DE3530312A1

DE3530312A1 - Traeger fuer die photometrische immunspezifische bestimmung von antigenen oder antikoerpern, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE3530312A1
Application number: DE19853530312
Authority: DE
Inventors: Guenther Dr Sawatzki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-08-24
Filing date: 1985-08-24
Publication date: 1987-02-26

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die photometrische, insbesondere quantitative immunspezifische Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, wie sie unter der Bezeichnung "ELISA" bekannt ist, und bezieht sich insbesondere auf einen Träger für die Durchführung solcher Bestimmungen. Als Träger kommen vorwiegend sog. Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von becherartigen Vertiefungen in Frage, jedoch auch andere Reagenzgefäße und Reagenzröhrchen. Die Träger bestehen in der Regel aus Polystyrol, weil dies ein für photometrische Bestimmungen geeigneter durchsichtiger Werkstoff ist, der preisgünstig ist.

Bei den bisherigen immunspezifischen Bestimmungen von Antikörpern und Antigenen werden Antikörper oder aus Proteinen bestehende Antigene aufgrund der elektrostatischen Aufladung der Polystyrolplatten über elektrische Kräfte an die Platte gebunden. Nicht abgesättigte, bindungsfähige Stellen der Mikrotiterplatte werden daraufhin mit Rinderserum Albumin (BSA) abgedeckt. Die auf diese Weise immunspezifisch beschichteten Mikrotiterplatten können dann mit Seren zur Bestimmung deren Gehaltes, z. B. an einem speziellen Antigen behandelt werden, wobei sich eine Antikörper-/Antigenbindung auf der Platte bildet. Es gibt verschiedene Methoden, um die Menge an gebundenem Antigen zu bestimmen. So zum Beispiel die Konkurrenz-Methode. Besonders bewährt hat sich jedoch die Sandwich-Methode, bei der mit dem gebundenen Antigen nochmals ein Antikörper gekoppelt wird, der ein bestimmtes, eine Farbreaktion katalysierendes Enzym trägt. Durch die Intensität der Farbreaktion kann dann der Gehalt an Antigen bestimmt werden. Infolge der doppelten Antigen-/Antikörperbindung ist diese Bestimmungsmethode sehr spezifisch. Ungenauigkeiten sind jedoch darauf zurückzuführen, daß das zur Abdeckung der Bindungsstellen auf der Trägerplatte verwendete Serumalbumin durch Immunglobuline verdrängt werden kann oder selbst mit Antigenen, beispielsweise Lactoferrin, Bindungen eingehen kann. Solche Bindungen lassen sich durch schärfere Waschreagenzien zwar verhindern, ohne daß dadurch die Antikörper-/Antigenbindung gefährdet wird, doch können die stärkeren Waschreagenzien die relativ lose Bindung zwischen der Trägerplatte und dem Antikörper aufheben, was wiederum zu Bestimmungsfehlern führt. Entsprechendes gilt für immunspezifische Bestimmungen, bei denen anstelle des Antikörpers ein einen Proteinbestandteil aufweisendes Antigen zunächst an die Platte gebunden und dann immunspezifisch mit einem Antikörper gekoppelt wird, da sich hier dieselben Probleme ergeben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die immunspezifische photometrische Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern zu verbessern, insbesondere um zuverlässige quantitative Auswertungen zu ermöglichen.

Dies wird dadurch erreicht, daß durch eine chemische Vorbehandlung der Träger die Möglichkeit zu echten kovalenten Bindungen zwischen Träger und Antikörper bzw. Antigen geschaffen wird. Hierzu werden zur chemischen Bindung fähige reaktive Gruppen in den Kunststoff des Trägers eingeführt. Insbesondere bei den üblicherweise für die photometrische Bestimmung verwendeten Trägern aus Polystyrol eignet sich die Aminogruppe, die durch Nitrieren des Trägers und anschließende Reduktion aufgepfropft werden kann. Erfindungsgemäß sind somit Träger aus Kunststoff, insbesondere Polystyrol, vorgesehen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens an bestimmten Bezirken ihrer Oberfläche NHR-Gruppen aufweisen, bei denen R Wasserstoff oder der eine Amidbindung eingegangene Rest einer Carbonsäure ist.

Die Dichte der RHN-Gruppen auf den Oberflächenbezirken des Trägers hängt von den Reaktionsbedingungen bei der Einführung der reaktiven Reste in den Trägerkunststoff ab. Bei Polystyrol, das sich verhältnismäßig leicht nitrieren läßt, liegen sie vorzugsweise im Bereich von 1 × 10^-16 Mol bis 1 × 10^-12 Mol, insbesondere 5 × 10^-16 Mol bis 5 × 10^-15 Mol pro Quadratmillimeter. Anstelle von Polystyrol kommen auch andere nitrierbare Kunststoffe in Frage, insbesondere solche, die durchsichtig sind.

Die RHN-Gruppen des Trägers tragen vorzugsweise kovalent gebundene Antikörper oder Proteinbestandteile aufweisende Antigene und zwar insbesondere über Amidbindungen. Hierzu sind für die Bindung der Antikörper bzw. Antigene an die Aminogruppe des Trägers mit Vorteil die Carbonsäurereste vorgesehen, die auf der einen Seite mit dem Träger über eine Amidbindung verknüpft sind und auf der anderen Seite über eine eben solche Bindung mit einer Aminogruppe des Antikörpers bzw. Antigens. Die Carbonsäuren sind vorzugsweise aliphatische Dicarbonsäuren und besitzen mit Vorteil eine bestimmte Kettenlänge, um eine etwaige sterische Behinderung bei der Verknüpfung des Antikörpers bzw. Antigens mit dem Träger zu vermeiden. Hierzu sind unverzweigte aliphalische Dicarbonsäuren mit 6 bis 10, insbesondere 8 Kohlenstoffen von besonderem Vorteil.

Ist der Träger eine photometrische Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von becherartigen Vertiefungen, wie sie für andere photometrische Bestimmungen üblich ist, dann befinden sich die RHN-Gruppen vorzugsweise ausschließlich in den becherartigen Vertiefungen, da die übrigen Oberflächenbezirke für die photometrische Bestimmung nicht gebraucht werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die immunspezifischen Bestimmungen, wenn sie mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trägers mit kovalent gebundenem Antikörper bzw. Antigen durchgeführt werden, nicht nur viel genauer sind als die mit herkömmlichen Trägern durchgeführten Bestimmungen, vielmehr hat sich darüber hinaus ergeben, daß die Menge an Antikörper bzw. Antigen, die zur Herstellung der kovalenten Bindung an den Träger benötigt wird, um bis zu zwei Zehnerpotenzen geringer gehalten werden kann als bei der bisherigen nicht kovalenten Bindung an den Träger. Dies wirkt sich besonders günstig auf die Kosten der Bestimmung aus.

Freie, neben dem Antikörper bzw. dem Antigen auf der Trägeroberfläche vorhandene bindungsaktive Stellen, insbesondere überschüssige NH₂-Gruppen oder freie Carboxylgruppen, sind vorzugsweise durch Aminosäuren blockiert, wobei die gleichzeitige Blockierung durch verschiedenartige Aminosäuren bevorzugt ist. Dabei kann die Blockierung sowohl durch kovalente Bindung als auch durch schwächere Bindungsarten, wie durch elektrostatische Bindung, vorgenommen sein. Aminosäuren haben im Vergleich zu dem für diesen Zweck bisher verwendeten Serumalbumin den Vorteil, daß sie keine unklaren immunologischen Bindungswirkungen zeigen, in wesentlich reinerer Form zur Verfügung stehen, billiger sind als Serum Albumin und wegen der größeren Anzahl verschiedener Aminosäuren in Form von unterschiedlich polaren, speziell zusammenstellbaren Mischungen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus können die Aminosäuren durch Peptidbindung mit noch vorhandenen Aminogruppen und insbesondere restlichen Carboxylgruppen der Dicarbonsäuren fest verknüpft werden, so daß hier keine unerwünschten Bindungen entstehen können. Aminosäuren mit hydrophilen Gruppen können zudem hydrophile Stellen des Trägers abdecken, wogegen Aminosäuren mit lipophilen Gruppen lipophile Stellen des Trägers abdecken können, so daß der Träger nach außen hin eine gleichmäßige hydrophile Beschichtung zeigt.

Die erfindungsgemäßen Träger können in verschiedene Formen auf den Markt gebracht werden und zwar insbesondere als Aminogruppen aufweisender Träger, der für die verschiedenartigsten Bestimmungen einsetzbar ist, oder auch als mit einem bestimmten Antikörper oder Antigen beladener Träger, der für eine immunspezifische Bestimmungsreaktion vorbereitet und unmittelbar einsetzbar ist. Im letzteren Falle liegt der Träger vorzugsweise in gefriergetrockneter Form vor.

Die erfindungsgemäßen Träger werden vorzugsweise hergestellt, indem mindestens in Bezirke der Oberfläche von vorzugsweise gamma-bestrahlten Polystyrolkörpern durch Ätzung mit Salpetersäure NO₂-Gruppen eingeführt werden und die NO₂-Gruppen durch Behandlung mit Reduktionsmitteln in an sich bekannter Weise in NH₂-Gruppen umgewandelt werden. Durch die vorherige Gamma-Bestrahlung kann das Trägermaterial für die Einführung der NO₂-Gruppen vorbereitet und aufgeschlossen werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn eine hohe Oberflächendichte an RNH-Gruppen erwünscht ist. In der Regel kommt eine Bestrahlungsdosis von 28-35 KGray in Frage. Die Nitrierung kann an der gesamten Oberfläche des Trägers vorgenommen werden oder im wesentlichen nur an den Bezirken, die später mit dem Antikörper bzw. dem Antigen beladen werden sollen. Die Reduktion der Nitrogruppen zu den Aminogruppen wird aber vorzugsweise nur an den gewünschten Bezirken durchgeführt. Zur Nitrierung kann mit Vorteil ein Gemisch aus vorzugsweise konzentrierter Salpetersäure und einer wasserfreien organischen Carbonsäure mit 2-5 Kohlenstoff-Atomen, insbesondere Eisessig, durchgeführt werden, wobei die Carbonsäure im Überschuß eingesetzt wird. Geeignet ist ein Gemisch aus 5-45 Volumen-Prozent, 65-prozentige Salpetersäure und 95-55 Volumen-Prozent Carbonsäure. Die anschließende Reduktion kann mit den üblichen Reduktionsmittelnn für NO₂- Gruppen durchgeführt werden, wobei Natriumdithionit bevorzugt ist. Auch die weitere Behandlung der Oberfläche des Trägers erfolgt vorzugsweise nur an den Bezirken, die für die Bestimmung vorgesehen sind.

Die kovalente Anbindung der Antikörper bzw. der Antigene mit Proteinbestandteil, erfolgt vorzugsweise über Aminogruppen der Proteine. Da auch die funktionellen Gruppen des Trägers Aminogruppen sind, werden zur Verknüpfung vorzugsweise Dicarbonsäuren eingesetzt, wobei die Kupplung unter schonenden Bedingungen der Peptidsynthese erfolgt, insbesondere mit Hilfe von Carbodiimid. Die Reaktion kann bei schwach saurem pH von ca. 6,5 abgepuffert bei Zimmertemperatur erfolgen. Als Dicarbonsäure ist Korksäure (Octandisäure) bevorzugt. Als Carbodiimid ist besonders geeignet N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid (EDC), da dies ein gute Wasserlöslichkeit besitzt. Die Anknüpfung der als Spacer dienenden Dicarbonsäure und die anschließende Anknüpfung des Antikörpers bzw. Antigens können nacheinander, aber in einer Stufe, erfolgen. Hierzu kann das den Spacer einführenden Reaktionsmedium aus Dicarbonsäure und Carbodiimid, nachdem es etwa 10-15 Stunden zur Einwirkung kam, teilweise oder vollständig entfernt werden und, ohne daß ein besonderer Waschvorgang vorgenommen wird, durch ein Reaktionsmedium aus Antikörper bzw. Antigen, Carbodiimid und Puffer ersetzt werden, wobei vorzugsweise schwach sauer, insbesondere etwa bei pH 6,5 gearbeitet wird. Die Kupplung zwischen der freien Carboxylgruppe der Dicarbonsäure und der Aminogruppe des Antikörpers bzw. des Antigens wird wiederum bei Zimmertemperatur vorgenommen, wobei zur Vervollständigung der Reaktion eine Zeitdauer von mindestens 10 Stunden bis ggf. mehrere Tage in Frage kommt. Die zur Beschichtung des Trägers verwendete Konzentration des Antikörpers bzw. Antigens im Reaktionsmedium, liegt mit Vorteil in der Größenordnung von 1-5, vorzugsweise 2 µg/ml und ist etwa um den Faktor 100 geringer als die bisherigen Konzentrationen bei den herkömmlichen Beschichtungen.

Nach der Beschichtung des Trägers mit dem Antikörper bzw. Antigen durch kovalente Säureamidbindung werden noch vorhandene reaktive Gruppen mit Aminosäure, insbesondere einem Gemisch von Gylcin und Phenylalanin, gebunden. Es gehen auch andere Aminosäurepaare mit hydrophilen Gruppen einerseits und hydrophoben Gruppen andedererseits. Die Bindung der noch vorhandenen unspezifischen bindungsfähigen Stellen erfolgt vorzugsweise wiederum unter Bedingungen der Peptidbildung, vorzugsweise in Gegenwart von Carbodiimid. Hierzu kann ein Teil des Reaktionsmediums, das für die Bindung des Antigens bzw. Antikörpers verwendet wurde und überschüssiges Carbodiimid enthält, auf dem Träger belassen werden, wonach dann das Aminosäurepaar in Gegenwart von Phosphatpuffer und einem milden Detergenz, z. B. Tween 20, zugegeben wird. Dabei werden auch andere bindungsaktive Stellen durch nicht kovalente Bindungen abgesättigt.

Die Absättigung der unspezifischen Bindungen der Trägeroberseite wurde bisher, wie bereits erwähnt, mit Hilfe von Serumalbumin vorgenommen. Es wurde gefunden, daß das Aminosäurepaar nicht nur dort anstelle von Serumalbumin verwendet werden kann, wo das Antigen bzw. der Antikörper kovalent an den Träger gebunden werden, sondern auch dort, wo eine wesentlich lockere Bindung vorgenommen wird, beispielsweise über elektrostatische Kräfte, d. h. die Aminosäurepaare sind generell zur Absättigung unspezifischer Bindungen bei mit Antikörper bzw. Antigen beladenen Trägern anwendbar. Die so abgesättigten Träger können dann nach mehrmaligem Waschen mit einer durch Phosphatpuffer gepufferten Natriumchloridlösung zur Entfernung nichtgebundener Aminosäuren unmittelbar für die immunspezifische Bestimmung durch Antigen-/Antikörperreaktion eingesetzt werden oder nach vorheriger schonender Trocknung, z. B. durch Gefriertrocknen, gelagert und als für die Durchführung bestimmter immunspezifischer Bestimmungen vorbereitete Träger in den Handel kommen. Dabei können die Träger mit verschiedenartigen Antikörpern bzw. Antigenen beschichtet sein. Die Antikörper können monoclonale oder polyclonale Antikörper sein oder auch definierte Mischungen monoclonaler Antikörper.

Die eigentliche immunspezifische Bestimmung und ihre optische Auswertung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden und wird nachfolgend anhand der Bestimmung von Lactoferrin beschrieben.

Es wurde weiterhin gefunden, daß Fehler bei der Bestimmung dadurch zustande kommen können, daß die Antikörper bzw. Antigene, mit denen der Träger beschichtet ist, Aggregate mit fremden Proteinen bilden können, die die Spezifität der Bestimmung verschlechtern oder die Antikörper bzw. Antigene maskieren. Das unter der Bezeichnung ′Tween′ im Handel erhältliche und zum Waschen der Träger während oder nach der Antigen-/Antikörperreaktion in der Regel verwendete Detergenz reicht häufig nicht aus, um solche Aggregate zu brechen. Es wurde nun gefunden, daß ein Cholsäure-Derivat, das unter der Bezeichnung ′Chaps′ im Handel (Chaps = 3-[(3-Cholamidopropyl)- dimethylammonio]-1-propan-sulfonat) ist und bei der Isolierung von Membranproteinen Verwendung findet, in der Lage ist, diese unerwünschten Aggregate zu brechen, ohne die Antigen-/Antikörperbindung zu beeinträchtigen oder die Eigenschaften des für die photometrische Bestimmung angekoppelten Enzyms zu beeinflussen. Ein solches Enzym ist bei der Bestimmung eines Antigens, beispielsweise bei der Sandwich-Methode an den zweiten Antikörper insbesondere mit Hilfe von Glutardialdehyd gebunden und liegt an der Außenfläche der Sandwich- Struktur. Chaps wird vorzugsweise in Konzentrationen von 2-10, vorzugsweise 5 mMol/l verwendet. Bei einer hinreichend festen, insbesondere kovalenten Bindung des Antikörpers bzw. Antigens an den Träger wird durch Verwendung von Chaps die Beschichtungsdichte des Antikörpers bzw. Antigens auf dem Träger nicht beeinträchtigt im Gegensatz zu den Fällen, bei denen der Antikörper bzw. das Antigen nur elektrostatisch an den Träger gebunden ist. Chaps wird vorzugsweise dem Medium zugesetzt, das das zu bestimmende Antigen bzw. den zu bestimmenden Antikörper enthält. Dadurch werden unerwünschte Bindungen von vornherein verhindert. Es kann auch in Form von Waschlösungen eingesetzt werden, um unerwünschte Bindungen zu lösen und Verunreinigungen zu beseitigen. Die Verwendbarkeit von Chaps ist weitgehend unabhängig von dem für den Träger verwendeten Material. Dieser kann beispielsweise auch aus Polyäthylen oder Polypropylen bestehen.

Weitere Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Beschreibung erfolgt anhand der Bestimmung von Lactoferrin in Verbindung mit einer handelsüblichen Mikrotiterplatte aus Polystyrol, die als für die kovalente Anknüpfung des Antilactoferrins in Frage kommenden Oberflächenbezirke 96 becherartige bzw. napfartige Vertiefungen besitzt. Mit Hilfe von entsprechenden Mehrfachpipettiereinrichtungen können in diese Vertiefungen gleichzeitig Reaktionslösungen eingebracht oder aus diesen herausgenommen werden.

Bestimmung von Lactoferrin mit Hilfe von kovalent an eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol kovalent gebundenem Anti-Lactoferrin. Die handelsübliche Mikrotiterplatte hat 96 napf- bzw. becherartige Vertiefungen, wobei das Anti-Lactoferrin an die Oberfläche der Vertiefungen kovalent gebunden ist. Die Bestimmungsart ist ELISA nach der Sandwich-Methode.

I. Einführung von Aminogruppen in Mikrotiterplatten aus Polystyrol und Beschichtung von Mikrotiterplatten mit Antikörper

1. Je 200 µl einer Säuremischung aus 10 ml rauchender Salpetersäure (65%) + 90 ml Eisessig werden in die Becher der Platten pipettiert und über Nacht im Abzug inkubiert. Eine Verdunstung in der obersten Platte des Stapels wird durch Abdecken mit einer nicht beschickten Platte verhindert.

Anschließend wird 3 × mit Aqua destillata gewaschen.

2. Reduktion der Nitrogruppen mit 1% Natriumdithionit.

1 g Natriumdithionit wird in 100 ml 0,1 N NaOH gelöst. In die Becher der Platten davon jeweils 200 µl pipettiert. Die Platten werden unverschlossen 3 Stunden bei 50°C inkubiert.
Anschließend 3 × mit Aqua destillata gewaschen.

3. Einführung von Carboxylgruppen mit Hilfe von Octandisäure + EDC
(EDC = (N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid))

Es werden 250 mg Octandisäure (Korksäure) + 125 mg EDC (N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid) in 125 ml Aqua destillata unter Erwärmen gelöst und abgekühlt. Jeweils 200 µl werden in die Becher pipettiert und verschlossen bei Zimmertemperatur über Nacht in Styropor gepackt aufbewahrt, gegebenenfalls unter Rütteln.

4. Kovalente Verknüpfung der Carboxylgruppen mit Antikörper in 0.2 M Mops-Puffer
(Mops = 3-(N-Morpholino)-propan-sulfonsäure)

4,2 g Mops + 0,1 g EDC (N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid) werden mit 1 N NaOH auf pH 6,5 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt. In diesem Puffer werden 50 µl Anti-Lactoferrin verdünnt.

Von der Lösung von Stufe 3 werden jeweils 100 µl aus den Bechern herauspipettiert. Dafür werden 100 µl Antikörper-Verdünnung zupipettiert.

Die Platten werden im Kühlschrank aufbewahrt.

Vor Gebrauch Platten eine Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen lassen.

5. Absättigung der freien und unspezifischen Bindungsmöglichkeiten durch Glycin und Phenylalanin.

Die Becher der Platten werden entleert, aber nicht ausgewaschen . . Von einer Lösung aus PBS- Tween-20 + 50 mM Glycin + 1% Phenylalanin werden + 0.1% EDC jeweils 300 µl in die Becher pipettiert und 2-3 Stunden auf dem Rüttelgerät inkubiert.
(PBS = phosphat gepufferte isotone Kochsalzlösung;
Twenn-20 = Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat)

Danach wird gewaschen (hier und bei allen weiteren Zwischenwaschungen):
a) im Wascher mit PBS und NaCl oder
b) von Hand
3 × mit PBS waschen
(jeweils 3 Minuten einwirken lassen)
1 × mit 0.2 M NaCl waschen.

Die Platten können nach den einzelnen Stufen, insbesondere nach Stufe 2 und 5 aufbewahrt bzw. in den Handel gebracht werden.

II. Beschickung mit Standard und Plasmen 1. Standard-Verdünnungen in Mops-Chaps-Puffer

(Mops = 3-(N-Morpholino)-propan-sulfonsäure;
Chaps = 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propan-sulfonat)

Eine Standard-Stamm-Lösung enthält 12 000 ng/ml Human-Lactoferrin. Davon wurden Portionen zu je 300 µl tiefgefroren. Werden diese 300 µl mit 900 µl Mops-Chaps-Puffer verdünnt, so entspricht das einer Konzentration von 3000 ng/ml. Aus diesem Ansatz wird nun eine 1 : 3 Verdünnung hergestellt. Dies entspricht einer Konzentration von 1000 ng/ml. Daraus werden nun die Standard-Verdünnungen wie folgt pipettiert:

Für weitere Verdünnungen wird aus der 1000 ng/ml enthaltenden Lösung eine 1 : 10 Verdünnung hergestellt, die dann 100 ng/ml Lf enthält. Aus dieser Konzentration werden folgenden Verdünnungen pipettiert. Zu beachten:

Mops-Chaps-Puffer vorpipettieren und bei geschlossenem Cup durchrütteln, damit die gesamte innere Oberfläche mit dem Puffer benetzt wird (vermindert Lf-Anheftung am Cup).
(Cup = Reaktionsgefäß; aus Kunststoff (mit Deckel; enthält ca. 1 ml)

2. Plasma-Verdünnungen

Nur EDTA-Plasma verwenden.
(EDTA = Ethylen-diamin-tetraessigsäure)

Mäuseplasmen werden mit Mops-Chaps-Puffer verdünnt und auf die Platte pipettiert.

Humanplasmen benötigen follende Vorbehandlung zur Elimination von Störfaktoren (RF):
Plasma wird mit Immunglobilinaggegaten behandelt.

a) Herstellung der Immunglobulin-Aggregate
Lösungen:
2 M Tris-Base 24,21 g/100 ml
150 mM Na-Acetat
2.04 g/100 ml Aqua destillata mit Essigsäure auf ph 5 einstellen.

Intraglobin F (Biotest) enthält 50 mg/ml Immunglobulin, davon wird mit Na-Acetat-Puffer pH 5 eine Verdünnung hergestellt, die 20 mg/ml enthält.

Zur Aggregation wird die Lösung 30 Minuten in ein Wasserbad bei 63°C gestellt, anschließend wird mit physiol. NaCl 1 : 1 verdünnt und mit 2 M Tris-Puffer auf pH 7.4 titriert. Die Immunglobulinlösung wird zentrifugiert und der Überstand portionsweise tiefgefroren und bei Bedarf aufgetaut.

b) Plasmabehandlung

Plasmen werden 1 : 1 mit aufgetauten Introglobin F-Aggregaten verdünnt und gemischt (Globulin- Aggregat-Lösung vorlegen). Man läßt 10 Minuten bei 63°C im Wasserbad inkubieren.
Anschließend wird abzentrifugiert.
Mit Mops-Chaps-Puffer wird nun die endgültige Plasma-Verdünnung hergestellt.
Unmittelbar vor dem Pipettieren auf die Platte wird erneut zentrifugiert. Beim Pipettieren ist darauf zu achten, daß keine Klumpen und Proteinaggregate mitpipettiert werden.

Von den Standard- und Plasma-Verdünnungen werden jeweils 200 µl auf die Platte pipettiert. Man läßt 5 Stunden auf Schüttler im Styroporkasten inkubieren.
Danach wird im Wascher gewaschen.

III. Verbindung mit Antikörperkonjugat

Antikörperkonjugat wird 1 : 375 verdünnt.

Je Platte werden 1 1/2 Cups Antikörperkonjugat in 25 ml PBS + Polyethylenglycol 6000 verdünnt und je 200 ul in die Platte pipettiert und über Nacht auf dem Schüttler im Styroporkasten inkubiert.
Danach wird im Wascher gewaschen.

IV. Optische Messung

5 mg/ml Substrat Nitrophenyl-Phosphat werden in einer dunklen Flasche in Diethanolaminpuffer ph 9,8 gelöst. Je 200 µl werden einpipettiert. Dann wird auf dem Schüttler inkubiert. Nach ca. 1-1,5 Stunden wird im Photometer bei 405 nm gemessen (höchste Extinktion soll nicht 1.600 übersteigen).

Claims

1. Träger aus Polystyrol für die photometrische, insbesondere quantitative immunspezifische Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens an Bezirken seiner Oberfläche RHN-Gruppen aufweist, in denen R Wasserstoff oder der Carboxid-Rest einer eine Säureamidbindung eingegangenen Carbonsäure ist.

2. Träger nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächendichte der RHN-Gruppen in den Bezirken 1 × 10^-16 Mol bis 1 × 10^-12 Mol, insbesondere 5 × 10^-16 Mol bis 5 × 10^-15 Mol pro Quadratmillimeter beträgt.

3. Träger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er an die RHN-Gruppen kovalent gebundene Antikörper oder kovalent gebundene, aus Proteinen bestehende Antigene trägt.

4. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper bzw. Antigene über eine Dicarbonsäure, insbesondere eine aliphatische Dicarbonsäure mit 6-10, vorzugsweise 8 C-Atomen, über Amidbindungen an die NH₂-Gruppen gebunden sind.

5. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Form einer photometrischen Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von becherartigen Vertiefungen, dadurch gekennzeichnet, daß die RHN-Gruppen ausschließlich in den becherartigen Vertiefungen vorgesehen sind.

6. Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß neben dem Antikörper bzw. Antigen auf der Trägeroberfläche vorhandene bindungsaktive Stellen, insbesondere überschüssige Aminogruppen oder Carboxylgruppen durch Aminosäuren, insbesondere Gemische von Aminosäuren verschiedener Polarität blockiert sind, vorzugsweise durch Säureamidbindungen.

7. Träger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die bindungsaktiven Stellen durch ein Aminosäurepaar aus einer Aminosäure mit hydrophoben Resten und einer Aminosäure mit hydrophilen Resten, insbesondere Phenylalanin und Glycin, blockiert sind.

8. Träger nach Anspruch 6 oder 7. dadurch gekennzeichnet, daß die Blockierung überschüssiger NH₂-Gruppen mit den Aminosäuren über einen Dicarbonsäurerest, vorzugsweise über den gleichen Dicarbonsäurerest wie beim Antigen bzw. Antikörper vorgenommen ist.

9. Träger nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in gefriergetrocknetem Zustand.

10. Verfahren zur Herstellung der Träger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens in Oberflächenbezirke von vorzugsweise durch Gammastrahlung vorbehandelte Polystyrolkörper, insbesondere photometrische Mikrotiterplatten, durch Ätzung mit Salpetersäure NO₂-Gruppen eingeführt werden und diese durch Behandlung mit Reduktionsmitteln in an sich bekannter Weise in NH₂-Gruppen umgewandelt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper bzw. Antigene mit den NH₂-Gruppen, insbesondere nach der Carbodiimid-Methode verknüpft werden, indem zuerst eine Dicarbonsäure an die NH₂- Gruppen gebunden und danach der Antikörper bzw. das einen Proteinbestandteil aufweisende Antigen an die noch freie Carboxylgruppe der Dicarbonsäure gebunden wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezirke des Trägers nach der Verknüpfung mit dem Antikörper bzw. Antigen zur Blockierung noch vorhandener bindungsaktiver Stellen des Trägers, vorzugsweise in Gegenwart eines Peptidbildungsreagenz, mit Aminosäuren blockiert werden, insbesondere über eine Dicarbonsäure.

13. Verwendung der Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Durchführung von insbesondere quantitativen Bestimmungen von Antigenen bzw. Antikörpern, vorzugsweise nach der Sandwich-Methode.

14. Verwendung der Träger nach Anspruch 13 zur quantitativen Bestimmung von Lactoferrin.

15. Verwendung von Chaps (Desoxycholsäure-Derivat) als Reagenz zur Verhinderung bzw. Beseitigung von unspezifischen Bindungen neben den immunspezifischen Antigen-/ Antikörperbindungen bei insbesondere kovalent an einen Träger gebundenen Antikörpern oder Antigenen.

16. Verwendung von Aminosäuren, insbesondere in Form von Gemischen von Aminosäuren mit hydrophilen Gruppen bzw. hydrophoben Gruppen zur Verhinderung unspezifischer Bindungen an Trägern mit insbesondere kovalent gebundenen Antikörpern oder Antigenen für die immunspezifische photometrische Bestimmung.