JPS6043361B2 - 親水性ラテックス粒子の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は親水性ラテックス粒子の製法に関する。

特に迅速かつ簡単に実施し、かつしばしば裸眼。

で観察することができるために多くの該断測定の範囲の
免疫学で利用される抗原抗体複合物の凝集反応には免疫
学的に活性な物質、例えば抗体のキャリヤとして親水性
ラテックス粒子が長い間使用されている。この親水性ラ
テックス粒子は大てい！はポリスチレンホモポリマーま
たはコポリマー、例えばスチレン、例えばスチレン／ブ
タジエンコポリマーまたはアクリルニトリル／ブタジエ
ン／スチレンコポリマー（ＡＢＳ）から成り、かつエマ
ルジョン重合により製造される。長い間知られているエ
マルジョン重合では、一般に４成分が添加される：水に
難溶性のモノマーまたは数種の水に難溶性のモノマーの
混合物、水、乳化剤および水溶性開始剤。

モノマーは乳化剤によつて小滴の形状に液化され、その
際多数の乳化剤分子の会合によつて中でも一部は空の、
かつ一部はモノマー分子によつて満たされた大きなミセ
ルが形成される。後者はモノマーの゜“可溶化゛として
示される。水溶性開始剤は、水相の各モノマー分子の重
合、またモノマーで満たされたミセルで並びにモノマー
滴で重合を開始もしくは活性化することのできるラジカ
ルを形成する。しかし実際には重合は膨潤したミセルで
起る、それ）というのも一方でミセル中のモノマー濃度
が周囲における個々の溶けたモノマー分子の濃度よりも
著しく大きく、また他方でミセルの活性化の確率がモノ
マー滴の数に比べてミセルの数が多いためきわめて高い
からである。充填ミセルの直径は重−合中にミセルが最
終的に球形のラテックス粒子に移行するまで増大する。
活性化されないミセルの乳化剤分子および消費されたモ
ノマー滴の表面からの乳化剤分子はラテックス粒子の表
面をおおい、かつ生成するポリマー分散液の安定化に役
立つ。例えば界面活性剤または湿潤剤であつてよい乳化
剤またはエマルジョン安定剤の添加下に公知方法により
製造されるラテックスは次の欠点を持つており、これら
の欠点は特に免疫学的に活性な物質のキャリヤとしての
使用および連続的な溶液測定系での使用を妨げる：１
ラテックス粒子の疎水性表面に所望の免疫学的に活性な
物質、例えば抗体の他に非特異的に多数の他の血清成分
が結合する；２共有結合によらず吸着的にのみ結合せる
免疫学的に活性な物質は診断試験の経過の中で測定中に
再び分離する場合がある；３ エマルジョン重合で乳化
剤または安定剤として使用される界面活性剤が水溶液中
に拡散して生物学的に活性なたん白質の構造を、したが
つて活性を破壊する場合がある：４安定化作用を有する
界面活性剤を除く際にラテックス懸濁液が凝集し、かつ
遠心分離の際にも安定性がこわれる。

その際生成する沈澱物は再懸濁させて前の状態にするの
がきわめて困難かまたはもはや可能ではない。これらの
欠点を回避するために既に種々の提案がなされたが、こ
れらは常に前記の問題の一部のみを解決し得たにすぎな
かつた。

カルボキシ化ＡＢＳ−コポリマーおよびカルボキシル化
スチレン／ブタジエンコポリマーから成る、粒度０．０
１〜０．９μｍの疎水性ラテックス粒子が西ドイツ国特
許公告第２２０３３７７号公報から公知であり、これら
は血清学的に不活性のキャリヤとして生物学的に活性な
たん白質に対して使用され、その際たん白質はキャリヤ
に、ラテックス中に導入されたカルボキシル基を介して
アミド結合の形成下に共有結合される。

西ドイツ国特許公開第２８１２８４５号公報からＡＢＳ
−コポリマーから成る、粒度０．０５〜１μｍの疎水性
ラテックスが公知であり、この場合でもラテックスはカ
ルボキシル基で変性され、かつ反応性側鎖と縮合してお
り、そのために免疫学的に活性な物質も共有結合できる
。

この公知の疎水性ラテックスによつて前記の第２の問題
は解決されるが他のすべての欠点は相変わらず存在する
。

したがつて疎水性ラテックスの代わりに親水性ゲルを免
疫学的な物質のキャリヤとして使用することも試みられ
た。

親水性ゲルは吸着性を全くまたはきわめて僅かしか持た
ず、他方たん白質のかかるゲルへの共有結合は公知であ
るので、その製法および粒度に基づいて４６ラテックス
′２と示してもよい゜゜マイクロゲル゛が提案された。
かかる親水性ラテックスは例えば米国特許第４１３８３
８３号明細書から公知である。該ラテックスは０．３５
μｍよりも小さな直径を有する球形粒子から成り、ラジ
カルによつて開始される水性エマルジョン重合の条件下
に製造され、その際モノマーとしてアクリルアミド、ア
クリル酸、メタクリル酸またはアクリレートが使用され
る。乳化剤としては例えば金属石けんが使用される。こ
うして得られる親水性マイクロゲルに生物学的および／
または免疫学的に活性な物質が自体公知の方法でカルボ
ジイミド−ブリッジまたはグルタルジアルデヒドーブリ
ツジを介して共有結合する。これによつて前記の第１と
第２の問題が解決されるが、第３と第４の問題は解決さ
れない。それというのもエマルジョン重合は相変らず乳
化剤または安定剤の添加下に実施しなければならないか
らである。本発明の課題は、前記の４つの欠点すべてを
回避することのできる親水性ラテックスの製法を見い出
すことである。

したがつて本発明の課題は、特に生物学的および／また
は免疫学的に活性な物質を共有結合することができ、生
物学的に活性なたん白質の構造、したがつて活性を損な
わず、その安定性が遠心分離の際にこわれず、かつ凝集
し、かつ引続き再び容易に懸濁させることのできる疎水
性ラテックス粒子の製法を見出すことである。この課題
は本発明によれば水に難溶性のモノマーのホモポリマー
またはコポリマーから成る親水性ラテックス粒子によつ
て解決され、該親水性ラテックス粒子は水溶性の、ラジ
カルを形成する開始剤の存在で、しかし乳化剤、安定剤
または湿潤剤を添加せずにエマルジョン重合によつて製
造可能であり、かつホモポリマーの場合にモノマーが、
もしくはコポリマーの場合にモノマー類の一部が分子中
に少なくとも１個の重合可能なＣ＝Ｃ−ニ重結合を含ん
だエポキシドである。

意想外にも冒頭で引用された公知技術にも記述されてい
る、当業界で長い間支配的であつた思想に反して乳化剤
、安定剤または湿潤剤の添加がエマルジョン重合の実施
にまつたく必要ではないことが示された。

したがつて、乳化剤として使用される金属石けんまたは
界面活性剤はラテックス粒子から拡散し、かつラテック
ス粒子に共有結合せるたん白質の生物学的活性を損ない
または完全に破壊したために従来は無条件に必要であつ
た、ポリマーのラテックス粒子からの大ていはきわめて
困難かつ煩雑な乳化剤の除去が省略される。少くとも１
個の重合可能な二重結合を含むグリ”シジル化合物をモ
ノマーとして使用するのがきわめて有利であると示され
た。該化合物の構造は重合性の二重結合中に疎水性部分
およびエポキシド基、オキシラン環中に同時に親水性部
分を有する。本発明により生成するラテックス懸濁液は
乳化剤、安定剤または湿潤剤の不在にもかかわらず凝集
しない。ラテックス懸濁液の安定化は塩心分離の際にも
こわされない。末端エポキシド基は種々の反応（加水分
解、アンモノリシス、アミノリシス、縮合）をきわめて
受け易いのでエポキシノド基は単分散系に分散したラテ
ックス球体の表面を該エポキシド基が水相方向に配向さ
れるようにおおつているにちがいない。モノマーとして
は本発明によれば有利にグリシジルメタクリレート、グ
リシジルアクリレート、グリシジルビニルエーテル、グ
リシジルビニルフタレートおよび３，４−エポキシブト
１エンが使用される。

その際これらのモノマーの１種を専ら使用し、その結果
、生成する親水性ラテックス粒子はホモポリマーである
が、これらのモノマーの混合物を共重合してもよい。エ
ポキシド基の含量を制御するために前記のグリシジル化
合物１種または数種と一緒に他のモノマー、例えばスチ
レン、ジエン、アクリルアミド、メタクリルアミド、ア
ルキルー、ヒドロキシアルキルーおよびアミノアルキル
アクリレート、アルキルー、ヒドロキシアルキルーおよ
びアミノアルキルメタクリレート、ビニルエーテル、ビ
ニルエステル、Ｎ−ビニルピロリドン等も共重合するこ
とができる。

着色料または螢光性化合物、例えばフルオレセインのモ
ノマーの重合性誘導体の存在で重合してもよい。

このようにしてヒトまたは動物の組織で抗原もしくは抗
体を検出するために好適である着色した、もしくは螢光
性のラテックス粒子が得られる。この検出方法は組織学
で組織断片を製造するのに特に好適である。モノマーの
重合性誘導体としては有利に着色料もしくは螢光性化合
物が使用され、この中に自体公知の方法でメタクリル基
もしくはアクリル基が導入される。生成するラテックス
粒子の水に対する難溶性を高めるためにエマルジョン重
合中に常用の架橋剤、例えばアルキレンーまたはヒドロ
キシアルキレンジアクリレート、アルキレンーまたはヒ
ドロキシアルキレンジメタクリレート、アルキレンピー
スアクリルアミドまたはアルキレンビスアクリルアミド
、ジビニルベンゼン等を添加してもよい。

開始剤としてエマルジョン重合で常用の水溶性開始剤を
使用することができる。本発明によれば有利にペルオキ
ソジスルフエート、ペルオキソボ．レート、過酸化水素
または好適なレドックス系が使用される。水に難溶性の
モノマー１種または数種を乳化剤不含のエマルジョン重
合により親水性ラテックス粒子を製造するための本発明
による方法は空中酸一素もしくは遊離の酸素に対して敏
感である。

したがつて酸素をすべてのポリマー成分および容器から
十分な煮沸、不溶性ガス雰囲気下における蒸留または窒
素、アルゴンまたは他の不活性ガスの導通によりきわめ
て慎重に除去しなければならない。乳化剤不含のエルマ
ジヨン重合は本発明によれば有利に水相対モノマー相の
浴比を容量に関して８：１〜１６：１で実施する。

水相に溶けた開始剤の濃度は有利に０．５〜１．５ｙ／
ｅであり、かつモノマー相中のエポキシドの濃度は有利
に１〜１叩重量％である。

エルマジヨン重合は有利に温度０〜８０℃で実施遵する
。

温度は選択された開始剤に依存する。ペルオキソニ硫酸
カリウムの使用の際には有利に６０〜７０℃で作業する
。同様に反応時間は開始剤の選択に依存し、５〜４叫間
である。本考案による親水性ラテックス粒子は厳密に球
形で、単分散系で分散され、かつ直径約０．１５〜１．
５μｍの互いにほぼ同じ大きさの粒子である。

親水性ラテックス粒子はエマルジョン重合終了後尚重合
されないモノマーの残分を含んでいる場合があり、この
残分は水蒸気溜または透析により除去することができる
。この場合にも遠心分離によりラテックス粒子を安定性
をこわさずに沈降させることができ、その結果引続き再
分散することができる、本発明による親水性ラテックス
粒子の特に有利な性質は保持される。このようにして本
発明によるラテックスは数度の遠心分離およびデカンテ
ーシヨンによつて簡単に精製することができる。本発明
によるラテックスの末端の遊離エポキシド基は種々の化
学物質に対して高反応性であり、したがつて容易に加水
分解でき、過ヨウ素酸塩もしくは過ヨウ素酸を用いて酸
化してアルデヒド基にし、アンモニア、第１アミン、ジ
アミンまたはヒドラジンと反応させて第１または第２ア
ミノ基にし、または他の公知の反応を用いて変性するこ
とができる。

本発明によるラテックスのエマルジョンは乳化剤を欠い
ているにもかかわらずエポキシド基の変性が所望により
エマルジョン重合の間も実施し得るほど高い安定性を有
し、そのために既に重合反応から表面が例えば第１アミ
ノ基で変性されたラテックスが生成する。次いで変性さ
れた、または誘導体化されたエポキシド基は、キャリヤ
として作用する親水性ラテックス粒子に共有結合される
生物学的におよび／または免疫学的に活性なたん白質と
の“結合（Ｋｎｐｐｌｕｎｇ）゛に使用される。更に前
記の課題は本発明による親水性ラテックス粒子を生物学
的および／または免疫学的に活性な物質の血清学的に不
活性なキャリヤとして、例えばペプチド、たん白質、酵
素、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体および微生物のキ
ャリヤとして使用することにより解決される。

本発明により製造される親水性ラテックス粒子はキャリ
ヤとしてのこのキャリヤに直接または“ブリッジ゛とし
ての結合剤を介して共有結合する、生物学的および／ま
たは免疫学的に活性な前記の物質とともに診断薬を提供
する。この診断薬は同位元素標識免疫定量法（ＲＩＡ）
、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）およびいわゆるＥＬＩＳＡ
（酵素結合免疫吸着定量法）で使用するのに特に好適で
ある。例１ ペルオキソニ硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２Ｏ３）０．０８ｙ
を蒸溜水８０ｍ１に溶かし、かつ３吟間窒素を導通させ
ることにより空中酸素を排除する。

同時にグリシジルメタクリレート１０ｍ１から同様に空
中酸素を除く。２成分をガラス反応器に入れ、かつ更に
１０分間窒素で処理する。

次いで反応器を閉じ、かつ反応を温度６５℃で不断に攪
拌下に６時間実施する。この期間の後変換率は９８％で
ある。反応生成物は直径０．４４μｍの球形の、単分散
系に分配されるポリグリシジルメタクリレート粒子から
成るラテックスである。例２ 例１と同様にしてＫ２Ｓ２Ｏ８Ｏ．Ｏ８を溶かした蒸留
水１６０ｍＬおよびグリシジルメタクリレート１５重量
％とスチレン８５重量％の混合物１０ｍ１を別個に酸素
を排除し、かつ温度６５℃で不断に攪拌下に６時間互い
に反応させる。

変換率は７１．６％である。重合しない残量モノマーを
水蒸気溜により除く。生じる単分散系コポリマーのラテ
ックス粒子は直径０．２２μｍを有する。例３ 例１と同様にして、蒸留水１００ｍｔ中のＫ２Ｓ２Ｏ８
Ｏ．ｌＶの溶液およびグリシジルメタクリレート１５重
量％と酢酸ビニル８５重量％の混合物１０ｍｔを互いに
反応させる。

変換率は８０％である。残量モノマーを水蒸気溜により
除く。生成するラテックスは直径０．１６μｍの単分散
系、球形粒子である。こうして製造されたラテックス１
００ｍｔを０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液１００ｍ１と混合し
、かつ温度約２５゜Ｃで２４時間放置する。

加水分解中および後もラテックスの安定性は保持される
。エマルジョンを遠心分離し、上澄みをデカンテーシヨ
ンし、かつ固体相を再び水中に分散させる。遠心分離お
よび再分散を２度繰返す。生じる中性エマルジョンを（
Ｍ一Ｈ２ＳＯ４でＰＨ３にし、かつ過ヨウ素酸をエポキ
シド基と当量で加える。酸化は２５℃で約２４時間行な
う。引続き末反応低分子物質を透析によつて除く。安定
なエマルジョンの変性ラテックス粒子はアルデヒド基２
．踵量％または０．９７ミリモル／ｙを含有する。例４ 例１のようにして蒸溜水１００ｍｔ中のＫ２Ｓ２Ｏ８Ｏ
．ｌｙの溶液およびグリシジルメタクリレート１５重量
％とイソプレン８５重量％の混合物１０７Ｔｔ１を温度
６５℃で２肴間反応させる。

変換率は７６％である。引続き残量モノマーを水蒸気蒸
溜により除く、その際直径０．２５μｍの安定な、単分
散系に分散する球形のラテックス粒子が生じる。引続き
このエマルジョン１００ｍ１にアンモニア水溶液（２５
％）１００ｍｔを加え、かつ室温で２碕間放置し、その
際エポキシド基がアンモノリシスによつてアミノ基に変
わる。

引続き反応性成物を過ヨウ素酸で処理し、その際アルデ
ヒド基４．５重量％または１．５５ミリモル／ｙを含有
するラテックスが生じる。例５ 例１のようにして水１．５ｅ中のＫ２Ｓ２Ｏ８ｌ．５ｙ
の溶液およびグリシジルメタクリレート１５ｍ１を別個
に酸素を除き、かつ互いに反応させる。

更に酸素不含のグリシジルメタクリレート１２０ｍＬを
酸素排除下に６時間の間反応容器に連続的に滴下する。
次いで更に３紛間重合を続ける。変換率は８５％であり
、かつ生成する粒子は直径１．１μｍを有する。例６例
１のようにしてグリシジルメタクリレート１″重量％と
スチレン９踵量％の混合物１０ｍ１および蒸留水１００
ｍ１中のＫ２Ｓ２Ｏ８Ｏ．ｌｇの溶液を６５℃で２２時
間重合し、その際直径０．５μｍの親水性ラテックス粒
子が生成する。

変換率は９０％である。例１により製造されたラテック
ス懸濁液２０ｍｔをボー苛性ソーダ液５ｍ１とともに一
夜にわたつて室温で攪拌し、次いで５時間垂に対して透
析する。残溜する懸濁液を過ヨウ素酸ナトリウム１００
即の添加によりＰＨ３に調節し、かつ一夜にわたつて室
温で攪拌し、次いで４時間蒸溜水に対して透析する。例
８ 例１により製造されたラテックス懸濁液２０ｍｔを濃ア
ンモニア溶液１０ｍ１とともに室温で２Ｃ＄Ｆｆ間攪拌
し、かつ流水に対して北時間透析する。

得られる懸濁液を遠心分離する。乾燥物質の窒素含量は
約１％であり、これは各約１０のエポキシド単位のアミ
ノ化に相当し、しかし表面の優れた反応では確実により
高い誘導体化度に相当する。遠心分離された固体物質を
０．１Ｎ一苛性ソーダ液２０ｍｔで吸収する。これに攪
拌下にジメチルホルムアミド６ｍｔに溶かしたコハク酸
ヒドロキシサクシンイミドエステルーアミドアセトアル
デヒドーアセタール１．５ｙを滴下する。生成する懸濁
液を更に３時間攪拌し、次いで１Ｎ一塩酸でＰＨ３にし
、かつ流れる蒸溜水に対して１満間透析する。例９ 例１により製造されたラテックス懸濁液２０ｍ１にＮａ
２Ｓ−９Ｈ２００．５ｙを加え、かつ室温で２日攪拌す
る。

引続き懸濁液の臭いがなくなるまで流れる蒸留水に対し
て透析し、次いで懸濁液を遠心分離する。乾燥物質はイ
オウ約２％を有し、これは約１０のエポキシド単位の誘
導体化に相当し、表面での優れた反応ては確実により高
い誘導体化度に相当する。遠心分離された生成物にジメ
チルホルムアミド６ｍ１に溶かした６−マレインイミド
ヘキサン酸ヒドロキシサクシンイミドエスエル１ｆを加
え、室温で３時間攪拌し、次いで流れる蒸溜水に対して
１濁間透析する。

例１０ ラテックスーγ−グロプリンコンジユゲート（ＫＯｎｊ
ｕｇａｔ）の形成γ−グロブリン溶液１１ｒＬ１（たん
白質５６．６７７！９含有）にａ）例１により製造され
たラテックス懸濁液ｂ例７により誘導体化されたラテッ
クス ｃ例８により誘導体化されたラテックス ｄ例９により誘導体化されたラテックス 各２０ｍ１を加え、かつ室温で丘時間透析する。

残留する懸濁液を遠心分離する。引続き上澄み液中の遊
離のたん白質を測定する。実測値からラテックス粒子に
結合された割合を計算することができる。それによれば
バッチａ）はγ−グロブリン ８ｍ９を結合して含有、バッチｂ
）はγ−グロブリン ４３ｍｇを結合
して含有、バッチｃ）はγ−グロブリン
１５ｍｇを結合して含有、バッチｄ）はγ−グロブ
リン １９ｍｇを結合して含有。

例１１ラテックスー１ｇＧ一共液体 例１０のようにしてＩｇＧ一溶液および種々のラテック
スー１ｇＧ共液体を製造する。

抗体複合体形成によつてラテックス粒子にＩｇＧ−分子
が積載されていることが検出される。以下本発明による
親水性ラテックス粒子の使用例として、詳細にはヒンジ
の抗Ｔ４一血清からのＴ４一抗体を用いてチロキシン（
Ｔ４）を免疫定量するための、および二重抗体一分離法
を用いて血清中のヒトチレオトロピン（ＴＳＨ）を定量
するための２つの該断薬を記載する。

例１２ヒンジｔ／ＬＴ４一血清に対するキャリヤとして
のホモポリグリシジルメタクリレートラテックス粒子の
使用：Ｔ４上ＬＩＳＡを行なうための該断薬チロキシン
Ｔ４をＥＬＩＳＡを用いて定量するための先ずヒンジの
抗Ｔ４一血清からのＴ４一抗体を本発明による親水性ホ
モポリグリシジルメタクリレートラテックス粒子に、該
粒子に例７〜９のいずれかによつて誘導体化し、かつ例
１０および１１と同様にしてＴ４一抗体と反応させるこ
とによつて共有結合させる。

こうして得られるソリッドフェース（ＳＯｌｌｄ−Ｆａ
ｃｅ）一抗体は試験のための第１試薬である。第２試薬
としてＴ４を自体公知の方法で好適な酵素、例えばベル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）またはβ−ガラクトシダーゼ（
β−Ｇａｌ）で標識する、すなわち結合して酵素コンジ
ユゲートにする。酵素としてこの例ではβ−Ｇａｌを使
用する。第３試薬は未知量のＴ，を含有する試料であり
、かつ第４試薬は酵素コンジユゲートのβ−Ｇａｌの常
用の基質であり、詳細にはこの例ではトリスーＨｃｌ一
緩衝液（ＰＨ７．３）中のニトロフェニルーβ一ガラク
トシドである。試験の原理は次の３つの反応経過に基づ
く：１ 一方の親水性ラテックス粒チに共有結合せるＴ
４一抗体と他方の酵素標識Ｔ４Ｃ゜酵素コンジユゲード
）と試料中に含まれる遊離のＴ４との間の免疫反応。

この反応ではソリッド−フェースー抗体、酵素コンジユ
ゲートおよび試料のＴ４の間に競合的結合が起こる。２
Ｂ／Ｆ一分離（Ｂ＝結合、Ｆ＝遊離）。

これは結合した酵素コンジユゲートＢと結合しない酵素
コンジユゲートＦの分離である。この分離は有利に遠心
分離または例えば水または好適な緩衝液に対する透析に
よつて達成一・：れる。３酵素コンジユゲートと常用の
、使用される酵素に関して特異的な基質との間に進行し
、かつ比色法または他の公知方法で追跡することのでき
る酵素検出反応。

酵素活性は上澄み液（遊離部分）中でかまたは再懸濁さ
れた沈澱物（結合部分）中で測定することができる。ノ
試験実施 前記のようにして製造されたラテックスー抗Ｔ４懸濁液
を水または緩衝溶液中で比１：１０００で希望する。

この懸濁液０．５ｍ１に種々の既知量のＴ４一含量を有
するＴ４一血清標世溶液１００μｍおよびＴ４−β−Ｇ
ａ！−コンジユゲート溶液１００μｍを加える。反応混
合物を室温で３紛恒温保持する。恒温保持の間１バッチ
を不断に振盪し、かつ同じＴ４一標準含量を有する１バ
ッチを単に放置した。次いでそれぞれ懸濁液を遠心分離
し、かつＦ一相が存在する上澄み液を分離した。Ｂ一相
、すなわちソリッド−フェース抗体に結合したＴ４−β
−Ｇａｌコンジユゲートは沈澱物中に存在する。酵素活
性を測定するためにこれをから成る、ＰＨ７．３の過剰
の基質溶液に加え、かつ公知方法で波長４０５ｎｎ１で
吸光度を測定する。

外部の止械的な混合をしない場合に懸濁状態で保持され
るラテックス粒子が約１１％減少したシグナルを与える
こ？が示された。このようにしてＴ４一検量曲線を測定
した後、引続き同様にしてＴ４一標準血清１００ｐＩの
代わりに未知量のＴ４含量の試料それぞれ１００μｍを
使用し、かつ再懸濁後のＢ一相の吸光度を基質溶液中で
測定することにより定量を行なつた。

親水性ラテックス粒子が抗体および抗原のキャリヤとし
てきわめて好適であり、かつそれらの免疫反応性を損な
わないことが認められた。

したがつて親水性ラテックス粒子はソリッド−フェース
ー酵素免疫試験でキャリヤとして有利に使用することが
できる。更に緩衝剤条件にある親水性ラテックス粒子が
長期間にわたつて懸濁状態を保持し、したがつて粒子の
密度がほぼ１に等しいことが認められた。その上に本発
明による親水性ラテックス粒子は免疫反応性を損なわず
に良好に遠心分離可能であり、かつ再懸濁可能である。
例１３ ヒトチレオトロピン（ＴＳＨ）を定量するための酵素免
疫定量（ＥＩＡ）ヒト血清中のＴＳＨの測定は甲状腺腺
病の該断で著しく重要である。

基礎ＴＳＨ濃度の著しい上昇で１次甲状腺機能減弱が認
められる。その他血清中の゛爲Ｈ基礎値０．５〜３μＵ
がＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出因子）で刺激後に上
昇しない場合に甲状腺機能減弱は確実にあり得ない。そ
れに対してＴＳＨ値が少なくとも２．５μＵ／ｍｌ、し
かし２５μＵ／ｍｌ以上で上昇する場合には甲状腺物質
代謝は高い確率で損なわれていない。２５μＵ／ｍｌを
僅かに上回つた基礎値の上昇は潜在的な症状発現前の甲
状腺機能減弱を推測することができる。

既にπ■の酵素免疫定量は公知である〔“゜クリニカ・
ヒミカ●アクタ（ＣｌｌｎｉｃａＣｈｅｍｉｃａＡｃｔ
ａ）１′、第６７巻、２６３〜２６８頁（１９７岬）
゜゜エンツイーメ・ラ・ヘルド●イムノアツセイ・オ
ブ●ホルモンズ・アンド ドラツグス（ｅ厄Ｙｍｅｌａ
ｂｅｌｌｅｄｉｍｍｕｎＯａｓｓａｙＯｆｈＯｒｍＯｎ
ｅｓａｎｄｄｒｕｇｓ）′５、３２７〜３３頂。Ｓ．Ｂ
．Ｐａｌ、ＷａＩｔｅｒｄｅＧｒｕｙｔｅｒｌベルリン
およびＮ．Ｙ．（１９７８年） ゛アナリユーチカル
ビ オ ケ ミ ス ト リ （Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌＢｌＯｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）゛２第９６巻、４１
９〜４２５頁（１９７９年）〕。しかしこれらの公知の
測定法はきわめて長い恒温保持時間（５日まで）を必要
として、鋭敏ではなく（′ＹＳＨ５μＵ／ｍｌ）または
高温な測定装置（蛍光測定装置）を前提とし、その際そ
の他にバッチを混合するための装置が必要である。本発
明による親水性ラテックス粒子の使用は２１１２田こす
ぎない全恒温保持時間で二重抗体分離技術によるＴＳＨ
の測定法による測定を可能にする。その際第２の抗体が
本発明による親水性ラテックス粒子に共有結合される。
次いで結合された酵素活性をＢ／Ｆ一分離により測定す
る。ラテックス粒子は水の密度よりも著しくは高くない
密度を有しているので、ラテックス粒子は酵素反応の間
も懸濁状態にあり、これにより常用の混合が省略される
。抗体の負荷可能性のために可能であるきわめて希釈さ
れたラテックス粒子を使用する場合には酵素終了後の粒
子の遠心分離も省略される、それというのも懸濁液を通
過して測光できるからである。免疫学的試験方法で一般
に使用されるラテックスとは異なり抗体を負荷された、
本発明による親水性ポリグリシジルメタクリレート粒子
は遠心分離後容易に再懸濁させることができる。

同じ理由から酵素で標識された抗原のきわめて小さな非
特異的吸着が示される（第１抗体の不在での結合された
活性）。試験実施 ＴＳＨ一標準（ＴＳＨ不含血清中の国際参照調剤ＲＶｌ
ＲＣ６８／３８）０．２ｍ１を１：１５００００で水ま
たは好適な緩衝溶液で希釈した、自体公知の、例えばモ
ルモツトの抗′ＴＳＨ一抗血清０．１ｍｔとともに恒温
保持する。

１２時間後グルコースオキシダーゼ （ＧＯＤ）に共有結合せるＴＳＨ（ＴＳＨ約１．５×１
０−Ｖに相当）から成る酵素コンジユゲートの溶液０．
１ｍＬを第１工程の混合物にピペットで添加する。

この混合物に更に１満間後ラテックス懸濁液０．１ｍ１
をピペットで添加する。該懸濁液はメタクリレートラテ
ックス０．１〜１ｍ９／ｍｌを含有し、その際例１１に
記載されているように乾燥ラテックス粒子１０００ｍ９
につき、モルモツトー１ｇＧに対するヤギの抗血清から
得られた免疫グロプリンフラクシヨンのたん白質５〜１
５０ｍ９を加え、かつそうして親水性ラテックス粒子に
共有結合された。１時間後遠心分離し、かつラテックス
粒子の沈澱物を好適な緩衝溶液１ｍ１で洗う。

それによりラテックス粒子は再懸濁される。引続き改め
て数度遠心分離し、かつ洗浄する。上澄み液を棄てる。
各バッチにＧＯＤの基質溶液１ｍｔをピペットで入れ、
かつ短時間振盪する。

その後少なくとも２時間ラテックス粒子は均一に懸濁さ
れたままである。次いで懸濁液を目盛リクベツトに入れ
、かつ４０５ｎｍで吸光度を測定する。各吸光度から基
質盲検値Ｌ１を引く。Ｌ１は、抗ＴＳＨ一抗血清とＴＳ
Ｈ−ＧＯＤとの混合物に添加された前記のラテックス懸
濁液と同じ物質を負荷されたラテックス粒子を含む基質
溶液１ｍ１の吸光度である。こうして求められた吸光度
を種々のＴＳＨ標準濃度に関して記録する。

この検量曲線を用いて臨床試料中の未知含量のＴＳＨの
濃度を測定した吸光度に基づいて続み取る。好適な緩衝
溶液として有利にＥＤＴＡＯ．ＯＯ５モル、ウシ血清ア
ルブミン０．１％並びにＮａＣｌＯ．ｌ５モルを含む０
．０４Ｍ−ホスフェート溶液（ＰＨ７．４）を使用する
。

ＧＯＤ一基質溶液として有利にグリコース５ｇ／１００
ｍｔ１２，７−アジ／−ジー〔３−エチルーベンズチア
ゾロンースルホン酸（６）〕（ＡＢＴＳ）１００ｍｇ／
１００ｍ１１ベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）５ｍｇ／１０
０ｍ１１０．０５Ｍ−ホスフェート緩衝液（ＰＨ５．６
）を含む水溶液を使用する。

比較のために３つの血清試料のＴＳＨ含量を前記ＥＩＡ
（Ａ）並びに公知の二重抗体−ＲＩＡ（Ｂ）で測定した
。次表に示す通りそれぞれ測定値は良く一致する：前記
のＴＳＨ一測定からも、本発明による親水性ラテックス
粒子が生物学的および／または免疫学的に活性な物質、
特にキャリヤとしてきわめて好適であることが得られる
。

非特異的結合の測定 ＴＳＨ標準試料を前記の試験実施の項目で記載されたよ
うにして処理し（試料Ｃ）、かつほとん・ど試料Ｃと同
じ反応にかけられた同様な試料（試料Ｄ）と比較する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水に難溶性のモノマーのホモポリマーまたはコポリ
   マーから成る親水性ラテックス粒子を製造するための方
   法において分子中に少なくとも１個の共重合または重合
   可能なＣ＝Ｃ−二重結合を含むエポキシドを場合により
   他の共重合可能なモノマーとの混合物で水中に分散させ
   、かつ酸素排除下に水溶性のラジカル形成性開始剤の存
   在で、しかし乳化剤、安定剤または湿潤剤を添加せずに
   エルマジヨン重合によつてホモ重合または共重合するこ
   とを特徴とする、親水性ラテックス粒子の製法。 ２ エポキシドとしてエポキシ−アルキレン化合物もし
   くはグリシジルエステルまたはグリシジルエーテルを使
   用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ エポキシドとしてグリシジルアクリレートまたはグ
   リシジルメタクリレートを使用する、特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の方法。 ４ エマルジョン重合を２個または数個不飽和の架橋剤
   の添加下に実施する、特許請求の範囲第１項から第３項
   までのいずれか１項記載の方法。 ５ エマルジョン重合の際に浴比（水：モノマー相）が
   容量に関して８：１〜１６：１である、特許請求の範囲
   第１項から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６ 水相中の開始剤の濃度が０．５〜１．５ｇ／ｌであ
   る、特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか１
   項記載の方法。 ７ モノマー相中のエポキシドの濃度が１〜１００重量
   ％である、特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
   れか１項記載の方法。 ８ エマルジョン重合を温度０〜８０℃で実施する、特
   許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか１項記載
   の方法。 ９ 末端エポキシド基を含有するラテックスをエマルジ
   ョン重合中にまたは該重合後に水酸化アルカリ水溶液、
   アンモニア水溶液、第１アミン、ヒドラジンまたはスル
   フィドと加水分解、アンモノリンス、アミノリンスまた
   はチオ−リシス反応させて末端ヒドロキシル、場合によ
   りモノ置換されたアミノ基またはチオール基を形成し、
   これらの基を場合により引続き酵素によりまたは過ヨウ
   素酸塩もしくは過ヨウ素酸を用いてアルデヒド基に変え
   る、特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１
   項記載の方法。