WO2019208670A1 - 粒子、及びその製造方法 - Google Patents

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WO2019208670A1
WO2019208670A1 PCT/JP2019/017535 JP2019017535W WO2019208670A1 WO 2019208670 A1 WO2019208670 A1 WO 2019208670A1 JP 2019017535 W JP2019017535 W JP 2019017535W WO 2019208670 A1 WO2019208670 A1 WO 2019208670A1
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group
particle
dispersion
antibody
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法重 掛川
小林　本和
哲士 山本
文生 山内
健吾 金崎
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キヤノン株式会社
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • C08J3/128—Polymer particles coated by inorganic and non-macromolecular organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C01B33/18—Preparation of finely divided silica neither in sol nor in gel form; After-treatment thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2325/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an aromatic carbocyclic ring; Derivatives of such polymers
    • C08J2325/02—Homopolymers or copolymers of hydrocarbons
    • C08J2325/04—Homopolymers or copolymers of styrene
    • C08J2325/06—Polystyrene

Definitions

  • the present invention relates to particles and a method for producing the same.
  • immunoassay In the fields of medicine and clinical examination, it is necessary to detect a minute amount of biological components with high sensitivity from blood or a part of a collected organ in order to investigate the cause of the disease.
  • immunoassay is widely used.
  • One of the immunoassays is the latex agglutination method using antigen-antibody reaction.
  • the latex agglutination method is to detect the antigen in a liquid such as a biological sample, and measure the degree of latex agglutination by mixing a latex carrying an antibody that specifically binds to the antigen and the liquid. This is a method for detecting and quantifying an antigen.
  • an antigen is captured by an antibody bound to latex, and a plurality of latexes are cross-linked through the captured antibody, resulting in aggregation. That is, the amount of antigen in a liquid such as a biological sample can be quantified by evaluating the degree of latex aggregation. The degree of aggregation can be quantified by evaluating a change in the amount of light transmitted or scattered through the liquid sample.
  • the latex agglutination method can perform quantitative evaluation of antigens simply and quickly, but has a problem that it cannot be detected if the amount of antigen in a liquid such as a biological sample is small.
  • latex captures only the target antigen and suppresses specific adsorption of other proteins, etc., and increases the amount of adsorption of the target antigen.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3265653
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2016-180716
  • Patent Document 1 proposes a core-shell structure in which a layer composed only of silica is provided on the surface of polystyrene particles.
  • a layer composed only of silica is provided on the surface of polystyrene particles.
  • the chemical state of the silica surface is unknown, and the thickness of the silica layer is not clear, and with a thickness of 40 nm as seen in the examples, the specific gravity of the particles increases and the particles easily settle in the liquid. Therefore, it cannot be measured by the latex agglutination method.
  • Patent Document 2 proposes a structure in which a betaine polymer having a hydrophilic structure is provided as a shell on the surface of a core particle.
  • Betaine is a compound that has a positive charge and a negative charge at non-adjacent positions in the same molecule, and a positively charged atom is not bound to a dissociable hydrogen atom, and the molecule as a whole has no charge.
  • Patent Document 2 since the core particle is coated with a betaine polymer having a molecular weight of 5000 or more, it is difficult to adsorb the antibody to the particle and capture the target antigen on the particle surface with the antibody. As a result, it is difficult to cause particle aggregation due to the antigen-antibody reaction, which is necessary in the latex aggregation method.
  • the present invention has been made in view of the background art as described above, and is used for a latex aggregating method in which a shell containing silica is coated on the surface of a core structure containing a polymer, and molecules of a betaine structure are bonded to the surface of the shell. It provides analyte test particles.
  • the particle according to the present invention is a particle comprising a core structure containing a polymer and a shell structure containing silica, wherein the shell structure is a molecule represented by the following formula (1) in the silyl group of the silica. And a structure in which a molecule represented by the following formula (2) is bonded to the silyl group of the silica.
  • * 1 represents a bonding position for bonding to Si of the silyl group.
  • R 1 represents (CH 2 ) a —S or (CH 2 ) b —NH, a, b represents an integer of 1 to 5), R 2 represents H or CH 3 .
  • R 3 represents a functional group having a betaine structure.
  • * 2 represents a bonding position for bonding to Si of the silyl group.
  • L 1 is (CH 2 ) x (x is an integer from 0 to 5), and L 2 is NH—CO, NH, O, S, CO, (CH 2 —CH 2 —O) n A divalent group containing at least any one of (n is an integer of 1 to 30), or a direct bond, L 3 is (CH 2 ) y (y is an integer of 0 to 5), and R 4 represents any of SH, NH 2 , and COOH.
  • the particle according to the embodiment of the present invention is a structure having a core structure at the center and a shell structure formed around the core structure.
  • FIG. 1 is a schematic view of particles according to an embodiment of the present invention.
  • the core structure 1 in the figure is spherical (particulate), and there is only one in the structure.
  • the core structure 1 includes a polymer.
  • the polymer is preferably at least one selected from the group of styrenes and (meth) acrylates, more preferably polystyrene and poly (meth) acrylates.
  • the core structure 1 can be obtained by emulsion polymerization using a polystyrene monomer as a main component.
  • divinylbenzene, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, or the like may be added and crosslinked when forming the core structure.
  • an additive or the like may be added to strictly control the size of the core structure 1. Examples of the additive include sodium dodecyl sulfate and sodium parastyrene sulfonate.
  • a shell structure 2 in FIG. 1 is a layered structure in which the outer periphery of the core structure 1 is uniformly coated.
  • the shell structure 2 is in close contact with the core structure 1, and the thickness of the shell structure 2 can be 3 nm or more and 15 nm or less.
  • a shell structure 2 having a thickness of 5 nm to 10 nm is used. If the thickness of the shell structure is too thin, the physical properties as a silica layer may not function sufficiently. On the other hand, if the shell structure is too thick, the specific gravity of the particles becomes heavy, making it difficult to obtain a stable dispersion state in water and increasing the sedimentation rate.
  • the sedimentation rate of the particulate material according to the embodiment of the present invention is preferably 4.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / second or less (in water, temperature 25 degrees).
  • Shell structure 2 is a structure formed by hydrolyzing trifunctional silane. Hydrophilicity can be imparted to the surface of the particulate material by the presence of silanol groups in part of the silica formed by the hydrolyzed silane.
  • * 1 represents a bonding position for bonding to Si (silicon) of the silyl group.
  • R 1 represents (CH 2 ) a —S or (CH 2 ) b —NH (a and b each independently represents an integer of 1 to 5).
  • R 2 represents H or CH 3 .
  • R 3 represents a functional group having a betaine structure.
  • the molecule represented by the above formula (1) is bonded to the surface of the shell structure 2.
  • R 1 in the above formula (1) is preferably carbon or an alkyl chain covalently bonded to silicon.
  • R 2 and R 3 in the above formula (2) can be formed by causing a Michael addition reaction between a thiol group and an acrylic group or a methacryl group. That is, it is formed by using trifunctional alkoxysilane having a thiol group as a raw material of the shell structure 2 and reacting with acrylate and methacrylate molecules.
  • R 4 in the above formula (1) represents a functional group having a betaine structure.
  • the functional group having a betaine structure has a positive charge and a negative charge at positions that are not adjacent to each other in the same molecule, and a dissociable hydrogen atom is not bonded to a positively charged atom, and the entire molecule Is a functional group having no charge.
  • the functional group having a positive charge can use any of quaternary ammonium, sulfonium, phosphonium, and the like
  • the functional group having a negative charge can use sulfonic acid, carboxylic acid, phosphonic acid, or the like. I can do it.
  • a functional group having a positive charge and a functional group having a negative charge are present in a ratio of 1: 1.
  • the betaine structure is preferably carboxybetaine or sulfobetaine.
  • the molecular weight of the functional group having a betaine structure in the molecule is preferably 2000 or less, and more preferably 1000 or less.
  • the surface of the particle is strongly hydrated and is considered to exhibit a hydrogel-like property.
  • the hydrated molecular layer works as a refractive index interference layer, and the light scattering intensity of the particles may be reduced.
  • the sensitivity that can be detected by the latex agglutination method decreases.
  • the molecule represented by the above formula (1) is preferably represented by the following formula (1-i).
  • 1 is a structure formed by hydrolyzing trifunctional silane.
  • a molecule represented by the formula (2) can be produced in the silyl group of silica on the surface of the shell structure.
  • * 2 represents a bonding position for bonding to Si of the silyl group.
  • L 1 is (CH 2 ) x (x is an integer from 0 to 5), and L 2 is NH—CO, NH, O, S, CO, (CH 2 —CH 2 —O) n.
  • L 3 is (CH 2 ) y (y is an integer from 0 to 5).
  • R 4 represents one of SH, NH 2 , COOH, and a glycidyl group.
  • L 2 is a direct bond and y in L 3 is 0.
  • L 2 is preferably (CH 2 —CH 2 —O) n
  • n is preferably an integer of 1 to 20, and n is any of 5 to 10 More preferably, it is an integer.
  • (CH 2 —CH 2 —O) can impart hydrophilicity to the particles.
  • the group represented by the formula (2) has an appropriate length, and the ligand can be easily bonded.
  • R 4 is a reactive functional group used when binding a ligand such as an antibody.
  • the raw material trifunctional silane constituting the shell structure 2 include mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptopropyltriethoxysilane, aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, vinyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, Glycidyloxypropyltrimethoxysilane, methacryloxypropyltrimethoxysilane, or the like can be used.
  • the thiol group, amino group or carboxyl group present on the surface of the shell structure 2 is used as a scaffold for binding the antibody to the particle material.
  • a vinyl group, a glycidyl group, a methacryl group or the like, a thiol group, an amino group, or a carboxyl group can be added using an addition reaction, an insertion reaction or the like. If the amount of thiol group, amino group or carboxyl group present on the surface of the shell structure 2 is too large, too many antibodies may be bound and the hydrophilicity of the particle material may be impaired. Specifically, the density per unit area of thiol groups and amino groups present on the surface of the particles according to the present embodiment is preferably 0.01 / nm 2 or less.
  • the molecule represented by the above formula (2) is preferably represented by the following formula (2-i).
  • R 4 represents any of SH, NH 2 , COOH, and a glycidyl group.
  • the colloidal liquid in which the particulate material according to this embodiment is dispersed in an aqueous solvent can be used as an antibody test reagent for latex agglutination.
  • a buffer solution can also be used as the aqueous solvent.
  • a surfactant, preservative, sensitizer, and the like may be added to the aqueous solvent.
  • the dispersion according to this embodiment includes particles and a dispersion medium for dispersing the particles.
  • an antioxidant or the like may be included as appropriate.
  • the average diameter of the particles contained in the dispersion is preferably from 100 nm to 300 nm, more preferably from 150 nm to 250 nm.
  • the variation coefficient of the particle size distribution of the particles contained in the dispersion is preferably 5% or less, and more preferably 3% or less.
  • an affinity particle having the particle according to the present embodiment and a ligand bound to R 4 of the above formula (2) can be provided.
  • R 4 is any one of SH (thiol), NH 2 (amino group), COOH (carboxyl group), and glycidyl group.
  • the ligand is a compound that specifically binds to a receptor possessed by a specific target substance.
  • the site where the ligand binds to the target substance is determined and has a high affinity selectively or specifically.
  • examples include antigens and antibodies, enzyme proteins and their substrates, signal substances such as hormones and neurotransmitters and their receptors, and nucleic acids, but the ligands in this embodiment are not limited thereto.
  • the nucleic acid include deoxyribonucleic acid.
  • the affinity particles in the present embodiment have a high affinity (affinity) selectively or specifically for the target substance.
  • the ligand in the present embodiment is preferably any one of an antibody, an antigen, and a nucleic acid.
  • a conventionally known method can be applied to the chemical reaction method for chemically bonding the reactive functional group of the particle according to the present embodiment and the ligand to the extent that the object of the present invention can be achieved. it can.
  • a catalyst such as 1- [3- (dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide] can be appropriately used.
  • the affinity particle in this embodiment uses an antibody (antigen) as a ligand and an antigen (antibody) as a target substance, it can be preferably applied to an immunolatex agglutination measurement method widely used in areas such as clinical examination and biochemical research. .
  • the test reagent for in-vitro diagnosis in this embodiment that is, the test reagent for use in detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis has affinity particles according to this embodiment and a dispersion medium for dispersing the affinity particles.
  • the amount of the affinity particles according to this embodiment contained in the reagent in this embodiment is preferably 0.001% by mass to 20% by mass, and more preferably 0.01% by mass to 10% by mass.
  • the reagent according to the present embodiment may contain a third substance such as a solvent or a blocking agent in addition to the affinity particles according to the present embodiment as long as the object of the present invention can be achieved. Third substances such as solvents and blocking agents may be included in combination of two or more.
  • Examples of the solvent used in the present embodiment include various buffer solutions such as a phosphate buffer solution, a glycine buffer solution, a Good buffer solution, a Tris buffer solution, and an ammonia buffer solution, and are included in the reagent in the present embodiment.
  • the solvent is not limited to these.
  • an antibody or antigen When used for detection of an antigen or antibody in a specimen by latex agglutination, an antibody or antigen can be used as the ligand.
  • a test kit for use in detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis includes the reagent and a housing that contains the reagent.
  • the kit according to this embodiment may contain a sensitizer for measuring latex aggregation.
  • the sensitizer for measuring latex agglutination include polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyalginic acid and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the kit according to the present embodiment may include a positive control, a negative control, a serum diluent, and the like.
  • a solvent other than serum and physiological saline containing no measurable target substance may be used as a medium for positive control and negative control.
  • the kit according to the present embodiment can be used in the method for detecting a target substance according to the present embodiment in the same manner as a kit for use in detecting a target substance in a specimen by normal in vitro diagnosis. Further, the concentration of the target substance can be measured by a conventionally known method, and it is particularly suitable for use in detecting the target substance in the specimen by the latex agglutination method.
  • the method for detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis according to the present embodiment includes a step of mixing the affinity particles according to the present embodiment and a specimen that may contain the target substance.
  • the mixing of the affinity particles and the specimen according to the present embodiment is preferably performed in the range of pH 3.0 to pH 11.0.
  • the mixing temperature is in the range of 20 ° C. to 50 ° C.
  • the mixing time is in the range of 1 minute to 20 minutes.
  • this detection method uses a solvent.
  • the concentration of the affinity particles according to this embodiment in the detection method according to this embodiment is preferably 0.001% by mass to 5% by mass, more preferably 0.01% by mass to 1% by mass in the reaction system.
  • the detection method according to this embodiment optically detects an agglutination reaction that occurs as a result of mixing the affinity particles according to this embodiment and the specimen, that is, can detect a target substance in the specimen by a latex agglutination method. preferable. Specifically, at least one of a step of mixing a specimen with a test reagent to obtain a mixture, a step of irradiating the mixture with light, and a transmitted light or a scattered light of the light irradiated on the mixture A step of detecting. By optically detecting the agglutination reaction occurring in the mixed solution, the target substance in the specimen can be detected, and the concentration of the target substance can also be measured. As a method for optically detecting the agglutination reaction, the amount of change in these values may be measured using an optical instrument capable of detecting scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, and the like.
  • the method for producing particles according to this embodiment includes the following steps.
  • a step of obtaining a solution containing core particles containing a polymer by mixing a monomer having a vinyl group and a radical polymerization initiator (step 1).
  • a shell structure containing silica is formed on the surface of the core particle by adding a silane having a vinyl group and a thiol group or an amino group to the solution obtained in (1) and hydrolyzing it.
  • a step of obtaining particles having a shell structure (step 2); A step of bonding molecules having a vinyl group and a betaine structure to the thiol group or amino group in the particles obtained in (2) (step 3).
  • the monomer having a vinyl group is preferably styrene.
  • the silane having a vinyl group is trimethoxyvinylsilane, triethoxyvinylsilane, tetramethylorthosilicate, tetraethylorthosilicate, mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptopropyltriethoxysilane, aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxy. It is preferably at least one selected from the group consisting of silane, vinyltrimethoxysilane, and vinyltriethoxysilane.
  • the method for producing particles according to this embodiment includes the following steps.
  • a step of producing a particle dispersion containing polystyrene from an emulsion dispersion containing at least a compound containing styrene and an initiator A step of providing a silica layer on the surface of the carrier using a silicon alkoxide having a thiol group or an amino group.
  • the core structure 1 in FIG. 1 can be obtained by emulsion polymerization of a styrene monomer in an aqueous solvent.
  • Emulsion polymerization is a step of obtaining particles by adding a styrene monomer and an additive to an aqueous solvent, stirring sufficiently, and then adding a polymerization initiator in a nitrogen atmosphere and heating.
  • a polymerization initiator for emulsion polymerization potassium persulfate, 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, or the like can be used. Additives may be added to adjust the particle size and make the particle size distribution more uniform.
  • sodium parastyrene sulfonate sodium dodecyl sulfate, polyvinyl pyrrolidone, or the like can be used.
  • sodium parastyrene sulfonate that can control the particle size depending on the amount added and can produce the core structure 1 exhibiting high dispersibility in an aqueous solvent can be suitably used.
  • the strength of the core structure 1 can be increased by adding methoxysilane or the like. It can refine
  • the shell structure 2 is composed of trimethoxyvinylsilane, triethoxyvinylsilane, tetramethylorthosilicate, tetraethylorthosilicate, mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptopropyltriethoxysilane, aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane.
  • Vinyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane and the like can be obtained by hydrolysis.
  • a raw material containing at least one silane containing a thiol group or an amino group such as mercaptopropyltrimethoxysilane or aminopropyltrimethoxysilane.
  • Hydrolysis is performed by introducing the silane into a liquid in which the core structure 1 is dispersed in a high pH aqueous solvent.
  • the pH in the liquid is preferably 11 or more.
  • a uniform shell structure 2 can be obtained by increasing the rate of hydrolysis of the silane introduced in a high pH solution and precipitating it on the surface of the core structure 1.
  • the reaction temperature may be controlled between 60 degrees and 80 degrees depending on the conditions. If the hydrolysis rate is too fast, a solvent such as alcohol may be added.
  • the obtained particulate material can be purified by centrifuging and redispersing the precipitate in a solvent.
  • the thiol group or amino group existing on the surface can be obtained by a step of bonding an acrylate or methacrylate having a betaine structure by a Michael addition reaction.
  • the step of bonding the betaine structure to the surface of the shell structure 2 in FIG. 1 is preferably performed using a Michael addition reaction.
  • the Michael addition reaction is a reaction in which a carbon or heteroatom nucleophile is 1,4-added to an electron-deficient alkene such as an unsaturated ester, ketone, or nitrile.
  • the betaine structure can be bonded to the surface of the shell structure 2 by reacting the thiol group present on the surface of the shell structure 2 with an acrylate or methacrylate having a betaine structure in a liquid.
  • an organic solvent or an aqueous solvent can be used.
  • an aqueous solvent is preferable.
  • the Michael addition reaction in an aqueous solvent proceeds even without catalyst, but it is preferable to use a catalyst such as an amine. It is preferable to use triethylamine, hexylamine, dimethylethylenediamine or the like as the catalyst.
  • the Michael addition reaction is completed when the solution is stirred at room temperature for about 12 hours. After the reaction, the obtained particulate material can be purified by centrifuging and redispersing the precipitate in a solvent.
  • ⁇ / RTI> By binding various antibodies to the particles according to this embodiment, they can be used as specimen test particles for latex agglutination. What is necessary is just to select the optimal method for couple
  • FIG. For example, maleimide can be reacted with a thiol group to bind an antibody.
  • the particles according to this embodiment can be used for the treatment of the surface of the carrier.
  • the surface treatment method in the present embodiment includes the following steps.
  • a step of bonding an acrylate or methacrylate having a betaine structure to a thiol group or amino group present on the surface of the support by a Michael addition reaction Note that molecules having a betaine structure are bonded to the silica layer.
  • Core structure 1-1 was produced by an emulsion polymerization method. To a round bottomed four-necked separable flask, 900 g of pure water, 56 g of styrene monomer (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.), 0.165 g of sodium parastyrene sulfonate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) are added, and nitrogen bubbling is performed using a mechanical stirrer. Stir for minutes. After heating the sample to 70 ° C.
  • Core structure 1-2 was prepared by an emulsion polymerization method. In a round bottom four-necked separable flask, pH 7.4 phosphate buffer 150 g (manufactured by Kishida Chemical), styrene monomer 7.5 g (manufactured by Kishida Chemical), 2.5 g of 3-methacryloxypropyltriethoxysilane (Shin-Etsu Chemical) Product) and polyvinylpyrrolidone K-300.5 g (manufactured by Tokyo Chemical Industry, molecular weight 40000). The resulting solution was stirred for 30 minutes while bubbling nitrogen using a mechanical stirrer. The sample was heated to 70 ° C.
  • the core structure 1-2 had a diameter of 219 nm and a variation coefficient of the particle size distribution of 2.4%.
  • the non-specific adsorption inhibiting ability of the product was evaluated using chyle.
  • the chyle is a substance that causes non-specific adsorption strongly to latex particles and causes aggregation of particles in serum components.
  • the chyle used the reagent contained in the kit of interference check A (made by Sysmex).
  • the resulting 0.1 wt% particulate material was mixed with 0.8 ⁇ L of chyle dispersion and 120 ⁇ L of pH 7.4 phosphate buffer (containing ethylenediaminetetraacetic acid, TWEEN20, bovine serum albumin, sodium chloride). 60 ⁇ L of the dispersion was added.
  • an ultraviolet-visible absorption spectrum (GENEQUANT 1300) was measured. After the measurement, the sample was immersed in a 37 ° C. water bath for 5 minutes, and then an ultraviolet-visible absorption spectrum was measured again. The change in absorbance at a wavelength of 572 nm before and after aging for 5 minutes was measured to evaluate the aggregation of particles in the dispersion. The sample having the absorbance change of less than 0.1 was evaluated as being able to suppress the nonspecific adsorption ability. The change of less than 0.1 is the maximum permissible background fluctuation with respect to the measurement by the actual latex agglutination method, and is preferably 0.01 or less.
  • the scattering intensity was measured by the same method as the evaluation of the ability to suppress nonspecific adsorption by chyle. Scattering intensity was evaluated by replacing with the magnitude of absorbance. That is, a sample having an absorbance of 1.0 or more was considered to have sufficient scattering intensity and can be detected by actual measurement using a latex agglutination method.
  • Example 1 3-[[2- (Methacryloyloxy) ethyl] dimethylammonio] propionate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) is added to the dispersion of the core-shell structure produced using the core structure 1-1 to obtain a product. It was.
  • Example 2 To a dispersion of the core-shell structure produced using the core structure 1-1, 3-[[2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethylammonio] propionate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) and N, N-dimethyl- N- (3-sulfonatopropyl) -2- (methacryloyloxy) ethane-1-aminium (manufactured by Sigma Aldrich) was added at a weight ratio of 1: 1 to obtain a product.
  • Example 3 To a dispersion of the core-shell structure prepared using the core structure 1-1, N, N-dimethyl-N- (3-sulfonatopropyl) -2- (methacryloyloxy) ethane-1-aminium (Sigma) was added. Aldrich)) was added to obtain the product.
  • Example 4 3-[[2- (Methacryloyloxy) ethyl] dimethylammonio] propionate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) is added to the core-shell structure dispersion prepared using core structure 1-2 to obtain a product. It was.
  • Comparative Example 1 Commercially available latex particles (Imtex, manufactured by JSR) having a diameter of 188 nm were diluted to 0.1 wt% with pure water and used.
  • N, N-dimethyl-N- (3-sulfonatopropyl) -2- (methacryloyloxy) ethane-1-aminium (manufactured by Sigma-Aldrich) was added in a weight ratio to the solid content in the dispersion. Ten times the amount was added. Subsequently, a betaine polymer was imparted to the surface of the particles using a catalyst amount of a polymerization initiator (V-50: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) under a nitrogen atmosphere and a temperature of 70 ° C. The obtained dispersion of the structure was washed and then adjusted to 0.1 wt%.
  • V-50 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Table 1 shows the structures and physical properties of the particulate materials of Examples and Comparative Examples.
  • the diameter of the core structure and the thickness of the shell structure are values obtained by observation with an electron microscope.
  • the functional groups present on the surface in Table 1 include silanols in Examples 1, 2, 3, 4 and Comparative Examples 3, 4, 5 in addition to the described functional groups.
  • sulfobetaine means a betaine structure having sulfonic acid.
  • carboxybetaine means a betaine structure having a carboxylic acid.
  • Comparative Example 4 When the produced material was observed with an electron microscope, a uniform particle surface was formed. The coefficient of variation was about 5% or less except for Comparative Example 4, and it was confirmed that the particles were in a state where the particle size distribution was extremely uniform. The variation coefficient of the particles of Comparative Example 4 was 13.7%. Further, Comparative Example 4 aggregated and settled even when left still overnight. Therefore, the particle material of Comparative Example 4 is not suitable for antibody test particles for latex agglutination.
  • the thickness of the shell structure 2 was 7 to 10 nm.
  • Precipitation was unstable in Comparative Example 3 in which only the thiol group was present on the surface and Comparative Example 4 in which the core structure was composed of silica, and precipitation was confirmed. This result shows that due to the presence of the shell structure 2, the increased specific gravity of the product does not affect the dispersion state of the particles, and the cause of the precipitation is that the thiol group is oxidized to form a disulfide bond. Is thought to have influenced.
  • Table 1 shows the results of comparison of nonspecific adsorption inhibition ability.
  • the change in absorbance before and after the chyle test was 0.003, 0.031, 0.002, 0.009 and It was 0.000 and it was confirmed that there was almost no fluctuation.
  • the absorbance change was as large as 0.4 or more, and it was confirmed that particles in this state cannot be used in the latex agglutination method.
  • Anti-CRP antibodies were bound to the thiol groups of the particles of Examples 1, 2, and 3.
  • EMCS N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide
  • the polymer fine particle dispersion was centrifuged at 15000 rpm (20400 g) for 15 minutes to precipitate the fine particles. After removing the supernatant, the pellet of fine particles was redispersed with a buffer solution, and a premaleidized anti-CRP antibody was added thereto. After stirring for 180 minutes at room temperature, the particles were collected by centrifugation. The particles were sufficiently washed with a buffer to obtain microparticles bound with an anti-CRP antibody. The binding of the antibody was confirmed by measuring the amount of decrease in the antibody concentration in the buffer containing the antibody by BCA assay. It was found that about 200 antibodies were bound per particle.
  • the latex agglutination reaction was performed with the particles bound with the antibody.
  • Human serum-derived CRP Sigma Aldrich
  • polymer fine particle dispersion were mixed, and the absorbance at a wavelength of 572 nm before and after mixing was measured. If the anti-CRP antibody on the microparticles can capture CRP as an antigen, an agglutination reaction between the microparticles via CRP occurs. At this time, as a result of the decrease in transmittance, an increase in absorbance is observed.
  • CRP was added to a solution containing antibody-bound microparticles (with CRP added) and when CRP was not added (without CRP added)
  • the absorbance change rate at a reaction temperature of 37 ° C. and a reaction time of 5 minutes was 1. It was 4 to 8.4%. From these results, it was shown that the antigen-antibody reaction can be detected by the latex agglutination method when using the particles according to the examples of the present invention.
  • the particulate material in this example is a material having both surface characteristics having non-specific adsorption ability and physical properties that do not easily settle. As a result, it was found that it showed excellent performance as an antibody test for latex aggregation.
  • the particles according to the present invention are excellent in the ability to suppress non-specific adsorption and are difficult to settle.

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Abstract

ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、前記シリカのシリル基に、ベタイン構造を有する官能基を含む分子が結合している粒子。

Description

粒子、及びその製造方法
　本発明は、粒子、及びその製造方法に関するものである。
　医学、臨床検査の分野において、血液や採取された臓器の一部などから微量な生体成分を高感度で検出することは、病気の原因を追究するために必要である。生体成分の検出手法の中でも、免疫分析は広く利用されている。免疫分析の一つに、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集法がある。ラテックス凝集法とは、生体試料等の液体中の抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体などを担持させたラテックスと、液体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原の検出や定量を行う方法である。
　ラテックス凝集法では、抗原がラテックスに結合した抗体に捕捉され、捕捉された抗体を介して複数のラテックスが架橋し、その結果凝集が起きる。つまり、生体試料等の液体中の抗原の量は、ラテックスの凝集の程度を評価することで定量できる。凝集の程度は、液体試料を透過、あるいは散乱する光の量の変化を評価することで定量できる。
　ラテックス凝集法は、簡便かつ迅速に、抗原の定量評価ができる一方、生体試料などの液体中の抗原の量が少ないと、検出できないという課題があった。
　検出感度を向上させるためには、ラテックスが目的の抗原のみを補捉し、他のタンパク質などの特異的吸着を抑制させる事や、目的の抗原の吸着量を大きくする事が挙げられる。
　ラテックスへのタンパク質の非特異吸着を抑制する方法として、ラテックス粒子の表面を親水化することが効果的であると考えられている。一般的にタンパク質は疎水的な性質が強いものが多いので、ラテックスの表面を強い電荷を帯びずに親水化することにより、非特異吸着は抑制できると考えられている。このような考え方に沿って、ラテックス、例えばポリスチレン粒子などの表面に親水層をコートする試みがなされている（特許文献１：特許３２６５６５３号公報、特許文献２：特開２０１６－１８０７１６号公報）。
　特許文献１では、ポリスチレン粒子の表面にシリカのみで構成される層を付与したコア－シェル構造体が提案されている。しかしながら、シリカ表面の化学状態が不明である事と、シリカ層の厚みが明確ではなく、実施例などにみられる４０ｎｍの厚みでは、粒子の比重が大きくなり、液体中で容易に沈降してしまうため、ラテックス凝集法では測定することができない。
　特許文献２では、コア粒子の表面に親水構造を有するベタインポリマーをシェルとして付与した構造体が提案されている。ベタインは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の事を示す。つまり、ベタインは構造的に電荷がゼロであり、非常に高い親水性を示す構造なので、ベタインでコートした担体は非特異吸着が著しく抑制できることが知られている。しかしながら、特許文献２では分子量５０００以上のベタインポリマーでコア粒子を被覆しているため、抗体を粒子に吸着させ、更に粒子表面で目的の抗原を前記抗体で捕捉することが難しい。その結果、ラテックス凝集法で必要な、抗原抗体反応による粒子の凝集を起こすことが困難である。
　従って、先行技術では、粒子表面の親水性を保ち非特異吸着を抑制でき、かつ、抗原を補足して、粒子が凝集した状態でも沈降しにくいような分散安定性を有するような材料を作製することが難しい。
：特許３２６５６５３号公報 ：特開２０１６－１８０７１６号公報
　本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、ポリマーを含むコア構造の表面にシリカを含むシェルが被覆し、シェルの表面にベタイン構造の分子が結合したラテックス凝集法用の検体検査粒子を提供するものである。
　本発明に係る粒子はポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造とを含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、前記シリカのシリル基に、下記式（１）で示される分子が結合した構造と、前記シリカのシリル基に、下記式（２）で示される分子が結合した構造と、を有する粒子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（１）において、
　＊１は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
　Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ－Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ－ＮＨを表しａ、ｂは１から５の整数を表す）、
　Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表す。
　Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（２）において、
　＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
　Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘ（ｘは０から５のいずれかの整数）であり、Ｌ２は、ＮＨ－ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
　Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）であり、Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、及びＣＯＯＨのいずれかを表す。
本発明の実施形態に係る粒子を説明する図。
　以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して詳細に説明する。ただし、発明の範囲を限定するものではない。
　（粒子）
　本発明の実施形態に係る粒子は、中心にコア構造があり、その周囲にシェル構造形成している構造体である。図１は本発明の実施形態に係る粒子の概略図である。図中のコア構造１は球状（粒子状）であり、構造体の中に一つだけ存在するものである。
　（コア構造）
　コア構造１はポリマーを含む。ポリマーは、スチレン類、（メタ）アクリレート類の群から選択される少なくとも一種であることが好ましく、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレートがより好ましい。好ましくはポリスチレンを含む場合で、ポリスチレンを主成分として含むことが特に好ましい。
　コア構造１はポリスチレンモノマーを主成分として乳化重合することで得ることができる。コア構造１の強度を向上させるために、コア構造を形成する時に、ジビニルベンゼン、３－メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランなどを加えて架橋しても良い。また、コア構造１のサイズを厳密に制御するために添加剤などを加えても良い。添加剤はドデシル硫酸ナトリウムやパラスチレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　（シェル構造）
　図１におけるシェル構造２はコア構造１の外周を均一に被覆した層状の構造体である。シェル構造２はコア構造１に密着していて、シェル構造２の厚さは３ｎｍ以上１５ｎｍ以下のとすることができる。好適には５ｎｍ以上１０ｎｍ以下の厚さのシェル構造２が用いられる。シェル構造の厚さは薄すぎると、シリカ層としての物性が十分に機能しないおそれがある。一方シェル構造の厚さが厚すぎると、粒子の比重が重くなり、水中で安定な分散状態を得ることが難しくなり、沈降速度が速くなる。本発明の実施形態に係る粒子材料の沈降速度が、４．０×１０－３μｍ／秒以下（水中、温度２５度）であることが好ましい。
　シェル構造２は３官能のシランを加水分解することで形成した構造体である。加水分解したシランによって形成するシリカの一部にシラノール基が存在することで、粒子材料の表面に親水性を付与することができる。
　更に、３官能のシランを用いる事で、シェル構造のシリカのシリル基に下記式（１）で示される分子を結合する事が可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記式（１）において、
　＊１は、前記シリル基のＳｉ（シリコン）に結合する結合位置を表す。
　Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ－Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ－ＮＨを表す（ａ、ｂは、各々独立に、１から５の整数を表す）。
　Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表す。
　Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表す。
　上記式（１）で示される分子は、シェル構造２の表面に結合している。上記式（１）のＲ１は、シリコンと共有結合している炭素、アルキル鎖などが好ましい。上記式（２）のＲ２とＲ３は、チオール基とアクリル基、あるいはメタクリル基間でマイケル付加反応を起こして形成することができる。つまり、シェル構造２の原料にチオール基を有する３官能アルコキシシランを用い、アクリレート、メタクリレート分子と反応させることで形成する。上記式（１）のＲ４はベタイン構造を有する官能基を示す。本実施形態において、ベタイン構造を有する官能基は正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない官能基である。具体的には正電荷を有する官能基は４級アンモニウム、スルホニウム、及びホスホニウムのいずれか等を用いる事ができ、負電荷を有する官能基は、スルホン酸、カルボン酸、及びホスホン酸等を用いる事が出来る。Ｒ４は、正電荷を有する官能基と負電荷を有する官能基が１：１の割合で存在している。なお、ベタイン構造が、カルボキシベタイン、またはスルホベタインであることが好ましい。
　上記式（１）で示される分子において、分子中のベタイン構造を有する官能基の分子量は２０００以下が好ましく、１０００以下がさらに好ましい。分子量が２０００より大きくなると、粒子の表面が強く水和し、ヒドロゲルの様な性質を示すと考えられる。その結果、後述する抗体等のリガンドを粒子の表面に結合する事が困難になる。また、水和した分子層が屈折率干渉層として働き、粒子の光散乱強度が低下する可能性がある。結果として、ラテックス凝集法で検出できる感度が下がってしまう。
　本実施形態において、上記式（１）で表される分子が、下記式（１－ｉ）で表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　図１におけるシェル構造２は３官能のシランを加水分解することで形成した構造体である。３官能のシランを用いる事で、シェル構造の表面のシリカのシリル基に式（２）で示される分子を作製する事が可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（２）において、
　＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
　Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘであり（ｘは０から５のいずれかの整数）、Ｌ２は、ＮＨ－ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
　Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）である。Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかを表す。
　上記式（２）において、Ｌ２が直接結合であり、Ｌ３におけるｙが０であることが好ましい。また、上記式（２）において、Ｌ２が（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎであり、ｎが１から２０のいずれかの整数であることが好ましく、ｎが５から１０のいずれかの整数であることさらに好ましい。（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）は粒子に親水性を付与することができる。また、上記ｎが５から１０以下だと、式（２）で表す基が適切な長さとなり、リガンドを結合させやすい。
　Ｒ４は、抗体などのリガンドを結合する際に用いられる反応性官能基である。シェル構造２を構成する原料の３官能のシランは、例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランなどを用いることができる。シェル構造２の表面に存在するチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基は粒子材料に抗体を結合するための足場として利用する。ビニル基、グリシジル基、メタクリル基などからは付加反応、挿入反応などを用いてチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基を付加する事ができる。シェル構造２の表面に存在するチオール基、アミノ基乃至カルボキシル基の量は多すぎると抗体が多く結合しすぎて、粒子材料の親水性が損なわれるおそれがある。具体的には本実施形態に係る粒子の表面に存在するチオール基やアミノ基の単位面積あたりの密度が０．０１個／ｎｍ２以下である事が好ましい。
　本実施形態において、上記式（２）で表される分子が、下記式（２－ｉ）で表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（２－ｉ）において、Ｒ４はＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、及びグリシジル基のいずれかを表す。
　本実施形態に係る粒子を用いると、非特異吸着が少なく、水溶媒への分散性が高く、かつ、沈降も少ないコロイド液を得ることができる。したがって、本実施形態に係る粒子材料を水溶媒に分散したコロイド液はラテックス凝集法用の抗体検査試薬として利用する事ができる。水溶媒には、緩衝液を用いる事も可能である。また、本実施形態にかかる粒子を分散した液の安定性を増すために、水溶媒中に、界面活性剤、防腐剤や増感剤なども添加してもよい。
　（分散液）
　本実施形態に係る分散液は粒子と、粒子を分散させる分散媒とを有する。また適宜、酸化防止剤、等が含まれていても良い。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましく、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であるがさらに好ましい。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の粒度分布の変動係数が５％以下であることが好ましく、３％以下であることがさらに好ましい。
　（リガンド・アフィニティー粒子）
　本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、上記式（２）のＲ４に結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。Ｒ４は、ＳＨ（チオール記）、ＮＨ２（アミノ基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、グリシジル基のいずれかである。
　本実施形態において、リガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的または特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本実施形態におけるリガンドはこれらに限定されない。核酸としてはデオキシリボ核酸等が挙げられる。本実施形態におけるアフィニティー粒子とは、標的物質に対して選択的または特異的に高い親和性（アフィニティー）を有する。本実施形態におけるリガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることが好ましい。
　本実施形態において、本実施形態に係る粒子が有する反応性官能基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。また、リガンドをアミド結合させる場合は、１－［３－（ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド］等の触媒を適宜用いることができる。
　本実施形態におけるアフィニティー粒子が、リガンドとして抗体（抗原）、標的物質として抗原（抗体）を用いる場合、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されている免疫ラテックス凝集測定法に好ましく適用できる。
　（体外診断用の検査試薬）
　本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、０．００１質量％から２０質量％が好ましく、０．０１質量％から１０質量％がより好ましい。本実施形態に係る試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態に係るアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は２種類以上を組み合わせて含んでも良い。本実施形態において用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
　ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いる場合は、リガンドは、抗体または抗原を用いることができる。
　（検査キット）
　本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査キットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。本実施形態に係るキットとしては、ラテックス凝集測定用増感剤を含有させても良い。ラテックス凝集測定用増感剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本実施形態に係るキットは、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。本実施形態に係るキットは、通常の体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本実施形態に係る標的物質の検出方法に使用できる。また、従来公知の方法によって標的物質の濃度も測定することができ、特に、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出に用いることが好適である。
　（検出方法）
　本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する工程を有する。また、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合は、ｐＨ３．０からｐＨ１１．０の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は２０℃から５０℃の範囲であり、混合時間は１分から２０分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態に係る検出方法における本実施形態に係るアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは０．００１質量％から５質量％、より好ましくは０．０１質量％から１質量％である。本実施形態に係る検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。前記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
　（粒子の製造方法）
　次に、本実施形態に係る粒子材料の製造方法について以下に記す。ただし、発明の範囲を限定するものではない。
　本実施形態に係る粒子の製造方法は以下の各工程を有する。
　ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）。
（１）で得た溶液に、ビニル基と、及びチオール基またはアミノ基と、を有するシランを添加して加水分解することで、前記コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア－シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）。
（２）で得た粒子における前記チオール基またはアミノ基に、ビニル基とベタイン構造を有する分子を結合させる工程（工程３）。
　なお、上記ビニル基を有するモノマーがスチレンであることが好ましい。また、上記ビニル基を有するシランが、トリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　なお、粒子にリガンドを結合する工程をさらに有していてもよく、リガンドは、抗体、抗原、及び核酸等を用いることができる。
　以下、本実施形態に係る粒子の製造方法の一例を詳細に説明する。
　本実施形態に係る粒子の製造方法は以下の工程を有する。
　少なくともスチレンを含有する化合物、開始剤を含む乳化分散液からポリスチレンを含む粒子分散液を製造する工程。
チオール基あるいはアミノ基を有するシリコンアルコキシドを用いて担体の表面にシリカ層を設ける工程。
前記表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレート乃至メタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程。
　図１中におけるコア構造１はスチレンモノマーを水溶媒中で乳化重合することで得ることができる。乳化重合は、スチレンモノマーおよび添加剤を水溶媒に加え、充分に撹拌した後、窒素雰囲気化で重合開始剤を加えて加熱することで粒子を得る工程である。乳化重合の開始剤には過硫酸カリウムや２、２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ニ塩酸塩などを用いる事ができる。粒子サイズの調整や、粒度分布をより揃えるために添加剤を加えても良い。具体的にはパラスチレンスルホン酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどを用いる事ができる。界面活性剤を用いずに、添加量によって粒子サイズが制御でき、さらに水溶媒中で高い分散性を示すコア構造１を作製できるパラスチレンスルホン酸ナトリウムが好適に用いる事ができる。また架橋剤としてジビニルベンゼン、３－メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３－アクリロキシプロピルトリメトキシシランなどを加えることでコア構造１の強度を上げることができる。乳化重合で得たコア構造１を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
　図１中におけるシェル構造２を形成する工程は、３官能あるいは４官能のシランを加水分解することで形成できる。具体的には、シェル構造２はトリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランなどを原料に加水分解を行うことで得ることができる。これらのシランで構成する群から選択される少なくとも１種をもちいればよく、複数のシランを混合して用いてもよい。しかし、後のベタイン構造を粒子表面に結合させる工程において、チオール基、アミノ基が、シェル構造２の表面に存在させる必要がある。そのため、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランなど、チオール基、アミノ基を含むシランを少なくとも１種類含む原料を用いる事が好ましい。コア構造１を高いｐＨの水溶媒に分散した液に前記シランを導入し加水分解を行う。液中のｐＨは１１以上であることが好ましい。酸性条件下で行うと、形成したシェル２のゼータ電位が低くなり、凝集する可能性がある。高いｐＨの液中で導入したシランの加水分解の速度を上げてコア構造１の表面に析出するようにすると、均一なシェル構造２を得ることができる。この時、反応温度を条件に応じて６０度～８０度の間で制御するとよい。また、加水分解の速度が速すぎる場合は、アルコールなどの溶媒を添加しても良い。反応後、得られた粒子材料を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
　前記表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレート乃至メタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程とで得られる。
　図１におけるシェル構造２の表面にベタイン構造を結合させる工程は、マイケル付加反応を用いて行うことが好ましい。マイケル付加反応は、不飽和エステル・ケトン・ニトリルなどの電子不足アルケンに、炭素もしくはヘテロ原子求核剤を１，４‐付加させる反応である。具体的には、シェル構造２の表面に存在するチオール基に、ベタイン構造を有するアクリレート、乃至メタクリレートを液中で反応させることで、ベタイン構造を、シェル構造２の表面に結合させることができる。反応は有機溶媒や水溶媒などを用いる事が出来る。溶媒の極性が高い方が、マイケル付加反応が早く進むので、水やメタノール、エタノールなどを用いる事が好ましい。更に、作製したコア－シェル構造の粒子を安定に分散させる事を考慮すると、水溶媒である事が好ましい。水溶媒中のマイケル付加反応は無触媒でも進行するが、アミンなどの触媒を用いる方が好ましい。触媒には、トリエチルアミン、ヘキシルアミン、ジメチルエチレンジアミンなどを用いる事が好ましい。マイケル付加反応は１２時間くらい常温で溶液を撹拌すると完了する。反応後、得られた粒子材料を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
　本実施形態に係る粒子に各種の抗体を結合させることで、ラテックス凝集法用の検体検査粒子として利用することができる。シェル構造２に存在する官能基を利用して目的の抗体を結合させるための最適な手法を選択すればよい。たとえばチオール基にはマレイミドを反応させて抗体を結合させることができる。
　（表面処理方法）
　本実施形態に係る粒子は、担体の表面の処理に用いることが出来る。本実施形態における表面処理方法は、以下の工程を有する。
　チオール基あるいはアミノ基を有するシリコンアルコキシドを用いて担体の表面にシリカ層を設ける工程。
　担体の表面上に存在するチオール基あるいはアミノ基にベタイン構造を有するアクリレートまたはメタクリレートをマイケル付加反応により結合をさせる工程。なお、ベタイン構造を有する分子はシリカ層に結合する。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
　（１）コア構造１－１の作製
　乳化重合法にてコア構造１－１を作製した。丸底四ツ口のセパラブルフラスコに純水９００ｇ、スチレンモノマー５６ｇ（キシダ化学製）、パラスチレンスルホン酸ナトリウム０．１６５ｇ（東京化成製）を加え、メカニカルスターラーを用いて窒素バブリングをしながら３０分間撹拌した。オイルバスにて試料を撹拌した状態のまま７０度まで加熱した後、触媒の過硫酸カリウム３．６ｇ（シグマ－アルドリッチ社製）を加え窒素雰囲気にて８時間スチレンの重合反応を行った。試料を冷却した後、遠心分離にて沈殿物を回収し、純水を用いて生成物の洗浄を行った。得られた試料は純水に分散しコア構造１－１のスラリーを得た。コア構造１－１は電子顕微鏡で粒子径と粒度分布を測定した結果、直径２１０ｎｍ、粒度分布の変動係数が３％であった。
　（２）コア構造１－２の作製
　乳化重合法にてコア構造１－２を作製した。丸底四ツ口のセパラブルフラスコにｐＨ７．４のリン酸緩衝液１５０ｇ（キシダ化学製）、スチレンモノマー７．５ｇ（キシダ化学製）、３－メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン２．５ｇ（信越化学製）、ポリビニルピロリドンＫ－３００．５ｇ（東京化成製、分子量４００００）を加えた。得られた溶液を、メカニカルスターラーを用いて窒素バブリングをしながら３０分間撹拌した。オイルバスにて試料を撹拌した状態のまま７０度まで加熱した後、触媒の過硫酸カリウム０．４ｇ（シグマ－アルドリッチ社製）を加え窒素雰囲気にて７時間スチレンの重合反応を行った。試料を冷却した後、遠心分離にて沈殿物を回収し、純水を用いて生成物の洗浄を行った。得られた試料は純水に分散しコア構造１－２のスラリーを得た。コア構造１－２は電子顕微鏡で粒子径と粒度分布を測定した結果、直径２１９ｎｍ、粒度分布の変動係数が２．４％であった。
　（３）シェル構造２の形成
　遠心分離によって回収したスラリー状のコア構造１－１、あるいは１－２を純水で０．５ｗｔ％に希釈した。希釈した液に２８ｗｔ％アンモニア水を溶液の５ｗｔ％（キシダ化学製）加えてｐＨ１１．７の分散液を調整した。常温にて３０分間撹拌後、メルカプトプロピルトリメトキシシランを溶液中の固形分に対して１０ｗｔ％（東京化成製）投入した。１０時間撹拌した後、反応液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）、純水に再分散してコア－シェル構造体を得た。コア－シェル構造体は水分計（エーアンドディー社製：ＭＸ－５０）にて秤量した。
　（４）シェル構造２の表面へのベタイン構造を有する分子の結合
　生成したコア－シェル構造体の分散液を純水で１．０ｗｔ％に希釈した。希釈した分散液にベタイン構造を有するメタクリレートを溶液に対して１．０ｗｔ％添加し、ジメチルエチレンジアミンを触媒量（東京化成製）加えて室温にて１４時間撹拌した。撹拌後の反応液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）した後、純水に再分散して生成物を得た。生成物は水分計（エーアンドディー社製：ＭＸ－５０）にて秤量した後、純水にて希釈して０．１ｗｔ％に調整した。
　（５）シェル構造２の評価
　得た粒子材料の分散液を揮発・乾固させて固形分を走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー社製：Ｓ－５５００）で観察した。生成した粒子材料を、少なくとも１５０個以上観察して平均、標準偏差、変動係数を求めた。同様に求めていたコア構造１の直径を、得た粒子材料の直径から差し引き、シェル構造２の厚さの合計値を求めた。
　（６）生成物の沈降性の評価
　得た粒子材料の０．１ｗｔ％の分散液を、１週間常温にて放置し、観察した。放置前後で凝集や沈降がないことを目視にて観察した。
　（７）生成物の非特異吸着抑制能の評価（乳び試験）
　生成物の非特異吸着抑制能は乳びを用いて評価した。乳びは、血清中の成分において、ラテックス粒子に対して非特異吸着を強く起こし、粒子の凝集を引き起こす要因になる物質である。乳びは干渉チェックＡ（シスメックス製）のキットに含まれる試薬を用いた。乳びの分散液０．８μＬと、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（エチレンジアミン四酢酸、ＴＷＥＥＮ２０、牛血清アルブミン、塩化ナトリウム含有）１２０μＬを混合した液に、生成した０．１ｗｔ％の粒子材料の分散液を６０μＬ添加した。その後、すぐに紫外可視吸収スペクトル（ＧＥＮＥＱＵＡＮＴ　１３００）を測定した。測定後の試料を３７度の湯浴に５分間浸した後、再び紫外可視吸収スペクトルを測定した。５分間のエージング前後での波長５７２ｎｍの吸光度の変化を測定し、分散液中の粒子の凝集を評価した。この吸光度変化が０．１未満の試料は非特異吸着能が抑制できているものと評価した。０．１未満という変化は、実際のラテックス凝集法による測定に対して、バックグラウンドの変動の最大許容値であり、０．０１以下である事が好ましい。
　（８）散乱強度の定量
　乳びによる非特異吸着抑制能の評価と同様の方法で、散乱強度を測定した。散乱強度は吸光度の大きさに置き換えて評価した。つまり、吸光度が１．０以上の試料であれば、充分な散乱強度を有し、ラテックス凝集法の実機測定でも検出ができるものとみなした。
　（９）チオール基の定量
　ＡｍｐｌｉｔｅＴＭ　Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｔｏｔａｌ　Ｔｈｉｏｌ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，　Ｉｎｃ．社製）を用いて、生成した粒子材料のチオール基表面密度の定量を行った。ＢｉｏＴｅｋ社製プレートリーダーと９６ｗｅｌｌ黒マイクロプレート（測定量１００ｍＬ）を用いて、蛍光（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）測定した。サンプルの分散液中の粒子の濃度は１ｍｇ／ｍＬで固定し測定を行った。検量線は、ＧＳＨバッファー（０．０１４ｍＭ～１０ｍＭ）を標準液として作成した。
　（実施例１）
　コア構造１－１を用いて作製したコア－シェル構造体の分散液に、３－［［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）を添加して生成物を得た。
　（実施例２）
　コア構造１－１を用いて作製したコア－シェル構造体の分散液に、３－［［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホナトプロピル）－２－（メタクリロイルオキシ）エタン－１－アミニウム（シグマーアルドリッチ製）を重量比１：１の割合で添加して生成物を得た。
　（実施例３）
　コア構造１－１を用いて作製したコア－シェル構造体の分散液に、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホナトプロピル）－２－（メタクリロイルオキシ）エタン－１－アミニウム（シグマ－アルドリッチ製））を添加して生成物を得た。
　（実施例４）
　コア構造１－２を用いて作製したコア－シェル構造体の分散液に、３－［［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート（東京化成製）を添加して生成物を得た。
　（比較例１）
　直径１８８ｎｍの市販のラテックス粒子（イムテックス、ＪＳＲ社製）を０．１ｗｔ％に純水で希釈して用いた。
　（比較例２）
　コア構造１－１のスラリー（４２．５ｗｔ％）の濃度を調整して０．１ｗｔ％の分散液とした。
　（比較例３）
　コア構造１－１を用いて作製したコア－シェル構造体の分散液を０．１ｗｔ％に調整した。
　（比較例４）
　シリカ粒子（ＱＵＡＲＴＺ　ＤＯＴ（登録商標）：古河電工アドバンスドエンジニアリング製）をそのまま用いた。
　（比較例５）
　コア構造１－１の粒子のスラリーを希釈し、アンモニア水を加えてｐＨを１１に調整して０．５ｗｔ％の分散液を作製した。作製した分散液を３０分間撹拌した後、ビニルトリメトキシシラン（東京化成製）を液中の固形分に対して１０ｗｔ％添加し、１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ約７の分散液を得た。得た分散液にＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホナトプロピル）－２－（メタクリロイルオキシ）エタン－１－アミニウム（シグマ－アルドリッチ製）を、重量比で分散液中の固形分の１０倍量を添加した。続いて、窒素雰囲気、７０℃の条件下で重合開始剤（Ｖ－５０：和光純薬製）を触媒量用いて粒子の表面にベタインポリマーを付与した。得られた構造体の分散液を洗浄した後、０．１ｗｔ％に調整した。
　（性能評価）
　実施例および比較例の粒子材料の構造と物性を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１中におけるコア構造の直径およびシェル構造の厚さは電子顕微鏡による観察より求めた値である。
　表１中における表面に存在する官能基は、記載した官能基の他に、実施例１、２、３、４および比較例３、４、５にはシラノールが存在する。
　表１中における表面に存在する官能基において、スルホベタインの記載はスルホン酸を有するベタイン構造を意味している。
　表１中における表面に存在する官能基において、カルボキシベタインの記載はカルボン酸を有するベタイン構造を意味している。
　作製した材料を電子顕微鏡で観察したところ、均一な粒子表面を形成していた。また、変動係数は、比較例４以外は約５％以下であり、粒度分布が極めて揃った状態の粒子である事を確認した。比較例４の粒子の変動係数は１３．７％であった。更に比較例４は一晩静置しただけでも凝集し沈降してきた。よって、比較例４の粒子材料はラテックス凝集法用の抗体検査粒子には不適である。
　シェル構造を被覆した粒子において、シェル構造２の厚さは、７～１０ｎｍであった。このシェル構造の有無は、沈降性評価の結果、粒子の沈降性に影響を及ぼさないことを確認した。沈降性はチオール基のみが表面に存在する比較例３およびコア構造がシリカで構成されている比較例４で不安定であり、沈降を確認した。この結果は、シェル構造２が存在することで、増加した生成物の比重は粒子の分散状態に影響を与えない程度である事と、沈降の原因はチオール基が酸化し、ジスルフィド結合を作る事が影響していると考えられる。つまり、チオール基の一部を親水性のベタイン構造に置換した実施例１、２、３、４および比較例５の分散液は沈降せずに安定であり、ベタイン構造が粒子の分散性に効果的である事を示している。
　非特異吸着抑制能を比較した結果を表１に示す。粒子表面にベタイン構造が存在する実施例１、２、３、４および比較例５では、乳び試験前後の吸光度の変化がそれぞれ、０．００３、０．０３１、０．００２、０．００９および０．０００となり、ほとんど変動がないことを確認した。一方、比較例では、吸光度変化が０．４以上と大きく、このままの状態の粒子ではラテックス凝集法で用いる事が出来ないことを確認した。
　散乱強度評価の結果、実施例は、１．２以上であったのに対して、比較例５の散乱強度は０．８と低い事が判明した。同じ濃度、同じ粒子サイズの実施例などと比較して小さくなってしまうのは、粒子表面に形成したベタインポリマー層が光散乱を抑制する干渉層として働いたためであると考えられる。
　（実施例の粒子への抗体結合と抗原抗体反応）
　実施例１、２、３の粒子のチオール基に、抗ＣＲＰ抗体を結合した。
　チオール反応性の抗体を得るために、抗ＣＲＰ抗体溶液にＥＭＣＳ（Ｎ－（６－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を加えて、抗体にマレイミド基を導入した。
　ポリマー微粒子分散液を、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）、１５分間、遠心して微粒子を沈殿させた。上清を除去した後、微粒子のペレットを、緩衝液で再分散させ、これにあらかじめマレイミド化した抗ＣＲＰ抗体を加えた。室温、１８０分間撹拌した後、遠心分離によって、粒子を回収した。粒子を、緩衝液で十分に洗浄して、抗ＣＲＰ抗体が結合した微粒子を得た。抗体が結合していることは、抗体を加えた緩衝液中の抗体濃度の減少量をＢＣＡアッセイで測定することで確認した。粒子１個あたり、抗体が約２００個結合していることが分かった。
　抗体を結合した粒子でラテックス凝集反応を行った。ヒト血清由来ＣＲＰ（シグマアルドリッチ、）とポリマー微粒子分散液とを混合して、混合前後での波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定した。微粒子上の抗ＣＲＰ抗体が抗原であるＣＲＰを捕捉できれば、ＣＲＰを介した微粒子同士の凝集反応が起こる。この時、透過率の減少が生じる結果、吸光度の上昇が観測される。抗体を結合した微粒子を含む溶液にＣＲＰを添加したとき（ＣＲＰ添加あり）、ならびにＣＲＰを添加しなかったとき（ＣＲＰ添加なし）について、反応温度３７℃、反応時間５分間の吸光度変化率は１．４～８．４％となった。この結果より、本発明の実施例に係る粒子を用いると、抗原抗体反応をラテックス凝集法で検出出来る事が示された。
　以上のことから、本実施例に粒子材料は、非特異吸着能を有する表面特性かつ、沈降がすくない物性を兼ね揃えた材料であることが明らかとなった。その結果、ラテックス凝集法用の抗体検査薬として優れた性能を示すことがわかった。
　上記の通り、本発明に係る粒子によれば、非特異吸着の抑制能に優れ、かつ、沈降しにくい。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０１８年４月２７日提出の日本国特許出願特願２０１８－０８７５１５を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
 

Claims (26)

  1. 　ポリマーを含むコア構造と、
    　シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、
    　前記シェル構造は、
    　前記シリカのシリル基に、下記式（１）で示される分子が結合した構造と、
    　前記シリカのシリル基に、下記式（２）で示される分子が結合した構造と、
    　を有する粒子、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    　上記式（１）において、
    　＊１は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表す。
    　Ｒ１は、（ＣＨ２）ａ－Ｓ、あるいは（ＣＨ２）ｂ－ＮＨを表しａ、ｂは、各々独立に１から５の整数を表す）、
    　Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を表し、
    　Ｒ３は、ベタイン構造を有する官能基を表し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    　上記式（２）において、
    　＊２は、前記シリル基のＳｉに結合する結合位置を表し、
    　Ｌ１は、（ＣＨ２）ｘ（ｘは０から５のいずれかの整数）であり、Ｌ２は、ＮＨ－ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ（ｎは１から３０のいずれかの整数）のうち少なくともいずれか１つを含む２価の基、または直接結合であり、
    　Ｌ３は（ＣＨ２）ｙ（ｙは０から５のいずれかの整数）であり、Ｒ４は、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかを表す。
  2. 　前記式（２）において、前記Ｌ２が直接結合であり、前記Ｌ３におけるｙが０である請求項１に記載の粒子。
  3. 　前記式（２）において、前記Ｌ２が（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎであり、前記ｎが１から２０のいずれかの整数である請求項１に記載の粒子。
  4. 　前記ベタイン構造を有する官能基が、４級アンモニウム、スルホニウム、及びホスホニウムのいずれかと、及びスルホン酸、カルボン酸、及びホスホン酸のいずれかと、を有する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の粒子。
  5. 　前記ベタイン構造を有する官能基の分子量が２０００以下である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の粒子。
  6. 　前記ベタイン構造を有する官能基の分子量が１０００以下である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の粒子。
  7. 　前記式（１）で表される分子が、下記式（１－ｉ）で表される請求項１に記載の粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  8. 　前記式（２）で表される分子が、下記式（２－ｉ）で表される請求項１または２に記載の粒子、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    　上記式（２－ｉ）において、Ｒ４はＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、及びグリシジル基のいずれかを表す。
  9. 　前記ポリマーがポリスチレンである、
    　請求項１乃至８のいずれか１項に記載の粒子。
  10. 　請求項１乃至９のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子を分散させる分散媒とを有する分散液。
  11. 　前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である請求項１０に記載の分散液。
  12. 　前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下である請求項１０または１１に記載の分散液。
  13. 　前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が５％以下である請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の分散液。
  14. 　前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が３％以下である請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の分散液。
  15. 　請求項１及至９のいずれか１項に記載の粒子と、前記Ｒ４に結合したリガンドと、を有するアフィニティー粒子。
  16. 　前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項１５に記載のアフィニティー粒子。
  17. 　請求項１５または１６に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒と、を有することを特徴とする体外診断用の検査試薬。
  18. 　前記リガンドが抗体または抗原であり、ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いられる請求項１７に記載の検査試薬。
  19. 　請求項１７または１８に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有することを特徴とする体外診断用の検査キット。
  20. 　検体中の標的物質の検出方法であって、
    　請求項１７または１８に記載の検査試薬に、検体を混合する工程を有することを特徴とする検出方法。
  21. 　ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、
    　請求項１７または１８に記載の検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、
    　前記混合液に、光を照射する工程と、
    　前記混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程と、
    　を有することを特徴とする検出方法。
  22. 　ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）と、
    　前記溶液に、ビニル基と、及びチオール基またはアミノ基と、を有するシランを添加して加水分解することで、前記コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア－シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）と、
    　前記粒子における前記チオール基またはアミノ基に、ビニル基とベタイン構造を有する分子を結合させる工程（工程３）と、
    　を有する粒子の製造方法。
  23. 　前記ビニル基を有するモノマーがスチレンである請求項２２に記載の粒子の製造方法。
  24. 　ビニル基を有するシランが、トリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種である請求項２２または２３に記載の粒子の製造方法。
  25. 　粒子にリガンドを結合する工程をさらに有する請求項２２乃至２４のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
  26. 　前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項２５に記載の粒子の製造方法。
     
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005154514A (ja) * 2003-11-21 2005-06-16 Univ Waseda 機能性生分解性材料およびその製造方法
JP2008298505A (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Jsr Corp 標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬
JP2012513963A (ja) * 2008-12-29 2012-06-21 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 診断イメージング用のナノ粒子造影剤
JP2013139506A (ja) * 2011-12-29 2013-07-18 Nippon Zeon Co Ltd コアシェル型粒子の製造方法
JP2014153057A (ja) * 2013-02-04 2014-08-25 Furukawa Electric Co Ltd:The 標識抗体の製造方法
JP2016501286A (ja) * 2012-11-16 2016-01-18 エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーショ コード化された高分子微粒子
JP2016180716A (ja) * 2015-03-25 2016-10-13 住友ベークライト株式会社 アフィニティビーズ

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005154514A (ja) * 2003-11-21 2005-06-16 Univ Waseda 機能性生分解性材料およびその製造方法
JP2008298505A (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Jsr Corp 標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬
JP2012513963A (ja) * 2008-12-29 2012-06-21 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 診断イメージング用のナノ粒子造影剤
JP2013139506A (ja) * 2011-12-29 2013-07-18 Nippon Zeon Co Ltd コアシェル型粒子の製造方法
JP2016501286A (ja) * 2012-11-16 2016-01-18 エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーショ コード化された高分子微粒子
JP2014153057A (ja) * 2013-02-04 2014-08-25 Furukawa Electric Co Ltd:The 標識抗体の製造方法
JP2016180716A (ja) * 2015-03-25 2016-10-13 住友ベークライト株式会社 アフィニティビーズ

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021075426A1 (ja) * 2019-10-15 2021-04-22 キヤノン株式会社 粒子、及び粒子の製造方法

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