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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
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trägergebundenen Proteinen durch Koppeln eines Proteins oder einer
Proteinkomponente an einen Latex mit oberflächlichen Epoxygruppen unter Ausbildung
einer Aminbildung, die sich insbesondere zur Durchführung von immunologischen Tests
auf Basis der Antigen-Antikörper-Reaktion eignen.
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Die Antigen-Antikörper-Reaktion ist die Grundlage aller immunologischen
Tests. Als Reaktion auf die Anwesenheit eines Antigens, d.h. einer Fremdsubstanz,
die gewöhnlich ein Protein darstellt, werden in den Körperflüssigkeiten spezielle
Proteine gebildet !, sogenannte Antikörper. Diese normale Körperreaktion auf Fremdproteine
hat zur Entwicklung zahlreicher Methoden geführt, mit denen verschiedene menschliche
und tierische Krankheiten oder Störungen diagnostiziert werden können.
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In vitro-Tests bezüglich der Anwesenheit eines vermuteten Antigens
oder Antikörpers in einer Körperflüssigkeit werden so durchgeführt, daß man eine
Probe der Körperflüssigkeit mit dem immunologischen Gegenpartner versetzt, d.h.
mit Antigen im Falle des Tests auf Antikörper oder mit Antikörper im Falle des Tests
auf Antigen. Wenn das vermutete Protein vorhanden ist, macht sich die ablaufende
Antigen-Antikörper-Reaktion im allgemeinen durch Präzipitation oder Agglutination
des Antigen-Antikörperkomplexes bemerkbar.
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In manchen Fällen bildet sich der Antigen-Antikörper -Komplex langsam
und die entstehenden Teilchen sind zu klein, um sie mit Sicherheit beobachten zu
können. In diesen Fällen kann die Nachweisbarkeit der Antigen -Antikörper-Reaktion
durch Verwendung eines Trägers verbessert werden. Belädt man die Oberfläche eines
Trägers mit Antigen oder Antikör-
per, so ergibt die Reaktion mit
dem immunologischen Gegenpartner eine sichtbare Agglutinatmasse. Zur Adsorption
der proteinischen Antigene oder Antikörper eignen sich zbB.
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Träger, wie Erythrozyten, Bakterienzellen, Bentonit, Polystyrollatexpartikel,
anionische Phenolharze oder feinteilige diazotierte Aminocellulose. Es hat sich
jedoch gezeigt, daß die chemische Bindung des Antigen- oder Antikörpermoleküls an
den Träger der physikalischen Oberflächenadsorption überlegen ist. In der US-PS
3 857 931 ist beschrieben, daß proteinische Antigene oder Antikörper chemisch über
eine Amidbindung, die sich in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimid-Kopplungsrcagens
bildet, an Polymerlatexträger mit oberflächlichen Carbonylgruppen binden lassen.
In der US-PS 3 806 417 ist ein Verfahren zum Binden eines Proteins an eine Verbindung,
die eine Epoxygruppe enthält, und Koppeln dieses Zwischenprodukts mit einem Trägermaterial
beschrieben. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß das Protein zuerst
mit einer Verbindung umgesetzt werden muß, die sowohl eine Epoxy- als auch eine
olefinische Gruppe aufweist. Das erhaltene Konjugat wird dann mit einem weiteren
olefinischen Monomer und einem bis-olefinischen Vernetzungsmittel zu dem gewünschten
trägergebundenen Enzym polymerisiert. Weitere Verfahren zum Binden von Proteinen
an polymere Träger sind z.B. in den US-PSen 3 639 558; 3 853 708e 3 841 970; 3 844
892; 3 821 084 und 4 086 199 beschrieben.
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Insbesondere bei Verwendung von Latex systemen aus Trägern wurden
bisher Kopplungsverfahren angewandt, die ein bifunktionelles Kopplungsmittel oder
ein Kopplungsmittel erfordern, das die reaktiven Gruppen des Proteins mit denen
der Trägerpartikel verknüpft. Ein Problem dieser Kopplungsmittel besteht darin,
daß sie nicht zwischen den reaktiven Gruppen des Proteins und denen des Trägers
unterscheiden können. Es kommt daher zu einer Kopplung des Proteins an Protein und
sogar eine intramolekulare Proteinkopplung kann
auftreten. Diese
unerwünschten Bindungen können Konformationsänderungen des Proteinmoleküls zur Folge
haben, die die Aktivität beeinflussen.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur kovalenten Bindung
eines Proteins mit einer reaktiven Gruppe, die ein labiles Wasserstoffatom enthält,
an einen Latex mit oberflächlichen Epoxidgruppen. Vorzugsweise ist die reaktive
Gruppe eine freie Aminogruppe, jedoch sind auch andere reaktive Gruppen anwendbar,
z.B. Carboxyl-, Phenol-, Hydroxyl- und Thiolgruppen. Die Kopplung erfolgt, wenn
die Aminogruppen des Proteins mit den Epoxidgruppen des Latex reagieren, gewöhnlich
bei einem pH von etwa 7,0 bis etwa 9,o, unter Ausbildung einer neuen Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung
(im folgenden Aminbindung), so daß das Protein auf der Oberfläche des Latex gebunden
ist. Dieses Verfahren bietet zahlreiche Vorteile gegenüber bekannten Verfahren zur
Herstellung von Protein-Latex-Konjugaten. Insbesondere ist es leicht und einfach
durchzuführen. Das Protein wird keinen harten Reaktionsbedingungen unterworfen,
die eine Veränderung oder Denaturierung des Proteinmoleküls zur Folge haben könnten.
Dies ist von besonderer Bedeutung, da Konformationsänderungen einen Aktivitätsverlust
mit sich bringen können. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es auch, die
restlichen Epoxygruppen nach der Bindung der Proteine zu entfernen. Das Verfahren
der Erfindung hat außerdem den Vorteil, daß trägergebundene Proteine mit gleichmäßiger
Teilchengrößenverteilung entstehen.
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Unter "Latex" werden wäßrige kolloidale Dispersionen von wasserunlöslichen
Polymerisaten verstanden. Die erfindungsgemäß verwendeten Latices bestehen aus im
wesentlichen kugelförmigen Polymerpartikeln mit einem Durchmesser von 0,15 bis 1,5
ßm, vorzugsweise 0,45 bis 0,90 ßm. Die Partikel bestehen aus einem inneren Kern
und einer umgebenden Schale. Der Kern wird aus Hartmonomeren, wie Styrol, poly-
merisiert
oder copolymerisiert. Die Schale entsteht durch Copolymerisation eines oder mehrerer
Hartmonomere mit einer copolymerisierbaren, äthylenisch ungesättigten Verbindung
mit einem dreigliedrigen Epoxyring. Gegebenenfalls können in den Kern und/oder die
Schale auch Weichmonomere zusammen mit den Hartmonomeren copolymerisiert werden,
um einen Bruch der Partikel zu verhindern. Unter "Hartmonomeren2' werden Monomere
verstanden, die Polymerisate mit einer Glastemperatur oberhalb Raumtemperatur bilden.
Unter "Weichmonomeren" werden Monomere verstanden, die Polymerisate mit einer Glastemperatur
unter Raumtemperatur bilden. Bevorzugte emulsion polymerisierbare Monomere für den
Kern sind Hartmonomere, die untereinander in beliebigen Mengenverhältnissen und/
oder mit anderen Monomeren zu nicht-filmbildenden Polymerisaten polymerisiert und/oder
copolymerisiert werden können.
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Unter 1nicht-filmbildend11 werden Polymerlatexteilchen tter -standen,
die keine Filme bilden oder unter den Anwendunqsbedingungen nicht zusammenfließen.
Derartige Monomere Sind z.B. carbocyclische Monovinylidenmonomere, wie Styrol, a-Methylstyrol,
ar-(t-Butyl)-styrol, ar-Methylstyrol, ar, ar-Dimethylstyrol, ar-Chlorstyrol, ar-
(t-Amyl) -styrol, ar-Bromstyrol, ar-Fluorstyrol, ar-Cyanstyrol, ar-Methoxystyrol,
ar-Äthylstyrol, ar-Hydroxymethylstyrol, ar-Xthoatystyrol, ar-Chlor-ar-methylstyrol,
ar, ar-Dichlorstyrol, ar, ar-Difluorstyrol, Vinylnaphthalin und andere emulsion
polymerisierbare Monomere mit nicht mehr als 26 Kohlenstoffatomen, Ester von a,ß-äthylenisch
ungesättigten Carbonsäuren, die zu nicht-filmbildenden Polymerisaten polymerisieren,
wie Methylmethacrylat1 Chloräthylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, Äthylmethacrylat,
Isobutylmethacrylat, Isopropylmethacrylat, PhenylmethacrylatS Butylchloracrylat,
Cyclohexylchloracrylat, kthylchloracrylat e Methylchloracrylat, Isopropylchloracrylat
und andere derartige Ester, die zu Hartpolymerisaten polymerisiert werden können,
cL7-äthylenisch ungesättigte Ester von nicht-polymerisierbaren Carbonsäuren, wie
Benzoesäurevinylester, Toluylsäurevinylester,
ar-Äthylbenzoesäurevinylester,
ar-Lthylbenzoesäurevinylester, ar-Äthylbenzoesäurevinylester, ar-Äthylbenzoesäureallylester,
Pival msäurevinylester, Trichloressigsäurevinylester und andere derartige Monomere,
bei denen die ungesättigte Gruppe 2 bis 14 Kohlenstoffatome und die Säuregruppe
2 bis 12 Kohlenstoffatome enthält, a,ß-äthylenisch ungesättigte Nitrile, z.B. Nitrile
mit nicht mehr als 12 Kohlenstoffatomen, sowie andere polymerisierbare Vinylmonomere,
wie Vinylchlorid und Vinylbromid. Hierbei sind carbocyclische aromatische Monovinylidenmonomere,
insbesondere Styrol und Gemische aus Styrol, Methylmethacrylat und Acrylnitril besonders
bevorzugt.
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Die gegebenenfalls verwendbaren Weichmonomeren umfassen z.B.
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Alkylacrylate, z.B. Äthylacrylat, Butylacrylat oder 2-Äthylhexylacrylat,
höhere Alkylmethacrylate, wie Hexylmethacrylat oder 2-Äthylhexylmethacrylat, und
konjugierte Diene, wie Isopren oder Butadien.
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Ein bevorzugtes Monomer für das Schalencopolymerisat ist ein Gemisch
aus einem oder mehreren Hartmonomeren, wie sie vorstehend genannt wurden, und einer
copolymerisierbaren, äthylenisch ungesättigten Verbindung mit einem dreigliedrigen
Epoxyring. Spezielle Epoxymonomere sind z.B. ungesättigte Alkylglycidylester, ungesättigte
Alkylglycidyläther, ungesättigte Cycloalkylglycidyläther, ungesättigte alkylsubstituierte
Phenylglycidyläther und die Monoepoxide von Dienmonomeren. Beispiele für Glycidylester
sind Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat, Glycidylester von Crotonsäure und langkettigen
ungesättigten Fettsäuren; Beispiele für ungesättigte Alkylglycidyläther sind Vinylglycidyläther,
Isopropenylglycidyläther, Oleylglycidyläther, Allyl- und Methallylglycidyläther;
Beispiele für ungesättigte Cycloalkyl- und Phenylglycidyläther sind 4-Vinylcyclohexylglycidyläther,
p -Vinylbenzylglycidy Iäther , o-Allylphenylglycidyläther; Beispiele für Monoepoxide
von Dienmonomeren sind
Butadienmonoepoxid, Chloroprenmonoepoxid,
3,4 -Epoxy-1 penten, 4,5-Epoxy-1-penten, 4,5 -Epoxy-2 -penten, 4,5-Epoay-1 -hexen,
3,4-Epoxy-1-vinylcyclohexen und Divinylbenzol monoxid.
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Die genane Menge des zur Herstellung der erfindungsgemaßen Latices
erforderlichen Epoxymonomers richtet sich nach der Population der oberflächlichen
Epoxygruppen, die für eine optimale Kopplung des gewünschten Proteins erforderlich
ist.
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Zur Kopplung von Humanchoriongonadotropin (im folgenden (HCG) an einen
Styrol-Glycidylmethacrylat -Latex ergibt t.B.
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eine Kopplungsstellendichte von etwa einer Epoxyeinheit pro 5 bis
40 22 zufriedenstellende Ergebnisse, während etwa eine Epoxyeinheit pro 8 bis 20
i bevorzugt ist. Diese Kbpplungsstellendichte ist auch bei anderen Proteinen anwendbar,
z.B. bei Insulin. Bei der Herstellung latexgebundthEr Proteine für immunologische
Tests hat sich gezeigt, daß monodisperse Latices, d.h. Latices mit im wesentlichen
gleichmäßiger Teilchengröße, bevorzugt sind, da die gleichmßibe Größe eine gleichmäßige
statistische Verteilung der Antigene oder Antikörpermoleküle auf der Oberfläche
der LatexteAlthen ermöglicht. Für ein bestimmtes Polymergewicht nimmt die Gesamtoberfläche
des Latex mit abnehmender Teilchengröße zu und umgekehrt. In einem Latex, der eine
Verteilung unter schiedlicher Teilchengrößen aufweist, haben daher die kleineren
Partikel eine größere Oberfläche, so daß sie instr; samt mehr Reaktionsstellen aufweisen
als größere Teilchen.
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Die ungleichmäßige Verteilung von Antigen oder Antikörper auf den
Latexpartikeln führt zu einer ungleichmäßigen Agglutination der Partikel und schlecht
auswertbaren diatnostischen Ergebnissen.
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Ein weiterer Vorteil der Verwendung von gleichförmigen Latexpartikeln
als diagnostischen Mitteln besteht darin, daß sie sich besser für die instrumentelle
Analyse eignen.
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Partikel derselben Größe flocken, agglutinieren oder zer-
setzen
sich mit derselben Geschwindigkeit ab, während unterschiedlich große Partikel mit
unterschiedlichen Geschwindigkeiten agglutinieren. Eine auf der Absorption oder
Transmission von Licht durch eine agglutinierende Latexsuspension beruhende instrumentelle
Methode ist daher genauer, reproduzierbarer und leichter zu standardisieren und
abzulesen, wenn man gleichförmige Latexteilchen verwendet. Erfindungsgemäße Konjugate
aus HCG und Styrol-Glycidylmethacrylat-Latex zeigen nach 12monatiger Lagerung bei
etwa 4 bis 6°C praktisch keine Änderung ihrer immunologischen Aktivität.
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Andere Faktoren, die die Kopplung von HCG an monodisperse Styrol-Glycidylmethacrylat
-Latices beeinflussen, sind das Alter des Latex und die Lagerungsart des Latex vor
der Kopplung. Der Latex sollte gekühlt gelagert und so schnell wie möglich für die
Kopplungsreaktion verwendet werden. Der in dem folgenden Beispiel 2 hergestellte
Latex verhält sich nach 1-monatiger Lagerung unter Kühlung bei der Kopplung mit
HCG zufriedenstellend.
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Bei der Herstellung von immunologischen aktiven Latex-HCG-Konjugaten
hat sich gezeigt, daß die HCG-Quelle ein wichtiger Faktor hinsichtlich der Empfindlichkeit
ist. Verschiedene im Handel erhältliche HCG-Präparate sollten untersucht werden,
um das für die jeweilige Anwendung am besten geeignete Präparat auszuwählen. Obwohl
unterschiedliche Proteinmengen an den Latex gekoppelt werden können, ergibt eine
maximale Beladung des Latex mit HCG keine optimalen Ergebnisse. Für die Kopplungsreaktion
werden vorzugsweise etwa 1000 bis 25 000 IE und insbesondere etwa 11 000 IE HCG
pro g Polymerisat verwendet, jedoch sind auch andere Mengen anwendbar. Die bevorzugte
Reaktionskonzentration der Polymerfeststoffe beträgt etwa 4 bis 5 %. Im allgemeinen
erfolgt die Kopplungsreaktion bei einem pH von etwa 7,5 bis 8,5, vorzugsweise etwa
8,0. Um HCG an den Latex zu koppeln,
wird üblicherweise ein Phosphatpuffer
verwendet. Boratpuffer sind im allgemeinen nicht zufriedenstellend, da Proteine,
wie HCG, einen hohen Kohlenhydratgehalt aufweisen.
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Es wurde auch gefunden, daß die Kopplungsreaktionszeit auf etwa 1
Tag oder weniger reduziert werden kann, wenn man die Reaktion bei Raumtemperatur
und nicht wie in den Beispielen bis 7 bei 50C durchführt. Wo jedoch keine spezielle
Kühleinrichtung verwendet wird, muß eine geeignete Vorsorge gegen mikrobielle Verunreinigungen
getroffen werden.
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Nach dem Koppeln des Latex mit dem HCG müssen nicht umgesetztes HCG
und andere Verunreinigungen aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Ein zufriedenstellendes
Produkt wird durch Ultrafiltration und anschließende Cellophandialyse oder Hochgeschwindigkeitszentrifugieren
und anschließende Cellophandialyse erhalten. Die Hohlfaserdialyse ist zwar anwendbar,
hat sich jedoch zum Abtrennen von überschüssigem HCG aus dem Reaktionsgemisch als
weniger wirksam erwiesen.
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Wenn das erhaltene Latex-HCG-Konjugat mit dem bevorzugten Glycinpuffer
(pH 8,2) gepuffert wird, ist es nicht notwendig, die restlichen Epoxygruppen abzuspalten.
Falls jedoch ein neutrales Puffersystem verwendet wird, werden die restlichen Epoxygruppen
vorzugsweise in einer zusätzlichen Stufe zersetzt; vgl Beispiel 5.
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Im allgemeinen hat sich gezeigt, daß eine Alterung des erhaltenen
Latex-HCG-Konjugats seine immunologische Aktivität wesentlich verbessert. Die für
eine optimale immunologische Aktivität erforderliche Alterungsdauer richtet sich
nach der Alterungstemperatur, wobei niedrigere Temperaturen längere Alterungszeiten
erfordern. Es wurde gefunden, daß ein 3 bis 5 Tage bei etwa 25°C gealtertes Produkt
zufricdenstellende Eigenschaften zeigt. Ein bei etwa 50C gelagertes Produkt erfordert
etwa 2 Wochen, um optimale Aktivität zu erreichen.
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Das Latex-HCG-Konjugat kann zu einem Testsatz kombiniert werden, der
alle notwendigen Reagenzien für den immunologischen Schwangerschaftstest enthält.
Ein derartiger Satz weist ein erstes Reagenz, das das erfindungsgemäße Latex-HCG-Konjugat
enthält, und ein zweites Reagenz auf, das gepuffertes Anti-HCG-Serum enthält, welches
üblicherweise von weißen Neuseeland-Kaninchen stammt; vgl. J. Clin. Endocr.,Bd.
33, S. 988 (197a). Die Grundreagenzien können auch mit Hilfskomponenten kombiniert
werden, z.B. einem opaken Glasträger mit versenkten Mischbereichen und einem Applikatorstab.
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Wenn das Konjugat für immunologische Zwecke verwendet werden soll,
können die Latex-Partikel vor der Kopplung mit dem Protein vorzugsweise gefärbt
werden, um den Nachweis der Agglutination zu erleichtern. Dies kann z.B. dadurch
erfolgen, daß man den Latex mit einer Farbstofflösung vermischt, die ein Lösungsmittel
enthält, welches in die Latexpartikel eindringen kann. Hierzu eignet sich z.B. der
Farbstoff Calco Oil Blue N (von der American Cyanamid), gelöst in Benzol. Das Benzol
wird vor der Kopplung mit dem Protein in einem Verdampfer entfernt.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von drei monodispersen
Styrol-Glycidylmethåcrylat -Latices. Hierbei werden handelsübliche monodisperse
Polystyrol-Latices mit einem Gemisch aus Styrol und Gylcidylmethacrylat umgesetzt.
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Alle Mengen beziehen sich auf Gewichtsteile, falls nichts anderes
angegeben ist.
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Beispiel 1 Ein 1 Liter-Dreihalskolben, der mit Rührer, Stickstoffeinleitrohr
und Kondensator ausgerüstet ist, wird mit den folgenden Bestandteilen beschickt:
Gewichts-
Gewichts -teile teile (trocken) (naß) Polystyrollatex (Teilchengröße 0,76 ßm) 60,5
188 Dihexylnatriumsulfosuccinat 0,3 6 Kaliumpersulfat 0,3 6 Natriumbicarbonat 0,3
6 Styrol 45 45 Glycidylmethacrylat 15 15 Wasser - 134 Das Reaktionsgemisch wird
unter Stickstoffspülung etwa 10 bis 20 Minuten gerührt. Hierauf erhöht man die Temperatur
auf 65qC und hält diese Temperatur 4 Stunden unter Stickstoffüberdruck. Der erhaltene
Latex wird abgekühlt und filtriert. Die elektronenmikroskopische Untersuchung ergibt
eine mittlere Teilchengröße von etwa 0,91 Am Durchmesser.
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Beispiel 2 Gemäß Beispiel 1 werden die folgenden Bestandteile zur
Herstellung eines monodispersen Latex mit einer mittleren Teilchengröße von etwa
0,59 µm verwendet.
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Gewichts- Gewichtsteile teile (trocken) (naß) Polystyrollatex (Teilchengröße
0,503 ßm) 30,1 g5 Dihexylnatriumsulfosuccinat 0,15 3 Kaliumpersulfat 0,15 3 Natriumbicarbonat
0,15 3 Styrol 15 15 Glycidylmethacrylat 15 15 Wasser - 266
Beispiel
3 Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren werden die folgenden Bestandteile
zur Herstellung eines monodispersen Latex mit einer mittleren Teilchengröße von
0,20 jim verwendet.
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Gewichts- Gewichtsteile teile (trocken) (naß) Polystyrollatex (Teilchengröße
0,176 ;ihm) 30 300 Dihexylnatriumsulfosuccinat 0,15 3 Kaliumpersulfat 0,15 3 Natriumbicarbonat
0,15 3 Styrol 15 15 Glycidylmethacrylat 15 15 Wasser - 61 Für jeden der vorstehend
erhaltenen Latices wird der Epoxygehalt, ausgedrückt als Milliäquivalent Oxirangruppen/g
und als 2 pro Oxirangruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I genannt.
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Tabelle I
| Latex aus Teilchengröße 2 ° oq /c mÄg |
| Beispiel (Am) 2 /-CH-CH2 -CH-CH2 /g |
| Nr. ~ |
| 1 0,907 15,0 0,07 |
| 2 0,592 9,4 0,17 |
| 3 0,201 17,0 0,278. |
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Die Milliäquivalente Oxirangruppen/g Polymerisat werden dadurch bestimmt,
daß man den Latex, der eine bekannte Menge Polymerisat enthält, mit bekannten Äquivalenten
Jodwasserstoff behandelt. Der in dem Latex zurückbleibende Jodwasserstoff wird mit
einer Standard-Silbernitratlösung titriert, um die Jodwasserstoffmenge zu bestimmen,
die mit
den Epoxygruppen reagiert hat. Aus dem Ergebnis werden
dann die Milliäquivalente der Epoxygruppen errechnet.
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Proben der vorstehend erhaltenen Latices werden mit HCG gekoppelt.
Dieses Hormon ist ein Glykoprotein, das die Produktion und Sekretion von Progesteron
durch den Gelbkörper steuert. Es wird normalerweise während der Schwangerschaft
durch das Choriongewebe der Plazenta abgesondert. Latexgebundenes HCG eignet sich
für den Schwangerschaftsnachweis.
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Beispiel 4 Eine Lösung, die 5000 IE HCG in 7 ml eines pH 8,0-Phosphatpuffers
(I = 0,05; 0,1 m NaCl; 1 : 10000 Thimerosal) enthält, wird unter Rühren in einen
silikonisierten 25 ml-Rundkolben gegeben, der bereits 1,61 g des gemäß Beispiel
1 hergestellten Styrol-Glycidylmethacrylats enthält. Die erhaltene Latexsuspension
wird 4 Tage bei 50C gerührt. Hierauf wäscht man das Reaktionsgemisch durch etwa
3-stündige Membranfiltration in einer Diaflo-Filterzelle mit 145 ml Phosphatpuffer.
Der gewaschene Latex und die Spüllösung werden in Cellophan gegen 0,1 m Glycinpuff
er (pH 8,2) dialysiert. Nach 2-tägiger Dialyse erhält man 16,4 g des Styrol-Glycidylmethacrylat-Latex/HCG-Produkts,
das eine Nachweisempfindlichkeit von 0,9 IE HCG/ml besitzt.
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Beispiel 5 Das Verfahren von Beispiel 4 wird mit folgenden Ausnahmen
wiederholt. Das Reaktionsgemisch wird nach 3 Tagen mit 1 ml Glycinpuffer (pH 8,2)
behandelt, um die restlichen Epoxygruppen zu zersetzen. Nach weiterem 1-tägigem
Rühren in der Kälte werden 9,9 g des Reaktionsgemisches durch Membranfiltration
mit 188 ml eines pH 7,0-Phosphatpuffers (I = 0,05; 0,1 m Nah1) gewaschen. Das erhaltene
Produkt und die Spüllösung werden mit 13 mg Natriumazid als Konservierungsmittel
bchandelt. Das Produkt besitzt eine Nachweisempfindlichkeit von 1,8 IE HCG/ml.
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Beispiel 6 Ein gemäß Beispiel 2 hergestellter Latex (3,08 g Latex,
0,46 g Polymerisat) wird in einen 25 ml-Rundkolben eingebracht, der mit einem Teflon-beschichteten
Magnetrührstab ausgerüstet ist. Eine Lösung, die 5000 IE HCG'in 8 ml kaltem pH 8-Phosphatpuffer
(I = 0,05; 0,1 m NaCl; 0,01 % Thimerosal) enthält, wird langsam in den Kolben gegeben,
worauf man 90 bis 96Stunden bei etwa 5 0C langsam rührt. Das erhaltene Latex-HCG-Konjugat
wird etwa 70 bis 110 Minuten durch Ultrafiltration mit 110 bis 115 ml Phosphatpuffer
gewaschen, Das kombinierte Latex-HCG und die Spüllösungen werden 24 Stunden bei
50C in Cellophan dialysiert. Das erhaltene Produkt besitzt eine Nachweisempfindlichkeit
von 0,9 bis 1,8 IE HCG/ml.
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Beispiel 7 Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren
wird HCG auch an den Latex von Beispiel 3 gekoppelt.
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In den folgenden Beispielen wird die Kopplung von Insulin an Styrol-Glycidylmethacrylat
-Latex erläutert.
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B e i s p i e l 8 Ein gemäß Beispiel 1 hergestellter Latex (2,5 g
Latex, 0,75 g Polymerisat) wird in einen Kolben eingebracht und mit 2,5 ml Insulinlösung
(15 mg Insulin) sowie 5 Tropfen 0,1 n Natronlauge versetzt. Der pH beträgt 8. Das
Reaktionsgemisch wird 90 Stunden bei 5 C gerührt, worauf man 4,4 g des Latex-Reaktionsgemisches
(4,8 g) durch Membranfiltration in einer Diaflo-Filterzelle unter Verwendung eines
0,1 ßm,Millipore-Filters mit pH 8-Boratpuffer wäscht. Es wird ein hydrodynamischer
Druck von etwa 3,5 atü angewandt, und der Abstrom wird W-spektrometrisch auf die
Anwesenheit von ungekoppeltem Insulin untersucht. Die Filtration wird solange fortgesetzt,
bis kein Insulin im Abstrom nachgewiesen wird. Durch Dünnschichtelektrophor;ese
wird bestätigt, daß das Insulin chemisch an den Latex gebunden ist.
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Beispiel 9 Ein gemäß Beispiel 1 hergestellter Latex (6,3 g Latex,
0,92 g Polymerisat) wird zu einer Lösung gegeben, die 7,33 mg Meerrettichperoxidase
in 10 ml eines pH 8-Phosphat-Kochsalz-Puffers enthält. Das Gemisch wird bedeckt
und etwa 5 Tage bei 50C gerührt. Hierauf verdünnt man das Reaktionsgemisch mit Puffer
auf das 2- bis 3-fache und zentrifuigert etwa 35 Minuten bei 18 000 U/min. Der Uberstand
wird verworfen und der Latex-Peroxidase-Rückstand wird unter Zusatz von 1 % Netzmittel
in einem pH 7-Phosphat-Kochsalz-Puffer resuspendiert. Das Zentrifugieren und Resuspendieren
wird zwei weitere Male unter Verwendung von pH 7-Phosphat-Kochsalz-Puffer ohne Netzmittel
wiederholt. Anschließend filtriert man das Latex-Peroxidase-Konjugat durch ein dünnes
Glaswollepolster. Das erhaltene Konjugat wird auf seine enzymatische Peroxidaseaktivität
nach einer Abwandlung der Methode von Steinman et al. [J.Cell.Biol.,Bd. 55, S. 186
(1972)] untersucht. Drei Proben des Produkts sowie eine Probe des Produktüberstands
läßt man hierbei unterschiedlich lange Zeitspannen mit Substrat reagieren, das Dianisidindihydrochlorid
und Wasserstoffperoxid in einem pH 7-Phosphat-Kochsalz-Puffer enthält. Die Reaktionsgemische
werden filtriert, worauf man die Filtrate bei 400 nm untersucht. Hierbei werden
folgende Ergebnisse erzielt: Probe Reaktionszeit optische Dichte bei (min (min :
sec) 400 nm 1 4 : 55 0,53 2 5 : 17 0,62 3 9 : 17 0,65 4 (Uberstand) 10 : 13 0,005
Die Daten zeigen eine sehr geringe enzymatische Aktivität (Oxidation von Dianisidin)
in dem überstehenden Reaktionsgemisch (Probe Nr. 4). Die enzymatische Aktivität
des Latex-Peroxidase-Produkts beruht daher im wesentlichen auf Enzym, das auf den
Latexpartikeln immobilisiert ist, und nicht auf löslicher restlicher Peroxidase
in dem Uberstand.