DE2163318A1 - Sensibilisierte Zellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur passiven Agglutination - Google Patents

Sensibilisierte Zellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur passiven Agglutination

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DE2163318A1 DE19712163318 DE2163318A DE2163318A1 DE 2163318 A1 DE2163318 A1 DE 2163318A1 DE 19712163318 DE19712163318 DE 19712163318 DE 2163318 A DE2163318 A DE 2163318A DE 2163318 A1 DE2163318 A1 DE 2163318A1
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Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF
PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 8O. MAUERKIKCHERSTR. 45 2163318
Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 80, MouerkircherslroSe 45 Ihr Schreiben Unser Zeichen Datum 2Oi D6Zl l371
Anv/altsalrce 21 921
Be/A
Pujizoki Seiyaku Kabushiki Kaisha Tokyo/Japan
"Sensibilisierte Zellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur passiven Agglutination"
Die vorliegende Erfindung betrifft sensibilisierte Zellen, die zur Passivagglutination geeignet sind sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Eine Masse, die man durch Adsorbieren eines Antigens oder eines Antikörpers auf ein partikelformiges Material gewüncch
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130 693/1970 ^ -2~
BAD
ter Größe, (wobei das partikelförmige Material ein Träger ist), erhält, unterliegt der Agglutination mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigeno Eine solche Agglutination wird als passive Agglutination und die oben erwähnte Masse, auf der ein Antigen oder ein Antikörper adsorbiert ist, v/ird als "sensibilisierte Zelle" in dieser Beschreibung bezeichnet. Die sensibilisierte Zelle kann auch als "Indikator" bezeichnet werden, der ein Antigen oder einen Antikörper sichtbar werden läßt.
Als herkömmliche Träger der sensibilisi'erten Zelle wurden nicht-biologische Materialien, wie Polystyrollatex, Kaolin oder Holzkohlenpulver und biologische Materialien, wie Erythrocyte^rote Blutkörperchen) eines Tieres, verwendet =
Verfahren zur Herstellung der sensibilisierten Zelle, bei denen Polystyrollatex, Kaolin, Holzkohlenpulver oder Erythrocyten verwendet wurden, sind in den folgenden Bezugsstellen beschrieben;
(1) Polystyrollatex: US-Patentschrift 3 077 875;
(2) Kaolin: M0 Abe, "Basic research on agglutination using kaolin as a carrier for syphilis antibody", The Tokyo Journal of Medical Science, 61, 249-272, 1953»
(3) Holzkohle: J. Portnoy, J. Ho Brewer and A.L0 Harris, "Sapid plasma reagin card test for syphilis and other treponematoses", Public Health Reports, 77(8), 645-65', 1962;
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(4) Erythrocytes So Vo Boyden, "The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera", Journal of Experimental kedicine, 93, 107 - 120, 1951.
Der nicht-biologische Träger hat die Vorteile, daß er chemisch stabil ist und keine antigene Wirksamkeit hat, aber den Uaehteil, daß er ein Antigen oder einen Antikörper nicht fest adsorbierte Bs entfernt sich daher bei einer unter Verwendung des nicht-biologischen Trägers hergestellten, sensibilioierten Zelle das adsorbierte Antigen oder der adsorbierte Antikörper leicht von dem Träger, wenn man die sensibilisierte Zelle dem Trocknen oder Gefrieren unterwirft. Es muß demgemäß die sensibilisierte Zelle in einem flüssigen Zustand an einem dunklen und kalten Platz gelagert und kann dennoch nicht über längere Zeit aufbewahrt werdeno
Wenn Kaolin oder Holzkohle als Träger verwendet wird, können sensibilieierte Zellen mit bestimmter Partikelgröße nicht erhalten werden, v/eil Kaolin oder Holzkohle gleichmäiiger Größe schwer zu erhalten sind. Andererseits können bei Polystyrollatex Partikel gleichmäßiger Größe hergestellt werden, aber die Polystyrollatex-Partikel agglutinieren von selbst in einem Medium bei einem p^-Wert von 5,0 bis 8,0 ohi e die Antigen- oder Antikörper-Reaktion. Wenn daher PoIystyiDllatex-Partikel als Träger verwendet werden, muß eine Unter ichung der Antigen-Antikörper-Re&ktion in einer geeig-
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neten Pufferlösung, wie einer alkalischen Lösung eines höheren pT,-Wert es als 8,6, durchgeführt werden. Humanserum hat jedoch einen Ρττ-Wert von ungefähr 7,2. Die Polystyrollatex-Partikel haben den Machteil, daß sie unerwünscht agglutinieren, wenn sie als Träger für die sensibilisierte Zelle in einem solchen neutralen Medium mit pH I1 2 verwendet werden.
Erythrocyten von Tieren wie Schafen, die biologische Träger sind, haben bestimmte Partikelgrößen und sind leicht erhältlich, aber ihre Größe ist im allgemeinen groß, wobei sie eine Größe von ungefähr 6 bis 8 yum haben» Es kann daher, wenn solche biologische Träger verwendet werden, eine Untersuchung der Agglutinationsreaktion nur in einem relativ großen Gefäß, wie einem Reagenzglas,durchgeführt werden. Wenn die Untersuchung auf einem Objektträger durchgeführt wird, können die bevorzugten Agglutinationsklümpchen - durch welche entweder eine positive oder negative Reaktion in der passiven Agglutination festgestellt werden kann - wegen des
großen Umfangs des Trägers nicht erhalten werden. Dies ist dem Fachmann bekannt.
Um nun verbesserte, sensibilisierte Zellen herzustellen, die nicht die oben erwähnten Nachteile haben, wird die Verwendung von Mikroorganismen als Träger für sensibilisierte Zellen vorgetragen, wobei die nachfolgenden Pakten berück^- sientigt wurden:
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(1) Es gibt verschiedene Arten von Mikroorganismen, die hinsichtlich Größe und Formgebung verschieden.sind» Man kann demgemäß einen Mikroorganismus mit gewünschter Größe und Form im Bereich von 0,2 kl bis 5 /u aussuchen. Nun unterliegen aber die als Rohmaterial dienenden Mikroorganismen der Autolyse durch ihre eigenen Enzyme, wobei sie sich zersetzen, und es können daher die aus diesen als Rohmaterial dienenden Mikroorganismen hergestellten, sensibilisierten Mikroorganismenzellen nicht längere Zeit gelagert werden. Weiterhin sind die als Rohmaterial dienenden Mikroorganismen hydrophil, d. h. sie haben eine starke Affinität gegenüber Wasser, so daß ein auf den Mikroorganismus adsorbiertes Antigen oder adsorbierter Antikörper nicht mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen in dem Medium unter Bildung eines Klümpchens der Passivagglutination in der Antigen-Antikörper-Reaktion reagieren kann.
(2) Unterwirft man die Mikroorganismen der Zellwandfixierung mit Formaldehyd, so kann die oben erwähnte Lagerzeit der sensibilisierten Zellen verlängert werden, aber diese sensibilisierten Zellen zeigen noch immer nicht die gewünschte passive Agglutination bei der Antigen-Antikörper-Reaktion.
(3) Die verbesserten, sensibilisierten Zellen können ohne die oben angegebenen Nachteile dadurch erhalten werden, daß man als Träger der sensibilisierten Zellen Mikroorganismen verwendet, die der Zellwandfixierung mit Formaldehyd (äach-
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folgend als "Formaldehydfixierung" bezeichnet) und dann der Intrazellfixierung bei einer Temperatur über 90 C wenigstens 5 Minuten (nachfolgend als"Wärmefixierung" bezeichnet) unterworfen werden. Auf diesen Erkenntnissen beruht die vorliegende Erfindung.
Die sensibilisierten Zellen der vorliegenden Erfindung werden dadurch hergestellt, daß man einen Mikroorganismus als Träger der sensibilisierten Zelle verwendet und ein Antigen oder Antikörper auf den Träger adsorbiert. Dabei sind die Träger Mikroorganismen, die der Zellwandungsfixierung mit Formaldehyd und dann der Intrazellfixierung bei einer erhöhten Temperatur unterworfen wurden.
Es können zahlreiche Mikroorganismen, die den folgenden Bedingungen entsprechen, als Träger für die sensibilisierten Zellen verwendet werden.
Zu derartigen Mikroorganismen gehören-solche, die
v (1) keine serologische Aktivität haben,
(2) keine nicht spezifische Agglutination aufweisen,
(3) ein Antigen oder einen Antikörper fest adsorbieren und keine Änderung der antigenen Eigenschaften hervorrufen,
(4) eine bestimmte Größe haben,
(5) ein dem Medium ähnliches spezifisches Gewicht haben,
(6) längere Zeit stabil sind.
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Bevorzugte Mikroorganismen, die den oben erwähnten Bedingungen entsprechen, sind beispielsweise«
Saccharomyces cerevisiae Serratia marcescens Bruceila abortus
(Größe: 5 /um)
(Größe: 0,5x0,5^1,0 /am) (Größe: 0,25 /um)
Weiterhin können die nachfolgenden Mikroorganismen bevorzugt verwendet werden:
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megatherium, Proteus vulgaris, Bacterium zopfii, Lactobacillus bulgarieus, Acetobactor suboxydans, Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Tetracoccus liguefaciens, Sarcina lutea, Llicrococcus lysodelkties, Stapholococcus, Saccharomyces delbruckii lindner, Eremas ,us fertilis, Endomyces bisporus, Cryptococcus albidus und dergleichen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde "Bruceila abortus", das in einem αgaikulturmedium, das Rinderserum enthielt, gezüchtet wurde, als I -äger der sensibilisierten Zelle verwendet.
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Bruceila abortus, wie oben angegeben kultiviert, 25 mg, wurde in 1 ml Kochsalzlösung, die 0,3 ^ Formaldehyd enthielt, suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur 12 Stunden stehengelassen, um die Zeilwandungsfixierung zu bewirken. Der so behandelte Brucella abortus-Träger wurde abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen und dann erneut in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert» Diese wäßrige Suspension wurde bei einer Temperatur von 120 0 20 Minuten in einem Autoklaven erhitzt. Der so behandelte Träger P wurde mit "Haematoxylin -Fe++" 12 Stunden unter Rühren gefärbt und dann mit Wasser gewaschen und in... 1 ml 0,15M PPK (Phosphatpufferkochsalz-) Lösung mit p™ 7»2 suspendiert«.
Der wie oben angegeben gefärbte Träger wurde mit einer 0,15M PPK-Lösung, die 0,02 $ Tanninsäure enthielt, behandelt.
1 ml der PPK-Lösung, die 25 mg Tanninsäure-behandelten Träger enthielt, wurde mit 1 ml 0,15M PPK-Lösung, die 2 mg eines Protein-Antigens, do ho Streptolysin 0," enthielt, ge-
mischt und das G-emisch bei 37°G und p-g 6,4 40 Minuten stehen gelassen, um die Adsorption des Antigens auf dem Träger zu bewirken»
Der Träger mit dem adsorbierten Antigen, (d. h. "die mit Streptolysin 0 sensibilisierte Zelle")» wurde mit der 0,15M PPK-Lösung (pjj 7>2) gewaschen, und dann wurde die sensibilisierte Zelle in die 0,15M PPK-Lösung, die normales Kanin-
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chenserumserum und Glycin enthält, suspendiert. Auf diese Weise wurde eine Suspension der gewünschten sensibilisierten Zelle (Indikator) zur Verwendung "bei der passiven Agglutination erhalten.
Es ist darauf hinzuweisen, daß der oben angegebene lanninsäure-behandelte !rager andere verschiedene Antigene, beispielsweise Streptokinase, Treponema pallidum-Zellkomponente, Ihyroglobulin und dergleichen, in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, adsorbieren kann und daß die so erhaltenen sensibilisierten Zellen vorzugsweise zu der entsprechenden passiven Agglutinierung verwendet werden können.
In.dem oben angegebenen Beispiel wurden die mit Formaldehyd fixierten Mikroorganismen bei einer Temperatur von 1200C 20 Minuten erhitzt. Die. so behandelten Mikroorganismen wurden mit nicht behandelten und mit nur Formaldehyd-fixierten Mikroorganismen in der folgenden Weise verglichen.
100 mg von jedem der angegebenen Mikroorganismen wurden entsprechend in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert, und 1 ml einer gesättigten wäßrigen lösung von Natriumzitrat wurde zu der Suspension zugegeben, um die Koagulierung zu vergleichen. Die Ergebnisse waren:
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Mikroorganismen Koagulierungsgra d
nicht fixiert
(nicht behandelte) vollständig fixiert mit Formaldehyd mäßig
fixiert nach der vorliegenden Erfindung nicht
Im allgemeinen haben Kolloide Partikelgrößen im Bereich von 0,001 bis 0,1 yum. Die in dieser Erfindung verwendeten Mikroorganismen haben aber Abmessungen von 0,2 bis 5 /um« Solche Mikroorganismen sind genau genommen keine Kolloide. Jedoch
zeigen wäßrige Suspensionen von diesen Mikroorganismen ein der kolloidalen Lösung ähnliches Verhalten·
In der Kolloidchemie ist es allgemein bekannt, daß durch Zugabe einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumzitrat eine hydrophile, kolloidale Lösung leicht und eine hydrophobe, kolloidale Lösung schwer zum Koagulieren zu bringen ist, d. h. daß die gesättigte wäßrige Lösung von llatriumzitrat zur Feststellung geeignet ist, ob ein hydrophiles oder hydrophobes Kolloid vorliegt.
Aus dem oben angegebenen Ergebnis ist daher zu erkennen, daß die Mikroorganismen durch die Wärmefixierung ihren hydrophilen, kolloidalen Zustand in einen hydrophoben, kolloidalen Zustand geändert haben.
TJm nun die Überlegenheit der vorliegenden Erfindung darzulegen, wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, bei der die
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Passivagglutination der sensibilisierten Zellen verglichen wurde:
(1) Herstellung der sensibilisierten Zellen mit Streptolysin 0.
(a) Die sensibilisierte Zelle A wurde dadurch hergestellt, daß man das oben erwähnte Verfahren verwendete, ausgenommen, daß die lOrmaldehydfixierung und die Wärmefixierung nicht durchgeführt wurdeno
(b) Die sensibilisierte Zelle B wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die Wärmefixierung nicht durchgeführt wurde„
(c) Die sensibilisierte Zelle C-1 sowie die sensibilisierten Zellen C-2 bis C-6 wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die Wärmefixierung unter Verwendung der folgenden Temperaturen und Zeiten anstelle einer Temperatur von 12O0C und 20 Minuten durchgeführt wurdeo
Sensibilisierte Zelle C-2 900G, 12 Stunden.
Sensibilisierte Zelle C-3 10O0G, 5 Stunden.
Sensibilisierte Zelle C-4 11O0C, 1 Stunde.
Sensibilisierte Zelle C-5 1300G, 10 Minuten.
Sensibilisierte Zelle C-6 135°C, 5 Minuten»
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(2) Untersuchungsverfahren
(a) Die Passivagglutination wurde wie folgt verglichen: Verdünnte Sera wurden wie folgt hergestellt:
Ein Serum, das aus dem mit Streptococcus hemolyticus infizierten Blut erhalten wurde, wurde auf die gewünschte Konzentration mit 0,15M PPK-Lö'sung verdünnt, Der Grad der Verdünnung war 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 und 1:1280.
Die Passivagglutination wurde dadurch "beobachtet, daß man einen Tropfen von jeder Suspension der sensibilisierten Zelle A bis 0-6 zu jedem der verdünnten Sera zugab.
(b) Spezifische Viskositäten der Suspension der sensibilisierten Zellen A bis G-6 wurden bei einer Temperatur von 25°0 mit dem Ostwald-Viskometer gemessene
In diesem Falle wurde die Suspension, die 10 mg sen-P sibilisierte Zellen in 1 ml enthielt, verwendet.
(3) Ergebnisse
(a) Ergebnisse nach dem Untersuchungsverfahren (a)
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Grad der Verdünnung des Serums 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280* Sensibilisierte Zelle
C-1
0-2
C-3
0-4
C-5
C-6
* -: keine Agglutinierung
+: mäßige Agglutinierung ++: vollständige Agglutinierung
(b) Ergebnisse nach dem Untersuchungsverfahren (b) Sensibilisierte Zelle Spezifische Viskosität
A 1,0310
B 1,0287
0-1 1,0195
0-2 1,0245
0-3 1,0234
0-4 1,0215
0-5 1,0223
C-6 1,0205
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(4) Analyse
Aus den Ergebnissen der Untersuchungen ist zu erkennen, daß die sensibilisierten Zellen C-1 bis C-6 bevorzugt zur Passivagglutination verwendet werden, wobei diese sensibilisierten Zellen dadurch, hergestellt werden, daß man Mikroorganismen verwendet, die der Formaldehydfixierung und Wärmefixierung bei einer Temperatur über 90 G wenigstens 5 Minuten unterworfen wurden«,
Die Suspensionen der sensibilisierten Zellen C-1 bis C-6 haben eine geringe spezifische Viskosität. Eine derartige geringe Viskosität der Suspension ist der Änderung des hydrophilen, kolloidalen Zustande in den hydrophoben, kolloidalen Zustand des Mikroorganismus zuzuschreiben. Nach der Erfindung werden die sensibilisierten Zellen, die aus den Mikroorganismen des hydrophoben, kolloidalen Zustande hergestellt werden, bevorzugt zur passiven Agglutination verwendet.
Weiterhin können die, wie oben angegeben, erhaltenen
W _
sensibilisierten Zellen sehr gut mit einem Farbstoff, wie Fuchsin oder Methylen-Blau, gefärbt werden. Die Passivagglutination ist leichter festzustellen, wenn man gefärbte sensibilisierte Zellen verwendet oder man die Farbstoffe dem Medium zugibt, das zur Verdünnung des zur Prüfung vorgesehenen Serums verwendet wird.
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Bei der often erwähnten Formaldehydfixierung kann die Konzentration einer Formaldehyd-Lösung, die Temperatur der Lösung und die Fixierzeit gegebenenfalls und abhängig von der Art des zur Behandlung vorgesehenen Mikroorganismus geändert werden. Im allgemeinen kann die Konzentration von 0,2 bis 20 #, die Temperatur 0 bis 370C und eine Zeit von 30 Minuten bis 72 Stunden nach Wunsch verwendet v/erden.
Beispiel 2
Eine sensibilisierte Zelle wurde dadurch hergestellt, daß mar das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wiederholte, ausgenommen, daß:
(1) Saccharomyces eerevisiae, die in einem Agarkulturmedium, das 1 io Maltose enthielt, kultiviert wurden, als Träger anstelle von Bruceila abortus verwendet wurden}
(2) ein Antigen, "Sreponema pallidum-Zellkomponente", anstelle von Streptolysin 0 verwendet wurde, und
(3) ein Serum, das aus mit Syphilis infiziertem Blut erhalten wurde, anstelle eines Serums, das man aus mit Streptococcus hemolyticus infiziertem Blut erhalten hatte, verwendet wurde.
Die so hergestellten sensibilisierten Zellen zeigten ähnliche Eigenschaften wie die sensibilisierten Zellen von Bei-
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- 16 spiel 1 hinsichtlich der Antigen-Antikörper-Reaktion.
In den oben angegebenen Beispielen 1 und 2 wurden sensibilisierte Zellen vorgestellt, bei denen ein Antigen auf den Träger adsorbiert wurde. Es können jedoch die Mikroorganismen, die der Formaldehyd-Fixierung und der Wärmefixierung, wie oben angegeben, unterworfen wurden,ebenso als Träger verwendet werden, auf die ein Antikörper adsorbiert wird, und die so sensibilisierten Zellen, auf die der Antikörper adsorbiert ist, können mit dem entsprechenden Antigen reagieren, wodurch die passive Agglutination in ähnlicher Weise wie in den Beispielen 1 und 2 bewirkt wird.
Die Erfindung beinhaltet demgemäß sensibilisierte Zellen, die zur Passivagglutination geeignet sind, wobei sie in der Weise hergestellt sind, daß man als Träger Mikroorganismen verwendete, die der Zeilwandungsfixierung mit Formaldehyd und dann der Intrazellfixierung bei einer Temperatur über 900G wenigstens 5 Minuten unterworfen wurden und ein Antigen oder ein Antikörper auf den Träger adsorbiert wurde.
Patentansprüche:
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Claims (1)

  1. - 17 Patentansprüche»
    1o Zur passiven Agglutination geeignete, sensibilisierte Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen oder ein Antikörper auf einen Träger adsorbiert wurde, der ein Mikroorganismus ■ iH einem hydrophoben, kolloidalen Zustand ist.
    2β Verfahren zur Herstellung von zur Passivagglutination geeigneten, sensibilisierten Zellen, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus der Zellwandungsfixierung mit formaldehyd und dann der Intrazellfixierung bei einer erhöhten Temperatur unterwirft, um den Mikroorganismus von einem hydrophilen, kolloidalen Zustand in einen hydrophoben, kolloidalen Zustand zu überführen und ein Antigen oder einen Antikörper auf den Mikroorganismus adsorbierte
    3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Intrazellfixierung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von 90 bis 135 C wenigstens 5 Minuten lang in einer wäßrigen Suspension durchführt.
    4β Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwandfixierung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von 0 bis 37 C
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    wenigstens 30 Minuten unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von Formaldehyd mit einer Konzentration von 0,2 bis 20 <$> durchführt.
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DE2163318A 1970-12-26 1971-12-20 Verfahren zur Herstellung von zur passiven Agglutination geeigneten Tra gerteilchen aus mit Formaldehyd be handelten Mikroorganismen Expired DE2163318C3 (de)

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