DE2710264C3 - Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines ImmunkomplexesInfo
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Description
45
Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In den vergangenen Jahren hat man immune Antigen-Antikörper-Komplexe in Verbindung mit der
Pathogenese vieler menschlicher Krankheiten, wie beispielsweise systemischer Lupus erythematodes, rheumatischer
Arthritis, bestimmter Formen von Glomerulonephritis und chronischen inflammatorischen Darmbzw.
Eingeweidekrankheiten, gebracht Die Bestimmung und Bewertung von Immunkomplexen und ihren
Bestandteilen ist für die Behandlung dieser Krankheiten von großer Bedeutung. Keine der zur Zeit verfügbaren
Nachweis- und Bewertungsverfahren sind jedoch zufriedenstellend. Den physikalisch-chemischen Verfahren
fehlt im allgemeinen die erforderliche Empfindlichkeit, wohingegen biologische Verfahren, obgleich sie
empfindlicher sind, oft sehr komplex sind oder nur begrenzt verwendbar sind und oft. die Verwendung
lebender Zellen oder menschlicher Reagentien erfordern. Dies bewirkt, daß diese Verfahren für eine breite
Anwendung in Krankenhauslaboratorien ungeeignet sind. Beispielsweise wurde kürzlich die Bestimmung von
IgG-Komplexen durch Inhibierung der Agglutination
von IgG-beschichteten Latexteilchen durch den rheumatoidischen
Faktor oder C Iq, der die Komplexe verursacht, vorgeschlagen (Lurhuma et al (1976) »Clin.
Exp. ImmunGl.«, 25, 212). Dieses letztere Verfahren ist ungeeignet, da menschliche Reagentien, C Iq und
rheumatische Faktoren verwendet werden müssen, von denen die rheumatischen Faktoren nur von kranken
Patienten erhalten werden können. Es ist weiterhin auf den Nachweis der IgG-Komponente von IgG-Komplexen
beschränkt
Es stellte sich daher die Aufgabe, ein einfaches und wirksames Verfahren für den Nachweis und die
Bewertung von Immunkomplexen zu entwickeln, bei nicht-menschliche Reagentien verwendet werden und
das zusätzlich die Analyse der Bestandteile der Komplexe ermöglicht
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 durch die im Kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis δ beschrieben.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man irgendeinen Bestandteil des Immunkomplexes analysieren,
vorausgesetzt daß der Bestandteil zur Bildung nicht-menschlicher IgM-Antikörper verwendet werden
kann, und vorausgesetzt daß der Bestandteil fähig ist an Latexteilchen zu haften bzw. mit den Latexteilchen eine
Bindung einzugehen. So kann der Antikörperbestandteil, beispielsweise IgM, IgG oder IgA oder komplementäre
Komponenten, beispielsweise C3, eines Komplexes nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert
werden. Das Verfahren kann ebenfalls zur Analyse von Antigenbestandteilen eines Komplexes verwendet werden,
beispielsweise zur Analyse viraler, bakterieller oder anderer antigener Materialien, die eine Komplexbildung
ergeben.
Es wird angenommen, daß Immunkomplexe Krankheitssymptome, insbesondere Gewebeschäden, verursachen
und somit kann das Verfahren entweder als solches oder zusammen mit anderen klinischen Testverfahren
für die Diagnose und den Nachweis von Krankheiten verwendet werden, die mit Immunkomplexen assoziiert
sind. Beispielsweise kann das Verfahren zur Verfolgung der Behandlungswirkung, beispielsweise der Chemotherapie
oder Plasmapherese,, auf die Gehalte an vorhandenem Immunkomplex, beispielsweise in dem
Blutstrom eines Patienten, verwendet werden.
Die beschichteten Latexteiilchen können hergestellt werden, indem man den Komplexbestandteil, der
analysiert werden soll, an Latexteilchen bindet, und charakteristischerweise liegen sie in einer für Latexteilchen-Agglutinationstests
geeigneten Form vor. Einige Komplexbestandteile, bemerkenswerterweise IgG, können
eine spontane Bindung bei dem Kontakt mit Latexteilchen eingehen und im einigen Fällen können
beschichtete Latexteilchen aus solchen Bestandteilen durch direkte Zwischenwirkungen des Bestandteils und
der Latexteilchen hergestellt «erden. Andere Bestandteile jedoch, einschließlich andere Immunoglobulinklassen, wie FgM und IgA, widerstehen einer spontanen
Bindung bzw. Haftung und es kann somit wünschenswert sein, ein Kupplungsreagens zum Verbinden einiger
Komplexbestandteile an die Latexteilchen zu verwenden. Man kann irgendein geeignetes Kupplungsreagens
oder eine geeignete Aktivierungsbehandlung verwenden.
Die bei dem Verfahren verwendeten, nicht-menschli-
chen igM-Anükörper mil niedriger Affinität werden in
Tieren gezüchtet, die für den Komplexbestandteil, der
analysiert werden soll, geeignet sind. Für die Herstellung dieser Antikörper reichen für Laborzwecke kleine
Tiere, wie Kaninchen und Meerschweinchen, aus. Für r,
eine Produktion mit größerem Maßstab sind jedoch größere Tiere, wie Schafe, Kühe oder Pferde, geeigneter.
Im allgemeinen wird der Immunkomplexbestandteil, bevorzugt in gereiniger Form, in das Tier injiziert Das
Tier wird anschließend ausgeblutet bzw. dem Tier wird in Blut entnommen und aus dem Antiserum wird der
IgM-Bestandteil mit niedriger Affinität abgetrennt
Bevorzugt wird die Ausbeute an IgM mit niedriger Affinität im Hinblick auf verschiedene Faktoren
optimiert, was dem Fachmann geläufig ist Beispielsweise können die Konzentration der den Tieren injizierten
Immunkomplexbestandteils, die Verwendung von Adjuvantien und der Ort der Injektion Einfluß auf die
anschließende Ausbeute an Antikörper besitzen. Insbesondere kann ebenfalls die Zeit, die man nach der
Injektion und vor der Blutentnahme an den Tieren vergehen läßt, die verschiedenen in dem Antiserum
vorhandenen Antikörperkomponenten beeirfflussen. Es wurde gefunden, daß für eine zufriedenstellende Bildung
an IgM mit niedriger Affinität eine Zeit von etwa 10 Tagen bei Kaninchen nach der Injektion mit gereinigtem
Menschen-Immunoglobulin Klassen IgA und IgG in Freund's vollständigem Adjuvans geeignet ist. Im
allgemeinen wird angenommen, daß ähnliche Zeiten geeignet sind, eine ausreichende IgM-Büdung mit
niedriger Affinität bei anderen menschlichen Immunoglobulinen,
beispielsweise IgM und IgE, zu erhalten.
Charakteristischerweise wirken die nicht-menschlichen IgM-Antikörper mit niedriger Affinität spezifisch
ein auf den Komplexbestandteil, gegenüber dem sie gezüchtet wurden, und diese Einwirkung bzw. Zwischenwirkung
ist typischerweise leicht reversibel, sofern nicht der Bestandteil in einer aggregierten Form,
beispielsweise als Komponente eines Immunkompiexes oder als Oberzug auf Latexteilchen, vorliegt Bei der
Inkubieruiig wirken die IgM-Antikörper stark ein sowohl auf die Latexteilchen, die mit dem entsprechenden
Komplexbestandteil überzogen sind, und bewirken eine Latexteilchenagglutination, und ebenfalls auf
irgendeinen Immunkomplex, enthaltend den besonderen Bestandteil, der in dem Inkubat vorhanden ist
Immunkomplexe können so bestimmt und auf ihre Bestandteile analysiert werden durch Inhibierung der
Agglutination, die sie verursachen. Je größer die Konzentration an Immunkomplex ist, umso weniger an
IgM ist für die Agglutination der Latexteilchen vorhanden. Beispielsweise kann eine Immunkomplex
enthaltende Probe mit beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern vermischt werden, die bevorzugt in
solchen Verhältnissen vorhanden sind, daß sie in Abwesenheit der Probe einen bekannten Agglutinationswert
ergeben, und inkubiert werden. So kann anschließend die Inhibierung der Agglutination nach
einem geeigneten Verfahren gemessen werden.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, Immunkomple- &o
xe als Komponenten des Blutstroms eines Patienten zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls
zur Bestimmung von Immunkomplexen in anderen Medien, beispielsweise anderer physiologischer fluider
Materialien, wie Urin, verwendet werden. Die Proben stammen so im allgemeinen aus Serum oder anderen
physiologischen fluiden Materialien und werden, bevor sie bei dem Immunkon/plextest eingesetzt werden, auf
geeignete Weise vorbehandelt Beispielsweise wird Serum vorteilhafterweise vor dem Test entkomplementiert
(d.h. das Komplement wird entfernt), da freie Ci-Komplementkomponenten, die in dem Serum
vorhanden sein können, bei dem Versuch stören können und flasche Ergebnisse verursachen können. Die Sera
können durch Wärmebehandlung entkomplementiert werden. Dies ist im allgemeinen jedoch nicht zufriedenstellend,
da die Wärmebehandlung üblicherweise eine unerwünschte Aggregation von Protein ergibt, was
falsche positive Ergebenisse bei dem Versuch bewirken kann. Ein bevorzugtes Entkompiementierungsverfahren
für Sera besteht in der Behandlung mit EDTA zur Freisetzung von C lq, das dann durch ein Immunoabsorbens,
beispielsweise Sigma-Zell-IgG, entfernt wird.
Nach der Entkomplementierung und/oder anderer
erforderlicher Vorbehandlungen werden die Proben, beispielsweise die Serumproben, mit beschichteten
Latexteilchen und nicht-menschlichen IgM-Antikörpern niedriger Affinität vermischt Das Inkubat ist im
allgemeinen wäßrig und die Inkur iiion wird vorzugsweise
unter Rühren bzw. Bewegen während einer Zeit durchgeführt die ausreicht die Umsetzung zu beenden.
Anschließend nach der Inkubation kann die Inhibierung der Agglutination der Latexteilchen auf irgendeine
geeignete Weise gemessen bzw. überwacht werden. Beispielsweise kann ein einfacher Objektträger-Agglutinationstest
verwendet werden, d. h. man verläßt sich direkt auf einen visuellen Vergleich. Bevorzugt wird
jedoch eine elektronische Teilchenzählvorrichtung, wie
ein Coulter-Zähler verwendet Beispielsweise kann diese Vorrichtung bevorzugt so programmiert sein, daß
sie nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt
Bei dieser letzteren Art kann die Wahl der LatexteilchengröSe wichtig sein. Beispielsweise wurde
in der Praxis gefunden, daß Latexteilchen mit einer Größe entsprechend einem Durchmesser von etwa
1,15 μπι bevorzugt sind, wenn ein Coulter-Zähler
verwendet wird, der so programmiert ist daß er nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt Kleinere Teilchen,
beispielsweise mit einem Durchmesser unter 0,8 μπι,
oder größere Teilchen, beispielsweise mit einem Durchmesser über 1,5 μπι, können durch andere
Teilchen, beispielsweise Plättchen oder Aggregate, die in den Proben vorhanden sind, beeinflußt werden bzw.
Interferenzerscheinungen können auftreten.
Die Reagentien, die bei der erfindungsgemäßen Immunkomplexanalyse bzw. dem erfindungsgemäßen
Immunkomplexassay verwendet werden, können dem Verbraucher in Form von Kits bzw. Bestecken geliefert
werden. Beispielsweise umfaßt ein Besteck für die Bestimmung eines Immunkomplexes und die Analyse
der Bestandteile des Komplexes typischerweise nichtmenschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität für
den Bestandteil des Komplexes, Latexteilchen, die mit dem Bestandteil ,^schichtet sind, und zweckdienlicherweise
ebenfalls ein Immunoabsorbens (Immunoabsorptionsmittel), beispielsweise Sigma-Zell-IgG, und EDTA
für die Entkomplementierung der Probe.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Zeichnungen näher erläutert
F i g. 1 ist eine Standardkurve für die Inhibicrung von
Latexteilchenagglutination gegenüber der IgG-Konzentration;
Fig.2 ist eine graphische Darstellung in Punktform
und stellt die Inhibierung der Latexteilchenagglutination dar, die durch Sera von Patienten verursacht wird,
die an systemischer Lupus erythematosus (SLE) leiden;
F i g. 3 ist eine Reihe von graphischen Darstellungen, die die klinische Geschichte von Patienten darstellen,
die an Lupus nephritis leiden, und
Fig.4 ist die graphische Darstellung der IgA- und
IgG-Komplexaktivitäten abgetrennter Fraktionen aus
Serum von einem Patienten, der an Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet.
Beispiel I
Antikörper-Herstellung:
Antikörper-Herstellung:
IgM-Antikörper mit niedriger Affinität gegenüber menschlichen Immunoglobiilinklassen IgA, IgM und
IgG, die bei dem erfindungsgemäßen Immunkomplexversuch
verwendet werden, werden getrennt folgendermaßen hergestellt. Hochreines IgA und hochreines IgM
werden aus Myelom-Sera und IgG aus gesammeltem frisch gefrorenem Plasma durch DEAE-/»-Ionenaustauschchromatographie
gewonnen. 1OmK von jedem der gereinigten Immunoglobuline in vollständigem
Freund's Adjuvans werden dann subkutan an vier verschiedenen Stellen in Kaninchen injiziert, denen 10
Tage nach der ersten Injektion Blut entnommen wird.
Die erhaltenen Sera werden an einer Sephadex-G200-Säule getrennt und die IgM-Peaks werden
gesammelt und auf das Ausgangsvolumen durch Ultrafiltration konzentriert. Eine in dem so gebildeten
IgM-Antiserum vorhandene Leichtkettenspezifität wird
durch Sepharose (Fab')2-Immunoabsorbenssäulen herausabsorbiert, wobei man ein monospezifisches Antiserum
erhält. Es wurde gefunden, daß eine Zeitdauer von 10 Tagen zwischen der Injektion und der Blutentnahme
reproduzierbare Ausbeuten mit hohem Titer, aber IgM-Antikörper mit niedriger Affinität ergibt, die keine
nennenswerten Ausfällungsantikörper oder Antikörper mit hoher Affinität enthalten.
Beschichten der Latexteilchen:
IgA:
IgA:
10 mg gereinigtes menschliches IgA in 1 ml Salzpuffer
werden 3 h bei 37°C gegenüber 10% Gew^V Natriumbicarbonat
dialysiert. 3 μΙ Monofluor-2,4-dinitrophenol
werden zugegeben, und die Reaktionsteilnehmer werden bei 37°C konstant vermischt, bis eine hellgelbe
Farbe erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt wird die Umsetzung durch Zugabe eines gleichen Volumens
Benzol, wodurch überschüssiges MonofIuor-2,4-dinitrophenol extrahiert wird, beendet. Die entstehende
Monofluor-2,4-dinitrophenol-IgA-Lösung wird dann durch Dialyse während 24 h gegenüber 1/4 konzentrierter
0.27M-GIycinsalzlösung, pH 8,2, gereinigt.
800 μ I einer 10%igen Gew/Vol. Latexsuspension
(durchschnittlicher Teilchendurchmesser 1,15 μιη), hergestellt von Coulter Electronics, werden zweimal in 1A
konzentrierter O^M-Glycinsalzlösung, pH 8,2, gewaschen. Die Latexteilchen werden von der Waschflüssigkeit zwischen und nach dem Waschen durch Zentrifugieren bei 10 000 Upm abgetrennt Schließlich werden
sie in 20 ml '/s konzentriertem Puffer resuspendiert 40 μg der wie oben hergestellten Monofluor-2,4-dinitrophenol-IgA-Lösung werden dann pro mg Trockengewicht Latex zugegeben. Das gesamte Reaktionsgemisch
wird 30 bis 60 min bei Zimmertemperatur vermischt Das entstehende, mit IgA beschichtete Latexprodukt
wird zweimal mit Ά konzentriertem Puffer gewaschen und in 20 ml konzentrierter 0,27M-GIycinsalzlösung,
enthaltend 0,1% Menschenserumalbumin (HSA), wodurch irgendwelche freien Stellen, die an den Latexteilchen
verbleiben, blockiert werden, wieder suspendiert. Die so erhaltene Suspension aus mit IgA beschichteten
-, Latexteilchen ist für die Bestimmung von Immunkomplexen, die einen IgA-Bestandteil enthalten, geeignet.
Außer IgA können auch andere Materialien, die einer spontanen Bindung an Latexteilchen widerstehen, nach
dem Monofluor-2,4-dinitrophenol-Verfahren im we-
j,, sentlichen, wie oben ausgeführt, gebunden werden,
wobei das besondere Material anstelle von IgA bei dem Reaktionsschema verwendet wird. Beispiele für Materialien,
die nach dem Monofluor-2,4-dinitrophenolVerfahren gebunden werden können, sind andere Immuno-
i, globulinklassen, wie IgM oder IgE, oder andere Typen
von Materialien, wie Ovalbumin, Rindermilchbestandteile oder lösliche virale oder bakterielle Antigene.
Allgemein wird ein ähnliches Verfahren, wie oben beschrieben, zum Beschichten von Latexteilcheri mit
ι. Materialien wie IgG und HSA, die eine spontane
Bindung eingehen, verwendet, ausgenommen, daß die Monofluor-2,4-dinitrophenol-Aktivierung weggelassen
wird.
Beispiel 3
Immunkomplextest:
(o maßen entkomplementiert: 50 μ 1 aliquote Teile von
Sera werden während 10 min bei Zimmertemperatur mit 50μl-Mengen von 0,2M-EDTA, pH 7,6, zur
Freigabe von CIq inkubiert Das CIq wird dann aus den
Proben durch Zugabe geeigneter Mengen aus Sigma-
r, Zell-IgG-Immunoabsorbens, suspendiert mit 5,5-Diäthylbarbitursäure gepufferter Salzlösung, pH 7,4,
entfernt. Anschließend werden die Proben während weiterer 20 min bei Zimmertemperatur inkubiert und
dann wird das Sigma-Zell-IgG durch Zentrifugieren
entfernt. Andere Verfahren zur Entkomplementierung der Sera einschließlich der Verwendung ähnlicher
Immunoabsorbentien können verwendet werden, obgleich normalerweise die Entkomplementierung durch
Wärmebehandlung ungeeignet ist da eine Aggregation
Ji von Proteinen auftritt, die falsche positive Ergebnisse
bei dem Versuch ergeben kann.
Der nicht-menschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität (hergestellt wie im Beispiel 1) wird mit den
entsprechenden beschichteten Latexteilchen (herge-
stellt wie im Beispiel 2), beispielsweise mit menschlichem IgA beschichteten Latexteikhen, titric* bzw.
bestimmt und die Konzentration, die eine 70%ige Agglutination des Latex ergibt, wird bestimmt Eine
ΙΟΟ-μ-1-Probe an entkomplementiertem Testserum, verdünnt auf 1:10, wird mit 100 μ I Antikörper mit niedriger Affinität geeigneter Konzentration zusammen
mit ΙΟΟμΙ beschichteten, beispielsweise mit IgA
beschichteten, Latexteilchen vermischt Das gesamte Reaktionsgemisch wird dann in einem Plastikrohr auf einer Rotationsmischvorrichtung 30 min bewegt Danach werden die Latexteikhen 1 :500 in Isoton (Coulter
Electronics) verdünnt Die Anzahl der nJcht-agghitmierten Teilchen wird in einem Coulter-Zähler Modell B
gezählt der so programmiert ist, daß er nur die
einzelnen Teilchen und keine Aggregate zählt
Der Antikörper mit niedriger Affinität reagiert stark
sowohl mit beschichteten Latexteikhen als auch dem Komplex und somit wird durch die Anwesenheit des
Komplexes die Agglutination von Latexteilchen inhibiert.
Beispiel 4
Herstellung einer Standardvergleichskurve
Herstellung einer Standardvergleichskurve
Der oben beschrebene Immunkomplextest wird
durchgeführt, indem man anstelle von Sera Testlösungen
verwendet, die bekannte Konzentrationen zusammengeballtes
IgG enthalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem beigefügten Diagramm von F ι g. I
dargestellt. Ii g. I zeigt eine St.indardkurve A der
Pro/ent-Agglutination (vertikale log-Probit-Skala) gegenüber
der Konzentration an zusammengeballten· Ig(I
im Glvcinsalzpuffcr in mg/u I (horizontale logarithmische
Skala) und zeigt ebenfalls die Ergebnisse, die bei der Kurve B für monomeres IgG erhalten werden, die
keine bemerkenswerte Inhibicning der Agglutination
Die .Standardkurve A kann als semi-quaniitativer
Vergleich verwendet werden, aus der die Imrmmkomplexkonzentrationen
von ilen AgglutmationsinhibierungMTgebnissen
extrapoliert werden können. Die Ing-Probit-Skala der vertikalen Achse der F i g. 1 ist eint·
statistisch angeordnete Skala, die zuvor für die Darstellung von quantitativen Hämagglutinationsergebnissen
verwendet wurde.
Der Immunkomplextest von Beispiel 3 fur die Bei immung der IgG-Komplexe wir.: an dem von
Komplement befreiten Serum von 24 Pain, ten, die an
systemischer Lupus erythematosus (SLK) leiden, angewendet,
wobei IgM-Antimenschen-lgG-Antikörpo mit
niedriger Affinität von Kaninchen und IgGbeschichtete Latexteilchen verwendet werden. Die erhaltenen
Ergebnisse sind in Spalte X 1 von F i g. 2 aufgeführt, wo der Prozenigehalt der Inhibierung der Agglutination für
jeden Patienten dargestellt ist. in der Spalte X 2 sind die
entsprechenden Ergebnisse für 12 Kontrollsera dargestellt. Zum Vergleich werden die Sera von 21 der
ursprünglichen Gruppe von SLE-Patienten ebenfalls nach dem Clq-Latexteilchen-Agglutinationstest. wie es
von Lurhuma et al (Clin. Exp. Immunol.. 25, 212 — 1976)
beschrieben wird, getestet, der so angepaßt wird, daß
mit einem Coulter-Zähler, wie bei dem Verfahren von Beispiel 3. durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse,
die bei dem Clq-Test erhalten werden, sind in der Sapite
Y1 von F i g. 2 aufgeführt, zusammen mit den entsprechenden Vergleichsversuchen in der Sapite Y2.
Man stellt eine gute Übereinstimmung zwischen dem erfindungsgemäßen Test und dem angepaßten Lurhuma
Test fest.
Der Immunkomplextest von Beispiel 3 für die Bestimmung von IgG-Komplexen wird zur Bestimmung
des Verlaufes von Lupus nephritis bei einer 18 Jahre alten Frau verwendet, die diese Krankheit kurz nach der
Geburt ihres ersten Kindes bekam. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Zeile 1 der Fig.3 (f) zusammen r-.n
den in Zeile 2 erhaltenen Ergebnissen aufgeführt wc ;ei
der modifizierte Lurhuma-Test wie in den vorherigen Beispielen verwendet wurde. Die Patientin zeigte zuerst
Nierenversagen, Ausschlag, Fieber. Mocarditis und Krämpfe. Die DNA-Bindung war hoch, die Serum-Ci.C«
und Clq-Gehalte wurden vermindert und die Nierenbiopsie
zeigte starke diffuse proliferative Glomerulonephritis. Die Patientin wurde mit Azathioprin. Prednisolon,
Dipyridamol. Antikoagulationsmittel ;md Methylprcdnisolon-Pulsthcrapie
(1 g/Tag i/v während 3 Tagen) behandelt. In der F i g. 3 sind ebenfalls die Informationen
bei der Medikamentverabreichung (i.i). der Melhvlprednisolonthcrapie und gesonderten Nicrenzeichcn
(Jb). GFR und der klinischen Aktivität (3c/ DNA-Bindung (3</J und Serum CIq und Ci-Kompiementgclialten
(3(.1^ während des Verlaufs der Krankheit
aufgeführt.
Aus I i g. i ist erkennbar, daß die Serumimmunkomplexgfhalte
anfangs sehr hoch sind und stark nach der Metlivipredmsolontherapie abfallen, was einer Verbesserung
des Zustandes der Patientin entspricht. Die
Serumkompkwgeh.ill·· steigen jedoch erneut und
ergeben ein Warnsignal für einen Rückfall der Patientin am folgenden Tag mit Myocarditis und Krämpfen Die
Patientin wird erneut mit der Mcihylprcdnisolonthera· pie behandelt, ihr Zustand verbessert sich und die
Serumkomplexgehalte fallen erneut Der vorübergehende
Anstieg in den Gehalten der Immunkomplexe im |uni tritt zusammen mit einem kleinen Rückfall an Fieber
und Ausschlag auf.
Aus diesem Beispiel geht eindeutig hervor, wie der erfindungsgemäße Test die Prüfung des Immunkomplexes,
der mit der Krankheit assoziiert ist. erleichtert bzw. ermöglicht.
2 ml Serum von einem 11 Jahre alten Jungen, der an
Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet, werden an einer kalibrierten Sepharose C. L6B-Säule
(90 χ 3.2 cm) getrennt.
Alle erhaltenen Fraktionen werden auf IgA- und
IgG-Komplexe nach dem Immunkomplextest. wie er im weseniliehen im Beispiel 3 beschrieben wurde, geprüft.
Die IgA-Komplexe werden durch die Inhibiening der
Agglutination von IgA-Latex durch Kaninchen-lgM-Antimenschen-IgA
bewertet, die sie verursachen, und IgG-Komplexe durch die Inhibierung der Agglutination
von IgG-Latex durch Kaninchen-lgM-Antimenschen-IgG.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. A
aufgeführt, die in Form einer graphischen Darstellung >' des Elutionsmusters der Fraktionen in Γ rm der
optischen Dichte bei 280 um (links y-Achse o. d.) lusammen mit vertikalen Linien, die der Größe der
!nhibierung entsprechen (rechts y-Achse % Inhibierung) dargestellt ist Nur die Ergebnisse, die eine
Inhibierung, die über 3% liegt ergeben, sind graphisch dargestellt.
F i g. 4 zeigt, daß das Serum zwei Populationen an IgA
enthaltenden Komplexen enthält, entsprechend 25 bis
4 χ Wund 4 bis 8 χ 105 Molekulargewichtsbereichen,
und ebenfalls eine geringe Menge an IgG enthaltenden Komplexen im Bereich von 33 bis 4 χ 10* m. w.
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes mit einem Latexteilchen-Aggluti- ■>
nationstest, bei dem die den Immunkomplex enthaltende Probe mit mit einem Komplexbestandteil
beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet,
daß die IgM-Antikörper nicht-menschliche iu
Antikörper niedriger Affinität gegenüber dem Komplexbestandteil sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Komplexbestandteil ein Antikörperbestandteil des Komplexes ist '
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein antigener
Bestandteil des Komplexes ist
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kornplement
ans der Probe vor der Inkubierung entfernt wird
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß man die Probe durch Behandlung mit
EDTA zur Freigabe von C Iq, das dann durch Kontakt mit einem Immunoabsorbens entfernt wird,
entkomplementiert
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß anschließend
an die Inkubierung die Inhibierung der Agglutination durch ein Objekt-Träger-Agglutinationsverfahren
bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem, der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß anschließend an die
Inkubierung die Inhibierung -Her Agglutination mit einer elektronischen Teilchenzählvorrichtung bestimmt
wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung so programmiert ist,
daß nur nicht-zusammengeballte Teilchen gezählt »0 werden.
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