DE2651139C3 - Reagens zur Durchführung eines Direktagglutinationstests zum Schwangerschaftsnachweis und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Reagens zur Durchführung eines Direktagglutinationstests zum Schwangerschaftsnachweis und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein flüssiges Reagens, das beim Inberührunggelangen mit Human-Choriongonadotropin
enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert, einem polymeren Latexträger einer Teilchengröße von etwa
0,15 bis etwa 0,9 Mikron, der mit Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropinserum beschichtet ist, enthält
und auf einen pH-Wert zwischen schwach sauer und schwach basisch gepuffert ist.
Direktagglutinationstests, die die Grundlage der vorliegenden Erfindung bilden, sind ebenso wie die
Theorie, nach der sie arbeiten, bekannt.
Aus der US-PS 38 73 683 ist ein flüssiges Reagens bekannt, das beim Inberührunggelangen mit Human-Choriongonadotropin
enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert und das einen polymeren Latexträger einer
Teilchengröße von etwa 0,15 bis etwa 0,9 Mikron, der mit Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropin-Serum
beschichtet ist, sowie gegebenenfalls Merthiolat enthält und mit Hilfe eines Puffers auf einen pH-Wert
von 6,0 bis 8,4 gepuffert ist.
Bei dem mit dem bekannten Reagens durchgeführten Direktagg'.utinationstest wird nur eine Empfindlichkeit
von etwa 1,25 bis 2,5 i.u./ml erreicht, welche als nicht
ausreichend für einen zuverlässigen Schangerschaftsnachweis anzusehen ist. Es stellte sich daher die
Aufgabe, das bekannte Reagens derart zu verbessern, daß es einen Nachweis mit größerer Empfindlichkeit
ermöglicht.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Reagens der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß mit
Hilfe eines Puffers, der etwa 0,005 bis etwa I.Om-Piperazindihydrochlorid,
Wasser und eine zur Gewährleistung des (gewünschten) gepufferten pH-Werts ausreichende
Menge Natriumhydroxid enthält, auf einen pH-Wert von 5,0 bis etwa 8,6 gepuffert ist.
Mit einem derartigen Reagens kann eine Empfindlichkeit von 0,6 bis 1,25 i.u./ml erreicht werden.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Reagens sind in den Patentansprüchen 2 bis 6 und ein Verfahren, das für die
Herstellung des Reagens bevorzugt geeignet ist, ist im Patentanspruch 7 beschrieben.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen:
Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropin-Globu-Hn:
Gegen HCG vorsensibilisierten Kaninchen wird eine bestimmte Menge Blut abgezapft. Das gewonnene Blut
wird dann bei Raumtemperatur gerinnen gelassen, worauf das Serum aus dem Gerinnsel entfernt und auf
(,5 eine Temperatur von 4°C gekühlt wird Sämtliche bei
der Zubereitung verwendete Reagentien werden ebenfalls auf eine Temperatur von 4° C gekühlt.
Das Serum wird durch Zugabe einer gesättigten
Ammoniumsuifatlösung fraktioniert Deren Menge ist
so groß, daß man nach beendeter Zugabe (der gesättigten Ammoniumsulfatlösung) eine 40%ige Ammoniumsuifatlösung
vorliegen hat Der Niederschlag, der sich bei Zugabe des Ammoniumsulfats bildet, enthält
Anti-HCG. Dieser wird von der später zu verwerfenden überstehenden Flüssigkeit durch Filtrieren, Zentrifugieren
und dergleichen abgetrennt Dann wird der gesammelte Niederschlag erneut in einer Waschlösung
von 40% gesättigten Ammoniumsulfats suspendiert um ι α sämtliche Spuren von Verunreinigungen in Form der
vorher vorhandenen Flüssigkeit zu entfernen. Nach erneuter Sammlung des Niederschlags wird dieser in
einer 0,85gew.-%igen Natriumchloridlösung in einer solchen Menge gelöst daß eine Anti-HCG-Konzentration
von etwa 40% seiner ursprünglichen Konzentration im Gesamtserum erreicht wird. Diese Lösung wird
durch Dialysieren gegen eine 0,85%ige Natriumchloridlösung weiter gereinigt Das erhaltene Dialysat kann
sofort verwendet oder zum zukünftigen Gebrauch bei einer Temperatur von — 20° C eingefroren werden.
Beispiel 2
2%ige Polystyrollatexsuspension:
2%ige Polystyrollatexsuspension:
Polystyrollatexteilchen einer Teilchengröße zwischen etwa 0,15 und 0,9 Mikron werden in der gewünschten
Konzentration in einer ausreichenden Menge destillierten Wassers suspendiert. Obwohl nicht zwingend
erforderlich, ist es von Vorteil, die Konzentration durch in kolorimetrische Standardisierung sicherzustellen.
Beispiel 3
Anti-HCG-Latex-Reagens:
Anti-HCG-Latex-Reagens:
25 ml eines Piperazindihydrochlorid-Puffers eines ph-Werts von 6,4 mit O,02m-Aminocssigsäure, 6%
Natriumchlorid und 1 :5000 bis 1 :15GO0 Merthiolat (Thimerosal) werden in 25 ml destilliertes Wasser
eingetragen, worauf das Ganze auf eine Temperatur von 50° C erwärmt wird. Etwa 8 ml des gemäß Beispiel 1
hergestellten Anti-HCG-Globulins werden dann rasch mit 50 ml der gemäß Beispiel 2 zubereiteten Latexsuspension
versetzt, worauf die Mischung etwa 2 h lang bei einer Temperatur von 560C inkubiert wird. Nach 4;
beendeter Inkubation wird das Reagens mit etwa 0,5 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 3% Rohrzucker
und etwa 0,1 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 1,0% Rinderserumalbumin versetzt. Nach gründlichem
Durchmischen wird das Reagens auf eine Temperatur w von 4° C gekühlt und bei dieser Temperatur gelagert.
Das in der geschilderten Weise zubereitete Reagens ist bei einer Temperatur von 4° C bis zu 3 Jahren lagerfähig.
Das zur Ausfällung des HCG-Antiserums im Beispiel 1 verwendete gesättigte Ammoniumsulfat kann in einer v-,
solchen Menge zugesetzt werden, daß seine Endkonzentration in Kombination mit dem Serum zwischen 33
und 60, vorzugsweise 40 und 50% Sättigungsgrad liegt.
Die im Beispiel 3 gewählte Inkubationstemperatur für den Latex von 56° C stellt zwar die bevorzugte m>
Temperatur dar, die Inkubationstemperatur ist jedoch nicht kritisch und kann unter Berücksichtigung der
Inkubationsdauer (kürzer bei höherer Temperatur bzw. länger bei niedrigerer Temperatur) nach beiden Seiten
hin variiert werden. 6r>
Die im Beispiel 3 dem Latex zugesetzte Menge Anti-HCG wird derart gesteuert, daß die Teilchen
j?eriids oKgrj vollständig* bedeckt sind Hierdurch laß*
sich die Notwendigkeit eines wiederholten Waschens zur Entfernung jeglichen Oberschusses an nicht-adsorbiertem
Globulin von dem Reagens vermeiden.
Das im Beispiel 3 in dem Reagenssystem verwendete Puffersystem gestattet eine Verwendung des Reagens
sowohl für Serumproben als auch beim üblichen Urintest Weiterhin verringert es weitestgehend falsche
positive Befunde infolge von in den Seren enthaltenem Rheumafaktor. Schließlich ermöglicht es auch einen
Schwangerschaftstest mit blut- oder eiweißhaltigen Urinproben.
Durch den Zusatz des Rohrzuckers und des Rinderserumalbumins im Beispiel 3 läßt sich das
Reagens nicht nur hinsichtlich einer Unterscheidbarkeit positiver und negativer Befunde verbessern, sondern
auch auf Karten auftragen und trocknen (wobei das Reagenssystem eine noch weiter verbesserte Stabilität
bei Raumtemperatur erhält).
Beispiel 4
- Getrocknete Testkarten:
- Getrocknete Testkarten:
50 Lambda der gemäß Beispiel 3 zubereiteten Reagenssuspension werden auf aus Glas, Kunststoffen,
2i Pappe und dergleichen bestehende, wegwerfbare »Objektträger« verteilt Dann wird das Reagens auf den
Objektträgern bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die trockenen Prüflinge sind dann für den im Beispiel 5
geschilderten Schwangerschaftstest gebrauchsfertig.
Beispiel 5
Schwangerschaftstest:
Schwangerschaftstest:
Der von der Versuchsperson gesammelte Urin wird zur Entfernung von Verunreinigungen filtriert.
Ein Tropfen des filtrierten Urins wird auf einen klaren Glasobjektträger appliziert und mit einem Tropfen des
gemäß Beispiel 3 zubereiteten Latexreagens gemischt. Der Objektträger wird etwa 2 min lang schwach vor-
und zurückgeschwenkt. Wenn die Urinprobe HCG enthält, bilden sich für das bloße Auge ohne weiteres
unterscheidbare einzelne Latexteilchen oder -klumpen. Wenn das Urin kein HCG enthält, verändert der Latex
seine gleichmäßige Suspensionsfarm nicht.
Anstelle des filtrierten Urins kann bei dem geschilderten Test selbstverständlich auch Serum verwendet
werden. Anstelle des klaren Glasobjektträgers kann der Urin- oder Serumtropfen auch auf die gemäß Beispiel 4
hergestellten Testkarten aufgebracht werden. Hierdurch läßt sich die Notwendigkeit der Zugabe eines
Tropfens des Latexreagens vermeiden.
Der erfindungsgemäße Schwangerschaftstest wurde mit Urinproben von 215 schwangeren und 414
nicht-schwangeren Frauen durchgeführt, wobei es sich letztlich zeigte, daß eine Genauigkeit von 99,3% erzielt
wurde.
Das erfindungsgemäße Testreagens bzw. Testsystem ist, wie das folgende Beispiel 6 ausweist, bereits bei etwa
1,0 IU oder HCG pro ml Urin empfindlich.
Vergleich mit Handelsüblichen Tesreagentien durchgeführten Schwangerschaftstests:
13 handelsübliche Schwangerschaftstestreagentien
werden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit unter Verwendung bekannter Mengen von im Urin einer
nicht-schwangeren Frau gelösten Human-Chloriongonadotropin
(HCG) getestet 7 beruhen auf dem Prinzip einer Latexagglutinationsinhibierung (indirekter Objektträgertest),
einer stellt ein auf demselben Prinzip beruhender Röhrchentest dar, 3 beruhen auf dem
Prinzip einer passiven Hämaggl;tinationsinhibierung
(HAI) und 3 (einschließlich des erfindungsgemäßen Testsystems) beruhen auf einer direkten Latexagglutination.
Human-Chloriongonadotropin (HCG): Urinfreie Zubereitung
A der Division Biological Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland. Der Inhalt einer
Phiole mit 5000 Lu. (internationalen Einheit) HCG wird in 5 ml destillierten Wassers gelöst, wobei man eine
Konzentration von 1000 Luiml erhält Unter Verwendung
von filtrierten Urinproben nicht-schwangerer Frauen werden weitere Verdünnungen auf Konzentrationen
von 10 i.iL/ml bis 0,6 üiVml zubereitet Auf diese
Weise erhält man bekannte Konzentrationen an HCG unterschiedlicher Größen.
Der von nicht-schwangeren Frauen gesammelte Urin wird durch handelsüblichen Filterpapiere (Whatman 42
und DE 81) filtriert Ein aliquoter Teil jeder Urinprobe wird als negative Vergleichsprobe für den Schwangerschaftstest aufbewahrt Der Rest wird zur Herstellung
von HCG-Verdünnungen verwendet
Die folgende Tabelle zeigt, daß die unter Verwendung des NIH-Standards ermittelte Empfindlichkeit auf HCG
von 0,6 bis 5 i.u7ml reicht
Empfindlichkeit von Schwangerschaftstests
| I | 10 | I | Λ | Art |
Angegebene
Empfindlich keit |
Gefundene |
Hämagglutinationsinhibierung (Röhrchentest).
Gemäß US-PS 38 73 683. |
| 5 Γ | (L o/ml) |
Empfindlich
keit |
|||||
| 1 | :rfindungs- | nicht | (L uVml) | ||||
| Jezeich- | C | jemäß | LDSi) | festgestellt | 3-4 | ||
| ii-ng | I | 1,5-2,5 | |||||
| I | K | LIS2) | 2 | 2,5-5 | |||
| A | 15 I | L | LIS | 3 | 2,5-5 | ||
| Z) | 25 Fußnoten: | LIS | 3,5 | 2,5-5 | |||
| I | LIS | 1-2 | 2,5-5 | ||||
| LlS | 1-2 | 1,25-2,5 | |||||
| G | 3 | LIS | 1 | 1,25-2,5 | |||
| I | S | LIT3) | 2 | <0,6 | |||
| I | LDS5) | 1 | 1,25-2,5 | ||||
| I | LDS | 0,6-1,25 | |||||
| 20 i | 0,75 | ||||||
| I | HAI") | 0,75 | 0,6-1,25 | ||||
| HAI | 1 | <0,6 | |||||
| HAI | <0,6 | ||||||
| Latex-Direktobjektträgertest. | |||||||
| Latex-lndirektobjektträgertest. | |||||||
| Latex-Indirektröhrchentest. | |||||||
Claims (8)
1. Flüssiges Reagens, das beim lnberührunggelangen
mit Human-Choriongonadotropin enthaltenden Flüssigkeiten agglutiniert, einen polymeren Latexträger einer Teilchengröße von etwa 0,15 bis etwa
0,9 Mikron, der mit Kaninchen-Anti-Human-Choriongonadotropinserum
beschichtet ist, enthält und auf einen pH-Wert zwischen schwach sauer und
schwach basisch gepuffert ist, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Hilfe eines Puffers,
der etwa 0,005 bis etwa l.Om-Piperazindihydrochlorid,
Wasser und eine zur Gewährleistung des (gewünschten) gepufferten pH-Werts ausreichende
Menge Natriumhydroxyd enthält, auf einen pH-Wert von 5,0 bis etwa 8,6 gepuffert ist
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich Aminoessigsäure, Natriumchlorid und Merthiolath enthält
3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Polystyrollatex
einer Teilchengröße von etwa 036 Mikron besteht,
daß es auf einen pH-Wert von 6,4 gepuffert ist und daß es ferner etwa 0,0025- bis etwa 0,1m-Aminoessigsäure,
etwa 1 bis etwa 10% Natriumchlorid und etwa 1 Teil MerthioFat pro 5000 Teile Reagens
enthält.
4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es O^m-Piperazindihydrochlorid/Natriumhydroxid-Puffer,
0,02m-Aminoessigsäure und 6% Natriumchlorid enthält.
5. Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich etwa 0,5
bis etwa 20% Rohrzucker und etwa 0,1 bis etwa 20% Rinderserumalbumin enthält.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß es etwa 2% Rohrzucker und etwa 0,5% Rinderserumalbumin enthält
7. Verfahren zur Zubereitung eines Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem
man Kaninchen eine bestimmte Menge Human-Choriongonadotropin injiziert und die Kaninchen
Antikörper gegen das Choriongonadotropin bilden läßt; einen Teil des Kaninchenbluts abzapft und das
Blut in üblicher Weise gerinnen läßt; das Serum vom Blutkuchen trennt, den Globulinteil des Serums
durch Zusatz einer etwa 35- bis 60%igen Ammoniumsulfatlösung ausfällt, den Niederschlag zur Entfernung
sämtlicher Spuren an (überstehenden) Verunreinigungen reinigt, den Niederschlag in einer
physiologischen Kochsalzlösung löst, die erhaltene Globulinlösung mit Polystyrollatexteilchen einer
Teilchengröße zwischen etwa 0,15 und 0,9 Mikron mischt und die erhaltene Mischung bei einer
Temperatur von etwa 56° C inkubiert, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 0,005- bis lm-Pipera-
IS zindihydrochlorid-Puffer eines pH-Werts von etwa
5,0 bis 8,6, der 0,0025- bis 0,1m-Aminoessigsäure und
1 bis 10Gew.-% Natriumchlorid enthält, zusetzt, das erhaltene Gemisch nochmals eine bestimmte Zeit
lang inkubiert und dann das Gemisch mit etwa 0,5 bis
ίο etwa 20% Rohrzucker und etwa 0,1 bis etwa 20%
Rinderserumalbumin versetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Menge des in der
geschilderten Weise erhaltenen Reagens auf weg-
r> werfbare Objektträger appliziert und dann auf den
Objektträgern trocknet.
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