JPS61155960A - 免疫学的診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からなり、ラテックス凝集反応において非特異的凝集
反応がなく、且つ、凝集反応の判定が容易であると共に
、保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬に関する。

（従来の技術） 近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の状態の医
学的診断のために、血液、尿その他の体液中の生理活性
物質が有する免疫活性を利用する免疫学的診断方法が広
く用いられている。この方法は、免疫学的な反応を起こ
す抗原又は抗体のいずれか一方、又は両者を組合せて体
液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対
応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によ、つて
、上記のような免疫活性成分の存在を決定する方法であ
る。この場合、肉眼による観察を容易にするために、一
般に、抗原又は抗体は微粒子状の担体、例えばラテック
ス、赤血球等に担持されて、診断試薬とされ、このよう
な粒子の凝集反応を利用して、血清等の体液中の被検成
分が測定される。

例えば、微粒子がラテックスからなる診断試薬の凝集反
応について説明すると、抗原又は抗体を担持させた微粒
子を含有する水性分散液からなる診断試薬を被検液と混
合すると、上記抗原又は抗体に対応する被検液中の抗体
又は抗原は、微粒子上の抗原又は抗体と特異的に反応し
、ラテックス凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒
子の凝集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗原又は抗体が存在しない場合は、肉眼的に観察し得る
凝集は起こらない。このようにして、抗体又は抗原を固
定化した微粒子の凝集反応の有無によって、被検液中の
抗体又は抗原の存在を決定することができる。

このような免疫学的学的診断試薬は、免疫活性物質、即
ち、抗原又は抗体が微量にでも被検液中に存在すれば、
これを検出し得る高い感度と、目的とする免疫活性物質
とのみ反応する高い特異性を有することが要求される。

更に、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異
性を保持することが要求される。

このような免疫学的診断試薬における微粒子担体として
は、従来、ポリスチレンラテックス粒子が広く用いられ
ている。このポリスチレンラテックスは、殆どの場合、
乳化剤及び水溶性ラジカル重合開始剤の存在下に、スチ
レンを乳化重合させて製造されている。ここに、上記乳
化剤は、一般に、乳化重合時における重合安定性を確保
すると共に、粒径が小さく、分散安定性のよい重合体粒
子を含むラテックスを得るのに効果がある。乳化剤がこ
のようにして得られるラテックスの分散安定性を高める
効果については、必ずしも明らかではないが、一般には
、乳化剤の一部がラテックス粒子に吸着されてお゛す、
残余はラテックス中に遊離の状態で存在し、このように
ラテックス中において、重合体粒子に吸着された乳化剤
と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡が存在し、かかる
平衡の結果として、ラテックスの安定化が達成されると
されている。

従って、このように乳化剤を含むポリスチレンラテック
スに前記したように抗原又は抗体を固定化する場合に、
ラテックスが遊離の乳化剤を含むときは、ラテックス粒
子がこの固定化操作の段階で凝集することがある。更に
、抗原又は抗体を固定化したポリスチレンラテックスを
用いて免疫学的診断を行なう際に、対応する抗体又は抗
原を含いるが（化学技術研究所報告第７５巻第８号３４
１頁（１９８０）”）、この方法によるラテックスも分
散安定性が十分でなく、特に、機械的な剪断応力下に容
易に凝集する。

従って、従来、ラテックス粒子の非特異的凝集を防ぐこ
とを目的として、ラテックス凝集反応の有無の判定を行
なう際に、血清をグリシン等の緩衝液で希釈したり、或
いは血清中の補体を失活させる非動化処理を施すことが
行なわれている。しかし、このような処理によっては、
非特異的凝集を十分に抑制することは困難であり、また
、手間を要して、診断に時間がかかるという問題がある
。

このような免疫学的診断試薬における問題を解決するた
めに、従来より、非特異的凝集反応を抑制することを目
的として、診断試薬に添加剤を添加することが一般に行
なわれており、かかる添加剤として、例えば、グリコー
ル類や、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、或いは
ポリアニオン等が知られている。しかし、これらの添加
剤の効果は一般に十分ではないので、近年、添加剤とし
て、例えば、ショ糖及び塩化コリン（特開昭５４−０２
６３２７号公報”）　、Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミドやジ
低級アルキルスルホキシド（特開昭５５−１６０８５３
号公報）等が提案されている。

更に、近年になって、種々の無機塩類が非特異的凝集を
抑制する効果をもつ添加剤としで提案されている。例え
ば、特開昭５６−１５８９４７号公報には、グアニジン
、グアニジン塩酸塩、グアニジニウムチオシアン酸塩、
尿素等を代表例とするケイオトロピツク（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｉｃ）剤と共に、似ケイオトロピック剤として塩化
リチウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウ
ム、ヨウ化リチウムのようなハロゲン化アルカリ金属や
、塩化カルシウムのようなハロゲン化金属が記載されて
おり、また、特開昭５７−３５７５４号公報にも同様に
ハロゲン化アルカリ金属が記載されている。

しかし、ハロゲン化アルカリ金属は、一般に陰性血清に
対する非特異的凝集が顕著であり、また、塩化カルシウ
ムも陰性血清に対する非特異的凝集″が顕著であるのみ
ならず、診断に際して、例えば、陰性血清と混合して数
分後の初期の凝集の程度が縦隔性であるとき、時間の経
過につれて非特異的凝集が強くなり、凝集の程度が時間
によって変動するので、正確な診断を行なうことが不可
能である。更に、塩化カルシウムを添加剤として含有す
る免疫学的診断試薬は、長期間にわたって保存するとき
、診断試薬に沈殿を生じ、使用に際しては診断試薬を十
分に振盪して均一にする必要がある等、保存性や使用性
に劣る。このように、従来、種々の無機塩が添加剤とし
て提案されているが、尚、非特異的凝集を抑制する効果
が劣ると共に、診断試薬が保存安定性に劣る問題がある
。

（発明の目的） 本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記の問題を
解決するために鋭意研究した結果、それ自体が従来の微
粒子担体に比べて格段に分散安定性にすぐれる水分散型
高分子重合体粒子を見出すと共に、かかる重合体粒子に
共有結合により免疫活性物質を固定化し、更に、かかる
重合体粒子の水性分散液に臭化カルシウムを共存させる
とき、臭化カルシウムが上記した無機塩類系の添加剤を
含めて、従来より知られている添加剤に比較して、非特
異的凝集を抑制する効果に格段にすぐれるため、非特異
的凝集が完全に抑制されて、高い感度及び高い特異性を
有すると共に、保存安定性にも格段にすぐれる免疫学的
診断試薬を得ることができることを見出して、本発明に
至ったものである。

従って、本発明は、血清を希釈することなく、しかも、
非動化処理も行なわずに、非特異的凝集反応が抑制され
、且つ、凝集反応の有無の判定が容易であると共に、保
存安定性にすぐれた免疫学的診断試薬を提供することを
目的とする。

（発明の構成） 本発明による免疫学的診断試薬は、 （ａ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、Ｒ２は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であっでもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、 （ｂｌスルホン酸基を有するビニル単量体０．００１〜
１０重量％、 （Ｃ１一般式 ％式％ （但し、Ｒ″は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は −（ＣＯ，）、−又は−（ＣＨｚ）　、　−ＣＨ−（ｃ
ｕｔ）　、　−０Ｒ’ （但し、ｍはＯ〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
あり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示す。また
、ｎはＯ〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体と、上記アクリル酸誘導体及び上記スルホン酸基を有
するビニル単量体を除くラジカル共重合性ビニル単量体
との混合物であって、この混合物に基づいて上記アクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜１００重量
％である混合物５０〜９９．７９９重量％、及び（ｄ）
多官能性内部架橋用単量体０．１〜２０重量％、からな
る単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させてなる水
分散型高分子重合体粒子が、共有結合により免疫活性物
質を固定化されて、水性媒体中に分散されてなる免疫学
的診断試薬において、臭化カルシウムが配合されている
ことを特徴とする。

本発明において用いるアクリル酸誘導体は、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、好ましくは水素又はメチル基、Ｒ１は水素又
は低級アルキル基を示し、好ましくは水素又はメチル基
を示し、Ｒ′が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ１
はカルボ低級アルコキシ基であってもよい。） で表わされ、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、　　
　６のイタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸
、　　　ルキモノアルキルマレイン酸、モノアルキルフ
マル酸、アンモノアルキルイタコン酸等を好ましい例と
して挙　　　で表げろことができるが、特に、アクリル
酸、メタク　　　ば、リル酸及びイタコン酸の１種又は
２種以上の混合　　　アル物が好ましく用いられる。

このようなアクリル酸誘導体は、後述するように、重合
体粒子に免疫活性物質を共有結合にて固ル干 アルキレン基、好ましくは炭素数１〜３のアレン基を示
し、Ｍは水素、アルカリ金属又はモニウムを示す、） わされるスルホアルキルアクリレート、例えスルホプロ
ピル（メタ）アクリレートやそのキル金属塩、一般式 し、Ｒ８は水素又は低級アルキル基、好まし水素又はメ
チル基を示し、Ｒ９は水素又は低ルキル基を示し、Ｍは
前記と同じである。）わされるスチレンスルホン酸、そ
の誘導体、らのアルキル金属塩、例えば、スチレンスル
酸ナトリウム、一般式 ％式％ し、Ｒ１′１は水素又は低級アルキル基、好まし水素又
はメチル基を示し、Ｒｌ　１は炭素数１〜アルキレン基
、好ましくは炭素数３〜４のアレン基を示し、Ｍは前記
と同じである。）で表わされる２−アクリルアミドアル
カンスルホ　　　　本発ン酸、その誘導体及びこれらの
アルキル金属塩、　　　　キルエ例えば、２−アクリル
アミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が用いられる
。　　　　　　　　　　　　　（但しかかるスルホン酸
基を有するビニル単量体も、　　　　くは水前記アクリ
ル酸誘導体と同様にその陰性基によつ　　　−（（て粒
子に陰性荷電を与えて、粒子の水性分散液における安定
性を高める。　　　　　　　　　　　　　　　（但し本
発明においては、水性媒体中での分散安定性　　　−１
でにすぐれる乳化共重合体粒子水性分散液を得るた　　
　を示しめに、単量体成分として、上記したアクリル酸
誘　　　ＣＦ、を導体とスルホン酸１を有するビニル単
量体を用い　　　て表わると共に、アクリル酸フルオロ
アルキルエステル　　　　　ＣＩ誘導体及び多官能性内
部架橋用単量体を用いる。　　　　　ＣＩ本発明によれ
ば、かかる単量体成分の所定の割合　　　　　ＣＩの混
合物を乳化共重合させることにより、特に乳　　　又は
Ｃ’Ｈ化剤他剤いずとも、凝集物の発生なしに安定に乳
化共重合させ得て、水性媒体中で分散状態が安定　　　
（但しに保持され、且つ、非膨潤性である共重合体粒子
　　　る。）の水性分°散液を得ることができるのであ
る。　　　　　　で表わ明において用いるアクリル酸フ
ルオロアルステル誘導体は、一般式 ％式％ Ｒ３は水素又は低級アルキル基、好まし禦又はメチル基
を示し、Ｒ４は 、ｍは０〜１２の整数を示し、Ｘ＋７＝ｍあり、Ｒ５は
水素又はアセチル基を示す。）、Ａはそれぞれ独立に水
素、フッ素又は示し、ｎは０〜１２の整数を示す。） され、好ましくは、一般式 ％式％（１１ ｙ　Ｒ３、Ｒ’　ｓ　ｍ及びｎは前記と同じであされ、
従って、特に、本発明において好ましく用いることがで
きるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体
例として、例えば、ＣＨｚ二Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨｚ
Ｃｈ　　　　　　　　　　　（５１ＧＨｚ＝Ｃ（ＣＨ＋
）ＣＯＯＣＨｚ（ＣＦｚ）　ｚＨ（６）ＣＨｚ・ｃ（Ｃ
Ｈｆｆ）ＣＯＯＣＲ，（ＣＦｚ）、Ｈ（７１ＧＨｚ＝Ｃ
（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨｚ）　ｚ（Ｃｈ）　ｓＦ　　　
　　　　（８１等を例示することができる。

かかるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体を単
量体成分として有する乳化共重合体は、フルオロアルキ
ルエステル基が粒子の表面張力を低下させ、例えば、後
述するように、粒子に免疫活性物質を固定化させる際に
、この免疫活性物質の粒子への吸着を妨げて、粒子分散
液の安定性を保持し、かくして、固定化を容易にすると
共に、固定化後の粒子を高感度及び高特異性とする。

また、本発明において、多官能性内部架橋用単量体は、
重合体に架橋構造を導入するので、診断試薬中に含まれ
れば好ましくない水溶性重合体の生成を抑制すると共に
、得られる重合体粒子のガラス転移温度を高めることが
できる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子重合体粒
子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中での分散安
定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３
−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架
橋用単量体として用いることができる。

本発明において微粒子担体として用いる水分散型高分子
重合体粒子の水性分散液の製造に際しては、乳化共重合
のための単量体組成は、前記アクリル酸誘導体０．１〜
２０重量％、好ましくは０．５〜１５！量％、前記スル
ホン酸基を有するビニル単量体ｏ、ｏｏｉ〜１０重量％
、好ましくは０．０１〜５重量％、前記アクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体５０〜９９．７９９重量％
、好ましくは６５〜９８．９９重量％、内部架橋用多官
能性単量体０．１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１
５重量％である。

上記アクリル酸誘導体及びスルホン酸基を有するビニル
単量体は、それぞれ陰性基であるカルボキシル基及びス
ルホン酸基によって粒子に陰性荷電を与えて、単量体混
合物の乳化共重合時の重合安定性と、得られる粒子の水
性分散液の安定性を図り、また、アクリル酸誘導体は、
免疫活性物質をスペーサ基を介して、又は介さずして、
重合体粒子に共有結合にて固定化する際の官能基を提供
するために、それぞれが本発明による単量体混合物にお
いて必須の単量体である。これらの効果を有効に発現さ
せるために、単量体組成において、アクリル酸誘導体に
ついては少なくとも０．１重量％を、また、スルホン酸
基を有するビニル単量体については少なくとも０．００
１重量％を必要とする。しかし、いずれも過多に共重合
単量体成分として用いるときは、却って重合安定性と、
得られる粒子の水性分散液の安定性を損なうので、それ
ぞれ２０重量％及び１０重量％以下の範囲で用いる。

また、内部架橋用多官能性車量体も、前記したように、
重合を安定に進行させ、また、得られる共重合体゛粒子
の安定な分散状態を保持すると共に、粒子を非膨潤性と
するために必要な単量体であり、単量体組成において少
なくとも０．１重量％が必要であるが、しかし、過多に
使用するときは、却って重合安定性と粒子分散液の安定
性を損なうので、２０重量％以下の範囲で用いられる。

更に、本発明においては、前記アクリル酸フルオロアル
キルエステル誘導体の一部に代えて、前記アクリル酸誘
導体、スルホン酸基を有するビニル単量体及び多官能性
内部架橋用単量体を除くうジカル共重合性ビニル単量体
を単量体成分として用いることができる。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の単独重合体が水不溶性である疎水性単量体
を挙げることができる。具体例としてエチレン、プロピ
レン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はそのハロゲン
置換体、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、
ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルケニルベンゼ
ン、ブタジェン、イソプレン等の共役ジオレフィン、（
メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸メチル、
（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピ
ル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘ
キシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（メタ）アク
リル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等を
挙げることができる。上記したラジカル共重合性ビニル
単量体のうちでは、特に、アルケニルベンゼン及び（メ
タ）アクリル酸エステルが好ましく用いられる。

また、それ自体の単独重合体が水溶性又は水膨潤性であ
る親水性単量体も用いることができ、かかる単量体の具
体例として、例えば、ヒドロキシメチル（メタ）アクリ
レート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒド
ロキシプロピル（メタ）アクリレート等のヒドロキシア
ルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド
、グリシジル（メタ）アクリレート等を挙げることがで
きる。このような親水性単量体は、特に、得られる粒子
に官能基を有せしめるために有効であり、上記疎水性単
量体と併用するのが好ましい。

本発明においては、粒子に免疫活性物質を固定化する際
にも、粒子の分散性を安定に保つために、アクリル酸フ
ルオロアルキルエステル誘導体が必須の単量体成分であ
り、他方、上記したラジカル共重合性ビニル単量体は、
余りに多量に使用すると、重合安定性を損じるのみなら
ず、得られる粒子が水分散安定性に劣るようになる。従
って、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキル
エステル誘導体と上記ラジカル共重合体ビニル単量体と
の混合物において、アクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体を少なくとも１重量％用いることが必要である
。

即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合性ビニル
単量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重量
に基づいて、９９重量％以下、好ましくは９７重量％以
下の範囲で用いられるが、親水性単量体は、混合物の重
量に基づいて、３０重量％以下、好ましくは２０重量％
以下の範囲で用いられる。

有効量の下限は特に制限されず、目的に応じて適宜に選
ばれるが、通常、アクリル酸フルオロアルキルエステル
誘導体とこのアクリル酸アルキルエステル誘導体の混合
物の重量に基づいて１重量％以上である。

尚、水分散型高分子重合体粒子水性分散液の調製におい
て、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合体
粒子のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上と
なるように選ばれる。粒子のガラス転移点が０℃よりも
低いときは、粒子の相互の融着や凝集が生じやすく、分
散液の分散安定性が低下する傾向があるからである。

本発明においては、以上のような各単量体を水性媒体中
にて、水溶性のラジカル重合開始剤を用いて、通常の方
法にて乳化共重合させることにより、分散安定性にすぐ
れた水不溶性共重合体粒子の水性分散液を得ることがで
きる。しかし、得られる水性分散液中に乳化剤が遊離の
状態で、或いは重合体粒子に吸着された状態にて存在す
るとき、前述したように、例えば、粒子への免疫活性物
質の固定化に際して有害な影響が現われることがあるの
で、乳化共重合に際しては乳化剤を用いないのが好まし
い。本発明による上記単量体組成によれば、特に乳化剤
を用いずして安定に共重合させることができると共に、
得られる重合体粒子水性分散液において粒子の分散状態
が安定に保持されるのが大きい特徴をなす。しかし、前
述したように、固定化や診断時に有害な粒子の凝集や沈
降が起こらない範囲において乳化剤を用いることは何ら
妨げられず、必要に応じて、乳化剤を用いてもよい。

また、本発明による乳化共重合において、単量体成分混
合物の水性媒体中での濃度は、得られる水性分散液にお
ける粒子の平均粒径とも関連するが、通常、０．１〜４
０重量％の範囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩とチ
オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナ
トリウム等のようなチオ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウム
、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような亜
硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用いられ
るが、これらに限定されるものではない。これら重合開
始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１〜１重
量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に制限さ
れないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が
用いられる。また、重合温度は、特に制限されないが、
通常、２０〜１００℃、好ましくは４０〜９０℃の範囲
である。

本発明による免疫学的診断試薬において、免疫活性物質
を固定化するための担体であって、上記のようにして得
られる水分散型高分子重合体粒子の平均粒径は、好まし
くは０．０３〜２μｍ、特に好ましくは０．１〜１μｍ
である。平均粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定
化した水分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による
凝集を肉眼で観察することが困難であり、一方、大きす
ぎる、ときは、重合体粒子に安定な分散状態を保持させ
るのが困難となるからである。また、重合体粒子の比重
は、０．９〜１．５の範囲にあることが好ましく、更に
、後述するように、免疫活性物質を固定化した後の比重
が１．０〜１．３の範囲にあることが好ましい。重合体
粒子が免疫活性物質の固定化の前後に上記範囲よりも小
さい比重を存するときは、重合体粒子がその水性分散液
における水性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るよ
うになり、一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子が
分散液の水性媒体中に沈降し、凝集しやすくなって、同
様に分散安定性に劣るようになるからである。

以上のように、本発明の単量体組成によれば、特に、乳
化剤を用いることなく、重合安定性を確保しつつ、乳化
共重合を行なうことができ、且つ、得られる共重合体粒
子は非膨潤性であると共に、粒径分布幅が小さく、均一
であって、しかも、水性媒体中で安定にその分散状態を
保持する。更に、一般に微粒子担体に免疫活性物質を固
定化させる場合、粒子表面の荷電状態が変化し、粒子の
分散安定性が不安定の方向に変化するが、上記したよう
な本発明による水分散型高分子重合体粒子によれば、粒
子がカルボキシル基及びスルホン酸基を有するので、粒
子への免疫活性物質の固定化時及びその後にも安定な分
散状態を保持することができ、かくして、分散安定性及
び保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬を得ることが
できるのである。

本発明による免疫学的診断試薬においては、免疫活性物
質が水分散型高分子重合体粒子にスペーサ基を介して共
有結合にて固定化されていることが好ましい。即ち、重
合体粒子に共有結合によってスペーサ基が結合され、こ
のスペーサ基に共有結合によって免疫活性物質が固定化
されていることが好ましい、スペーサ基を介さずに、直
接に免疫活性物質を重合体粒子に固定化し、この水性分
散液に臭化カルシウムを添加するときは、免疫活性物質
によっては、その活性を殆ど失ない、陽性血清に対して
も凝集反応を示さない場合があるからである。前記した
ように、本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、アクリル酸誘導体を単量体成分として含む単量体
混合物を乳化共重合させることにより得るので、このア
クリル酸誘導体に由来するカルボキシル基がスペーサ基
を重合体粒子に共有結合にて結合するための官能基とし
て機能する。

上記スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
るものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖を有
する二官能性の有機化合物が好ましい。このようなスペ
ーサ基として機能する化合物の具体例として、例えば、
ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、キ
シリレ　　　化しンジアミン等のジアミン類、グリシン
、β−アミ　　　　罰ノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸
、ε−アミツカ　　　粒７プロン酸、ε−アミノカプリ
ル酸等のアミノアル　　　し、キルカルボン酸、リジン
、グルタミン酸、β−ア　　　このラニン、アルギニン
、グリシルグリシルグリシン　　　足代等のアミノ酸類
等が好ましく用いられるが、これ　　　り匁らに限定さ
れるものではない。このスペーサ基は、　　　例え予め
重合体粒子に結合させ、この後にこのスペー　　　ボン
サ基と免疫活性物質とを結合させてもよく、或い　　　
水温はスペーサ基を予め免疫活性物質に結合させ、こ　
　　ン耐れを重合体粒子に結合させてもよい。更に、必
要　　　子のに応じて、重合体粒子及び免疫活性物質の
両方に　　　結召予めスペーサ基を結合させ、これらを
相互に結合　　　体栽させることもできる。　　　　　
　　　　　　　　　　　シイ但し、免疫活性物質を共有
結合にて直接に固定　　　キシ化した水分散型高分子重
合体粒子の水性分散液に　　　るこ所定濃度の臭化カル
シウムを配合したとき、免疫　　　　力活性物質が所期
の活性を有する場合には、水分散　　　ドと型高分子重
合体粒子に免疫活性物質を直接に固定　　　メチてもよ
いのはいうまでもない。

記した官能基を有する水分散型高分子重合体・に直接に
免疫活性物質を共有結合にて固定化又は重合体粒子にス
ペーサ基を結合し、また、スペーサ基に免疫活性物質を
共有結合にて固、するための方法は、特に制限されず、
従来よ：られている任意の方法によることができる。

ば、好ましい方法の一つとして、アミノカル酸をスペー
サ基として用いる場合であれば、□性カルボジイミドの
存在下に、アミノカルボｉの有するアミノ基と水分散型
高分子重合体粒子するカルボキシル基とを反応させ、ア
ミド・を形成させることにより、スペーサ基を重合子に
結合させ、次いで、同様に水溶性カルボミドを用いてこ
のスペーサ基の有するカルポル基に免疫活性物質を共有
結合にて固定化すとかできる。

・かる方法において用いる水溶性カルボジイミしては、
例えば、１−エチル−３−（３−ジルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩、ｌ−シクロヘキシル−３−（２
−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−）ル
エンスルホネート等を挙げることができる。このような
水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を介して、
又は介さずして直接に、共有結合によって免疫活性物質
を重合体粒子に固定化するには、従来より知られている
通常の方法及び条件によることができる。例えば、スペ
ーサ基を用いる場合であれば、重合体粒子の水性分散液
にスペーサ基と共に適宜量、例えば、水性分散液の単位
容量光りに０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように水溶
性カルボジイミドを添加し、通常の条件、例えばｐＨを
４〜１０に保持して、５〜６０℃程度の温度で数分乃至
数十時間、通常、１〜５時間程度反応させればよい。

次いで、このスペーサ基を結合させた重合体粒子に同様
にして免疫活性物質を固定化すればよい。

本発明において用いる免疫活性物質としては、特に制限
はなく、抗原、抗体及びハプテン等いずれを用いてもよ
い。例えば、ヒト及び動物免疫グロブリン、変性免疫グ
ロブリン、α−フェトプロナイン、Ｃ反応性タンパク（
ＣＲＰ）や肝炎ウィルス関連抗原、風疹ＨＡ抗原等の各
種ウィルス抗東、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅
毒トレボネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
跳原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパク成分
、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
等の各種ホルモン等が挙げられ、これらの抗原成分に対
する抗体等も使用することができる。

本発明による免疫学的診断試薬は、上記のように固定化
した免疫活性物質の失活が起こらないように、固定化し
た水分散型高分子重合体粒子が適当なｐＨ及び濃度のグ
リシン緩衝液、リン酸緩衝夜、ホウ酸緩衝液等の緩衝液
に分散されていると共に、この重合体粒子の水性分散液
に粒子の非特異的凝集を抑制するための添加剤として臭
化カルシウムが配合されてなる。

臭化カルシウムは、免疫活性物質を固定化した水分散型
高分子重合体粒子の水性分散液において、０．０１〜１
．５モル／Ｉｔ、好ましくは０．１〜１．２５モル／ｌ
の濃度で含有される。水性分散液における臭化カルシウ
ムの濃度が０．Ｏ１モル／１よりも少ないときは、陰性
血清に対する非特異的凝集の抑制効果が乏しく、一方、
濃度が１．５モル／ｌを越えるときは、却って陽性血清
に対する特異的凝集が抑制されることとなるからである
。

更に、本発明による免疫学的診断試薬において、上記緩
衝液の濃度は、通常、０．００５〜０．２Ｍの範囲が適
当であり、好ましくは０．０１〜０．１Ｍの範囲である
。また、緩衝液のｐＨは、水分散型高分子重合体粒子の
分散安定性及び抗原抗体反応の活性を考慮して、通常、
６〜９、好ましくは７〜８．５の範囲である。また、診
断試薬における感作重合体粒子の固形分濃度は、通常、
０．０１〜５重景％重量囲であるが、好ましくは０．１
〜３重量％の範囲である。尚、本発明による免疫学的診
断試薬には、防腐効果を与えるために、アジ化ナトリウ
ム等の防腐剤を添加してもよい。

本発明による免疫学的診断試薬は、臭化カルシウムを緩
衝液に溶解含有させ、ｐｉを調整した後、免疫活性物質
を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液に
添加混合し、必要に応じて更にｐＨを調整することによ
り得ることができる。

本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫学的診断
は、例えば、診断試薬と被検液とをガラス板又はプラス
チック板の窪み又は平面板上まマイクロプレート上にお
いて混合し、肉眼又は顕微鏡観察によって、重合体粒子
の凝集の有無を判定することにより行なわれる。また、
凝集の有無を光学的な変化として判定することもできる
。

（発明の効果） 以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、それ自体
が分散安定性にすぐれ、また、免疫活性物質の固定化に
対しても安定な分散状態を保持し得る水分散型高分子重
合体粒子に免疫活性物質を固定化し、この粒子の水分散
液に臭化カルシウムを含有させてなり、その結果、その
理由は必ずしも明らかではないが、粒子の非特異的凝集
が完全に抑制されると共に、高い検出感度と特異性とを
有し、従って、診断に際して、血清を緩衝液で希釈した
り、或いは非動化処理しなくとも、迅速に正確な判定を
行なうことができる。更に、本発明による診断試薬は、
例えば、ガラス板上で血清と均一に混じりやすく、また
、流動性にすぐれるので、凝集の有無判定が容易で且つ
正確である。また、診断試薬が臭化カルシウムを含むた
めのその比重が大きくなって、粒子の比重に近くなるた
めとみられるが、従来の診断試薬に比較して、長期間に
わたって何らの沈殿を生じることなく、重合体粒子の均
一分散性が保持され、その保存安定性に著しくすぐれる
。

（実施例） 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （ａｌ　　水分散型高分子重合体粒子の調製アクリル酸
５．０重量％、スチレンスルホン酸ナトリウム０．１重
量％、前記式（７）で表わされるＩＨ，１１（，５Ｈ−
オクタフルオロペンチルメタクリレート１０．０重量％
、メタクリル酸メチル４０．０重量％、メタクリル酸イ
ソブチル４０．０重量％及びトリエチレングリコールジ
メタクリレート４．９重量％からなる単量体混合物６０
ｇを蒸留水３３０ｇに加え、過硫酸カリウム０．１３　
ｇを水１０ｍ１に溶解した重合開始剤水溶液を７５℃の
温度で窒素気流下に加え、１２０ｒｐ＋ｍで攪拌しつつ
６時間重合させて、重合率９９．９％にて平均粒径０．
３０μｍの共重合体粒子の水性分散液を得た。重合は非
常に安定に行なわれて、凝集物は皆無であった。尚、凝
集物の測定は、重合終了後、生成した樹脂エマルジョン
を３０℃まで冷却し、濾布で濾過し、濾布上に残された
凝集物を乾燥し、その重量を測定することによって求め
た。

この粒子分散液を最初、蒸留水にて４回遠心洗浄し、次
いで、０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて２回
遠心洗浄して、水相中の水溶性高分子を除去し、重合体
粒子を精製した後、この重合体粒子を０．０１Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ７，５）に固形分が５重量％となるように
再分散させた。

共に、重合体粒子濃度１．０重量％の免疫学的診断試薬
を調製した。

（ｅ）　　免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質としてウサギＩｇＧを固定化した本試薬は
、リウマチ因子検出試薬として用いることができる。

第１表 （注）判定の基準は以下による。以下の判定においても
同じである。

−二顕微鏡観察（１００倍）によっても凝集が認められ
ない。

一〇　　二肉眼にては凝集が認められないが、顕微鏡観
察（１００倍）によって僅 かに凝集が認められる。

±　　：肉眼にて少し凝集が認められる。

＋　　：肉眼にて凝集が明らかに認められる。

＋〇　　：肉眼にて凝集が十よりやや強い程度に明らか
に認められる。

＋＋：少し強い凝集が認められる。

＋＋＋：激しい凝集が認められる。

この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性血清を原
液のままそれぞれガラス板上にて等容量混合攪拌しなが
ら、２分後に凝集状態を判定した。

その結果を第１表に示す。

本発明による診断試薬においては、非特異的凝集反応が
起こらないが、臭化カルシウムを含有しない対照診断試
薬では、非特異的凝集が生じた。

また、臭化カルシウム濃度が０．８５モル／１である上
記リウマチ因子検出試薬について、４℃の温度にて経口
安定性を調べた。評価方法は上記と同じである。結果を
第２表に示す。

本発明の診断試薬によれば、６か刃稜にも均一な外観を
有すると共に、陰性血清に対して何ら非特異的な凝集を
起こさず、保存安定性にすぐれることが明らかである。

更に、本発明の診断試薬によれば、凝集の程度は反応時
間によらずに実質的に一定している。しかし、臭化カル
シウムを含有しない診断試薬によれば、早期に沈殿が生
じ、また、非特異的凝集が認められる。

また、添加剤として塩化カルシウムを含有する対照診断
試薬によれば、陰性血清に対して非特異的凝集反応が生
じるのみならず、早期に沈殿を生じて、保存安定性に著
しく劣る。但し、この沈殿は粒子が沈降して生じるもの
であり、粒子が凝集するのではないので、十分に振盪し
て均一にすれば、診断試薬として使用することができる
。更に、塩化カルシウムを含有する診断試薬によれば、
陰性血清と混合して数分後の初期の凝集の程度が（±）
、即ち、縦隔性であるとき、時間の経過につれて非特異
的凝集が強くなり、例えば、約１０分後には凝集の程度
が（＋十）程度となって、凝集の程度が時間によって変
動し、かくして、正確な診断が不可能である。

更に、臭化カルシウム濃度０．８５モル／１の上記リウ
マチ因子検出試薬を４℃の温度で保存した、ときの陽性
活性の変化を調べた。結果を第３表に示す。凝集の判定
基準は前記と同じである。

次に、前記（ａ）の方法にて調製した水分散型高分子重
合体粒子にスペーサ基を結合させず、直接に（Ｃ）の方
法に従ってウサギＩｇＧを固定化した後、（ｄ）の方法
に従って種々の濃度で臭化カルシウムを含有する対照診
断試薬Ａを調製した。また、臭化カルシウムを含有しな
いほかは、本発明診断試薬と同じである対照診断試薬Ｂ
を調製した。

本発明による診断試薬及びこれらの対照診断試薬を（ｅ
）の方法に従って活性を判定した。結果を第４表に示す
０本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集が起こ
らず、且つ、検出感度も高いが、　　発明にスペーサ基
を介してウサギＩｇＧが固定化されてい　　　　比較な
い対照診断試薬Ａは陽性血清に対しても明瞭な　　　剤
とし凝集反応を示さず、また、対照診断試薬Ｂによれ　
　　チウムば、非特異的凝集が認められる。　　　　　
　　　　　　的診断更に、前記したスペーサ基を結合す
る方法にお　　　　これいて、スペーサ基としてエチレ
ンジアミンを用い　　　例１とた以外は、同様にしてス
ペーサ基を結合した水分　　　第５表敗型高分子重合体
粒子を調製し、次いで、この粒　　　非特異子に架橋剤
としてグルタルアルデヒドを用いる通　　　の場合常の
方法によってウサギＩｇＧを固定化した（粒子　　　実
施例１ｇ当りの固定化量４３ｍｇ）後、前記と同じ方法
　　　　実施に従って臭化カルシウムを種々の濃度で含
有させ　　　水分散て、本発明による免疫活性物質を得
た。この診断　　　して力試薬もスペーサ基としてε−
アミノカプロン酸を　　　た後・用いて得た診断試薬と
殆ど同じ活性を示した。　　　　　本発明実施例２　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　合体校実施例
１と同じウサギＩｇＧ固定化水分散型高分　　　あった
予電合体粒子分散液を用いて、実施例１と同様に　　　
　次にして、種々の濃度で臭化カルシウムを含有する本
　　　高分子よる免疫学的診断試薬を調製した。

Ｄために、血化カルシウムに代えて、添加て臭化ナトリ
ウム、臭化カリウム、臭化す又は塩化カルシウムを用い
て、対照免疫学式薬を調製した。

ら各種の免疫学的診断試薬について、実施同様にして活
性の判定を行なった。結果をに示す。本発明による診断
試薬によれば、均凝集は全く起こらないが、対照診断試
薬）よ、非特異的凝集が認められる。

列２において調製したスペーサ基を有する型高分子重合
体粒子に、実施例１と同様にルポジイミドを用いてヒト
ＩｇＧを固定化し臭化カルシウム０．７５モル／ｌを含
有するこよる免疫学的診断試薬Ａを調製した。重子１ｇ
当りのヒトＩｇＧ固定化量は８７ｍｇで、後述する実施
例４において得た水分散型重合体粒子にスペーサ基を結
合させず、カルポジイミドを用いて直接にヒｔ−１ｇＧ
を固定化し、重合体粒子の水性分散液に臭化カルシウム
を０．７５モル／２濃度にて溶解させて、本発明による
診断試薬Ｂを調製した。尚、この診断試薬におけるヒＸ
、ｇＧ固定化量は、重合体粒子１ｇ当り９１ｍｇであっ
た。

このようにヒトＩｇＧを固定化した診断試薬も、リウマ
チ因子診断試薬として用いることができる。

これらの本発明による診断試薬Ａ及びＢを何らの処理も
していない種々の血清と混合攪拌し、２分後に凝集状態
を判定した。結果を第６表に示す。

本発明の診断試薬によれば、非特異的凝集がなく、且つ
、検出感度も高い。

比較のために、臭化カルシウムを含有しないほかは上記
診断試薬Ａと同じ対照診断試薬Ｃを調製し、また、平均
粒径０．３５μｍのカルボキシル化ポリスチレンラテッ
クス粒子にスペーサ基ｔ−結合させず、直接にカルボジ
イミドを用いてヒトＩｇＧを固定化し、その分散液に臭
化カルシウムを０゜７５モル／１濃度にて溶解させて、
対照診断試薬Ｄを調製した。更に、臭化カルシウムを含
まないは　　　分かは、上記本発明の診断試薬Ｂと同じ
対照診断試薬Ｅを調製した。　　　　　　　　　　　　
　　　　　　らこれら対照診断試薬の活性も第６表に示
す。対　　　７゜照診断試薬Ａによれば、非特異的凝集
が認められ　　　せる。また、対照診断試薬りの場合は
、調製当初か　　　得ら自然凝集が認められ、陰性血清
に対してのみな　　　［ｂ）らず、緩衝液に対してもほ
ぼ同様に疑陽性と判定される凝集（±）が生じた。　　
　　　　　　　　　　、り実施例４　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ア（ａ）　　水分散型高分子
重合体粒子の調製　　　　　　　　（Ｃｌアクリル酸５
．０重量％、ビニルスルホン酸ナトリウム０．１重量％
、前記式（８）で表わされる　　　　量ＩＨ，ＩＨ，２
８，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルメタクリ　　　液
レート２０．０重量％、メタクリル酸メチル３５．０　
　　れ重量％、メタクリル酸イソブチル３５．０重量％
及　　　ピびジエチレングリコールジメタクリレート４
．９重　　　２景％からなる単量体混合物６０ｇを用い
た以外は、　　抗実施例１と同様にして重合率９９．５
％にて平均粒　　　１径０．３０μｍの水分散型高分子
重合体粒子の水性　　　化成液を得た。

この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得れた重合
体粒子を０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ５）に固形分濃
度５重量％となるように分散さて、水分散型高分子重合
体粒子の水性分散液をた。

重合体粒子へのスペーサ基の結合 実施例１と同様にして、カルボジイミド法によ１．上で
得た重合体粒子にスペーサ基としてω−ミノカプリル酸
を結合させた。

抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化上で得たス
ペーサ基を結合した重合体粒子５重％を含む水性分散液
５ｎ＋Ｌ　、０．　ＯＩ　Ｍホウ酸緩衝（ｐＨ７，５）
　２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混合し、こに１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノブロル）カルボジイミド塩
酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍ１）ｎ＋１を加えた後、抗ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモ７体溶液（抗ＨＣＧ、５ｍｇ／ｍ
ｌ）を５ｍｌ添加し、５℃で３時間反応を行なった。抗
ＨＣＧの固定量は粒子１ｇ当り４０ｍｇであった。

（ｄｌ　　免疫学的診断試薬の調製 実施例１と同様の方法により、臭化カルシウムをそれぞ
れ０．７５モル／ｌ及び０．５０モル／ｌ濃度にて含有
すると共に、重合体粒子濃度１．５重量％である本発明
による免疫学的診断試薬を得た。

ｔｅ＋　　免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質として抗ＨＣＧを固定化した本試薬は妊娠
診断試薬として用いることができる。　上で得たそれぞ
れの診断試薬と血清を原液のままガラス板上にて等量混
合し、３〜５分後の凝集の有無を判定したところ、いず
れの診断試薬の場合も、血清１ｍｌ中に１国際車位のＨ
ＣＧがあれば凝集が起こり、容易に且つ正確に妊娠の有
無を判定することができた。非特異的凝集は全く起こら
なかった。

他方、臭化カルシウムを含有しない対照診断試薬によれ
ば、妊娠していないヒト血清の場合も、疑陽性と判定さ
れる非特異的凝集が生じた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であってもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、 （ｂ）スルホン酸基を有するビニル単量体０．００１〜
   １０重量％、 （ｃ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は −（ＣＨ＿２）＿ｍ−▲数式、化学式、表等があります
   ▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体及び上記スルホン酸基を有
   するビニル単量体を除くラジカル共重合性ビニル単量体
   との混合物であって、この混合物に基づいて上記アクリ
   ル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜１００重量
   ％である混合物５０〜９９．７９９重量％、及び （ｄ）多官能性内部架橋用単量体０．１〜２０重量％、 からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なる水分散型高分子重合体粒子が共有結合により免疫活
   性物質を固定化されて、水性媒体中に分散されてなる免
   疫学的診断試薬において、臭化カルシウムが配合されて
   いることを特徴とする免疫学的診断試薬。
2. （２）免疫活性物質がスペーサ基を介して共有結合にて
   水分散型高分子重合体粒子に固定化されていることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫学的診断試薬
   。
3. （３）臭化カルシウムが０．０１〜１．５モル／ｌの範
   囲の濃度で配合されてなることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。
4. （４）ｐＨが６〜９であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。