JPS61159165A - 免疫学的診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からなり、ラテックス凝集反応において非特異的凝集
反応がなく、且つ、凝集反応の判定が容易であると共に
、保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬に関する。

（従来の技術） 近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の状態の医
学的診断のために、血液、尿その他の体液中の生理活性
物質が存する免疫活性を利用する免疫学的診断方法が広
く用いられている。この方法は、免疫学的な反応を起こ
す抗原又は抗体のいずれか一方、又は両者を組合せて体
液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対
応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によって、
上記のような免疫活性成分の存在を決定する方法である
。この場合、肉眼による観察を容易にするために、一般
に、抗原又は抗体は微粒子状の担体、例えばラテックス
、赤血球等に担持されて診断試薬とされ、このような粒
子の凝集反応を利用して、血清等の体液中の被検成分が
測定される。

例えば、ラテックスからなる診断試薬の凝集反応につい
て説明すると、抗原又は抗体を担持させたラテックスを
含有する水性分散液からなる診断試薬を被検液と混合す
ると、上記抗原又は抗体に対応する被検液中の抗体又は
抗原は、ラテックス上の抗原又は抗体と特異的に反応し
、ラテックス凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒
子の凝集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察し得る
凝集は起こらない。このようにして、抗原又は抗体を固
定化した微粒子の凝集反応の有無によって、被検液中の
抗体又は抗原の存在を測定することができる。

このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質、即ち、
抗原又は抗体が微量にでも被検液中に存在すれば、これ
を検出し得る高い感度と１．目的とする免疫活性物質と
のみ反応する高い特異性を有することが要求される。更
に、長期間の保存によっても、高い感度及び特異性を保
持することが要求される。

・このような免疫学的診断試薬としては、従来、ポリス
チレンラテックス粒子表面に抗原及び抗体を物理吸着に
より固定化してなる診断試薬や、カルボキシル化ラテッ
クス粒子にカルボジイミド、ジアルデヒド等を用いて共
有結合により固定化してなる診断試薬等が提案されてい
る。しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、血清
と反応させたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血
清のみならず、対応する抗体又は抗原を含まない陰性血
清に対しても凝集反応を起こすことがある。

このような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれており
、しばしば診断を誤まらせることがある。

このような非特異的凝集反応が起こる理由は必ずしも明
らかではないが、一つには血清中に含まれる補体等の因
子によるものと考えられる。

従って、従来、ラテックス粒子の非特異的凝集を防ぐこ
とを目的として、ラテックス凝集反応の有無の判定を行
なう際に、血清をグリシン等の緩衝液で希釈したり、或
いは血清中の補体を失活させる非動化処理を施すことが
行なわれている。しかし、このような処理によっては、
非特異的凝集を十分に抑制することは困難であり、また
、手間を要して、診断に時間がかかるという問題がある
。

このようなラテックス診断試薬における問題を解決する
ために、従来より、非特異的凝集反応を抑制することを
目的として、添加剤を添加することが一般に行なわれて
おり、かかる添加剤として、例えば、グリコール類や、
ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、或いはポリアニ
オン等が知られている。しかし、これらの添加剤の効果
は一般に十分ではないので、近年、添加剤として、例え
ば、ショ糖及び塩化コリン（特開昭５４−０２６３２７
号公報）、グアニジン、グアニジン塩酸塩、グアニジニ
ウムチオシアン酸塩、尿素等を代表とするケイオトロピ
ック剤（特開昭５６−１５８９４７号公報）　、Ｎ、Ｎ
−ジアルキルアミドやジ低級アルキルスルホキシド（特
開昭５５−１６０８５３号公報）等が提案されているが
、これらの添加剤も非特異的凝集を抑制する効果は十分
ではない。

（発明の目的） 本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記した問題
を解決するために鋭意研究した結果、免疫活性物質を固
定化した水分散型高分子重合体粒子水性分散液にパント
テン酸カルシウムを共存させることにより、非特異的凝
集が起こらず、且つ、凝集反応の有無の判定が容易であ
ると共に、保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬を得
ることができることを見出して、本発明に至ったもので
ある。

従って、本発明は、血清を希釈することなく、しかも、
非動化処理も行なわずに、非特異的凝集が抑制され、且
つ、凝集反応の有無の判定が容易であると共に、保存安
定性にすぐれる免疫学的診断試薬を提供することを目的
とする。

（発明の構成） 本発明による免疫学的診断試薬は、免疫活性物質を固定
化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液中にパン
トテン酸カルシウムが配合されてなることを特徴とする
。

本発明による免疫学的診断試薬において、免疫活性物質
を固定化するための担体である水分散型高分子重合体粒
子の平均粒径は、好ましくは０．０３〜２μｍ１特に好
ましくは０．１〜１μｍである。

平均粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した水
分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による凝集を肉
眼で観察することが困難であり、一方、大きすぎるとき
は、重合体粒子に安定な分散状態を保持させるのが困難
となるからである。また、重合体粒子の比重は、０．９
〜１．５の範囲にあることが好ましく、更に、後述する
ように、免疫活性物質を固定化した後の比重が１．０〜
１．３の範囲にあることが好ましい。重合体粒子が免疫
活性物質の固定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を
有するときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るようになり、
一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子が分散液の水
性媒体中に沈降し、凝集しやすくなって、同様に分散安
定性に劣るようになるからである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、通
常、不飽和二重結合を有する単量体の−又は二基上の乳
化重合によって調製される。かかる単量体としては、例
えば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量体、
酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチレン
、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量
体、アクリル酸メチル等のアクリル酸エステル系単量体
、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステル系単量
体、ブタジェン等のジエン系単量体等が用いられる。

また、これら単量体の単独重合体又は共重合体を改質す
るために、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリ
ル、メタクリレートリル、アクリルアミド等の単量体を
前記単量体と共重合させることもできる。

更に、上記単量体と共に、単量体成分として多官能性単
量体を内部架橋剤として乳化共重合させて、架橋させた
水分散型高分子重合体粒子を得ることもできる。内部架
橋剤は、重合体に架橋構造を導入するので、診断試薬中
に含まれれば好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、得られる重合体粒子のガラス転移温度を高め
ることができる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中で
の分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３
−ブチレンゲリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等も内部架橋剤と
して用いることができる。

尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる水分散型
高分子重合体粒子が融着、凝集を起こさないように、所
要のガラス転移点を有するように選ばれるが、ガラス転
移点は、診断試薬の保存温度及び診断試薬の使用温度を
考慮して、通常、１０℃以上、好ましくは室温以上であ
る。

免疫活性物質が共有結合にて上記水分散型高分子重合体
粒子に固定化される場合は、重合体粒子はその表面に官
能基を有することが必要である。

このような官能基としては、例えばカルボキシル基、水
酸基、グリシジル基、アミノ基、ヒドラジド基等を挙げ
ることができる。従って、これらの官能基を有する重合
体粒子を調製するには、単量体成分として、例えば、ア
クリル酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有す
る単量体、例えば、°ヒドロキシエチルアクリレート、
２−ヒドロキシメチルメタクリレートのような水酸基を
有する単量体、例えば、グリシジルメタクリレートのよ
うなグリシジル基を有する単量体を、必要に応じて、他
の共重合性単量体と乳化共重合させることによって得る
ことができる。

また、所要の単量体成分を重合させた後、得られた水分
散型高分子重合体粒子に官能基を導入することもできる
。このための方法としては、例えば、アクリル酸エステ
ルを単量体成分として重合させて得た重合体粒子を加水
分解することにより、カルボキシル基を有する重合体粒
子を得ることができる。また、アミノ基やヒドラジド基
を有する水分散型高分子重合体粒子を調製するには、例
えば、アクリルアミドのようなアミド基ををする単量体
、又はアクリル酸メチルのようなメチルエステル基を有
する単量体をそれぞれ他の単量体と乳化共重合し、得ら
れた共重合体中のアミド基をホフマン分解し、又はメチ
ルエステル基をヒドラジンと反応させることにより得る
ことができる。

しかし、このように官能基を有する水分散型高分子重合
体粒子に免疫活性物質を共有結合にて固定化するための
方法は、特に制限されず、従来より知られている任意の
方法によることができる。

例えば、好・ましい方法の一つとして、水溶性カルボジ
イミドの存在下に、免疫活性物質の有するアミノ基と水
分散型高分子重合体粒子の有するカルボキシル基とを反
応させ、アミド結合を形成させることにより結合するこ
とができる。水溶性カルボジイミドとしては、例えば、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩ｉ１塩、１−シクロヘキシル−３−（２−
モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−）ルエ
ンスルホネート等を挙げることができる。このような水
溶性カルボジイミドを用いる免疫活性物質の共有結合に
よる重合体粒子への固定化は、従来より知られている通
常の条件下で行なうことができ、重合体粒子の水性分散
液に免疫活性物質と共に適宜量、例えば、水性分散液の
単位容量当りに０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように
水溶性カルボジイミドを添加し、通常の条件、例えばｐ
Ｈを４〜１０に保持して、５〜６０℃程度の温度で数分
乃至数十時間、通常、１〜５時間程度反応させればよい
。　。

また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン法により
、また、アミノ基であるときはジアルデヒドと反応させ
、これら官能基を活性化することによって、タンパク質
の共有結合による固定化の常法を用いて固定化すること
ができる。

更に□、本発明による免疫学的診断試薬においては、水
分散型高分子重合体粒子に免疫活性物質を共有結合によ
って固定化するに際して、必要に応じて、免疫活性物質
の重合体粒子上での自由度を高めるために、重合体粒子
と免疫活性物質とをスペーサ基を介在させて共有結合に
て結合させることができる。このスペーサ基は、予め重
合体粒子に結合させ、この後にこのスペーサ基と免疫活
性物質とを結合させてもよく、或いはスペーサ基を予め
免疫活性物質に結合させ、これを重合体粒子に結合させ
てもよい。更に、必要に応じて、重合体粒子及び免疫活
性物質の両方に予めスペーサ基を結合させ、これらを相
互に結合させることも′できる。

スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二官能
性の有機化合物であり、具体例として、例えば、ヘキサ
メチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレ
ンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−アミノプロ
ピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等の
アミノアルキルカルボン酸、アミノ酸類等が好ましく用
いられるが、これらに限定されるものではない。

尚、本発明においては、水分散型高分子重合体粒子に免
疫活性物質を固定化するに際して、前述したような共有
結合法によらずに、物理吸着法やイオン結合法によって
重合体粒子に固定してもよいことはいうまでもない。

本発明において用いる免疫活性物質としては、特に制限
はなく、抗原、抗体及びハプテン等いずれを用いてもよ
い。例えば、ヒト及び動物免疫グロブリン、変性免疫グ
ロブリン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性タンパク（
ＣＲＰ）や肝炎ウィルス関連抗原、風疹ＨＡ抗原等の各
種ウィルス抗原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅
毒トレポネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパク成分
、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
等の各種ホルモン等が挙げられ、また、これらの抗原成
分に対する抗体等も使用することができる。

本発明による免疫学的診断試薬は、上記のように固定化
した免疫活性物質の失活が起こらないように、水分散型
高分子重合体粒子が適当なｐＨ及び濃度のグリシン緩衝
液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液に分散され
ていると共に、この重合体粒子の水性分散液に粒子の非
特異的凝集を抑制するための添加剤としてパントテン酸
カルシウムが配合されてなる。

本発明による免疫学的診断試薬において、上記緩衝液の
濃度は、通常、０．００５〜０．２Ｍの範囲が適当であ
り、好ましくは０．０１〜０．１Ｍの範囲である。また
、緩衝液のｐｉは、水分散型高分子重合体粒子の分散安
定性及び抗原抗体反応の活性を考慮して、通常、６〜９
、好ましくは７〜８．５の範囲である。また、診断試薬
における重合体粒子の濃度は、通常、０．０１〜５重量
％の範囲であるが、好ましくは０．１〜３重量％の範囲
である。

パントテン酸カルシウムは、免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液において、０．
１〜０．７５モル／ｊ！、好ましくは０゜２〜０．５モ
ル／βの濃度で含有される。水性分散液におけるパント
テン酸カルシウム濃度が０．１モル／ｌよりも少ないと
きは、陰性血清に対する非特異的凝集の抑制効果が乏し
く、一方、濃度が０゜７５モル／１を越えるときは、却
って陽性血清に対する特異的凝集が抑制されることとな
るからである。尚、本発明による免疫学的診断試薬には
、防腐効果を与えるために、アジ化ナトリウム等の防腐
剤を添加してもよい。

本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫学的診断
は、例えば、診断試薬と被検液とをガラス板又はプラス
チック板の富み又は平面板上又はマイクロプレート上に
おいて混合し、肉眼又は顕微鏡観察によって、重合体粒
子の凝集の有無を判定することにより行なわれる。また
、凝集の有無を光学的な変化として判定することもでき
る。

（発明の効果） 以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からな番と共に、パントテン酸カルシウムを含有し、
この結果、その理由は必ずしも明らかではないが、重合
体粒子の非特異的凝集が完全に阻止されるので、診断に
際して、血清を緩衝液で希釈したり、或いは葬儀化処理
しなくとも、迅速に正確な判定を行なうことができる。

更に、本発明による診断試薬は、例えば、血清と均一に
混じりやすく、凝集の有無判定が容易である。また、従
来の診断試薬に比較して、その保存安定性に著しくすぐ
れる。

また、免疫活性物質の担体として用いる水分散型高分子
重合体粒子は、粒径を含む品質が均一であるうえに、そ
れ自体は免疫活性をもたないので、固定化操作が容易で
あると共に、固定化重合体粒子は高い検出感度と高い特
異性とを有し、かくして、高精度での診断を可能とする
診断試薬を与える。゛ （実施例） 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （ａ）　　水分散型高分子重合体粒子の調製メタクリル
酸メチル７．５ｇ、メタクリル酸イソブチル７．５ｇ、
アクリル酸１．０ｇ、メタクリロニトリル３．０ｇ及び
トリエチレングリコールジメタクリレート０．７ｇを蒸
留水３７０ｇに加え、更に蒸留水１０ｇに過硫酸カリウ
ム０．１ｇを溶解させた重合開始剤水溶液を加え、窒素
気流下、７５℃の温度で攪拌速度１９０ｒｐ■で攪拌し
つつ、８時間重合を行なった０重合率９９％にて平均粒
径０゜２８μｍの水分散型高分子重合体粒子を含む水性
分散液を得た。

この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水にて４回遠
心分離し、次いで、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，
５）にて２回遠心分離して、水相中の水溶性高分子を除
去し、重合体粒子を精製した後、この重合体粒子を０．
０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固形分が５重量％
となるように再分散させた。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得た水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液１００ｍ１とε−
アミノカプロン酸水溶液（０，０２Ｍ）　　１００ｍｌ
とを混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，
５に調製した。０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に溶解させた１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５Ｂ／ｍｌ）
　２０ｍｌを上記水性分散液に加え、室温で３時間、攪
拌下に反応させた。−夜、冷蔵庫に放置した後、０．０
１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて３回遠心洗浄して
、スペーサ基を結合した重合体粒子を得、これを０．Ｏ
ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固形分５重量％にな
るように再分散させた。

（Ｃ）　　ウサギＩｇＧの固定化 上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重合体粒子
の水性分散液５ｍｌ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７
，５）　２ａ＋１及び蒸留水１１ｍ１を混合し、これに
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｎ＋ｔ）２ｍｌを加
え、１０分後にウサギＩｇＧ水溶液（５ｒｓｇ／ｍｌ）
を５ｍｌ添加し、１５℃で２時間反応させた。

次に、反応混合物中の余剰の水溶性カルボジイミドを消
費するために、１００重量％Ｌ−アルギニン水溶液（ｐ
Ｈ７，５）　５ｍｌを加え、１時間インキュベートした
。次いで、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜２）にて
遠心洗浄を３回行なった後、０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，２）に分散させて全量１０ｍ１、即ち、重合体
粒子濃度２．５重量％に調整し、かくして、ウサギ■ｇ
Ｇを前記スペーサ基を介して共有結合にて固定化した水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。

（ｄ）　　免疫学的診断試薬の調製 パントテン酸カルシウムをホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）
に溶解し、ｐｉを８．２に調製した後、上で得たウサギ
ＩｇＧ固定化重合体粒子の水性分散液と混合し、パント
テン酸カルシウムを種々の濃度で含有する本発明による
免疫学的診断試薬を調製した。

（ｅ）　　免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質としてウサギＩｇＧを固定化した本試薬は
、リウマチ因子検出試薬として用いることができる。

この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性血清を原
液の・ままそれぞれガラス板上にて等容量混合攪拌し、
２分後に凝集状態を肉眼判定ｔた。

その結果を第１表に示す。本発明による診断試薬におい
ては、非特異的凝集反応が起こらないが、パントテン酸
カルシウムを含有しない対照診断試薬では、非特異的凝
集が著しい。

第　　１　　表 （注）凝集の判定は以下による。

−二顕微鏡観察（１００倍）によっても凝集が認められ
ない。

一゛：肉眼では凝集が全く認められないが、顕微鏡観察
（１００倍）によれば、僅 かに凝集が認められる。

＋　　：肉眼にて凝集が明らかに認められる。

＋＋：少し強い凝集が認められる。

＋＋＋：激しい凝集が認められる。

実施例２ 実施例１と同じスペーサ基を結合した重合体粒子５重量
％を含む水性分散液５ｍｌ、　０．　ＯＩ　Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ７，５）２ｍｌ及び蒸留水１１１を混合し、
これにｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩水溶１（５ｍｇ／ｍｌ）　２ｍ
ｌを加えた後、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体溶液
（抗ＨＣＧ、５ｍｇ／＋ｍｌ）を５ｍｌ添加し、１５℃
で３時間反応を行なった。

この後、実施例１と全く同様に処理して、重合体粒子を
０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に分散させて、
全量１０−１に調製し、抗ＨＯＧ固定化水分散型高分子
重合体粒子の水性分散液を得た。

重合体粒子１ｇ当りの抗ＨＣＧ固定化量は４０ｍｇであ
った。

次に、この抗ＨＣＧ固定化重合体粒子の水性分散液を実
施例１と同様に処理して、それぞれパントテン酸カルシ
ウムを０．５モル／１及び０．２モル／　ｌ　ｔａ度で
含有すると共に、重合体粒子濃度が１゜５重量％である
本発明による免疫学的診断試薬を得た。

免疫活性物質として抗ＨＣＧを固定化した本試薬は妊娠
診断試薬として用いることができる。

この診断試薬と血清を原液のままガラス板上にて等量混
合し、３〜５分後の凝集の有無を判定したところ、血清
１ｍｌ中に１国際車位のＨＣＧがあれば凝集が起こり、
容易に且つ正確に妊娠の有無を判定することができた。

非特異的凝集は全く起こらなかった。

他方、パントテン酸カルシウムを含有しない対照診断試
薬によれば、妊娠していないヒト血清の場合も、疑陽性
と判定される非特異的凝集が生じた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
   粒子の水性分散液中にパントテン酸カルシウムが配合さ
   れてなることを特徴とする免疫学的診断試薬。