DE2551208A1 - Stabile erythrozyten-praeparation, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

Stabile erythrozyten-praeparation, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

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DE2551208A1 DE19752551208 DE2551208A DE2551208A1 DE 2551208 A1 DE2551208 A1 DE 2551208A1 DE 19752551208 DE19752551208 DE 19752551208 DE 2551208 A DE2551208 A DE 2551208A DE 2551208 A1 DE2551208 A1 DE 2551208A1
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Description

AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg(Lahn)
Aktenzeichen: Hoe 75/B 013 - Ma 232
Datum: 12. November 1975
Stabile Erythrozyten-Präparation, Verfahren zu deren Hers teil urtg und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft eine stabile lyophilisierbare, für die Beschichtung mit Antigen geeignete Erythrozyten-Präparation, ein Verfahren zu deren Herstellung durch Behandlung der Erythrozyten mit einem niedrigen Aldehyd und einem Chromsalz sowie deren Verwendung, insbesondere in einem Hämagglutinationstest.
Seit langem werden Antikörper im passiven oder indirekten Hämagglutinationstest nachgewiesen. Dabei werden Blutkörperchen verschiedenster Tierspezies, meist des Hammels, als Träger für gelöste Antigene benutzt. Da native Erythrozyten nur über eine kurze Zeitdauer stabil sind, hat man später eine Behandlung der Zellen mit Aldehyden (Formaldehyd, Pyruvaldehyd, Glutardialdehyd) oder Sulfosalizylsäure vorgenommen. So behandelte Zellen können längere Zeit konserviert werden. Sie werden erst vor Gebrauch mit dem entsprechenden Antigen beladen.
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Derart mit Antigen beladene Erythrozyten sind im allgemeinen nur in Kolloid wie z.B. Serum, Albumin, Gelatine enthaltenden Lösungen suspensions stabil. Je nach der Menge der in dem ge-
kann das zu untersuchende Serum im Kochsalz-Milieu oder in anderen geeigneten Medien eingesetzt werden. Die Verwendbarkeitsdauer beträgt je nach dem verwendeten Antigen Stunden bis Tage. Eine Verbesserung der Haltbarkeit kann durch lyophile Trocknung erreicht werden.
Es ist auch schon beschrieben. Erythrozyten gleichzeitig mit Chrom (III) chlor id und einem Antigen zu behandeln, wonach das Antigen an die Erythrozyten gekoppelt wird.
Die von verschiedenen Autoren vorgenommene Koppelung von Antigenen an native Hammel-Erythrozyten bei gleichzeitiger Einwirkung von. Antigen und Chrom (III) chlor id hat wesentliche Nachteile,, da die Chromsalze sowohl auf die Erythrozytenoberflache als auch auf das zugesetzte Antigen einwirken und damit eine optimale Einstellung der Reagenzien erschweren.
Bei der Herstellung, .Lagerung und Gebrauch von mit Antigenen beschichteten ■ Erythrozyten-Präparationen sind noch eine Reihe von Problemen nicht gelöst, beispielsweise die soeben erwähnte optimale Einstellung der Kachweisempfindlichkeit der Hämagglutinationsantigene. Auch hinsichtlich der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen und der Reproduzierbarkeit lassen
''die damxt durchgeführten Hämagglutinationsuntersuchungen zuweilen zu wünschen übrig.
Es bestand deshalb die Aufgabe, für die Beschichtung mit Anti-; genen geeignete Ery throzyten-Präparationen herzustellen, die bei der quantitativen Bestimmung in Häinagglutinationsuntersuchungen zuverlässige Resultate liefern, welche sich auch bei langer lagernden Präparationen reproduzieren lassen.
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Es wurde nun gefunden, dass eine wesentliche Verbesserung von in den Hämagglutinationstesten verwendbaren Reagenzien erreicht werden kann, wenn man auf in einer Pufferlösung suspendierte Erythrozyten einen niedrigen alipliä-tischen Aldehyd und ein. wasserlösliches Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms einwirken lässt, die Erythrozyten wäscht und gewünschtenfalls lyophilisiert. Nach dem Waschen kann gewünschtenf alls ein diagnostisches Antigen auf die erhaltene Erythrbzyten-Präparation aufgebracht
werden. »gleichzeitig oder in. beliebiger Reihenfolge nacheinander
Als Erythrozyten werden vorzugsweise kernhaltige Vogelerythrozyten verwendet. Durch Verwendung der zellkernhaltigen Vogelerythrozyten kommt es zu einer Beschleunigung der Sedimentation und gleichzeitig damit zu einfacher ablesbaren Sedimentationsmustern. Damit ist eine rasche und sichere Beurteilung der Reaktion gegeben.
Die Behandlung der Zellen mit einem Chromsalz verbessert vor allem wesentlich deren Lagerfähigkeit bei ca. 37°C. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäss behandelten Erythrozyten liegt in der geringen Tendenz zu unspezifisch positiven Reaktionen, womit in den meisten Fällen die Verwendung eines Kontroll-Reagenzes überflüssig wird. Insbesondere die behandelten Geflügelerythrozyten zeichnen sich durch rasche, empfindliche und spezifische Reaktionsfähigkeit in Hämagglutionstesten ebenso wie durch Stabilität in flüssiger- oder lyophil getrockneter Form aus.
Die mit Aldehyden und Chroinsalzen vorbehandelten Geflügel-Erythrozyten sind zur Adsorption der Verschiedenesten Bakterien-, Parasiten- und Virus-Antigene geeignet und ermöglichen auch eine Anlagerung von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen.
Gegenstand der Erfindung ist zunächst das Verfahren zur Herstellung der stabilen, zur Beschichtung mit Antigenen geeigneten Erythrozyten-Präparation.- Dazu werden native Erythrozyten
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im Vollblut von verschiedenen Tieren sowie von Menschen, vorzugsweise jedoch kernhaltige wie die von Vögeln wie Huhn, Taube und Truthahn gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen gerinnungshemmenden Substanzen versetzt, wonach die Erythrozyten beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen und mit verträglichen isotonischen Pufferlösungen mehrfach gewaschen werden, um die in dem Blut noch vorhandenen Antigene zu entfernen. Das gewaschene Erytiirozy tens ediment wird in nicht weniger als 8 Volumenteilen, einer isotonischen neutralen Pufferlösung: oder einer isotonisdien Salzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wird eine wässrige Lösung eines niedrigen aliphatischen Aldehyds, vorzugsweise eines solchen mit einer Kettenlänge von C 1 bis C 6 wie Formaldehyd, Methylglyoxal oder Glutaraldehyd in einer Menge von 0,2-10 Gewichtsprozent des Aldehyds bezogen auf das vorhandene Volumen des Erythrozytensediments zugesetzt. Die Reaktionszeit für die Einwirkung des Aldehyds auf die Erythrozyten, hängt von der Reaktionstemperatur und der eingesetzten Konzentration des Aldehyds ab. Zweckraässig werden diejenigen Reaktionsbedingungen eingehalten, die die Erythrozyten härten, ohne dass es zu Aggregaten kommt. Die Aggregatbildung kann mikroskopisch beobachtet werden.
In diesem Sinne werden in der Reg/el Reaktionszeiten von 1-24 Stunden bei Temperaturen von 5 - k5°C eingehalten. Gemäss bev—orzugten Bedingungen bei der Verwendung von Formaldehyd, das als ca. 35$ige Lösung handelsüblich ist, wird auf die Ery-fchrozytenS.uspension eine auf etwa 10-15$ vorverdünnte Formaldehydlösung zur Einwirkung gebracht. Im einzelnen kann nach dem Vorschlag von L.Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 1O3, 157 ff. (i960) vorgegangen werden. Das vorgelegte Beispiel 1 erläutert das Verfahrensprinzip. Im Anschluss an die Aldehydbehandlung werden die Erythrozyten mehrere Male gewaschen. Falls sie nicht unmittelbar weiterverarbeitet werden
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sollen, können die derartig vorbeiiandelten Erythrozyten mit einem antimikrobiell wirksamen Agens, beispielsweise Natriumtimerfcnat in einer Konzentration von. 0,.SJs-G, 03?», vejr-setist werden und als 10-30$ige, vorzugsweise 25?6ige, Suspension bei 4°C aufbewahrt werden.
Für die Behandlung mit einem Chrom-II- oder Chrom-Ill-salz werden die mit Aldehyd behandelten. Erythrozyten in einem wässrigen Milieu suspendiert. Zweckmässig: wird hierfür Wasser verwendet. Die Konzentration der Erythrozyten beträgt 0,5-25$» vorzugsweise 1 ,25$. Dieser Erythrozytenßtxspension wird eine wässrige Chromsalz—Lösung in einer Konzentration von 0,0001-2,0$ zugesetzt und nach dem Vermischen 5—30 Min. bei 5-**5 C belassen. Danach werden die Erytlirozyten durch Sedimentation oder Zentrifugati on abgetrennt« Zur Entfernung von überschüssigem Chromsalz wird mehrmals gewaschen.
Als Chromsalze im Sinne der Erfindung koiassnen alle wasserlöslichen Chrom-II- und Chrom-III-Salze infar-age wie Chrom-II- oder Chrom-III-chlorid, -sulfat, -nitrat, —phosphat oder -acetat.
Die Reihenfolge der Anwendung von Aldehyd und Chromsalz kann ohne nachteiligen Einfluss auf das Ergebnis vertauscht werden. Ebenso erfolgreich können Aldehyd und Chromsalz gleichzeitig zur Anwendung gebracht werden.
Die auf diese ¥eise erhaltenen Formaldehyd- und Chromsalzbehandelten Erythrozyten sind geeignet, i&xt verschiedenen Antigenen beschichtet zu werden.
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Im allgemeinen.werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigenen in einer wäßrigen Lösung überzogen, die auf einen pH-Wert unter 7, zweckmäßig auf einen schwachsauren pH-Wert zwiscHen 5,5 und 6,5, eingestellt wird. Unter Antigenen sollen die verschiedensten Substanzen verstanden werden, deren Nachweis im Blut oder Harn von Interesse ist. Su den beispielhaft ausgewählten Antigenen, die erfolgreich zum Überziehen der" stabilisierten Erythf'ozyten-Pra'parate verwendet v/erden können, gehören insbesondere Proteinantigene, vor allem die Plasmaproteinantigene menschlicher oder tierischer Herkunft, mikrobielle Antigene, beispielsweise Toxoplasma-Antigene, wie sie durch Ultraschall-Einwirkung erhalten werden können, oder Treponema-pällidum-Antigene, die aus infizierten Kaninchenhoden gewonnen werden, und andere. Es ist ein besonderer Vorteil der Erythrozyten-Praparation der vorliegenden Erfindung, daß sie für das Überziehen von Substanzen mit; unterschiedlichen chemischen Strukturen geeignet ist.
Die mit den Antigesen beschichteten stabilisierten Erythrozyten werden zweckmäßig in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung, beispielsweise einer O,l-l?£igen Gummi arabicum-Lösur.g oder einer entsprechenden Lösung eines Gelatine-Abbau-Produktes oder Polyvinylpyrrolidon zweckmäßig in Gegenwart weiterer stabilisierender Substanzen wie Aminosäuren, z.B. Natriximglutaminat, oder Glycin in einer Konzentration von 1-10% und/oder eines tierischen Serums in einer Konzentration von 0,5-20% suspendiert. In dieser Suspensionsflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei Kühl schrank temperatur, also etwa .4°C, gelagert oder aber nach dem Einfrieren lyopail getrocknet werden. Nach Auflösung des getrockneten' Präparates in destilliertem Wasser steht das Reagenz für die Durchführung von Hämagglutinationstesten in der gleichen Qualität zur Verfügung, wie dies vor der Trocknung der. Fall war.
Die Durchführung der Häiaagglutinationsuntersuchungen ist den* Fachmann bekannt. Ik allgemeinen wird dazu eine Serumprobe, welche den vermuteten Antikörper enthält, mit dem entsprechenden
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antigenbeschichteten Erythrozyten—Präparat in einem wäßrigen Milieu vermischt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt. Die Agglutinationsreaktion, wird vorteilhaft in Mikrofciterplatten durchgeführt- Dazu, wird beispielsweise 0,05 ml Serum bzw. Serumverdünnung mit O,O25 ml der erfindungsgemäßen mit Antigen beschichteten .. Erythrozyten (l,25%ig) vermischt und 30 Sekunden bis 1 Minute geschüttelt. Bei Anwendunq des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung der beschichteten Erythrozyten kann die Ablesung der Testergebnisse bereits nach 30 Minuten erfolgen.
• *
Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäß stabilisierten Erythrozyten-Präparationen mit Proteinantigenen beschichtet werden. Dies bedeutet, daß sie auch mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden können, so daß bei nachfolgender H Mmagg lut inat ion sunte rs uchung die Erythrozyten in Gegenwart des entsprechend spezifischen Antigens agglutinieren. Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, um bakterielle Infektionen nachzuweisen, für die Entdeckung von Virusinfektionen, für die Bestimmung der Histokompatibilität, für die Entdeckung von Autoimmunitätserkrankungen und anderen vergleichbaren Phänomenen.
Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
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Beispiel 1 · .
a) Stabilisierung der Erythrozyten
300 ml Hühnerblut werden in 100 ml 3,5%iger Citratlösung aufgefangen und noch am gleichen Tag verarbeitet.
Die Erythrozyten v/erden bei ca. 2.O00 χ g al>zentrifugiert und 5 Mal in 1Ό Volumina kalter (ca. 1O°C) O,85%iger NaCl-Lösung gewaschen. Dabei soll Schaumbildung vermieden werden. Das ge-, waschene Zellsediment wird in 8 Volumina O,85%iger NaCl-Lösung mit einem pH von 6,8 suspendiert. 1/4 des Volumens der Zellsuspension einer 14%igen Formaldehydlösung pH 5,5 wird in einen Zellophan-Dialyseschlauch gegossen {Breite 2,5 cm) und an einem Ende* verschlossen. Dabei wird etwa. 1/3 des Schlauches leer belassen. Die Luft wird ausgedrückt, das offene Ende zugebunden, der Schlauch auf den Boden eines Bechers gelegt und die Erythrozytensuspension darüber gegossen. Der Becher wird bei Raumtemperatur auf einem mechanischen Schüttler (orbital shaker) bewegt. Die Geschwindigkeit wird so reguliert, daß starke Mischung bei ,geringster Schaumbildung erreicht wird- Nach 3 Stunden wird der Zellophansack entfernt, sein Inhalt in öen Becher gegossen und weitere 16-18 Stunden geschüttelt. Danach werden verklumpte Zelltrümmer auf der Oberfläche öer Flüssigkeit und an den Becherwandungen gefunden, die durch vorsichtiges Dekantieren entfernt werden können.
Zu der homogenen Zellsuspension wixd 1/2 Volumen isotonische NaCl-Lösung gegossen und dann 6 Mal mit jeweils .. 75Ο ml gewaschen. Schließlich wird das gewaschene, forraalinisierte Zellsediment in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) mit 0,02% Natriumtimerfonat suspendiert, so daß eine 25%ige Lösung entsteht, die bei 4 C aufbewahrt wird.
Für die Behandlung der aldehydbeKandelten, gewaschenen, stabilisierter. Erythrozyten mit CrCl^ v/erden sie in einer ca. 1:4 ver-
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dünnten gepufferten Kochsalzlösung pH 7,5 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen feiner wäßrigen Chrom(III)-chlorid-Lösung in einer Konzentration von O,002% zugesetzt und der Ansatz 10 Min. bei 37°C belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen in physiologischer Kochsalzlösung.
b) Beschichtung mit Antigen - . -
1. Ein durch Ultraschalleinwirkung (2 χ 1 Min. 22 KHz) aus Toxopläsiuen erhaltener und durch Zentrifugation von partikulären Bestandteilen gereinigter Antigenextrakt wird in geeigneter Verdünnung, die in einem Vorversuch ermittelt wird, mit der Aldehyd-Chrom (III) chlorid-behandelten Erythrozytensuspension (l,25%ig) versetzt und für eine Einwirkungszeit von 1 Stunde bei 37°C belassen. Der pH-Wert wird dabei auf 6,4 gehalten.
Danach erfolgt eine zweimalige Waschung in O,l-l%iger Gummi arabicum-Lösung und die Suspendierung des Sedimentes in m/15 Trishydroxymethyl-aminoinethan-ECl-Puffer pH 8,0, dem 5% Natriuin-Glutaminat und 15% Kaninchen serum zugesetzt ist.
«
Die Suspension enthält 1,25% Erythrozyten.
In dieser Suspensions- und Stabilisatorflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei +4 C gelagert oder lyophil getrocknet werden. Die Auflösung erfolgt in dem Originalvolumen destillierten Wassers.
2. In entsprechender Weise kann ein Lues-Reagenz hergestellt werden, indem man anstelle eines Ultraschallextraktes von Toxoplasmen einen Extrakt von Treponeiaa pallidum aus infizierten Kaninchenhoden einsetzt und die Serumverdünnung in einem Absorption smedium durchführt.
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-yr-
Beispiel 2
Frisch gewonnene Schaferythrozyten werden in dem zweifachen Volumen der Alsever's. Lösung folgender Zusammensetzung suspendiert:
20,5 g Dextrose
8 g Natriumeitrat (Na2C6H5O7 · 2H2O) 0/552 g Citronensäure (H3CgHcO7 * H2O) 4,2 g Natriumchlorid ad 1000 ml mit Aqua dest.
Danach werden die Erythrozyten bei ca. 2.000 χ g abzentrifugiert und fünfmal in 10 Volumenteilen kalter phosphatgepufferter 0,15 molarer Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Nach dem Waschen werden die Erythrozyten bis zu einer Konzentration von 8% (v/v) in 0,15 molarer gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 suspendiert. Zu einem Volumenteil dieser Erythrozyten-Suspension wird das gleiche Volumen einer 3%igen Glutardialdehydlösung in gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 tropfenweise unter langsamen Rühren der Zellsuspension zugesetzt. Danach läßt man 17 Stunden bei Raumtemperatur rühren, wäscht die Suspension anschließend fünfmal mit gepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2 und resuspendiert die aldehydbehandelten Erythrozyten in Kochsalzlösung, so daß eine 15%ige (v/v) Suspensj.on der auf diese Weise stabilisierten Erythrozyten entsteht.
Für die Behandlung der aldehydbehandelten, gewaschenen, stabilisierten Erythrozyten mit Chrom (II) chlorid werden sie in einer ca. 1:4 verdünnten gepufferten Kochsalzlösung von pH 7,2 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen einer wäßrigen Chrom (II) chlorid-Lösung in einer Konzentration von 0,0 5% zugesetzt, der Ansatz bei 37°C 30 Minuten belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung.
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-y-
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Die Beschichtung mit. Antigen kann in der gleichen Weise wie unter Beispiel 1 b) beschrieben vorgenommen werden.
Geeignete Erythrozyten-Präparationen für die Beschichtung mit Antigen erhält man auch, wenn statt Glutardialdehyd, wie im vorliegenden Beispiel ausgeführt, Methylgiyoxal verwendet: wird.
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Claims (15)

7RS1208 Ma Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen lyophilisierbaren Erythrozyten-Präparation, dadurcli gekennzeichnet, dass man auf in einer wässrigen isotonisciien Lösung suspendierte Erythrozyten gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander einen niedrigen aliphatischen Aldehyd und ein wasserlösliches Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms einwirken lässt, die Erythrozyten wäscht und gewünschtenfalls lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als niedrigen aliphatischen Aldehyd einen Aldehyd mit 1-6
- C-Atomen verwendet
t.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der niedrige aliphatische Aldehyd in einer Konzentration von
' 0,1-1096 (g/v) verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserlöslichen Chromsalze der Erythrozyten-Suspension in einer Konzentration von 0,001-2% verwendet werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Chromsalz Chrom(II)chlorid · verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Chromsalz Chrom(III)chlorid verwendet wird.
7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1—6, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd oder das Chromsalz bei etwa 5 C bis etwa h5°G einwirkt.
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8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aldehyd 1-24 Stunden und das wasserlösliche Chromsalz 5-30 Minuten auf die Erythrozyten einwirken läßt.
9. Verfahren zur Beschichtung von Erythrozyten-Präparationen mit einem Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß mit Aldehyd und einem wasserlöslichen Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms behandelte Erythrozyten in schwachsaurer wäßriger Lösung mit einem Antigen in Kontakt gebracht, das überschüssige .Antigen abgewaschen und die Erythrozyten in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung resuspendiert werden.
10. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß einem der Ansprüche 1-9.
11. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Beschichtung ein Toxoplasma-Antigen verwendet wird.
12. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Beschichtung ein Treponema pallidum-Antigen verwendet wird.
13. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß einem der Ansprüche 1-12 in einem HämaggXutinationstest.
14. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß Anspruch
11 für die Diagnose einer Toxoplasma-Erkrankung.
15. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß /Anspruch
12 für die Diagnose luetischer Erkrankungen.
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DE19752551208 1975-11-14 1975-11-14 Verfahren zur Herstellung einer stabilen Erythrozyten-Präparation Expired DE2551208C3 (de)

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