JPS63273060A - 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 倉果上旦机且分国 本発明は、共有結合にてラテックス粒子に生理活性物質
を固定化するための生理活性物ｆ同定化用ラテックス、
及びこのラテックスを用いて製造されるラテックス免疫
比濁法のためのラテックス試薬に関する。

獲米皇茨■ 担体に生理活性物質を固定化してなる固定化生理活性物
質は、その生化学的反応を利用して種々利用されている
。その代表例として、酵素を水不溶性の担体に固定化さ
せてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固定化させてな
る免疫学的診断試薬が知られており、前者は近年、工業
的な酵素反応に実用化され、また後者は従来より種々の
診断に広く実用化されている。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。前記した固定化
酵素はかかる問題を解決するために実用化されたもので
あり、この固定化酵素に基質を反応させることによって
、酵素反応が行なわれる。

このような固定化酵素の製造方法として、代表的には、
水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理
吸着によって結合させる担体結合法が知られている。し
かし、従来、用いられている担体は、通常、セルロース
、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、ポリ
アクリルアミドゲル、多孔性ガラス等の径１ｍｍ乃至数
寵の粒子であり、このような粒子に酵素が固定化された
同定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場合、固
定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間を要すると共
に、反応収率が低いという問題がある。

そこで、担体としてラテックス粒子を用いることも提案
されている。例えば、従来の代表的なラテックスは、乳
化剤及び水溶性ラジカル重合開始剤の存在下に、例えば
スチレンのような水難溶性ラジカル重合性単量体を乳化
重合させて製造されている。

ここに、上記乳化剤は、一般に、乳化重合時における重
合安定性を確保すると共に、粒径が小さく、分散安定性
のよい重合体粒子を得るのに効果がある。乳化剤がこの
ようにして得られる重合体粒子の分散安定性を高める作
用については、必ずしも明らかではないが、−ａには、
乳化剤の一部が重合体粒子に吸着されており、残余は媒
体中に遊離の状態で存在し、このように水分散型高分子
重合体粒子の水分散液中において、これら重合体粒子に
吸着された乳化剤と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡
が存在し、かかる平衡の結果として、重合体粒子の分散
安定化が達成されるとされている。

従って、このように乳化剤を含むラテックスは、重合体
粒子に酵素等の生理活性物質を固定化するために、これ
を緩衝液や生理食塩水中に分散させたとき、乳化剤の前
記したような吸着脱着平衡がくずれる結果、重合体粒子
の分散安定性が損なわれて、重合体粒子が凝集、沈降し
、粒子の自由度が奪われ、生化学的反応性が低下する。

また、遊離の乳化剤は、酵素反応等の生化学的反応の妨
害物質となることが多い。

このため、近年、それ自体が乳化能を有する単量体、例
えば、スチレンスルホン酸ナトリウムやポリエチレング
リコールモノメタクリレート等を乳化剤の不存在下にス
チレンと乳化共重合させて、ラテックスを得る方法も提
案されているが、かかるラテックスを用いるときは、ラ
テックス粒子が反応性を有する官能基をもたないために
、生理活性物質をラテックス粒子に吸着法にて固定化し
なければならず、その結果、同定化し得る生理活性物質
が限定されるほか、かかる固定化生理活性物質を実用に
供し得るｐＨ範囲もまた限定され、更には、一般に、保
存安定性が悪い等、種々の問題を有している。

他方、スチレンとメタクリル酸とを共重合させてなる所
謂カルボキシル化ポリスチレン等のようなカルボキシル
化ラテックスに生理活性物質を共有結合にて固定化する
方法も提案されている。しかし、上記従来より知られて
いるカルボキシル化ラテックスは、一般に、分散安定性
や保存安定性に劣り、特に、ラテックス粒子に多量の生
理活性物質を固定化した場合や、或いはラテックスと共
に多量の生理活性物質が共存する環境下では、ラテック
ス粒子が容易に凝集沈降し、その生化学的活性が著しく
低下する。特に、生理活性物質を固定化したラテックス
を生理食塩水や有機質溶質を含有する緩衝液に分散させ
た場合に、この傾向が著しい。

他方、前記した免疫学的診断試薬は、血液、尿その他の
被検液としての体液中の生理活性物質が有する免疫活・
性を利用する免疫学的診断のために用いられる試薬であ
って、かかる免疫学的診断方法には、例えば、免疫学的
な反応を起こす抗原、抗体のいずれか一方、又は両者を
組合せて体液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、
これらに対応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、
即ち、抗原抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応
によって、上記のような免疫活性成分の存在を測定する
方法等がある。この場合、肉眼や光学的方法による測定
を容易にするために、一般に、抗原又は抗体は水不溶性
の微粒子状の担体、例えば、ラテックス、赤血球等に担
持されて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応を
利用して、血清等の体液中の被検成分が測定される。

このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質が微量に
でも被検液中に存在すれば、これを検出し得る高い感度
と、目的とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性
を有することが要求される。

更に、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異
性を保持することが要求される。

このような免疫学的診断試薬としては、従来、前述した
ように、ポリスチレンラテックス粒子を担体として用い
、その表面に抗原や抗体を物理吸着により固定化してな
る診断試薬や、カルボキシル化ラテックス粒子にカルボ
ジイミド、ジアルデヒド等を用いて抗原や抗体を共有結
合により同定化してなる診断試薬等が提案されている。

しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、前述した
ように、分散安定性や保存安定性に劣る等の問題を有す
るほか、特に、被検液と反応させたとき、対応する陽性
物質のみならず、陰性物質に対しても凝集反応を起こす
ことがある。このような凝集反応は非特異的凝集反応と
呼ばれている。このような非特異的凝集反応を起こすこ
とは、診断試薬として致命的な欠点である。

そこで、近年、このようなラテックスの非特異的凝集反
応を防ぐために、例えば、血清や尿のような被検液を数
百倍乃至数千倍にも希釈し、光学セル中でラテックスと
反応させ、抗原抗体反応に基づくラテックス凝集反応を
可視光、近赤外光、紫外光、レーザー光等の吸光度や、
濁度、散乱等の光学的変化によって測定するラテックス
免疫比濁法が開発されている。

しかし、この方法においては、上記のような被検液の大
幅な希釈は、当然に感度の著しい低下を招き、更には、
上記光学的変化のばらつきを大きくし、従って、測定の
再現性に劣ることとなる。

他方、ラテックス試薬の感度を高めるために、ラテック
スへの抗原抗体等の固定化量を多くすれば、光学的変化
のばらつきが増幅され、測定可能な被検液中の抗体抗原
濃度の範囲も極めて限られることとなる。また、前述し
たように、却って非特異的凝集反応も起こりやすくなる
。

「が解・“　しようとする、Ｒ点 従って、本発明は、固定化生理活性物質のための水不溶
性担体としてラテックスにおける上述したような問題を
解決するためになされたものであって、ラテックスの製
造時において、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現
性にて重合を行なうことができ、しかも、得られるラテ
ックス粒子がその粒径分布が狭（、且つ、分散安定性及
び保存安定性にすぐれ、更に、生理活性物質を安定確実
に共有結合にて固定化することができ、このようにして
得られる固定化生理活性物質が分散安定性及び保存安定
性にすぐれる生理活性物質固定化用ラテックスを提供す
ることを目的とする。

更に、本発明は、上記のラテックス粒子に、特に、抗原
、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化し、分散安定
性及び保存安定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応
を起こさずに、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検
液中の抗原抗体量を正確に再現性よく測定することがで
きるラテックス免疫比濁法のためのラテックス試薬及び
その製造方法を提供することを目的とする。

シラを解決するための　段 本発明による生理活性物質固定化用ラテックスは、 （ａｌ　　芳香族ビニル単量体１００重量部、（ｂ）ス
ルホン酸基を有するビニル単量体０．０１〜５重量部、 （ｃ）　　α、β−不飽和カルボン酸単量体１〜２０重
量部、及び （ｄｌ　　内部架橋用多官能性単量体０．０５〜５重量
部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させて得られる
平均粒子径０．０３〜２．０μｍの共重合体粒子からな
ることを特徴とする。

以下に本発明による生理活性物質固定化用ラテックスに
ついて、詳細に説明する。

先ず、本発明において用いる芳香族ビニル単量体の具体
例としては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、
ビニルトルエン等を挙げることができるが、好ましくは
、スチレンが用いられる。

本発明によれば、かかる芳香族ビニル単量体を単量体組
成における主成分とするために、与テックス粒子は約１
．０５の比重を有し、分散媒である水や緩衝液の比重に
近いので、得られるラテックスは、分散安定性にすぐれ
、特に、長期間にわたる保存においても、粒子が凝集沈
降しない。

スルホン酸基を有するビニル単量体としては、エチレン
スルホン酸のようなアルキレンスルホン酸や、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数２〜３のアルキレン基を示し、
Ｍは水素、アルカリ金属又はアンモニウムを示す。） で表わされるスルホアルキルアクリレート、例えば、ス
ルホプロピル（メタ）アクリレートやそのアルカリ金属
塩、一般式 （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、Ｍは前記と同じである。） で表わされるスチレンスルホン酸、その誘導体、これら
のアルカリ金属塩、例えば、スチレンスルホン酸ナトリ
ウム、一般式 ％式％ （但し、Ｒ４は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、ＲＳは炭素数１〜６のアルキレ
ン基、好ましくは炭素数３〜４のアルキレン基を示し、
Ｍは前記と同じである。）で表わされる２−アクリルア
ミドアルカンスルホン酸、その誘導体及びこれらのアル
カリ金属塩、例えば、２−アクリルアミド−２−メチル
プロパ゛ンスルホン酸等が用いられる。

このようなスルホン酸基を有するビニル単量体は、乳化
剤の不存在下での前記芳香族ビニル単量体の乳化共重合
時の重合安定性と、得られるラテックスの分散安定性を
高める効果を有する。かかる効果を有効に発現させるた
めに、本発明においては、単量体組成において、上記ス
ルホン酸基を有するビニル単量体は、前記芳香族ビニル
単量体１００重量部に対して、０．０１重量部以上の範
囲で含まれる。しかし、過多に用いるときは、却って、
重合安定性と得られるラテックスの分散安定性、特に、
保存安定性を劣化させるので、前記芳香族ビニル単量体
１００重量部に対して、５重量部以下の範囲で含まれる
。

更に、本発明において用いられるα、β−不飽和カルボ
ン酸は、好ましくは、一般式 ％式％ （但し、Ｒ６は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、好ましくは水素又はメチル基、Ｒ７は水素又
は低級アルキル基を示し、好ましくは水素又はメチル基
を示し、Ｒ６が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ７
はカルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体である。

このようなアクリル酸誘導体の好ましい具体例として、
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロ
トン酸、マレイン酸、フマル酸、モノアルキルマレイン
酸、モノアルキルフマル酸、モノアルキルイタコン酸等
を挙げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリ
ル酸及びイタコン酸の１種又は２種以上の混合物が好ま
しく用いられる。

このようなアクリル酸誘導体は、得られるラテックス粒
子に生理活性物質を共有結合にて固定化するための官能
基であるカルボキシル基を与えるために必須であると共
に、本発明において、単量体混合物の乳化共重合時の重
合安定性を高め、また、得られるラテックスに水性媒体
中での分散安定性を高める効果を有する。ラテックス粒
子に実用量の生理活性物質を固定化し得ると共に、上記
効果を有効に得るためには、本発明においては、アクリ
ル酸誘導体は、単量体組成において、芳香族ビニル単量
体１００重量部について、少なくとも１重量部を必要と
する。しかし、過多に共重合単量体成分として用いると
きは、却って重合安定性と、得られるラテックス分散安
定性を損なうので、アクリル酸誘導体は、単量体組成に
おいて、芳香族ビニル単量体１００重量部について、２
０重量部以下の範囲で用いられる。特に好ましい範囲は
、２〜１（ｌｆｆｉ部である。

更に、本発明においては、単量体成分として、内部架橋
用多官能性単量体が用いられる。この内部架橋用多官能
性単量体は、共重合体に架橋構造を導入するので、存在
する場合には好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、ラテックス粒子を非膨潤化して、重合体粒子
の水性媒体中での分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートが好ま
しく用いられる。具体例として、例えば、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタ
クリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート
、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３−
ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリ
メタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレ
ート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等が
好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、Ｎ
’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架橋
用単量体として用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、本発明においては、前記
芳香族ビニル単量体１００重量部について、０．０５〜
５重量部の範囲で用いられる。０．０５重量部よりも少
ないときは、ラテックス粒子における架橋密度が小さす
ぎ、他方、５重量部を越えるときは、却って重合安定性
と得られるラテックスの分散安定性を損ない、好ましく
ないからである。

本発明によれば、以上のような各単量体を水中にて、水
溶性のラジカル重合開始剤を用いて、乳化剤の不存在下
に乳化共重合させることにより、粒径が均一であり、且
つ、水中での分散安定性及び保存安定性にすぐれるラテ
ックスを得ることができる。このように、本発明による
前記単量体組成によれば、乳化剤を要せずして、安定に
共重合させることができると共に、得られるラテックス
の分散状態が安定に保持されるのが大きい特徴をなす。

上記乳化共重合において、単量体成分混合物の水中での
濃度は、得られるラテックスにおける重合体粒子の平均
粒径とも関連するが、通常、５〜４０重量％の範囲であ
る。

重合開始剤としては、前述したように、水溶性ラジカル
重合開始剤が用いられる。通常、過硫酸カリウム、過硫
酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、こ
れら過硫酸塩と千オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム
、チオ硫酸水素ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又は
亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリ
ウム等のような亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が
好ましく用いられるが、これらに限定されるものではな
い。これら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対し
て０．１〜１重量％の範囲が好適である。重合の雰囲気
も特に制限されないが、安定した重合反応の開始のため
には、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が用い
られる。また、重合温度は、特に制限されないが、通常
、２０−１００℃、好ましくは４０〜９０℃の範囲であ
る。

本発明においそば、ラテックス粒子の平均粒径は０．０
３〜２．０μｍ、好ましくは０．０５〜１．０μｍであ
る。粒径が小さすぎると、ラテックス粒子の種々の処理
や操作において、その回収が困難となり、一方、粒径が
大きすぎると、水中での安定な分散状態を確保すること
が困難となる。

本発明によるラテックスに固定化される生理活性物質は
、特に、限定されるものではない。具体例として、例え
ば、種々の酵素、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加
水分解酵素、リア゛−ゼ、異性化酵素、リガーゼ等や、
補酵素、ポリペプチド、抗原、抗体、ハプテン、ホルモ
ン類等を挙げることができる。

本発明によるラテックス粒子には、生理活性物質は、ラ
テックス粒子の存するカルボキシル基を利用して、共有
結合にて固定化される。この場合、生理活性物質は、共
有結合にて直接にラテックス粒子に結合されていてもよ
く、又はラテックス粒子に共有結合にてスペーサ基が結
合され、このスペーサ基に生理活性物質が共有結合にて
結合されていてもよい。後者におけるように、生理活性
物質がスペーサ基を介してラテックス粒子に固定化され
るときは、固定化された生理活性物質のラテックス粒子
上での自由度が高められる利点がある。

しうち、本発明によるラテックス粒子は、このように、
ラテックス粒子にスペーサ基を結合しても、その分散安
定性や保存安定性が損なわれることがないのである。

前記スペーサ基として用い得る化合物は、少な（とも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
る゛ものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基
を有する二官能性の有機化合物が好ましい。このような
スペーサ基として機能する化合物の具体例として、例え
ば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン
、キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−
アミノプロピオン酸、Ｔ−アミノ酪酸、ε−アミノカプ
ロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカル
ボン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギ
ニン、グリシルグリシルグリジン等のアミノ酸類等が好
ましく用いられるが、これらに限定されるものではない
。

カルボキシル基を有するラテックス粒子に直接に生理活
性物質を共有結合にて固定化し、或いはラテックス粒子
にスペーサ基を共有結合にて結合し、このスペーサ基に
生理活性物質を共有結合にて固定化するための方法は、
特に制限されず、従来より知られている任意の方法によ
ることができる。

例えば、好ましい方法の一つとして、架橋剤と。

して水溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げることが
できる。例えば、ジアミンをスペーサ基として用いる場
合であれば、水溶性カルボジイミドの存在下に、ジアミ
ンの有するアミノ基とラテックス粒子の有するカルボキ
シル基とを反応させ、アミド結合を形成させることによ
り、スペーサ基を重合体粒子に結合させ、次いで、同様
に水溶性カルボジイミドを用いて、このスペーサ基の有
するアミノ基を利用して、生理活性物質を共有結合にて
固定化することができる。

かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−
ｐ−トルエンスルホネート等を挙げることができる。

また、本発明においては、固定化すべき生理活性物質の
有する官能基や、前述した結合試薬の種類に応じて、ス
ペーサ基を用いて、ラテックス粒子のカルボキシル基の
一部又はすべてをカルボキシル基以外の官能基、例えば
、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等に変換してもよい
。

更に、スペーサ基の有する官能基、例えば、アミノ基で
あれば、これをジアルデヒドにて活性化した後、遊離の
アルデヒド基を利用して、これに生理活性物質のアミノ
基を結合させることができる。ジアルデヒドとしては、
特に限定されるものではないが、例えば、グルタルアル
デヒドやグリオキザール等を用いることができる。

本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテックス
試薬は、これまでに説明したラテックス粒子を担体とし
、これに抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて固定化
することによって得ることができる。

即ち、本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテ
ックス試薬は、 （ａｌ　　芳香族ビニル単量体１００重量部、（ｂ）　
　スルホン酸基を有するビニル単量体０．０１〜５重量
部、 （ｃ）　　α、β−不飽和カルボン酸単量体１〜２０重
量部、及び （ｄ）　　内部架橋用多官能性単量体０．０５〜５重量
からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させてなる平均
粒子径０．０３〜２．０μｍの共重合体粒子を含むラテ
ックスに抗原′、抗体又はハプテンを共有結合にて固定
化してなることを特徴とする。

上記抗原、抗体又はハプテンは、特に、限定されるもの
ではないが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ＋、Ｃａ、Ｃ
ＲＰ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ　（ａｂ）　’、ホルモン、ポリ
ペプチド等を挙げることができる。

発明の効果 以上のように、本発明による生理活性物質固定化用ラテ
ックスは、スチレンを主成分とする所定の単量体混合物
を共重合させてなり、平均粒径０゜０３〜２．０μｍ１
比重約１．０５、屈折率約１．６の重合体粒子を含むラ
テックスであって、先ず、ラテックスの製造時において
、乳化剤の不存在下に高い安定性及び再現性にて重合を
行なうことができ、しかも、得られるラテックス粒子が
その粒径分布が狭く、且つ、分散安定性及び保存安定性
にすぐれ、従って、その種類や固定化量に限定されるこ
となく、生理活性物質を安定に且つ再現性よく共有結合
にて固定化することができる・従って、また、このラテ
ックス粒子を担体として生理活性物質を共存結合にて固
定化してなる固定化生理活性物質もまた、分散安定性及
び保存安定性にすぐれる。

特に、本発明によるラテックス免疫比濁法のためのラテ
ックス試薬は、上記したようなすぐれた特性を有するラ
テックス粒子に抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて
固定化してなるものであるので、分散安定性及び保存安
定性にすぐれると共に、非特異的凝集反応を起こさずに
、被検液の広い濃度範囲にわたって、被検液中の抗原抗
体量を正確に再現性よく測定することができる。

更に、−Ｃに、メタクリル酸メチルを主成分とする重合
体粒子の場合は、比重が大きく、１．２に近いうえに、
屈折率が約１．４〜１．５の範囲にあって、このように
、屈折率が小さいときは、ラテックス免疫比濁法におい
て、吸光度や濁度の変化率が小さく、感度が小さい。こ
れに対して、本発明によれば、前述したように、ラテッ
クス粒子がスチレンのような芳香族ビニル単量体を主成
分とするので、重合体粒子が約１．６程度の屈折率を有
し、ラテックス免疫比濁法において感度の高い測定を可
能とする。

尖施開 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。尚、以下に
おいて、部は重量部を表わす。

実施例１ スチレン１００部、スチレンスルホン酸ナトリウム０．
５部、アクリル酸５．０部、トリエチレングリコールジ
メタクリレート０．２部及び蒸留水４１０部を反応容器
に仕込み、窒素ガスにて十分に置換した後、７０℃に昇
温し、３００ｒｐｍにて３０分間攪拌した。この後、同
様の撹拌下に過硫酸アンモニウム０．５部を蒸留水２０
部に溶解した重合開始剤水溶液を加え、７０℃の温度で
８時間重合させた。重合率は９８．６％であった。

このようにして得られたラテックスにおける重合体粒子
は、コールタ−社製サブミクロン・パーティクル・アナ
ライザーにて測定した結果、平均粒子径は０．１２μｍ
１粒径の変動係数は８％であった。また、重合体粒子の
表面のカルボキシル基量をアルカリ電導度滴定法によっ
て測定した結果、６．２μモル／ｄであった。

上記と同様にして、第１表に示す単量体組成にて、番号
２〜６のラテックスを得た。

比較例１ 実施例１と同様にして、第１表に示す単量体組成にて、
比較例１番号１〜６のラテックスを得た。

以上のようにして得た実施例１及び比較例１のそれぞれ
ラテックスについて、その乳化共重合時の重合安定性及
び得られたラテックス粒子の平均粒径を第１表に示す。

また、ラテックスを４０℃においてｐＨ９，０で４８時
間放置した。このように処理したときのラテックス粒子
上のカルボキシル基量の変化率をラテックス安定性とし
て第１表に示す。このカルボキシル基量の変化率もアル
カリ電導度滴定法によった。

更に、ラテックス粒子の生理食塩水中での分散安定性及
び種々の方法にてラテックス粒子にスペーサ基を結合し
た後のラテックスの分散安定性を第２表に示す。分散安
定性の評価は、光学顕微鏡（２００倍）にて観察し、次
のＡ、Ｂ及びＣの３段階評価によった。

Ａ　均一であって、凝集は認められない。

Ｂ　肉眼では凝集は認められないが、顕微鏡観察によれ
ば凝集が認められる。

Ｃ肉眼でも凝集が認められる。

ラテックス粒子の生理食塩水中での分散安定性の評価方
法及びスペーサ化の方法を以下に示す。

生食水での　性 ０．９重量％の塩化ナトリウムを含むホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０，０，ＯＩＭ）にラテックス粒子を５％濃度と
なるように分散させ、その直後及び２か列後の分散安定
性を評価した。

ｍ−キシリレンジアミンによるスペーサ化ラテックス粒
子をホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，ＯＩＭ＞に５重量
％濃度となるように分散させ、この分散液１０ｍ１をｍ
−キシリレンジアミン水溶液（０，０３Ｍ）１０…Ｉ及
び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）　　２ｍ
ｌと混合し、ＰＨ７，５，１０℃で２４時間反応させた
後、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，ＯＩＭ）にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分５重量％になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。

シスタミンによるスペーサ化 ラテックス粒子をホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，ＯＩ
Ｍ）に５重量％濃度となるように分散させ、この分散液
１０ｍ１をシスタミン水溶液（０，０３Ｍ＞１０ｍ１及
び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩水溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）　２ｍｌ
と混合し、ｐＨ７，５，１０℃で２４時間反応させた後
、ホウ酸緩衝液（ｐｌ（８，０，０，０１Ｍ）にて遠心
洗浄し、同じホウ酸緩衝液に固形分５重量％になるよう
に再分散させ、その直後の分散安定性を評価した。

±土二土化 上記シスタミンにてスペーサ化したラテックス粒子の有
するジスルフィド結合を２−メルカプトエチルアミンに
て完全にチオール基に還元し、その直後の分散安定性を
評価した。

次に、本発明によるラテックス粒子を担体とする固定化
生理活性物質の具体例を挙げる。

文乞ヱニ丸皿足化 第１表に示す種々のラテックス粒子を５重量％濃度で含
有するホウ酸緩衝液（ρ■７．５．０．０１Ｍ）３ｍｌ
をホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，０１Ｍ）、ウレアー
ゼ水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　２．５　ｍｌ及びｌ−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　０．６　ｍｌと混合
し、４℃で２４時間反応させた後、遠心分離し、ホウ酸
緩衝液（ｐｎ’ｒ、ｏ、０．０１Ｍ）にて洗浄して、ウ
レアーゼが固定化されたラテックスを得た。

このようなウレアーゼの固定化処理前後の２８０ｎｍに
おける吸光度の変化からラテックス粒子におけるウレア
ーゼ同定化量を求め、次に、ラテックスの単位重量当り
に固定化されたウレアーゼの活性を同じ量の遊離のウレ
アーゼの活性にて除した値を比活性とし、これを第３表
に示す。

また、ラテックス粒子の初期活性も示す。ウレアーゼの
活性は、次のようにして測定した。即ち、３重量％尿素
水溶液を基質として、３５℃にて酵素反応させ、生成し
たアンモニア量を０．２　Ｎ塩酸にて滴定し、アンモニ
ア１ｍｍｏｌを１分間に生成する活性を１単位とした。

次に、ウレアーゼを固定化したラテックスをホウ酸緩衝
液（ｐＨ７，０，０，ＯＩＭ）にて遠心洗浄し、再度、
同じホウ酸緩衝液に５重量％濃度に分散させ、このよう
にして、１０回の洗浄を繰り返した後、上記と同様にし
て、ラテックスのウレアーゼ活性を測定した。これを相
対活性として、第３表に示す。

ウサギＩｇＧの　電化 第１表に示す実施例１番号１〜６及び比較例１番号１及
び３のｍ−キシリレンジアミンにてスペーサ化したラテ
ックスをホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０，０、ＯＩＭ）に固
形分５重量％となるように分散させた。

上記スペーサ化うテックス３１１１１％ホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，０、０，ＯＩ　Ｍ）　１．８　ｍｌ　１−エチ
ル−３＝（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　０．６　ｍｌ及びウ
サギＩｇＧ水溶液（５■／ｍｌ）　２．１ｍｌを混合し
、１０℃で２００時間反応せた後、上記と同じホウ酸緩
衝液にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に５重量％濃度
に分散させた。

このようにして、ウサギＩｇＧをラテックス粒子１ｇ当
り４０■を固定化したラテックス試薬を得た。

第１表に示す比較例１番号のラテックスについては、こ
れにウサギＩｇＧを吸着法にて同定化させた。固定化量
は、ラテックス粒子１ｇ当り４２ｍｇであった。

０．９重量％の塩化ナトリウムを含むホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，２，０，ＯＩＭ）に（ヤギ）抗ウサギＩｇＧを溶
解させ、これを被検液として、その５０μｌを上記ラテ
ックス試薬５０μｌとガラス板上で混合し、その凝集を
観察した。結果を第４表に示す。

実施例２ ラテックス粒　へのスペーサ　のｌ 実施例１と同じ単量体混合物を同じ方法にて乳化剤の不
存在下で乳化共重合させ、得られたラテックス粒子をホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，０１Ｍ）に５重量％濃度
となるように分散させた。この分散液１００ｍ１とε−
アミノカプロン酸水溶液（０゜０３Ｍ）　　１００Ｉｌ
ｌと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（３８ｕ／ｍｌ）　２０ｍ
ｌとを混合し、２５℃で３時間、次いで、４℃で１７時
間反応させた。この後、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０，０
，ＯＩＭ）にて遠心洗浄して、スペーサ基の結合された
重合体粒子を得、これを上記と同じ緩衝液に固形分濃度
５重量％となるように再分散させて、スペーサ化ラテッ
クスとした。

ウサギＩｇＧの固定化 上記スペーサ化ラテックス３ｍｌ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８，０，０，０１Ｍ）　１．８ｍｌ、　１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　０．６　ｍｌ及びウサギＩ
ｇＧ水溶液（５■／ｍｌ）　２．１　ｍｌを混合し、１
０℃で２０時間反応させた後、上記と同じホウ酸緩衝液
にて遠心洗浄し、同じホウ酸緩衝液に５重量％濃度に分
散させた。

次に、このラテックスをウシ血清アルブミン０゜２％と
塩化ナトリウム０．９％を含むホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
０，０，ＯＩＭ）に０．５重量％となるように分散させ
て、ラテックス粒子１ｇ当りウサギＩｇＧ４３■を固定
化したラテックス試薬を得た。

ラテックス試薬の活性の測 抗つサギＩｇＧ血清をウシ血清アルブミンホウ酸緩衝液
（ウシ血清アルブミン０．２％、塩化ナトリウム０．９
％、ｐｕｓ、ｏ、０．０１Ｍ）に溶解させ、ＡＩｇＧと
した。

セルに前記ウサギＩｇＧ固定化ラテックス試薬３０μｌ
と上記と同じウシ血清アルブミンホウ酸緩衝液４５０μ
ｌを入れ、次いで、上記ＡＩｇＧ溶液１５０μ２を入れ
、２０秒間攪拌した後、分光光度計に据え付け、３０秒
後の６００ｎｍにおける吸光度Ｔ０及び１００秒後の６
００ｎｍにおける吸光度Ｔ１　とをそれぞれ測定した。

吸光度変化ΔＴ　＝ＴＩ−Ｔ、とＡＩｇＧ溶液の濃度と
の関係を第１図に示す。

本発明のラテックスによれば、高濃度を含むＡｒｇｃ溶
液の広い濃度範囲について、吸光度変化との間に直線性
を得ることができる。

上記において、抗つサギＩｇＧ血清に代えて、リウマチ
陽性及び陰性の血清（非希釈）を用いた場合は、陰性血
清ついてはΔＴは０、陽性血清についてはΔＴは０．１
０４であった。

また、ＡＩｇＧ活性は、ラテックス試薬を室温で６か月
間放置した後も、全く変わらなかった。

比較例２ 実施例１において、スチレンスルホン酸ナトリウムを単
量体成分として用いない以外は、実施例１と同じ方法に
て平均粒径０．１８μｍのカルボキシル化ポリスチレン
ラテックスを得た。

このラテックスを用い、前記と同様にして、これにε−
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギＩｇＧを固定化させた。　　゛実施例２と同
様にして、これをラテックス試薬として、リウマチ陽性
及び陰性の血清（非希釈）を用いて、その活性を評価し
たところ、陰性血清ついてはΔＴは０．１８０、陽性血
清についてはΔＴは０．１７１であって、非特異凝集性
が顕著であった。

また、ＡＩｇＧ溶液の場合は、第２図に示すように、５
〜７０μｇ／ｍｌの濃度範囲においてのみ、直線性が認
められるにすぎなかった。

比較例３ 実施例１において、トリエチレングリコールジメタクリ
レートを単量体成分として用いない以外は、実施例１と
同じ方法にて平均粒径０．１４μｍのカルボキシル化ポ
リスチレンラテックスを得た。

実施例２と同様にして、このラテックスにε−アミノカ
プロン酸をスペーサ基として結合させた後、これにウサ
ギＩｇＧ固定化して、ウサギＩｇＧ固定化ラテックス試
薬を得た。

実施例２と同様にして、このウサギＩｇＧ同定化ラテッ
クス試薬のＡＩｇＧ活性を試薬の調製の直後と６か月後
とにおいて測定したところ、ΔＴの変動が著しく、６か
月後のΔＴは試薬の調製直後の約ｌ／１０に減少してい
た。

実施例３ 実施例１において、単量体成分として、スチレンスルホ
ン酸のナトリウム塩に代えて、スルホプロビルメタタリ
レートを用いた以外は、実施例１と同じ方法にて平均粒
径０．２１μｍのカルボキシル化ポリスチレンラテック
スを得た。

このラテックスを用い、前記と同様にして、これにε−
アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、こ
れにウサギＩｇＣ，に代えて、抗ヒト胎盤性性腺刺激ホ
ルモン抗体（ｈｃＧ）を同様にして固定化して、抗ｈｃ
Ｇ固定化ラテックス試薬を得た。

標準ｈｃＧ溶液を用いて、同様にΔＴを測定した。

結果を第５表に示す。

第５表

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるラテックス粒子を担体とするラ
テックス試薬を用いたときの抗つサギＩｇＧ抗体の濃度
と吸光度変化との関係の一例を示すグラフ、第２図は、
比較例としての担体を用いたときの同様の抗体の濃度と
吸光度変化との関係の一例を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）芳香族ビニル単量体１００重量部、（ｂ）
   スルホン酸基を有するビニル単量体０．０１〜５重量部
   、 （ｃ）α，β−不飽和カルボン酸単量体１〜２０重量部
   、及び （ｄ）内部架橋用多官能性単量体０．０５〜５重量部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
   カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させて得られる
   平均粒子径０．０３〜２．０μｍの共重合体粒子からな
   る生理活性物質固定化用ラテックス。
2. （２）（ａ）芳香族ビニル単量体１００重量部、（ｂ）
   スルホン酸基を有するビニル単量体０．０１〜５重量部
   、 （ｃ）α，β−不飽和カルボン酸単量体１〜２０重量部
   、及び （ｄ）内部架橋用多官能性単量体０．０５〜５重量部 からなる単量体混合物を乳化剤の不存在下、水溶性ラジ
   カル重合開始剤を用いて水中にて共重合させてなる平均
   粒子径が０．０３〜２．０μｍの共重合体粒子を含むラ
   テックスに抗原、抗体又はハプテンを共有結合にて固定
   化してなることを特徴とするラテックス免疫比濁法のた
   めのラテックス試薬。