AT251759B

AT251759B - Gefriergetrocknetes immunologisches Reagenz

Info

Publication number: AT251759B
Application number: AT68963A
Authority: AT
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1962-02-05
Filing date: 1963-01-29
Publication date: 1967-01-25

Description


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  Gefriergetrocknetes immunologisches Reagenz 
Die Erfindung betrifft ein immunologisches Reagens zur Feststellung und Bestimmung von menschlichem gonadotropem Chorionhormon (im nachstehenden HCG bezeichnet) in der Schwangerschaftsdiagno- 
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   Eine Schwangerschaft kann erfindungsgemäss durch Feststellung und Bestimmung von HCG in einer Urinprobe diagnostiziert werden, da in einem solchen Falle HCG anwesend ist, andernfalls jedoch gewöhnlich fehlt. Da HCG antigene Eigenschaften besitzt, kann der Test immunologisch unter Verwendung von HCG-Antikörper durchgeführt werden und die Antigen/Antikörperreaktion nach der Haemagglutinierungstechnik beobachtet werden. 



   Gemäss diesem Verfahren wird die immunologische Reaktion in Gegenwart einer Suspension von HCG-sensibilisierten roten Blutzellen von Säugetieren durchgeführt, wobei eine äuqivalente Menge von HCG-Antikörper verwendet wird (eine Menge, die gerade ausreicht, eine vollständige Agglutinierung der sensibilisierten Zellen bei Abwesenheit von zusätzlichem HCG zu bewirken). Ist eine hinreichende HCGMenge in der Urinprobe anwesend, werden die sensibilisierten Zellen nicht agglutiniert. Die Konzentration an HCG im Urin kann dadurch bestimmt werden, dass in Versuchsserien der Urin verdünnt wird und jene grösste Verdünnung bestimmt wird, welche noch die Agglutinierung verhindert. 



   Zur Herstellung der sensibilisierten Zellen werden frische rote Blutzellen von Säugetieren mit einem Aldehyd und einem Bindemittel sowie mit HCG behandelt. Zweckmässig sind Zellen von Schafen, doch können auch Zellen von andern Species, wie Rindern, Pferden, Kaninchen und Menschen, verwendet werden. Der Aldehyd ist zweckmässigerweise Formaldehyd, obwohl auch andere Aldehyde, wie Acetaldehyd oder Brenztraubenaldehyd, verwendet werden. Als Bindemittel kann Gerbsäure, Bis-diazobenz- 
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 werden können, dass in einem einzigen Verfahrensschritt frische Zellen mit einem Hydrochinon und Formaldehyd behandelt und danach mit HCG sensibilisiert werden. 



   Für eine   Schwangerschaftstest-Ausrüstung   werden die sensibilisierten Zellen und das Antiserum zweckmässigerweise gefriergetrocknet entweder einzeln oder in äquivalenten Mengen kombiniert zusammengestellt. 



   Gegenstand der Erfindung ist ein gefriergetrocknetes immunologisches Reagens zum Nachweis und zur Bestimmung von menschlichem gonadotropem Chorionhormon (HCG), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es HCG-sensibilisierte rote Blutzellen von Säugetieren, eine äquivalente Menge an HCGAntikörpern sowie einen Gefriertrocknungsexzipienten enthält. 



   Ein wasserlöslicher Exzipient (gewöhnlich ein Zucker, wie Rohrzucker) wird verwendet, um die Unversehrtheit der Zellen während des Gefriertrocknungsprozesses zu erhalten, und dient dazu, die Zellen bei Zugabe eines wässerigen Mediums schnell wieder zu dispergieren. Vor der Verwendung werden die gefriergetrockneten Zubereitungen in dem wässerigen Medium, in welchem der Test ausgeführt werden soll, wiederhergestellt. Das gleiche Medium wird verwendet, um den Urin zur Herstellung der Proben für den Test zu verdünnen. 

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    :11/2   h unter gelegentlichem Rühren bebrütet. Die Zellen wurden danach 4mal mit 100 Volumina Borat/ Succinatpuffer gewaschen. 



   Die sensibilisierten Zellen wurden in 100 ml Borat/Succinatpuffer, enthaltend 10 Gew.-/Vol. 



  Rohrzucker, wieder suspendiert. Hiezu werden 80 ml Borat/Succinatpuffer zugesetzt sowie 20 ml Kaninchenserum, enthaltend ausreichend Antikörper zu HCG, um eine vollständige Agglutinierung der sensibilisierten Zellen zu bewirken. Das zugesetzte Kaninchenserum besteht aus der erforderlichen Menge (bestimmt durch Berechnung aus dem Antikörpertiter) eines von durch gereinigtes HCG geimpften Kaninchen erhaltenen Antiserums zusätzlich einer Menge gewöhnlichen Kaninchenserums zur Auffüllung auf 20 ml. 



   Die agglutinierte Suspension wurde in 1 ml Mengen in 5 ml Ampullen verteilt und in üblicher Weise der Gefriertrocknung unterworfen. 



     Beispiel 2 :   Reagens für den Schwangerschaftstest. 



   Frische rote Blutzellen von Schafen wurden 3mal mit 20 Volumina physiologischer Salzlösung gewaschen und als   zigue   Suspension in   5% figer   Natriumchloridlösung, enthaltend   0, 150/0 Benzol-l, 4-diol,   welche mit 0, 15m-Phosphat auf PH   7, 0   gepuffert war, angesetzt. Die Suspension wurde während 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu 10 Volumina der Suspension wurde 1 Volumen Formalin (handelsübliche 40   Gew.-/Vol.-% Formaldehydlösung)   zugesetzt. Die Mischung wurde während 18 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und zu   l%   in Borat/Succinatpuffer wiedersuspendiert. 



   Die roten Zellen von   1 1 der lloigen   Suspension wurden danach 3mal in physiologischer Salzlösung gewaschen und in 200 ml Ädetatpuffer wiedersuspendiert. Darauf wurden 3500 IE gereinigtes HCG (Leo) in 3 ml Ädetatpuffer zugesetzt. Die Mischung wurde während 4 h bei   370C   unter gelegentlichem Rühren bebrütet. Danach wurde 4mal mit 100 Volumina Borat/Succinatpuffer gewaschen. 



   In der in Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden die sensibilisierten Zellen abermals in Borat/Succinatpuffer enthaltend Rohrzucker suspendiert und mit Kaninchenserum enthaltend HCG-Antikörper agglutiniert und die agglutinierte Suspension der Gefriertrocknung unterworfen. 



   Verwendung des Reagens. 



   Je eine Ampulle des gefriergetrockneten Reagens und eine Kontrollampulle (enthaltend konservierte unsensibilisierte Zellen, nur mit gewöhnlichem Kaninchenserum behandelt und gefriergetrocknet) werden mit Boratpuffer wieder zu Suspensionen von 5 ml angesetzt. Die zu prüfende Probe menschlichen Urins wurde durch Zentrifugieren geklärt und mit Boratpuffer verdünnt. Verdünnungen im Ausmass von 1/2,1/5, 1/10,1/20 und 1/200 wurden ebenso wie eine Kontrollprobe mit Puffer allein in Mengen von 1, 0 ml in zwei Reihen von Glasröhren mit rundem Boden (vorzugsweise im Ausmass von 0, 195 cm x 7, 6 cm) in einem geeigneten Gestell einpippetiert. Jedem Proberohr der ersten Reihe wurde die wieder angesetzte Reagenssuspension in Mengen von 0, 1 ml und die Kontrollsuspension jedem Rohr der zweiten Reihe zugesetzt.

   Die Inhalte wurden durch Schütteln oder Umdrehen der Röhrchen vermischt und die Mischungen über Nacht frei von Zugluft und Erschütterungen bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am nachfolgenden Morgen wurden die Ergebnisse dieses Versuches abgelesen, indem das Agglutinierungsbild am Boden der Röhrchen beobachtet wurde. Aus den Kontrollproben mit Puffer allein und ohne Urin ergab sich, dass mit der Reagenssuspension vollständige Agglutinierung, mit der Kontrollsuspension hingegen keine Agglutinierung eintrat. Bei Anwesenheit von HCG im Urin war die Reagenssuspension, beginnend mit der halben Verdünnung, unagglutiniert und besass das Aussehen der nicht agglutinierten Kontrollproben. Der Titer der Urinprobe wurde ausgedrückt als jene Verdünnung der Probe im letzten Rohr, in welchem eine definierte Disagglutinierung der Reagenssuspension beobachtet wurde.

   Gelegentlich tritt bei Verdünnungen von 1/2 oder 1/5 sowohl ein Agglutinieren der Reagens- als auch der Kontrollsuspensionen ein ; dies zeigt die Anwesenheit eines nicht spezifischen Agglutinins im Urin an. Sind nur geringe Mengen HCG im Urin anwesend, kann diese nicht spezifische Agglutinierung die Disagglutinierungsreaktion verdecken, so dass es in diesen seltenen Fällen erforderlich werden kann, den Versuch mit einer frischen Urinprobe zu wiederholen. 



   Die Ergebnisse des Schwangerschaftstests an Urinproben von 127 klinisch festgestellten Schwangerschaften sind in Tabelle 1 in der Reihenfolge der Schwangerschaftsdauer (in Wochen) wiedergegeben. Mit Ausnahme eines Falles, welcher ein negatives Ergebnis gab und welcher bei der klinischen Nachprüfung keine Schwangerschaft ergab, wurden alle Schwangerschaften später bestätigt. 

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  Tabelle 1 
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<tb> 
<tb> Schwangerschaftsdauer <SEP> Testergebnisse <SEP> 
<tb> positiv <SEP> negativ
<tb> 6-8 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> 9-12 <SEP> 39 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 13-16 <SEP> 33 <SEP> 2
<tb> 17 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 21-24 <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> 25 <SEP> - <SEP> 28 <SEP> 14 <SEP> 0
<tb> > 28 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 
 
Die durchwegs negativen Ergebnisse an 211 nichtschwangeren Frauen, in der Reihenfolge der Altersgruppen (Jahre) angeführt, sind in Tabelle 2 wiedergegeben. 



   Tabelle 2 
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<tb> 
<tb> Altersgruppe <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Frauen
<tb> 17 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 41
<tb> 20-30 <SEP> 56
<tb> 30 <SEP> - <SEP> 40 <SEP> 23
<tb> 40-50 <SEP> 37
<tb> > 50 <SEP> 54
<tb> 
   PATENTANSPRÜCHE :    1. Gefriergetrocknetes immunologisches Reagens zum Nachweis und zur Bestimmung von menschli- 
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 sierte rote Blutzellen von Säugetieren, eine äquivalente Menge an   HCG-Antikörpem   sowie einen Gefriertrocknungsexzipienten enthält.

Claims

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem einen Boratpuffer in Mischung mit den übrigen Bestandteilen oder getrennt hievon enthält. EMI4.4