JP2023126848A - 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む試薬及びキット、並びに標的物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】非特異吸着を抑制する能力が高く、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための官能基を有する粒子、及び、この粒子を高収率で製造するための新規手法を提供する。【解決手段】側鎖に、スルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bと、を有する共重合体を含み構成され、非特異吸着が抑制される粒子。【選択図】なし
Description
本発明は、粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む検査試薬及び検査キット、並びに標的物質の検出方法に関する。
近年、標的物質に対して親和性を有するリガンドと粒子が化学結合して成るアフィニティー粒子を使用して、標的物質を精製したり、定量したりする研究が広く行われている。このような目的に使用される粒子には、標的物質以外の物質と吸着する特性、いわゆる非特異吸着性が小さいことが望まれる。例えば、非特許文献1では、スチレンとグリシジルメタクリレートの両モノマーを用い、乳化重合によって表面がポリグリシジルメタクリレートで被覆された樹脂粒子(以下、SG粒子)が開示されている。また、特許文献1(特開2014-193972号公報)では、SG粒子の粒径制御方法が開示されている。
SG粒子は、ポリグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基が一部開環してグリコールとなっており、このグリコールの親水性に起因して非特異吸着が抑制される。一方、SG粒子表面にリガンドを化学結合する場合、ポリグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をそのまま利用することも可能である。しかし、通常は、エポキシ基をカルボキシル基、アミノ基、チオール基等の別の反応性官能基に変換する工程を経た後、この反応性官能基とリガンドを化学反応させる方法が一般的である。中でもSG粒子のエポキシ基をカルボキシル基に変換した粒子が、粒子表面にリガンドを化学結合する上で汎用性があり、好ましい形態である。
また、近年、簡易・迅速な免疫検査方法として、免疫ラテックス凝集測定法が注目されている。この方法では、リガンドとして抗体あるいは抗原を化学結合して成る粒子の分散液と、標的物質(抗原あるいは抗体)を含有する可能性のある検体とを混合する。この時、検体中に標的物質(抗体あるいは抗原)が含有されていれば、粒子が凝集反応を生じるため、この凝集反応を、散乱光強度、透過光強度、吸光度等の変化量として光学的に検出することで病気の有無を特定できる。免疫ラテックス凝集測定法に用いられる粒子は、欺様性なノイズを低減することを目的として、SG粒子のように、非特的吸着性が小さく、リガンドを固定化するための反応性官能基を有することが好ましい。
アフィニティーラテックスを用いたバイオセパレーション(1995)p11-p30
本発明者等は、非特許文献1(アフィニティーラテックスを用いたバイオセパレーション(1995)p11-p30)に従ってSG粒子を合成し、さらにSG粒子の有するグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にアミノ酸を化学反応させ、前記エポキシ基をカルボキシル基に変換した粒子を得た。しかし、このようにして得た粒子は非特異吸着を抑制する能力がSG粒子よりも悪化した。一方、SG粒子にカルボキシル基を導入する方法が知られている。これはSG粒子をアンモニア水で処理した後、エチレングリコールジグリシジルエーテルと化学反応させ、さらに、前記エチレングリコールジグリシジルエーテル由来のエポキシ基とアミノ酸を化学反応させることで得る。このようにして得た粒子は非特異吸着を抑制するが、過剰な分散安定性を呈するため、粒子同士が凝集しにくく、免疫ラテックス凝集法に用いた場合には、十分な感度が得られない場合があった。また、化学反応の工程が多段階な上、煩雑であり、工業化に適さない点も課題である。
本発明は、これらの背景技術、及び、課題を鑑みてなされたものである。具体的には、本発明の目的は、非特異吸着を抑制する能力が高く、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための反応性官能基を有する粒子を提供することである。そして、この粒子を簡易、且つ、高収率で製造するための新規手法を提供することを目的とする。
本発明に係る粒子は、側鎖に、スルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bとを有する共重合体を含み構成され、前記水酸基を表面に配することで非特異吸着が抑制されることを特徴とする。
また、本発明に係る粒子の製造方法は、
グリシジル(メタ)アクリレートと、スチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートと、水と、ラジカル重合開始剤とを混合して粒状の共重合体を形成させ、前記粒状の共重合体の水分散液を得る工程(工程1)と、
前記水分散液と、チオール基を有するラジカル重合性モノマーとを混合して混合液を調製し、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、前記チオール基を反応させる工程(工程2)と、を有することを特徴とする。
また、本発明に係る粒子の製造方法は、
グリシジル(メタ)アクリレートと、スチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートと、水と、ラジカル重合開始剤とを混合して粒状の共重合体を形成させ、前記粒状の共重合体の水分散液を得る工程(工程1)と、
前記水分散液と、チオール基を有するラジカル重合性モノマーとを混合して混合液を調製し、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、前記チオール基を反応させる工程(工程2)と、を有することを特徴とする。
本発明によれば、非特異吸着を抑制する能力に優れ、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための官能基を有する粒子、及び、この粒子を簡易、且つ、高収率で製造するための新規手法を提供することができる。
以下、本発明の実施形態について詳しく説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施形態に限定されない。
(粒子)
本発明の実施形態に係る粒子について説明する。
本発明の実施形態に係る粒子について説明する。
本実施形態に係る粒子は、側鎖に、スルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bとを有する共重合を含み構成される。主に、粒子の表面に存在する水酸基により非特異吸着が抑制される。本実施形態に係る粒子は、3つ以上の水酸基を有することで粒子の親水性が非常に高くなり、非特異吸着を抑制する能力が高い。
(反応性官能基)
本実施形態に係る反応性官能基は、リガンドと結合(例えば、化学結合)するためのものであり、本発明の目的を達成可能な範囲において特に制限されない。例えば、本実施形態における反応性官能基の例として、アミノ基、チオール基、活性エステル基、カルボキシル基等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。汎用面や官能基の安定性を考慮すると、本実施形態における反応性官能基はカルボキシル基であることが好ましい。
本実施形態に係る反応性官能基は、リガンドと結合(例えば、化学結合)するためのものであり、本発明の目的を達成可能な範囲において特に制限されない。例えば、本実施形態における反応性官能基の例として、アミノ基、チオール基、活性エステル基、カルボキシル基等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。汎用面や官能基の安定性を考慮すると、本実施形態における反応性官能基はカルボキシル基であることが好ましい。
本実施形態における繰り返し単位Bが有する反応性官能基がカルボキシル基であり、繰り返し単位Bが2つ以上のカルボキシル基を有することが好ましい。側鎖に2つ以上のカルボキシル基を有することにより、リガンドとの反応効率に優れる。また、このようにカルボキシル基同士が極めて近傍に存在する場合、互いに相互作用して解離を抑制し合い、粒子の分散安定性がほどよく不安定化するため、免疫ラテックス凝集測定法に用いると、標的物質を高感度で検出するのに有利である。
(繰り返し単位B)
さらに、本実施形態における「繰り返し単位B」は下記一般式(2)で示される化学構造であることが好ましい。一般式(2)において、R2はH(水素)あるいはCH3(メチル基)、L4及至L6は、互いに独立に、直接結合、及び炭素数1から3のアルキレン基のいずれかを表す。また、Xは、S(スルフィド基)またはNH(2級アミン)のいずれかを表す。本実施形態における一般式(2)が、下記式(2-i)で示されることがより好ましい。式(2-i)において、R4はH(水素)あるいはCH3(メチル基)であり、XはS(スルフィド基)またはNH(2級アミン)である。本実施形態における繰り返し単位Bがこのような化学構造を有する時、上述したカルボキシル基同士の相互作用が最も顕著になる。
さらに、本実施形態における「繰り返し単位B」は下記一般式(2)で示される化学構造であることが好ましい。一般式(2)において、R2はH(水素)あるいはCH3(メチル基)、L4及至L6は、互いに独立に、直接結合、及び炭素数1から3のアルキレン基のいずれかを表す。また、Xは、S(スルフィド基)またはNH(2級アミン)のいずれかを表す。本実施形態における一般式(2)が、下記式(2-i)で示されることがより好ましい。式(2-i)において、R4はH(水素)あるいはCH3(メチル基)であり、XはS(スルフィド基)またはNH(2級アミン)である。本実施形態における繰り返し単位Bがこのような化学構造を有する時、上述したカルボキシル基同士の相互作用が最も顕著になる。
(繰り返し単位A)
本実施形態における粒子は、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aを有することを特徴とする。繰り返し単位Aの化学構造は、本発明の目的を達成可能な範囲において、特に限定されないが、下記一般式(1)で表される化学構造であることが好ましい。一般式(1)において、R1はH(水素)あるいはCH3(メチル基)で表され、L1及至L3は、互いに独立に、直接結合、及び炭素数1から3のアルキレン基のいずれかを表す。繰り返し単位Aが一般式(1)で表される化学構造である場合、SG粒子のグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を開環して得られる化学構造よりも親水性において劣る。しかし、非特異吸着を抑制する能力においては、同等あるいはそれ以上であることが、本発明者等の検討から明らかになっている。本実施形態において、下記一般式(1)が、下記式(1-i)で示されることが特に好ましい。式(1-i)において、R3は、HあるいはCH3で表され、Xは、SまたはNHで表される。
本実施形態における粒子は、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aを有することを特徴とする。繰り返し単位Aの化学構造は、本発明の目的を達成可能な範囲において、特に限定されないが、下記一般式(1)で表される化学構造であることが好ましい。一般式(1)において、R1はH(水素)あるいはCH3(メチル基)で表され、L1及至L3は、互いに独立に、直接結合、及び炭素数1から3のアルキレン基のいずれかを表す。繰り返し単位Aが一般式(1)で表される化学構造である場合、SG粒子のグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を開環して得られる化学構造よりも親水性において劣る。しかし、非特異吸着を抑制する能力においては、同等あるいはそれ以上であることが、本発明者等の検討から明らかになっている。本実施形態において、下記一般式(1)が、下記式(1-i)で示されることが特に好ましい。式(1-i)において、R3は、HあるいはCH3で表され、Xは、SまたはNHで表される。
本実施形態における粒子は、繰り返し単位Aが式(1-i)、繰り返し単位Bが式(2-i)で表される場合に最も、非特異吸着が抑制され、リガンドとの反応効率にも優れる。さらに粒子の分散安定性も免疫ラテックス凝集測定法に用いる際に過不足のない形態となる。「繰り返し単位A」/「繰り返し単位B」は1以上30以下(mоl分率)が好ましく、より好ましくは、2以上20以下(mоl分率)である。1(mоl分率)未満の場合、粒子中の反応性官能基の割合が過多であり、必要以上に粒子の分散安定性を損ねる可能性がある。また、粒子の反応性官能基とリガンドを化学結合させた場合に、未反応の反応性官能基がリガンドと相互作用し、リガンドを変性させてしまう可能性がある。また、30より大きい場合、粒子の反応性官能基とリガンドの化学反応における反応効率が十分でない場合がある。
(繰り返し単位C)
本実施形態における粒子は、側鎖にスルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bに加える。更に疎水性の繰り返し単位Cを有する共重合体を含み構成されることが好ましい。前記共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Cを有することにより、繰り返し単位Aと繰り返し単位Bのみの共重体から成る粒子よりも、物理的に強固になり、遠心操作を繰り返しても割れや欠けが少ない。
本実施形態における粒子は、側鎖にスルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bに加える。更に疎水性の繰り返し単位Cを有する共重合体を含み構成されることが好ましい。前記共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Cを有することにより、繰り返し単位Aと繰り返し単位Bのみの共重体から成る粒子よりも、物理的に強固になり、遠心操作を繰り返しても割れや欠けが少ない。
本実施形態における疎水性の繰り返し単位Cは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されないが、好ましくはスチレン類、(メタ)アクリレート類に由来する群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。すなわち、スチレン類の重合体を構成する繰り返し単位、及び(メタ)アクリレート類の重合体を構成する繰り返し単位から選択される少なくとも一種であることが好ましい。なお、繰り返し単位Cがスチレン、或いは、メチルメタクリレート、或いはその両方に由来する場合、繰り返し単位Cのガラス転移温度が高く、粒子が十分な強度を有するため好ましい。以下、本実施形態における「繰り返し単位C」に用いることのできるスチレン類、及び、(メタ)アクリレート類を例示するが、本実施形態における「繰り返し単位C」はこれらに限定されない。また、疎水性の「繰り返し単位C」は2種以上の油性ラジカル重合性単量体を用いても良い。
スチレン類:スチレン、α-メチルスチレン、β-メチルスチレン、o-メチルスチレン、m-メチルスチレン、p-メチルスチレン、2,4-ジメチルスチレン、p-n-ブチルスチレン、p-tert-ブチルスチレン、p-n-ヘキシルスチレン、p-n-オクチルスチレン、p-n-ノニルスチレン、p-n-デシルスチレン、p-n-ドデシルスチレン、p-メトキシスチレン、及び、p-フェニルスチレン等。
(メタ)アクリレート類:メチルアクリレート、エチルアクリレート、n-プロピルアクリレート、iso-プロピルアクリレート、n-ブチルアクリレート、iso-ブチルアクリレート、tert-ブチルアクリレート、n-アミルアクリレート、n-ヘキシルアクリレート、2-エチルヘキシルアクリレート、n-オクチルアクリレート、n-ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、ベンジルアクリレート、ジメチルフォスフェートエチルアクリレート、ジエチルフォスフェートエチルアクリレート、ジブチルフォスフェートエチルアクリレート、及び、2-ベンゾイルオキシエチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、n-プロピルメタクリレート、iso-プロピルメタクリレート、n-ブチルメタクリレート、iso-ブチルメタクリレート、tert-ブチルメタクリレート、n-アミルメタクリレート、n-ヘキシルメタクリレート、2-エチルヘキシルメタクリレート、n-オクチルメタクリレート、n-ノニルメタクリレート、ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート、及び、ジブチルフォスフェートエチルメタクリレート等。
また、疎水性の繰り返し単位Cを用いる場合、本発明の目的を達成可能な範囲において、繰り返し単位Bとの組成比率は限定されない。好ましくは[「繰り返し単位A」+「繰り返し単位B」]/[「繰り返し単位C」]が、1以上30以下(mоl分率)、好ましくは2以上15以下(mоl分率)、より好ましくは、2以上7以下(mоl分率)である。この好ましい範囲は、粒子が、「繰り返し単位A」に由来する非特異吸着を抑制する能力と、「繰り返し単位B」に由来する反応性官能基とリガンドとの化学反応の反応効率、粒子の強度との関係で決まる数値である。上記関係を満たす場合、粒子の、非特異吸着を抑制する能力と強度のバランスが良い。
(粒径)
本実施形態における粒子の粒径は、水中における個数平均粒子径で0.05μm以上1μm以下、好ましくは0.1μm以上0.5μm以下、より好ましくは0.15μm以上0.3μm以下である。0.15μm以上0.3μm以下である場合、遠心操作におけるハンドリング性に優れ、且つ、粒子の特徴である非表面積の大きさが際立つ。本実施形態における粒子の粒径は、動的光散乱法によって評価されたものである。
本実施形態における粒子の粒径は、水中における個数平均粒子径で0.05μm以上1μm以下、好ましくは0.1μm以上0.5μm以下、より好ましくは0.15μm以上0.3μm以下である。0.15μm以上0.3μm以下である場合、遠心操作におけるハンドリング性に優れ、且つ、粒子の特徴である非表面積の大きさが際立つ。本実施形態における粒子の粒径は、動的光散乱法によって評価されたものである。
(リガンド・アフィニティー粒子)
本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、上記繰り返し単位Aに含まれる(由来する)カルボキシル基に化学結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。
本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、上記繰り返し単位Aに含まれる(由来する)カルボキシル基に化学結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。
本実施形態において、リガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的または特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本実施形態におけるリガンドはこれらに限定されない。核酸としてはデオキシリボ核酸等が挙げられる。本実施形態におけるアフィニティー粒子とは、標的物質に対して選択的または特異的に高い親和性(アフィニティー)を有する。本実施形態におけるリガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることが好ましい。
本実施形態において、本実施形態における粒子が有する「繰り返し単位A」に由来する反応性官能基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。例えば、本実施形態における反応性官能基がカルボキシル基の場合、カルボジイミド媒介性反応やNHSエステル活性化反応は、良く用いられる化学反応の方法である。ただし、本発明における、本実施形態における粒子が有する「繰り返し単位A」に由来するカルボキシル基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法はこれらに限定されない。また、リガンドをアミド結合させる場合は、1-[3-(ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド]等の触媒を適宜用いることができる。
本実施形態におけるアフィニティー粒子が、リガンドとして抗体(抗原)、標的物質として抗原(抗体)を用いる場合、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されている免疫ラテックス凝集測定法に好ましく適用できる。一般的な粒子を免疫ラテックス凝集測定法に適用した場合、標的物質である抗原(抗体)や血清中の異物等が粒子表面に非特異吸着することがある。この非特異吸着に起因して意図しない粒子凝集が検出されてしまい正確な測定の妨げになること(欺様性なノイズの発生)が課題になっている。
そのため、欺様性なノイズを低減することを目的として、通常、アルブミンなどの生物由来物質をブロッキング剤として粒子にコーティングし、粒子表面への非特的吸着を抑制して用いられている。しかし、このような生物由来物質は、ロットによってその特性が少しずつ異なるため、これらによってコーティングされた粒子は、コーティング処理ごとに非特異吸着の抑制能力が異なる。そのため、非特異吸着を抑制する能力が同水準の粒子を安定的に供給することに課題がある。また、粒子表面にコーティングされた生物由来物質は、変性によって疎水性を呈することがあり、必ずしも非特異吸着を抑制する能力に優れるわけではない。また、生物汚染も課題として挙げられる。
特許文献2(特開2014-153140号公報)では、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体をブロッキング剤として粒子にコーティングすることを特徴とする体外診断に用いるアフィニティー粒子を開示している。しかし、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体は、水溶性で、物理的吸着によって粒子表面をコーティングしていることから、本質的に、希釈によって遊離する懸念がある。また、発明者等が非特許文献1に記載の方法で得たSG粒子と、特許文献2に記載の方法で得たポリスチレン粒子に吸着させた粒子の乳ビ中における非特的吸着の抑制能力を評価した。
特許文献2に記載の方法で得た粒子は、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体を、ソープフリー乳化重合によって得た。
その結果、非特許文献1を完全に再現できていない可能性はあるが、SG粒子の方が非特異吸着の抑制能力に優れていた。ここで、SG粒子とは、酸性水溶液中で加熱してグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をグリコールに変換した粒子である。
(体外診断用の検査試薬)
本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、0.001質量%から20質量%が好ましく、0.01質量%から10質量%がより好ましい。本実施形態における試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態におけるアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は2種類以上を組み合わせて含んでも良い。本発明に用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、0.001質量%から20質量%が好ましく、0.01質量%から10質量%がより好ましい。本実施形態における試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態におけるアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は2種類以上を組み合わせて含んでも良い。本発明に用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
(検査キット)
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。
本実施形態におけるキットとしては、本実施形態における試薬(以下、試薬1)に加えて、アルブミンを含有する反応緩衝液(以下、試薬2)を更にそなえるものが好ましい。前記アルブミンとしては血清アルブミン等が挙げられ、プロテアーゼ処理されたものでも良い。試薬2に含有されるアルブミンの量は、0.001質量%から5質量%を目安とするが、本実施形態におけるキットはこれに限定されない。試薬1と試薬2の両方、或いは何れか一方に、ラテックス凝集測定用増感剤を含有させても良い。ラテックス凝集測定用増感剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本実施形態におけるキットは、試薬1、試薬2に加え、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。本実施形態におけるキットは、通常の体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本実施形態に係る標的物質の検出方法に使用できる。また、従来公知の方法によって標的物質の濃度も測定することができ、特に、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出に用いることが好適である。
(検出方法)
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する。また、本実施形態におけるアフィニティー粒子と検体との混合は、pH3.0からpH11.0の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は20℃から50℃の範囲であり、混合時間は1分から20分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態における検出方法における本実施形態におけるアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは0・001質量%から5質量%、より好ましくは0.01質量%から1質量%である。本実施形態における検出方法は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。前記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する。また、本実施形態におけるアフィニティー粒子と検体との混合は、pH3.0からpH11.0の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は20℃から50℃の範囲であり、混合時間は1分から20分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態における検出方法における本実施形態におけるアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは0・001質量%から5質量%、より好ましくは0.01質量%から1質量%である。本実施形態における検出方法は、本実施形態におけるアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。前記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
(粒子の製造方法)
本実施形態に係る粒子の製造方法は、以下の工程を有する。
本実施形態に係る粒子の製造方法は、以下の工程を有する。
グリシジル(メタ)アクリレートと、スチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートと、水と、ラジカル重合開始剤とを混合して粒状の共重合体を形成させ、前記粒状の共重合体の水分散液を得る工程(工程1)。
前記水分散液と、チオール基を有するラジカル重合性モノマーとを混合して混合液を調製し、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、前記チオール基を反応させる工程(工程2)。
前記水分散液と、チオール基を有するラジカル重合性モノマーとを混合して混合液を調製し、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、前記チオール基を反応させる工程(工程2)。
なお、チオール基を有するラジカル重合性単量体が、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール、メルカプトコハク酸、及び3-メルカプトプロピオン酸の少なくともいずれか一つであることが好ましい。
本実施形態に係る粒子の製造方法は好ましくは以下の工程を有する。
グリシジル(メタ)アクリレートとスチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートと水、ラジカル重合開始剤とを混合して粒状の共重合体を形成させ、前記粒状の共重合体の水分散液を得る(工程1)。
前記水分散液と3-メルカプト-1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸を混合して混合液を調製する。そして、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール及びメルカプトコハク酸に由来するチオール基を反応させる(工程2)。
前記水分散液と3-メルカプト-1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸を混合して混合液を調製する。そして、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール及びメルカプトコハク酸に由来するチオール基を反応させる(工程2)。
前記ラジカル重合開始剤が、少なくとも4,4’―Azobis(4-cyanovaleric acid)、2,2’-Azobis[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide、2,2’-Azobis[N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidine]tetrahydrate、2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]disulfate dihydrateの何れかである。
ラジカル重合開始剤は2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]disulfate dihydrate、2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]の何れかであることが好ましい。
前記工程2の混合液が1級アミンを有さない有機塩基を用いてpH0.1以上9.0以下に調製される工程を含むことが好ましい。
本実施形態における粒状の共重合体を形成させる方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、ラジカル重合を用いること以外に限定されない。ラジカル重合の中でも、乳化重合、ソープフリー乳化重合、懸濁重合を用いることが好ましく、乳化重合あるいはソープフリー乳化重合を用いることがより好ましい。さらに好ましくはソープフリー乳化重合を用いることである。一般に、懸濁重合と比較して乳化重合とソープフリー乳化重合は、粒径分布がシャープな粒状の重合体(共重合体)を得ることができる。また、粒子をリガンドと化学結合させる場合、乳化重合で一般的に用いるようなアニオン性界面活性剤が存在すると、リガンドを変性させてしまうことが懸念される。よっと、本実施形態における粒状の重合体を形成させる方法は、ソープフリー乳化重合が最も好ましい。
本実施形態における粒子の製造方法の工程1において、グリシジル(メタ)アクリレートとスチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートに加え、さらに、架橋性ラジカル重合単量体を含むことが好まし。架橋性ラジカル重合単量体を含むことにより、得られる粒状の共重合体が物理的に強固になり、精製時に遠心操作を繰り返しても割れ・欠けする懸念がなくなる。
以下、本発明に用いることのできる架橋性ラジカル重合性単量体の事例を列挙するが、本発明はこれらに限定されない。また、2種類以上の油性ラジカル重合性単量体を用いても良い。例示したラジカル重合性単量体において、理由は明らかでないが、ジビニルベンゼンを用いる場合に、ラジカル重合反応時のハンドリング性に優れ、好ましい。
架橋性ラジカル重合性単量体:ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、1,6-ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、2,2’-ビス(4-(アクリロキシジエトキシ)フェニル)プロパン、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、1,3-ブチレングリコールジメタクリレート、1,6-ヘキサンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、2,2’-ビス(4-(メタクリロキシジエトキシ)フェニル)プロパン、2,2’-ビス(4-(メタクリロキシポリエトキシ)フェニル)プロパン、トリメチロールプロパントリメタクリレート、テトラメチロールメタンテトラメタクリレート、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタリン、及び、ジビニルエーテル等。
本実施形態における粒子の製造方法の工程1において、粒状重合体を形成させる過程で、グリシジル(メタ)アクリレートをさらに混合し、前記粒状の共重合体表面をポリグリシジル(メタ)アクリレートで被覆する工程をさらに含むことが好ましい。
前記ラジカル重合開始剤が、少なくとも4,4’―Azobis(4-cyanovaleric acid)、2,2’-Azobis[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide、2,2’-Azobis[N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidine]tetrahydrate、2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride(V-50(和光純薬株式会社))、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]disulfate dihydrateの何れかであることが好ましい。なぜなら、粒状の共重合体の水分散液を得る工程1において、グリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基を開環させないためである。例えば、ラジカル重合開始剤として過硫酸カリウムを用いる場合、開始剤残基の影響で、ラジカル重合反応場が酸性になり、グリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基が水と反応してグリコールを形成してしまう場合がある。また、ラジカル重合開始剤として過硫酸アンモニウムを用いた場合、グリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基とアンモニアが反応してしまう場合がある。また、ラジカル重合開始剤としてカルボキシル基を有するアニオン性ラジカル重合開始剤を用いた場合、グリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基と重合開始剤由来のカルボキシル基が反応し、粒状の共重合体が凝集する。この凝集を回避するために、ラジカル重合開始剤の10時間半減温度よりもかなり低い温度で粒状の共重合体を形成させる手段も考えられるが、多量のラジカル重合開始剤が必要であることと、ラジカル重合時間が長時間になり、工業化には不向きである。
工程2は、粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基に、グリコール、及び、カルボキシル基を導入する工程である。一般に、エポキシ基は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基と容易に反応するが、水中で反応させる場合、酸性条件ではエポキシ基と水との化学反応が優勢であるため、強塩基条件が選択される。しかし、本実施形態における粒子の製造方法では、粒状の共重合体を得るために、カチオン性のラジカル重合開始剤を用いているため、強塩基条件ではラジカル重合開始剤残基の解離が抑制される。その結果、粒状の共重合体が分散不安定なり、部分凝集が生じる結果、本実施形態における粒子の収率が低下しうる。発明者等は、粒状の重合体のグリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基に、グリコール、及び、カルボキシル基を導入するための試薬として、3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸を用いる手段を提案した。即ち、エポキシ基とチオール基の化学反応は、エポキシ基とアミノ基、あるいはエポキシ基とカルボキシル基の化学反応よりも反応性が高いことを利用し、部分凝集を生じることなく、目的の粒子が得られることを発見した。即ち、ラジカル重合開始剤残基のpka以下pH0.1以上、好ましくはpH9以下pH1以上、さらに好ましくはpH7以下pH3以上の条件で、本実施形態における粒状の共重合体とこれら試薬を混合する。そして、粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基と上記試薬を所定時間接触させ、僅かながらでも粒状の共重合体表面にグリコールとカルボキシル基を導入する。それにより、前記粒状の共重合体のゼータ電位を正から負に反転させた後、工程2の反応場をpH11に再調整することで、ほぼ100%の収率で目的の粒子が得られることを見出した。
本実施形態における粒子の製造方法の工程2において、pH調整に用いる試薬としては1級アミンを有さない有機塩基を用いることが必須である。1級アミンを有する有機塩基を用いる場合、有機塩基そのものが粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレート由来のエポキシ基と化学反応するため好ましくない。また、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の金属塩基を用いてpH調整する場合、粒状の共重合体表面に導入したカルボキシル基が金属塩の構造を呈するため、得られた粒子をリガンドと化学結合する際に反応効率が著しく低下する。本実施形態における1級アミンを有さない有機塩基は、本発明の目的を達成可能な範囲において特に限定しないが、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレン等を用いることが好ましい。有機塩基は2種類以上を併用して用いても良い。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
(実施例1 粒子1の合成)
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替えた。そして、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(和光純薬株式会社)とメルカプトコハク酸(和光純薬株式会社)を溶解させた水溶液(3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸が9:1(mol分率)である。そして、3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量である。トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えて、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した後、200mlフラスコ内容物をトリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持する。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-メルカプト1,2-プロパンジオール由来のチオール基、及び、メルカプトコハク酸由来のチオール基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子1を得た。化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。粒子1は遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子1を評価したところ、個数平均粒径が232nmであった。
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替えた。そして、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(和光純薬株式会社)とメルカプトコハク酸(和光純薬株式会社)を溶解させた水溶液(3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸が9:1(mol分率)である。そして、3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量である。トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えて、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した後、200mlフラスコ内容物をトリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持する。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-メルカプト1,2-プロパンジオール由来のチオール基、及び、メルカプトコハク酸由来のチオール基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子1を得た。化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。粒子1は遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子1を評価したところ、個数平均粒径が232nmであった。
(実施例2 粒子2の合成)
実施例1のスチレンをメチルメタクリレート(東京化成株式会社)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子2を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子2の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が286nmであった。
実施例1のスチレンをメチルメタクリレート(東京化成株式会社)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子2を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子2の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が286nmであった。
(実施例3 粒子3の合成)
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-アミノ-1,2-プロパンジオール(東京化成株式会社)とアミノコハク酸を溶解させた水溶液(3-アミノ-1,2-プロパンジオールとアミノコハク酸の割合が9:1(mol分率)である。3-アミノ-1,2-プロパンジオールとアミノコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量である。トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えて、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した後、200mlフラスコ内容物を、トリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-アミノ-1,2-プロパンジオール由来のアミノ基、及び、2アミノコハク酸由来のアミノ基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子3を得た。化学反応中、かなりの量の凝集塊が発生したため、この凝集塊をデカンテーションによって取り除いた後、粒子3を遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子3を評価したところ、個数平均粒径が235nmであった。
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-アミノ-1,2-プロパンジオール(東京化成株式会社)とアミノコハク酸を溶解させた水溶液(3-アミノ-1,2-プロパンジオールとアミノコハク酸の割合が9:1(mol分率)である。3-アミノ-1,2-プロパンジオールとアミノコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量である。トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えて、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した後、200mlフラスコ内容物を、トリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-アミノ-1,2-プロパンジオール由来のアミノ基、及び、2アミノコハク酸由来のアミノ基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子3を得た。化学反応中、かなりの量の凝集塊が発生したため、この凝集塊をデカンテーションによって取り除いた後、粒子3を遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子3を評価したところ、個数平均粒径が235nmであった。
(実施例4 粒子4の合成)
実施例1の3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の割合を8:2(mol分率)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子4を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子4の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が248nmであった。
実施例1の3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の割合を8:2(mol分率)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子4を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子4の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が248nmであった。
(実施例5 粒子5の合成)
実施例1の3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の割合を7:3(mol分率)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子5を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子5の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が276nmであった。
実施例1の3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の割合を7:3(mol分率)に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子5を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子5の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が276nmであった。
(実施例6 粒子6の合成)
実施例1のメルカプトコハク酸を3-メルカプトプロピオン酸に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子6を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子6の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が251nmであった。
実施例1のメルカプトコハク酸を3-メルカプトプロピオン酸に変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子6を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子6の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が251nmであった。
(実施例7 粒子7の合成)
実施例1のメルカプトコハク酸をDL-ジチオトレイトールに変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてチオール基を有する粒子7を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子7の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が268nmであった。
実施例1のメルカプトコハク酸をDL-ジチオトレイトールに変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてチオール基を有する粒子7を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子7の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が268nmであった。
(実施例8 粒子8の合成)
実施例1のメルカプトコハク酸をエチレンジアミンに変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてチオール基を有する粒子7を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子8の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が225nmであった。
実施例1のメルカプトコハク酸をエチレンジアミンに変更した以外は、実施例1と同様の実験操作によって反応性官能基としてチオール基を有する粒子7を得た。実施例1と同様、化学反応の間、凝集塊などは生じなかった。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いて粒子8の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が225nmであった。
(比較例1 SG粒子改の合成)
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいたグリシンを溶解させた水溶液(グリシンのmol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数に対して1/10molであり、トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えた。その後、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持し、200mlフラスコ内容物をトリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基とグリシン由来のアミノ基を化学反応させた。次に、2N塩酸水溶液を用いて200mlフラスコ内容物をpH1.5に調製し、さらに3時間、70℃、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、未反応のエポキシ基を水と化学反応させ前記エポキシ基をグリコールに変換することで、反応性官能基としてカルボキシル基を有するSG粒子改を得た。化学反応中、かなりの量の凝集塊が発生したため、この凝集塊をデカンテーションによって取り除いた後、SG粒子改を遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いてSG粒子改を評価したところ、個数平均粒径が213nmであった。
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいたグリシンを溶解させた水溶液(グリシンのmol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数に対して1/10molであり、トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した水溶液)を加えた。その後、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持し、200mlフラスコ内容物をトリエチルアミンを用いてpH10に調製した。その後、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基とグリシン由来のアミノ基を化学反応させた。次に、2N塩酸水溶液を用いて200mlフラスコ内容物をpH1.5に調製し、さらに3時間、70℃、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、未反応のエポキシ基を水と化学反応させ前記エポキシ基をグリコールに変換することで、反応性官能基としてカルボキシル基を有するSG粒子改を得た。化学反応中、かなりの量の凝集塊が発生したため、この凝集塊をデカンテーションによって取り除いた後、SG粒子改を遠心操作によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した(分散媒体の置換も遠心操作によって行った)。動的光散乱(DLS-8000:大塚電子株式会社)を用いてSG粒子改を評価したところ、個数平均粒径が213nmであった。
(比較例2 粒子8の合成)
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(和光純薬株式会社)とメルカプトコハク酸(和光純薬株式会社)を溶解させた水溶液(3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸が9:1(mol分率)である。3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量であるトリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH10に調製した水溶液)を加えた。そして、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した。その後、さらに、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-メルカプト1,2-プロパンジオール由来のチオール基、及び、メルカプトコハク酸由来のチオール基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子8を得た。化学反応の間、200mlフラスコ内容物がpH10を維持するようpHメーターを用いて常にモニタリングし、必要に応じてトリエチルアミンを添加した。化学反応中、かなりの凝集塊が生じ、収率が著しく低下した。
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調整しておいた3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(和光純薬株式会社)とメルカプトコハク酸(和光純薬株式会社)を溶解させた水溶液(3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸が9:1(mol分率)である。3-メルカプト1,2-プロパンジオールとメルカプトコハク酸の合計mol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数と等量であるトリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH10に調製した水溶液)を加えた。そして、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した。その後、さらに、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基と3-メルカプト1,2-プロパンジオール由来のチオール基、及び、メルカプトコハク酸由来のチオール基を化学反応させ反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子8を得た。化学反応の間、200mlフラスコ内容物がpH10を維持するようpHメーターを用いて常にモニタリングし、必要に応じてトリエチルアミンを添加した。化学反応中、かなりの凝集塊が生じ、収率が著しく低下した。
(比較例3 粒子9の合成)
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調製しておいたアミノコハク酸を溶解させた水溶液を加えた。予め調製しておいた水溶液は、アミノコハク酸のmol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数に対して1/10molであり、トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した。
200mlフラスコに1.2gのスチレン(キシダ化学株式会社)と1.8gのグリシジルメタクリレート(キシダ化学株式会社)、0.04gのジビニルベンゼン(キシダ化学株式会社)、100gのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を200rpmで撹拌しながら70℃に保持し、窒素バブリングを30分行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた0.06gのV-50(和光純薬株式会社)を3gの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合(ソープフリー乳化重合)を開始した。重合開始から2時間後、ラジカル重合反応場に0.3gのグリシジルメタクリレートを加え、さらに8時間、200rpmで撹拌しながら70℃で保持した後、室温まで徐冷した。この時点で200mlフラスコ内容物をサンプリングし、プロトンNMR、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に100%であることを確認した。次に、予め調製しておいたアミノコハク酸を溶解させた水溶液を加えた。予め調製しておいた水溶液は、アミノコハク酸のmol数が前記グリシジルメタクリレートのmol数に対して1/10molであり、トリエチルアミン(キシダ化学株式会社)と2N塩酸水溶液を用いてpH7に調製した。
そして、3時間、200rpmで撹拌しながら室温で保持した後、200mlフラスコ内容物を、トリエチルアミンを用いてpH10に調製し、70℃に昇温してさらに3時間、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基とアミノコハク酸由来のアミノ基を化学反応させた。次に、2N塩酸水溶液を用いて200mlフラスコ内容物をpH1.5に調製し、さらに3時間、70℃、200rpmで撹拌しながら保持した。それにより、未反応のエポキシ基を水と化学反応させ前記エポキシ基をグリコールに変換することで、反応性官能基としてカルボキシル基を有する粒子9を得た。化学反応の間、200mlフラスコ内容物がpH10を維持するようpHメーターを用いて常にモニタリングし、必要に応じてトリエチルアミンを添加した。化学反応中、かなりの凝集塊が生じ、収率が著しく低下した。
(実施例9 非特異吸着の抑制能力の評価)
粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、粒子7、粒子8、SG粒子改をそれぞれ、0.1wt%となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を調製した。次に、それぞれの分散液30μlに対して、トリオレイン、レシチン、遊離脂肪酸、ウシアルブミン、トリス緩衝液から成る乳ビ液を60μl添加し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定はBiochrom社製分光光度計GeneQuant 1300を用いた。そして、これらの分散液を37℃で5分静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。その結果、粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、粒子7、粒子8、SG粒子改の順に、ΔABS×10000は、30、50、103、68、95、86、105、73、562となった。分散液の吸光度変化は、分散液中の粒子に非特異吸着が生じた結果、粒子間凝集が生じることに起因すると考察できることから、本実施例における粒子は、SG粒子と比較して非特的吸着を抑制する能力に優れることが確認された。
粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、粒子7、粒子8、SG粒子改をそれぞれ、0.1wt%となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を調製した。次に、それぞれの分散液30μlに対して、トリオレイン、レシチン、遊離脂肪酸、ウシアルブミン、トリス緩衝液から成る乳ビ液を60μl添加し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定はBiochrom社製分光光度計GeneQuant 1300を用いた。そして、これらの分散液を37℃で5分静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。その結果、粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、粒子7、粒子8、SG粒子改の順に、ΔABS×10000は、30、50、103、68、95、86、105、73、562となった。分散液の吸光度変化は、分散液中の粒子に非特異吸着が生じた結果、粒子間凝集が生じることに起因すると考察できることから、本実施例における粒子は、SG粒子と比較して非特的吸着を抑制する能力に優れることが確認された。
(実施例10 アフィニティー粒子の合成*抗体の結合)
粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、SG粒子改をそれぞれ、1.0wt%となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を1μlずつ調製した。これらの分散液に、それぞれ、0.055mgの1-[3-(ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド](和光純薬株式会社)を10μlのリン酸緩衝液に溶解させた溶解液を加えた。その後、モノクローナル マウス アンチーヒューマン C-反応性タンパク(以下、CRP抗体)のクローンC5(フナコシ株式会社)の4.9mg/ml分散液を5μlとクローンC6(フナコシ株式会社)の5.8mg/ml分散液を5μl加えた。そして、室温で180時間振とうすることで、アフィニティー粒子を合成した。次に、遠心精製(15000rpm)を3回行うことで、アフィニティー粒子を精製し、最終的に1mlリン酸緩衝液に分散させた状態で保存した。以下、粒子1~6から得たアフィニティー粒子を各々、アフィニティー粒子1~6と表現する。また、SG粒子改から得たアフィニティー粒子をCRP固定化SG粒子改と表現する。アフィニティー粒子1のCRP抗体結合量は1204個/粒子、アフィニティー粒子2のCRP抗体結合量は1308個/粒子、アフィニティー粒子3のCRP抗体結合量は1157個/粒子であった。そして、アフィニティー粒子4のCRP抗体結合量は1402個/粒子、アフィニティー粒子5のCRP抗体結合量は1607個/粒子、アフィニティー粒子6のCRP抗体結合量は504個/粒子であった。そして、CRP固定化SG粒子改のCRP抗体結合量は295個/粒子であった。概して、側鎖に2個のカルボキシル基を有する繰り返し単位を有する粒子の方が、側鎖に1個のカルボキシル基を有する繰り返し単位を有する粒子より、CRP抗体結合反応における反応効率に優れることがわかった。
粒子1、粒子2、粒子3、粒子4、粒子5、粒子6、SG粒子改をそれぞれ、1.0wt%となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を1μlずつ調製した。これらの分散液に、それぞれ、0.055mgの1-[3-(ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド](和光純薬株式会社)を10μlのリン酸緩衝液に溶解させた溶解液を加えた。その後、モノクローナル マウス アンチーヒューマン C-反応性タンパク(以下、CRP抗体)のクローンC5(フナコシ株式会社)の4.9mg/ml分散液を5μlとクローンC6(フナコシ株式会社)の5.8mg/ml分散液を5μl加えた。そして、室温で180時間振とうすることで、アフィニティー粒子を合成した。次に、遠心精製(15000rpm)を3回行うことで、アフィニティー粒子を精製し、最終的に1mlリン酸緩衝液に分散させた状態で保存した。以下、粒子1~6から得たアフィニティー粒子を各々、アフィニティー粒子1~6と表現する。また、SG粒子改から得たアフィニティー粒子をCRP固定化SG粒子改と表現する。アフィニティー粒子1のCRP抗体結合量は1204個/粒子、アフィニティー粒子2のCRP抗体結合量は1308個/粒子、アフィニティー粒子3のCRP抗体結合量は1157個/粒子であった。そして、アフィニティー粒子4のCRP抗体結合量は1402個/粒子、アフィニティー粒子5のCRP抗体結合量は1607個/粒子、アフィニティー粒子6のCRP抗体結合量は504個/粒子であった。そして、CRP固定化SG粒子改のCRP抗体結合量は295個/粒子であった。概して、側鎖に2個のカルボキシル基を有する繰り返し単位を有する粒子の方が、側鎖に1個のカルボキシル基を有する繰り返し単位を有する粒子より、CRP抗体結合反応における反応効率に優れることがわかった。
(実施例11 ヒトCRP抗原に対する抗原抗体反応性評価)
ヒトCRP (シグマ社製C4063、C反応性タンパク質 ヒト血漿由来、32m/dl)を1μlと、緩衝液(デンカ生研 CRP-L オート「TBA」の緩衝液(R-1))を50μlとを混合し混合液とし、37℃で5分間、加温した。次に、実施例7で得たアフィニティー粒子の分散液を50μlと前記混合液とを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定はBiochrom社製分光光度計GeneQuant 1300を用いた。そして、この分散液を37℃で5分静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。アフィニティー粒子1~6、CRP固定化SG粒子改それぞれについて評価したところ、順に、ΔABS×10000は、5840、2456、4401、3517、2517、1820、839となった。また、これらの吸光度変化が欺陽性か否かを検証するため、次のような実験を行った。上記デンカ生研の緩衝液を51μlと、実施例7で得たアフィニティー粒子の分散液を50μlとを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。そして、この分散液を37℃で5分間静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。アフィニティー粒子1~6、CRP固定化SG粒子改のそれぞれについて評価したところ、アフィニティー粒子1、2、3、6のΔABS×10000はほとんど変化しなかった。なお、アフィニティー粒子4とアフィニティー粒子5のΔABS×10000は軽微に上昇した。CRP固定化SG粒子改のΔABS×10000は687であり、それぞれの陽性の値(839)に対して大きな割合となった。この結果により、本実施例におけるアフィニティー粒子を含有することを特徴とする体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬の優位性が検証された。なお、アフィニティー粒子1とアフィニティー粒子2で、CRP抗体結合量がほとんど同じにも関わらず、ΔABS×10000の値に大きな差が認められたのは、繰り返し単位BのXに由来するものと考察している。XがS(スルフィド)とXがNH(2級アミン)の場合を比較すると、繰り返し単位Bの水溶解性はNH(2級アミン)の方が優れる。このため、アフィニティー粒子2はアフィニティー粒子1に対して分散安定性に優れ過ぎたために、抗原抗体反応に基づくアフィニティー粒子間の凝集反応が生じにくかったと考えられる。
ヒトCRP (シグマ社製C4063、C反応性タンパク質 ヒト血漿由来、32m/dl)を1μlと、緩衝液(デンカ生研 CRP-L オート「TBA」の緩衝液(R-1))を50μlとを混合し混合液とし、37℃で5分間、加温した。次に、実施例7で得たアフィニティー粒子の分散液を50μlと前記混合液とを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定はBiochrom社製分光光度計GeneQuant 1300を用いた。そして、この分散液を37℃で5分静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。アフィニティー粒子1~6、CRP固定化SG粒子改それぞれについて評価したところ、順に、ΔABS×10000は、5840、2456、4401、3517、2517、1820、839となった。また、これらの吸光度変化が欺陽性か否かを検証するため、次のような実験を行った。上記デンカ生研の緩衝液を51μlと、実施例7で得たアフィニティー粒子の分散液を50μlとを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長572nmにおける吸光度を測定した。そして、この分散液を37℃で5分間静置した後、再び波長572nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔABS×10000を算出した。アフィニティー粒子1~6、CRP固定化SG粒子改のそれぞれについて評価したところ、アフィニティー粒子1、2、3、6のΔABS×10000はほとんど変化しなかった。なお、アフィニティー粒子4とアフィニティー粒子5のΔABS×10000は軽微に上昇した。CRP固定化SG粒子改のΔABS×10000は687であり、それぞれの陽性の値(839)に対して大きな割合となった。この結果により、本実施例におけるアフィニティー粒子を含有することを特徴とする体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬の優位性が検証された。なお、アフィニティー粒子1とアフィニティー粒子2で、CRP抗体結合量がほとんど同じにも関わらず、ΔABS×10000の値に大きな差が認められたのは、繰り返し単位BのXに由来するものと考察している。XがS(スルフィド)とXがNH(2級アミン)の場合を比較すると、繰り返し単位Bの水溶解性はNH(2級アミン)の方が優れる。このため、アフィニティー粒子2はアフィニティー粒子1に対して分散安定性に優れ過ぎたために、抗原抗体反応に基づくアフィニティー粒子間の凝集反応が生じにくかったと考えられる。
上記の通り、本発明によれば、非特異吸着を抑制する能力に優れ、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための官能基を有する粒子、及び、この粒子を簡易、且つ、高収率で製造するための新規手法を提供することができる。
本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
本願は、2018年4月27日提出の日本国特許出願特願2018-087518を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
Claims (22)
- 側鎖に、スルフィド基または2級アミン、及び、3つ以上の水酸基を有する繰り返し単位Aと、
側鎖に、リガンドを結合するための1つ以上の反応性官能基を有する繰り返し単位Bと、
を有する共重合体を含み構成され、
非特異吸着が抑制されることを特徴とする粒子。 - 前記反応性官能基がカルボキシル基であることを特徴とする請求項1に記載の粒子。
- 前記繰り返し単位Bの有する反応性官能基がカルボキシル基であり、前記繰り返し単位Bが2つ以上の前記カルボキシル基を有することを特徴とする請求項1または2に記載の粒子。
- 前記共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Cを有することを特徴とする請求項1及至7のいずれか1項に記載の粒子。
- 前記繰り返し単位Cが、スチレン類の重合体を構成する繰り返し単位、及び(メタ)アクリレート類の重合体を構成する繰り返し単位から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項4及至8のいずれか1項に記載の粒子。
- 請求項1及至9のいずれか1項に記載の粒子と、前記粒子の反応性官能基に結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子。
- 前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項10に記載のアフィニティー粒子。
- 請求項10または11に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒と、を有することを特徴とする体外診断用の検査試薬。
- 前記リガンドが抗体または抗原であり、ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いられることを特徴とする請求項12に記載の検査試薬。
- 請求項12または13に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有することを特徴とする体外診断用の検査キット。
- 検体中の標的物質の検出方法であって、請求項12または13に記載の検査試薬に、検体を混合する工程を有することを特徴とする検出方法。
- ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、
請求項12または13に記載の検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、
前記混合液に、光を照射する工程と、
前記混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程と、
を有することを特徴とする検出方法。 - 粒子の製造方法であって、
グリシジル(メタ)アクリレートと、スチレンあるいはメチル(メタ)アクリレートと、水と、ラジカル重合開始剤とを混合して粒状の共重合体を形成させ、前記粒状の共重合体の水分散液を得る工程(工程1)と、
前記水分散液と、チオール基を有するラジカル重合性モノマーとを混合して混合液を調製し、前記粒状の共重合体のグリシジル(メタ)アクリレートに由来するエポキシ基と、前記チオール基を反応させる工程(工程2)と、を有することを特徴とする粒子の製造方法。 - チオール基を有するラジカル重合性単量体が、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール、メルカプトコハク酸、及び3-メルカプトプロピオン酸の少なくともいずれか一つであることを特徴とする請求項17に記載の粒子の製造方法。
- 前記ラジカル重合開始剤が、少なくとも2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]disulfate dihydrate、2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride、2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]の何れかであることを特徴とする請求項17または18に記載の粒子の製造方法。
- 前記工程2の混合液が1級アミンを有さない有機塩基を用いてpH0.1以上9.0以下に調製される工程を含むことを特徴とする請求項17乃至19のいずれか1項に記載の粒子の製造方法。
- 前記工程1において、さらに、架橋性ラジカル重合性単量体を混合させることを特徴とする請求項17乃至20のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程1において、前記粒状の共重合体を形成させる過程で、グリシジル(メタ)アクリレートをさらに混合し、前記粒状の共重合体の表面をポリグリシジル(メタ)アクリレートで被覆する工程をさらに含むことを特徴とする請求項17乃至21のいずれか1項に記載の粒子の製造方法。
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