複合粒子を、市販の磁性体複合粒子（ｄ_ＴＥＭ７４０ｎｍ）へ代替した以外は、実施例３と同様の操作を行った。
すると、磁場の印加により当該市販の磁性体複合粒子はクラスター鎖を形成し、９μｍ／ｓの泳動速度を示した。
そして、泳動速度測定後に磁場を解除してもクラスター鎖は維持され、磁性体複合粒子は単分散に近い分散状態へは戻らなかった。

１．磁性体複合粒子
１１．核粒子
１２．磁性ナノ粒子
１３．ケイ素化合物の層
１４．外殻
２１．スライドガラス
２２．スペーサー
２３．分散液
２４．カバーガラス
２５．電磁石

Claims (9)

1. 無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
   前記外殻には、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とが含有され、
   透過型電子顕微鏡により測定される前記磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_TEM）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、
   動的光散乱法により測定される前記粒子の粒子径（ｄ_DLS）の値と前記体積平均粒子径（ｄ_TEM）の値との比である（ｄ_DLS）／（ｄ_TEM）の値が２．０以下である磁性体複合粒子。
   但し、前記ケイ素化合物は、テトラエチルオルトシリケートとシランカップリング剤であり、
   前記体積平均粒子径（ｄ _TEM ）とは、単独の前記磁性体複合粒子の粒子径であり、
   動的光散乱法により測定される前記粒子の粒子径（ｄ _DLS ）とは、凝集した前記磁性体複合粒子の凝集粒子径である。
2. 前記外殻に含有される磁性ナノ粒子が、マグネタイトまたはγ酸化鉄である請求項１に記載の磁性体複合粒子。
3. 球形または略球形の形状を有する請求項１または２に記載の磁性体複合粒子。
4. 飽和磁化の値が、３０Ａｍ²／ｋｇ以上２００Ａｍ²／ｋｇ以下である請求項１から３のいずれかに記載の磁性体複合粒子。
5. 無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
   前記外殻には、磁性ナノ粒子と、ケイ素化合物とが含有され、
   透過型電子顕微鏡により測定される前記磁性体複合粒子の体積平均粒子径（ｄ_TEM）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下であり、
   磁場の印加／解除によって前記磁性体複合粒子をクラスター状態と分散状態とに、可逆的に制御可能な磁性体複合粒子。
   但し、前記ケイ素化合物は、テトラエチルオルトシリケートとシランカップリング剤であり、
   前記体積平均粒子径（ｄ _TEM ）とは、単独の前記磁性体複合粒子の粒子径であり、
   前記クラスター状態とは、前記磁性体複合粒子が溶媒中において、磁場方向に対して鎖状クラスター状態で凝集している状態であり、
   前記分散状態とは、前記磁性体複合粒子が溶媒中において、単分散している分散状態である。
6. 前記鎖状クラスター状態のときの長辺側長さが、０．５μｍ以上５μｍ以下である請求項５に記載の磁性体複合粒子。
7. ０．１Ｔ以上０．４Ｔ以下の磁場を印加したとき、前記鎖状クラスター状態の磁性体複合粒子が、３μｍ／ｓ以上１５μｍ／ｓ以下の速度で泳動する請求項５または６に記載の磁性体複合粒子。
8. 請求項１から７のいずれかに記載の磁性体複合粒子の外殻に、抗体が存在している免疫測定用粒子。
9. 磁性ナノ粒子の懸濁液を作製する工程と、
   無機酸化物またはポリマーを含み、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径の値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である核粒子を作製する工程と、
   前記磁性ナノ粒子の懸濁液へ前記核粒子を添加して、ヘテロ凝集粒子の懸濁液を作製する工程と、
   ケイ素化合物の水溶液を前記ヘテロ凝集粒子の懸濁液へ添加し、前記ヘテロ凝集粒子の表面にケイ素化合物の層を設け、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径（ｄ_TEM）の値が３０ｎｍ以上２１０ｎｍ以下である磁性体複合粒子の、懸濁液を作製する工程とを、有する磁性体複合粒子の製造方法。
   但し、前記ケイ素化合物は、テトラエチルオルトシリケートとシランカップリング剤である。

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