DE1617734B1

DE1617734B1 - Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens

Info

Publication number: DE1617734B1
Application number: DE1967P0041853
Authority: DE
Inventors: Rene Guffroy
Original assignee: POLYPHARMA
Current assignee: POLYPHARMA
Priority date: 1966-04-19
Filing date: 1967-04-10
Publication date: 1972-03-09
Also published as: BE696623A; GB1186544A; US3594466A; CH505387A; DK121394B; SE355416B; NO120657B; FR1484727A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Erythrocytensuspension zur Feststellung des Rheumafaktors durch Bindung eines Antikörpers an Erythrocyten mit Formalin.

Das immunologische Reagens ermöglicht insbesondere die schnelle Feststellung des Rheumafaktors auf einem Objektträger, beispielsweise einem Glasplättchen, zur Diagnostizierung der chronisch entzündlichenPolyarthritis. Das Reagens nach der Erfindung ist so stabil, daß es sich lange Zeit konservieren läßt und auf einem Objektträger, der chronisch entzündlichen Polyarthritis. Das Reagens nach der Erfindung ist so stabil, daß es sich lange Zeit konservieren läßt und dabei zuverlässige Analysenergebnisse gewährleistet.

Es ist bekannt, daß der Rheumafaktor häm-agglutinierende Eigenschaften zeigt, wenn-er sich in Anwesenheit eines Blutkörperchen-Antigene und ihre entsprechenden Iso- und Hetero-Immunseren umfassenden Komplexes, also eines Komplexes löslicher Blutkörperchen-Antigene und Antikörper, befindet.

Man kann bereits durch eine Reaktion in der Eprouvette den Rheumafaktor der chronisch entzündlichen Polyarthritis dadurch feststellen, daß man ihn mit einem äußerst instabilen System zusammenbringt, das man ,nur im Augenblick der Verwendung herstellen kann. Dieses System besteht im wesentlichen aus frischen roten Blutkörperchen und aus einem sensibilisierenden hämolytischen Serum, das ein den betreffenden roten Blutkörperchen entsprechendes Iso- oder Hetero-Immunserum ist.

Es ist bekannt, daß die frischen roten Blutkörperchen sich als solche nicht konservieren lassen und. daß außerdem das sensibilisierende Serum nur stabil ist, solange es in sterilen Ampullen konserviert ist. Das erhaltene System, bestehend aus frischen roten Blutkörperchen und Antiserum, ist seinerseits ebenfalls instabil und muß zu Analysenzwecken sofort verwendet werden.

Die Abhandlungen von M i 1 g ι ο m (Arthritis und Rheumatismus 7, [1], S. 1 bis 7, [1964]) haben zwar die Möglichkeit der Konservierung von sensibilisierten roten Blutkörperchen angedeutet, der Komplex von Blutkörperchen und Serum hat sich jedoch bisher nach Stabilisierung des Systems nicht über längere Zeit konservieren lassen.

Die Erfindung schafft nun ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Reagens der obigen Gattung, das sieh mindestens ein Jahr lang konservieren läßt und ohne Notwendigkeit der Vorbereitung oder vorhergehenden Behandlung die Durchführung der sogenannten Waaler-Roseschen Reaktion oder der davon hergeleiteten, auf die Agglutinationsfähigkeit des Rheumafaktors gründenden Reaktionen auf schnelle Weise ermöglicht.

Das Reagens gemäß der Erfindung ist insbesondere von einem System gebildet, das einen löslichen, formulierten Komplex von Blutkörperchen-Antigenen und Antikörpern enthält.

Das Verfahren zur Herstellung des Reagens nach

ίο der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die formalinisierten Erythrocyten mit einem gegen sie sensibilisierten Serum in Gegenwart einer solchen Menge des gleichen. ,Serums, das nicht von sensibilisierten Tieren stammt, zusammenbringt, daß noch keine Agglutinierung eintritt, und dieses Gemisch mit Formalin behandelt.

Bisher war es unmöglich, eine stabile Vereinigung der roten Blutkörperchen und des Antiserums zu schaffen. Dadurch war man gezwungen, die roten

ao Blutkörperchen und das Antiserum getrennt herzustellen und erst im Augenblick der Verwendung miteinander zu vermischen. Der Komplex nach der Erfindung bleibt überraschenderweise mindestens ein Jahr lang stabil, wenn er bei +4⁰C konserviert wird.

Weiterhin kann der Komplex nach der Erfindung von beliebigen roten Blutkörperchen und von beliebigen sensibilisierenden Seren· ausgehend erhalten werden, wie sie in der folgenden Tabelle angeführt sind:

Erythrozyten

(rote)
Blutkörperchen)

A oder B
35

ORh +

Schaf

Ziege
Ziege

Rind ·

Meerschweinchen

Huhn
Schaf

Schaf

Maus

Meerschweinchen
Schaf

Pferd

Rind

Schaf

Schaf .
Pavian

Katze

Sensibilisierende Seren

Anti-A- oder Anti-B-Iso-Immun-

serum

Anti-Rh-Serum Kaninchen, Anti-Schaf Kaninchen, Anti-Ziege Kaninchen, Anti-Ziege Kaninchen, Anti-Schaf Kaninchen, Anti-Rind Kaninchen, Anti-Meerschweinchen

Kaninchen, Anti-Huhn Meerschweinchen, Anti-Schaf Pferd, Anti-Schaf Kaninchen, Anti-Maus Kaninchen, Anti-Meerschweinchen

Meerschweinchen, Anti-Schaf Meerschweinchen, Anti-Pferd Meerschweinchen, Anti-Rind Iso-Immun-Serum vom Schaf

Ziege, Anti-Schaf -

Kaninchen, Anti-Pavian Kaninchen, Anti-Katze

Das System, bestehend aus menschlichen Erythrozyten der Blutgruppe 0 und dem dazu gehörigen Anriserum (Anti-human-Erythrozyten-Serum) des Kaninchens, erweist sich nach den an diesem Komplex durchgeführten Versuchen als besonders interessant.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

1. Vorbereitung der Erythrozyten

Dieses Beispiel wird zur Veranschaulichung an Hand des Falles der Vorbereitung der roten Blut-

3 4

körperchen vom Schaf gegeben. Dieses Vorgehen Das Testserum wird in der folgenden Weise vorkann natürlich auch im Falle der roten Blutkörperchen bereitet:

anderer Herkunft (siehe obige Tabelle) angewandt Die formolierten Erythrozyten werden zu zwischen

werden. 5 und 10% in Anti-Schaf-Serum in Suspension ge-

Das Blut wird in steriler Weise auf einem koagula- 5 bracht, das seinerseits mit physiologischem Serum tionshemmenden Agens, beispielsweise tetraessig- bis zur Grenze seines Agglutinationstiters oder etwas sauerem Äthylendiamin (E. D. T. A.) in 1 gramm- darüber verdünnt ist.

prozentiger Lösung in physiologischem Serum von Dann wird 1 Volumteil Formol in 0,5- bis l%iger

■9 g %o entnommen. Man kann sich in gleicher Weise Lösung in physiologischem Serum hinzugegeben. Das anderer koagulationshemmender Agentien, wie Na- 10 verwendete Formol ist ein 30%iges Formol, das vorher triumcitrat, bedienen. mittels einer 1 N-NaOH-Lösung bis auf einen pH-Wert

Die frisch abgenommenen Blutkörperchen (9 Vo- von 7,2 neutralisiert wurde.

lumteile je Volumteil E. D. T. A.) werden sofort mit Die Lösung läßt man unter langsamem und konphysiologischem Serum (9 g NaCl/1) viermal ge- stantem Rühren mindestens 5 Stunden lang zwischen "waschen. Wenn die oben schwimmende Flüssigkeit 15 20 und 37° C inkubieren. Dieser Inkubationsvorgang noch Hämolyse zeigt (was mittels eines Kolorimeters in Anwesenheit von Formol führt zu dieser Sensibili-"von 550 ηιμ feststellbar ist), werden noch eine bis sierung der Erythrozyten durch das Anti-Schaf mehrere Waschungen durchgeführt. Serum.

Die roten Blutkörperchen werden schließlich in Das Formol wird dann nach bekannten Verfahrensphysiologischem Serum in Suspension gebracht. 20 weisen neutralisiert. Das Reagens wird in dem gleichen Einem Volumteil roter Blutkörperchen in 5- bis Albumin in Anwesenheit von 0,l°/oo Natriummeren-

»15%iger Suspension in physiologischem Serum von rothuolat bei+4° C in steriler Ampulle konserviert.
9 g %o ^wi^r(i ein gleiches Volumen einer zwischen

1- und 5%igen Verdünnung von Formol in physiolo- ⁴· Vorbereitung des Kontrollreagens

gischem Serum zugegeben. (Das verwendete Formol 25 Um die Spezifizität des immunologischen Systems ist ein 40%iges Formol, das mittels einer normalen zu erhärten, wird parallel dazu die Reaktion mit einem Sodalösung vorher bis auf einen pH-Wert von 7,2 Kontrollreagens durchgeführt, das von einer Suspenneutralisiert wurde.) sion von formolierten Erythrozyten in 5- bis 10 %ig^er

Die Suspension läßt man unter langsamem und Verdünnung in einer Lösung von physiologischem konstantem Rühren bei einer Temperatur zwischen 30 Serum mit einem Gehalt von 0,2 bis 1 % von normalem 25 und 37°C 12 bis 22 Stunden lang je nach den Kaninchenserum gebildet ist.

Anteilen inkubieren. Aus den oben gegebenen Beispielen geht also hervor,

Anschließend wird zwei- bis dreimal mit physio- daß die äußerst weitgetriebene Sensibilisierung der

logischem Serum gewaschen. formolierten Erythrozyten durch die Verwendung

35 einer hohen Konzentration von Erythrozyten und

2. Vorbereitung des hämolytischen durch ihre Verdünnung in einem Albumin-Milieu

Anti-Schaf-Kaninchenserums ermöglicht wird.

Diese Faktoren begünstigen die lang andauernde

Die Schafserythrozyten, die in der oben beschrie- Stabilität des immunologischen Komplexes, mit dem "benen Weise vorbereitet wurden, werden mit der 40 der Rheumafaktor augenblicklich feststellbar ist, und Hälfte ihres Volumens an physiologischem Serum zwar ausgehend von einem Tropfen des reinen Serums ■verdünnt. eines Patienten.

Einem Kaninchen wird in Abständen von 3 oder Das Vorgehen ist das gleiche wie das übliche Vor-

b 4 Tagen ein gewisses Volumen der Blutkörperchen- gehen unter Verwendung von frischen Reagenzien Suspension in folgender Weise intravenös injiziert. 45 und unter Anwendung der sogenannten »Waaler-Die erste Injektion beträgt 5 ml; die drei folgenden Roseschen« Reaktion oder der daraus abgeleiteten

betragen 2 oder 3 ml und die übrigen (drei oder vier) Reaktionen, die auf die Agglutinationsfähigkeit des

"betragen je 1 ml. Rheumafaktors gegründet sind, d. h., man bringt auf

Nach Feststellung des Titers des Serums wird dem das Glasplättchen einen Tropfen Serum des Patienten

Tier durch Carotispunktion eine Woche nach der 50 in Anwesenheit des Testserums. Wenn eine Agglutina-

letzten Injektion Blut entnommen. tion auftritt, ist daraus auf die Anwesenheit des

Nach Koagulieren des Blutes wird das Serum ge- Rheumafaktors zu schließen. Bei Fehlen dieses

sammelt und zur Zerstörung des Komplements auf Faktors tritt keine Agglutination auf.

56° C erhitzt. Das Reagens gemäß der Erfindung kann auch in

Das Serum wird anschließend in sterilen Ampullen 55 lyophilisierter Form, also als Produkt einer Trocknung

"bei +4⁰C konserviert. der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen

formolierten Suspension im Vakuum bei niedriger

3. Vorbereitung des Testserums gemäß der Temperatur (zwischen —5 und -2O⁰C) konserviert

Erfindung werden. Um sich -seiner als Testserum zu bedienen,

60 genügt es dann, das genannte Testserum in lyophili-

Das laut obiger Beschreibung hergestellte hämoly- sierter Form in physiologischem Serum in Suspension tische Serum hat einen hohen hämolytischen Titer zu bringen.

von über 5000 hämolytischen Einheiten. Man kann in gleicher Weise die Verwendung des

Auf einem Glasplättchen wird der Agglutinations- Reagens nach einer Immunofluoieszenz-Technik in titer des hämolytischen Serums gegenüber den formo- 65 Betracht ziehen, und zwar nach Hinzufügen eines lierten Erythrozyten in 5- bis 10%iger Suspension in Farbstoffes wie Fluorescein-Isothiocyanat, und diese physiologischem Serum mit einem Gehalt von zwischen letztere Technik erleichtert den Nachweis des Rheuma-■0,2 und 1% des normalen Kaninchenserums bestimmt. faktors auf Gewebeebene.

Claims

Patentanspruch.:

Verfahren zur Herstellung einer Erythrocytensuspension zur Feststellung des Rheumafaktors durch Bindung eines Antikörpers an Erythrocyten mit Formalin, dadurch gekennzeichnet, daß man die formalinisierten Erythrocyten mit einem gegen sie sensibilisierten Serum in Gegenwart einer solchen Menge des gleichen Serums, das nicht von sensibilisierten Tieren stammt, zusammenbringt, daß noch keine- Agglutinierung eintritt und dieses Gemisch mit Formalin behandelt.