AT241027B - Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens 
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Reagientien(Blutkörperchen) können auch in Gegenwart von weiterem freiem Antigen disagglutinieren. Diese Reaktionen können zum Nachweis von Proteinantigenen verwendet werden,   z. B. in Körperflüssigkelten.   Solche Antigene sind unter anderem chorionisches Gonadotropin (HCG), Serumalbumin, y-Globulin, Insulin, Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid. Für den Nachweis von HCG Im Harn von Schwangeren bildet die Reaktion die Basis eines in vitro-Tests für bestehende Schwangerschaft. 



   Die verwendeten roten Blutkörperchen stammen üblicherweise von Schafen, es können jedoch auch Blutkörperchen von andern Säugetieren einschliesslich Rind, Pferd, Kaninchen und Mensch verwendet werden. 



   Bei einem bekannten Verfahren für die Herstellung von antigen sensibilisierten roten Blutkörperchen werden dieselben zunächst durch Behandlung mit einem Aldehyd in wässerigem Medium konserviert, wobei gewöhnlich Formaldehyd verwendet wird, obgleich auch andere Aldehyde, wie Azetaldehyd und Methylglyoxal, benutzt werden können. Danach werden die Blutzellen sorgfältig von Aldehyd freigewaschen und in wässerigem Medium mit einem Beizmittel (Bindemittel) behandelt, welches üblicherweise Gerbsäure ist. Das überschüssige Beizmittel wird entfernt, und die Zellen werden schliesslich durch Behandlung mit dem bestimmten Antigen, z. B. HCG, in wässerigem Medium sensibilisiert.

   Während dieses gesamten Arbeitsvorganges ist der Umfang des erforderlichen Waschens beschwerlich, wenn die Herstellung in grossem Massstab ausgeführt wird, und die Gerbsäure ist auch ein recht unbefriedigendes Beizmittel. 



   Es wurde nun gefunden, dass antigen sensibilisierte Zellen in verlässlicher Weise durch Verwendung eines Diphenols oder Chinons niederen Molekulargewichts (unter 200) als Beizmittel erzeugt werden können. Ein solches Beizmittel wird vorzugsweise den frischen Zellen zugesetzt, noch bevor der Aldehyd zugefügt wird, obwohl unter gewissen Umständen gleiche Ergebnisse erzielt werden können, wenn der Aldehyd vor dem Beizmittel, oder eine Mischung des Beizmittels und des Aldehyds zu den roten Blutkörperchen zugesetzt wird. Es kann auch notwendig sein, einen Puffer gegenwärtig zu haben, um während des Mischens des Beizmittels mit dem Aldehyd das Absinken des pH-Wertes zu verringern. Die so behandelten Zellen können mit einem Antigen nach relativ kurzem Waschen sensibilisiert werden.

   Sie sind relativ stabil und können, wenn notwendig, viele Tage gelagert werden, bis sie für die Sensibilisierung mit einem Antigen gebraucht werden. 



   Die Beizmittel, die gemäss der Erfindung verwendet werden können, sind unter anderem Hydrochinone (kreuzkonjugierte aromatische Diole, die sich zu Chinonen oxydieren lassen) einschliesslich Benzol-   - 1, 4-diol (I, 4-Dihydroxybenzol), Toluol-2,   5-diol   (2, 5-Dihydroxytoluol),   und die Naphthalin-1, 4- und - 2, 6-diole sowie die entsprechenden Chinone und auch die andern Dihydroxybenzole, Dihydroxytoluole und Dihydroxynaphthaline. 



   Die Menge des benötigten Beizmittels steigt mit zunehmender Menge des verwendeten Aldehyds. Das Beizmittel und der Aldehyd werden vorzugsweise in einem Molverhältnis zwischen 1 : 5 und 1 : 150 ver- 

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 hält man ein Produkt von gleichmässigem und reproduzierbarem Titer. 



   Die sensibilisierten Zellen werden passenderweise entweder separat oder in Verbindung mit einer äquivalenten Menge an Antiserum gefriergetrocknet dargestellt. Es wird ein wasserlöslicher Exzipient (passenderweise ein Zucker wie Sucrose) verwendet, um die Unversehrtheit der Zellen während des Gefriertrocknungsprozesses sicherzustellen und die rasche Redispergierung derselben zu gewährleisten, wenn ein wässeriges Medium zugesetzt wird. Vor der Verwendung werden die gefriergetrockneten Präparate in das wässerige Medium, in welchem der Test vorgenommen werden soll, wiederhergestellt. 



   Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Herstellung der beiden zur Verwendung gelangenden Pufferlösungen wird im folgenden beschrieben. 



   Borat/Succinatpuffer PH 7, 5. 



   95, 5 g Natriumborat   NaO. 10 H2O   und   37. 5   g Natriumchlorid wurden in 5   l   dest. Wasser aufgelöst.   23, 6   g   Bernsteinsäure   und 30, 0 g Natriumchlorid wurden in 4 1 dest. Wasser aufgelöst. Gleiche Volumina der beiden Lösungen wurden vermischt, und der PH wurde durch Zusatz einer kleinen Menge der Natriumboratlösung   auf 7. 5   eingestellt. 



   Boratpuffer PH   8,     2-8, 3.   



   Eine Mischung von   3, 0   g Natriumborat   Na B40. 10 HO. 4, 4   g Borsäure   H BO und 7.   6 g Natriumchlorid wurden in 11 dest. Wasser aufgelöst. 



     Beispiel l : Frische,   vom Schaf stammende rote Blutkörperchen wurden dreimal mit 20 Teilen 
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Kochsalzlösungdispergiert, welche 0,   15%   Hydrochinon enthielt und auf PH 7, 0 mit 0, 15m-Phosphat gepuffert war. Die Suspension wurde während 15 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Zu 10 Vole-Teilen der Suspension wurde 1   Vol. -Teil   Formalin (handelsübliche   40%   G/V Formaldehydlösung) zugesetzt. Die Mischung wurde 18 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und in einer   l%oigen Borat/Succinatpufferlösung   redispergiert. 



     Die roten Blutkörperchen   von   11 der l% igen Suspension   wurden dann dreimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 200 ml   eines "#detatpuffers" (0,05m-Dinatriumdihydrogen-äthylendiamin-   - tetraazetat durch Zusatz von   2n-Natriumhydroxyd   auf ein PH von 8, 4 eingestellt) redispergiert. Sodann wurde gereinigte HCG (Leo), 3500 internationale Einheiten, in 3 ml Ädetatpuffer zugesetzt. Die Mi- 
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   Die sensibilisierten Zellen wurden in 100 ml   Borat/Succinatpuffer,   welcher   100/0   G/V Sucrose enthielt, redispergiert. Dazu wurden 80 ml Borat/Succinatpuffer und 20 ml Kaninchenserum, welches genügend Antikörper zu HCG enthielt, um vollständige Agglutination der sensibilisierten Zellen zu bewirken, zugesetzt. Das zugesetzte Kaninchenserum bestand aus der erforderlichen Menge (geschätzt durch Kalkulation aus   dem Antikörper-Titer) eines Antiserums,   welches von Kaninchen erhalten wurde, die mit gereinigtem HCG behandelt wurden, plus einer Menge von normalem Kaninchenserum, um auf 20 ml Gesamtvolumen aufzufüllen. 



   Die agglutinierte Suspension wurde in Mengen von 1 ml in 5   ml-Ampullen   eingefüllt und in der üblichen Weise gefriergetrocknet. 



   Zum Zwecke der Verwendung für einen in vitro-Schwangerschaftstest wurden die Ampullen des gefriergetrockneten Reagens und eine Kontrollampulle (enthaltend konservierte, nicht sensibilisierte Zellen, die mit normalem Kaninchenserum allein behandelt und gefriergetrocknet wurden) mit   Boratpuffe :   zu 5 ml Suspensionen redispergiert. Eine Probe von menschlichem Harn. welcher auf HCG untersuchl werden soll, wurde durch Zentrifugieren geklärt und mit Boratpuffer verdünnt. Verdünnungen von 1/2, 1/5, 1/10, 1/20 und 1/200 sowie eine Kontrolle mit Puffer allein wurden in Mengen von 1 ml in zwei Reihen von Rundbodenglasröhren (vorzugsweise mit der Abmessung von 0, 195 cm. 7, 6 cm), welche   sicl   in einem geeigneten Ständer befanden, einpipettiert.

   Die wiederhergestellte Reagenssuspension wurde ir Mengen von 1 ml in jedes Rohr der ersten Reihe und der Kontrollsuspension in ähnlicher Weise zu jeden Rohr der zweiten Reihe zugesetzt. Der Inhalt der Röhren wurde durch Schütteln oder Umdrehen derselber gemischt, und die Mischungen wurden über Nacht bei Zimmertemperatur, geschützt vor Zugluft und Erschütterung, stehen gelassen. Das Ergebnis des Tests wurde am nächsten Morgen durch Beobachtung de ! 

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 Musters der Agglutination am Boden der Röhren abgelesen. Von den Kontrollen mit Puffer allein und ohne Harn war das mit der Reagenssuspension völlig agglutiniert und das mit der Kontrollsuspension war unagglutiniert. Wenn HCG im Harn vorhanden war, war die Reagenssuspension in den Röhren, beginnend bei der Verdünnung 1/2, disagglutiniert und hatte das Aussehen der unagglutinierten Kontrollen.

   Der Titer der Harnprobe wurde ausgedrückt als die Verdünnung der Probe in der letzten Röhre, in welcher definitive Disagglutination der Reagenssuspension beobachtet wurde. Gelegentlich wurden bei Verdünnungen von 1/2 oder 1/5 sowohl die Reagens- wie auch die Kontrollsuspensionen agglutiniert ; dies zeigte die Gegenwart eines nicht spezifischenAgglutinins im Harn an. Wenn nur kleine Mengen von HCG im Harn vorhanden waren, konnte diese nicht spezifische Agglutination die Disagglutinationsreaktion maskieren und in seltenen Fällen die Wiederholung des Tests mit einer frischen Harnprobe notwendig machen. 



   Die Ergebnisse der Schwangerschaftstests an Harnproben von 127 klinisch diagnostizierten Schwangerschaften, geordnet nach der Dauer der Schwangerschaft   (Wochen),   sind in Tabelle I zusammengestellt. Mit Ausnahme von einem der Fälle, der ein negatives Resultat ergab und welcher bei neuerlicher klinischer Prüfung als nicht schwanger gefunden wurde, wurden alle diese Schwangerschaften später bestätigt. Die Ergebnisse, sämtliche negativ, von Tests an 211 nicht schwangeren Frauen, die entsprechend der Altersgruppen (Jahre) zusammengestellt wurden, werden in Tabelle II gezeigt. 



   Tabelle I 
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<tb> 
<tb> Klinisch <SEP> diagnostizierte <SEP> Schwangerschaften
<tb> Schwangerschaftsdauer <SEP> Testergebnisse
<tb> (Wochen) <SEP> positiv <SEP> negativ
<tb> 6-8 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> - <SEP> 12 <SEP> 39 <SEP> 1
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 16 <SEP> 33 <SEP> 2
<tb> 17-20 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 21 <SEP> - <SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> 25-28 <SEP> 14 <SEP> 0
<tb> > 28 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 
 Tabelle II 
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<tb> 
<tb> nicht <SEP> schwangere <SEP> Frauen
<tb> Altersgruppe <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Frauen
<tb> 17 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 41
<tb> 20 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 56
<tb> 30 <SEP> - <SEP> 40 <SEP> 23
<tb> 40 <SEP> - <SEP> 50 <SEP> 37
<tb> > 50 <SEP> 54
<tb> 
   Beispiel 2 :   Ähnlich zufriedenstellende Reagentien wurden durch Abänderung der Arbeitsweise des Beispiels 1 hergestellt.

   Die Konzentration von Hydrochinon wurde von   0, 15z   auf 0,   So   und   1, 0pro   erhöht und die Suspensionen wurden, bevor Formalin zugesetzt wurde, 15-30 min und danach 18 h bis 4 Tage stehen gelassen. Die Incubationszeit mit HCG wurde von 4 h auf   1, 5   h   verkürzt, und   die sensibilisierten Zellen wurden dann fünfmal mit 100 Vol. -Teilen Borat/Succinatpuffer gewaschen. 



     Beispiel 3 : Frische,   vom Schaf stammende rote Blutkörperchen wurden dreimal mit 20   Vol.-Tei-   len physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. 100 ml der gewaschenen, dicht gepackten Zellen wurden in 500 ml einer Lösung von 2, 5 g Hydrochinon in eine mit   0, 15m-Phosphat   auf PH 7, 0 gepufferte   55oigne   Natriumchloridlösung eingebracht. Die Suspension wurde 15 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. 



  Zu dieser wurden dann 500 ml einer Lösung von 40 g Paraformaldehyd in 5%iger Natriumchloridlösung zugesetzt, die mit 0, 15m-Phosphat auf PH 7, 0 gepuffert war. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur während ungefähr 24 h stehen gelassen. 



   Die Zellen von 500 ml dieser Suspension wurden dreimal in   physiologischer Kochsalzlösung   gewaschen und in. einer Lösung von 250 mg menschlichem y-Globulin in 11 Ädetatpuffer PH 8, 4 (hergestellt 

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 durch Mischen von   O, 05m-Dinatriumdihydrogenäthylen-diamin-tetraazetat   und 0,   Sn-Natriumhydroxyd   redispergiert. Die Mischung wurde während 1 h bei   3'7 C   incubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit 20   Vol.-Teilen   physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 11 Borat/Succinatpuffer suspendiert, welcher   5%   Sucrose und   50/0 normales Kaninchenserum   enthielt, wobei das Serum vorher an mit Hydrochinon-Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen vom Schaf absorbiert wurde.

   Die Suspension wurde in Mengen von 1 ml in 5   ml-Ampullen   eingefüllt und in der üblichen Weise gefriergetrocknet. 



   Ein Antiserum, welches von Kaninchen gewonnen wurde, die mit menschlichem y-Globulin behandelt wurden, wurde in geeigneter Weise verdünnt und gefriergetrocknet, so dass es bei der Wiederherstellung einen Agglutinintiter von ungefähr 1 in 200 hatte. 



   Ein Standard-Menschenserumpräparat von   bekanntem Y-Globulingehalt wurde   in geeigneter Weise verdünnt und gefriergetrocknet, so dass zwischen 0,2 ml und 0,4 ml des wiederhergestellten Präparats 0, 5 ml des Antiserums äquivalent waren. 



   Für den Gebrauch wurde eine Ampulle des gefriergetrockneten sensibilisierten Zellreagens mit Boratpuffer wieder zu 5 ml einer Suspension zurückverwandelt. Das gefriergetrocknete Antiserum und die Stan-   dard-Y-Globulin-Präparate   wurden in   ähnlicher Weise wiederhergestellt. Ein   menschliches Serum, in welchem der   Y-Globulingehalt   durch den Test bestimmt werden sollte, wurde reihenweise mit Boratpuffer wie das   Standard-Y-Globulin-Präparat   verdünnt. Durch Vergleichen der geringsten Volumina des getesteten Serums und des Standard-y-Globulin-Präparats, welche erforderlich waren, die Agglutination der sensibilisierten Zellen von 0, 5 ml des Antiserums zu inhibieren, wurde der   y-Globulingehalt   des getesteten Serums berechnet.

   Bei Abwesenheit von Antiserum oder bei den Kontrollen, bei welchen nicht sensibilisierte Zellen verwendet wurden, fand keine Agglutination statt, hingegen kam es zu vollständiger Agglutination der sensibilisierten Zellen bei Anwesenheit des Antiserums und Abwesenheit des 7-Globulin-Präparats. 



     Beispiel 4 :   Ein Reagens ähnlich jenem der Beispiele 1 und 2 wurde entsprechend dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Benutzung von Hydrochinon bei einer Endkonzentration von   1, 0%   G/V, hergestellt, und die Zellen wurden mit HCG, wie in Beispiel 2 beschrieben, sensibilisiert. 



   Beispiel 5 : Unter Verwendung von Arbeitsweisen   ähnlich.   jener des Beispiels 1 wurden rote Blutkörperchen vomSchaf mit   l,   Wo   G/VLösungen   von Hydrochinon, Resorcin, Brenzkatechin und 1, 4-Benzochinon behandelt, und alle Produkte wurden mit Rinderserumalbumin sensibilisiert, wodurch zufriedenstellende Reagentien für das Studium der immunologischen Reaktion von Rinderserumalbumin und einem entsprechenden Kaninchenantiserum erhalten wurden. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens zur Durchführung des Haemagglutinationstests, bei welchem   rote Blutkörperchen von Säugetieren   in einem wässerigen Medium suspendiert, mit einem Beizmittel, einem Aldehyd und einem Proteinantigen behandelt werden, dadurch gekennzeichnet,   dass als Beizmittel ein Diphenol oder Chinon mit einem Molekulargewicht unter 200   verwendet wird.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass das Beizmittel und der Aldehyd in einem molaren Verhältnis zwischen 1 : 5 und 1 : 150 verwendet werden.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zuerst mit dem Beizmittel, dann mit dem Aldehyd und dann mit dem Antigen behandelt werden. EMI4.1