AT364091B - Durchfuehrung eines haemagglutinationstests - Google Patents
Durchfuehrung eines haemagglutinationstestsInfo
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Description
<Desc/Clms Page number 1> Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Erythrozyten-Präparation, die durch gleichzeitiges oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander erfolgendes Behandeln von in einer wäs- serigen isotonischen Lösung suspendierten Erythrozyten mit einem niedrigen aliphatischen Aldehyd 1 bis 24 h in einer Konzentration von 0, 1 bis 10% (Gew./Vol.) und einem wasserlöslichen Salz des 2- oder 3wertigen Chroms 5 bis 30 min in einer Konzentration von 0, 001 bis 2% bei 5 bis 45OC, Inkontaktbringen der behandelten Erythrozyten in schwach saurer wässeriger Lösung mit einem Antigen, Abwaschen des überschüssigen Antigens und Resuspendieren derselben in einer ein lyophi- les Kolloid enthaltenden Lösung erhalten worden ist, zur Durchführung eines Hämagglutinations- tests. Seit langem werden Antikörper im passiven oder indirekten Hämagglutinationstest nachgewie- sen. Dabei werden Blutkörperchen verschiedenster Tierspezies, meist des Hammels, als Träger für gelöste Antigene benutzt. Da native Erythrozyten nur über eine kurze Zeitdauer stabil sind, hat man später eine Behandlung der Zellen mit Aldehyden (Formaldehyd, Pyruvaldehyd, Glutardialdehyd) oder Sulfosalizylsäure vorgenommen. So behandelte Zellen können längere Zeit konserviert werden. Sie werden erst vor Gebrauch mit dem entsprechenden Antigen beladen. Derart mit Antigen beladene Erythrozyten sind im allgemeinen nur in Kolloid wie z. B. Serum, Albumin, Gelatine enthaltenden Lösungen suspensionsstabil. Je nach der Menge der in dem ge- brauchsfertigen Reagens vorhandenen Stabilisator-Substanzen kann das zu untersuchende Serum im Kochsalz-Milieu oder in andern geeigneten Medien eingesetzt werden. Die Verwendbarkeits- dauer beträgt je nach dem verwendeten Antigen Stunden bis Tage. Eine Verbesserung der Haltbar- keit kann durch lyophile Trocknung erreicht werden. Es ist auch schon beschrieben, Erythrozyten gleichzeitig mit Chrom (III) chlorid und einem Antigen zu behandeln, wonach das Antigen an die Erythrozyten gekoppelt wird. Die von verschiedenen Autoren vorgenommene Koppelung von Antigenen an native HammelErythrozyten bei gleichzeitiger Einwirkung von Antigen und Chrom (III) chlorid hat wesentliche Nachteile, da die Chromsalze sowohl auf die Erythrozytenoberfläche als auch auf das zugesetzte Antigen einwirken und damit eine optimale Einstellung der Reagenzien erschweren. Bei der Herstellung, Lagerung und Gebrauch von mit Antigenen beschichteten ErythrozytenPräparationen sind noch eine Reihe von Problemen nicht gelöst, beispielsweise die soeben erwähnte optimale Einstellung der Nachweisempfindlichkeit der Hämagglutinationsantigene. Auch hinsichtlich der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen und der Reproduzierbarkeit lassen die damit durchgeführten Hämagglutinationsuntersuchungen zuweilen zu wünschen übrig. Es bestand deshalb die Aufgabe, für die Beschichtung mit Antigenen geeignete ErythrozytenPräparationen herzustellen, die bei der quantitativen Bestimmung in Hämagglutinationsuntersuchun- gen zuverlässige Resultate liefern, welche sich auch bei länger lagernden Präparationen reproduzieren lassen. Es wurde nun gefunden, dass eine wesentliche Verbesserung bei Hämagglutinationstesten erreicht werden kann, wenn man erfindungsgemäss eine Erythrozyten-Präparation einsetzt, die durch gleichzeitiges oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander erfolgendes Behandeln von in einer wässerigen isotonischen Lösung suspendierten Erythrozyten mit einem niedrigen aliphatischen Aldehyd 1 bis 24 h in einer Konzentration von 0, 1 bis 10% (Gew./Vol.) und einem wasserlöslichen Salz des 2- oder 3wertigen Chroms 5 bis 30 min in einer Konzentration von 0, 001 bis 2% bei 5 bis 45 C, Inkontaktbringen der behandelten Erythrozyten in schwach saurer wässeriger Lösung mit einem Antigen, Abwaschen des überschüssigen Antigens und Resuspendieren derselben in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung erhalten worden ist, in einem Hämagglutinationstest. Als Erythrozyten werden vorzugsweise kernhaltige Vogelerythrozyten verwendet. Durch Verwendung der zellkernhaltigen Vogelerythrozyten kommt es zu einer Beschleunigung der Sedimentation und gleichzeitig damit zu einfacher ablesbaren Sedimentationsmustern. Damit ist eine rasche und sichere Beurteilung der Reaktion gegeben. Die Behandlung der Zellen mit einem Chromsalz verbessert vor allem wesentlich deren Lagerfähigkeit bei zirka 37 C. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäss behandelten Erythrozyten liegt in der geringen Tendenz zu unspezifisch positiven Reaktionen, womit in den meisten Fällen die Verwendung eines Kontroll-Reagens überflüssig wird. Insbesondere die behandelten Geflügelerythrozy- <Desc/Clms Page number 2> ten zeichnen sich durch rasche, empfindliche und spezifische Reaktionsfähigkeit in Hämagglutina- tionstesten ebenso wie durch Stabilität in flüssiger oder lyophil getrockneter Form aus. Die mit Aldehyden und Chromsalzen vorbehandelten Geflügelerythrozyten sind zur Adsorption der verschiedensten Bakterien-, Parasiten- und Virus-Antigene geeignet und ermöglichen auch eine Anlagerung von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen. Zur Gewinnung einer stabilen lyophilisierten bzw. lyophilisierbaren, zur Beschichtung mit Antigenen geeigneten Erythrozyten-Präparation werden bei der praktischen Ausführung der Erfindung native Erythrozyten im Vollblut von verschiedenen Tieren sowie von Menschen, vorzugsweise jedoch kernhaltige wie die von Vögeln, wie Huhn, Taube und Truthahn gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen gerinnungshemmenden Substanzen versetzt, wonach die Erythrozyten beispiels- weise durch Zentrifugieren gewonnen und mit verträglichen isotonischen Pufferlösungen mehrfach gewaschen werden, um die in dem Blut noch vorhandenen Antigene zu entfernen. Das gewaschene Erythrozytensediment wird in nicht weniger als 8 Vol.-Teilen einer isotonischen neutralen Puffer- lösung oder einer isotonischen Salzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wird eine wässerige Lösung eines niedrigen aliphatischen Aldehyds, vorzugsweise eines solchen mit einer Kettenlänge von C 1 bis C 6 wie Formaldehyd, Methylglyoxal oder Glutaraldehyd in einer Menge von 0, 1 bis EMI2.1 temperatur und der eingesetzten Konzentration des Aldehyds ab. Zweckmässig werden diejenigen Reaktionsbedingungen eingehalten, die die Erythrozyten härten, ohne dass es zu Aggregaten kommt. Die Aggregatbildung kann mikroskopisch beobachtet werden. In diesem Sinne werden Reaktionszeiten von 1 bis 24 h bei Temperaturen von 5 bis 450C ein- gehalten. Gemäss bevorzugten Bedingungen bei der Verwendung von Formaldehyd, das als zirka 35%ige Lösung handelsüblich ist, wird auf die Erythrozytensuspension eine auf etwa 10 bis 15% vorverdünnte Formaldehydlösung zur Einwirkung gebracht. Im einzelnen kann nach dem Vorschlag von L. Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 103,157 ff. (1960) vorgegangen werden. Das vorgelegte Beispiel 1 erläutert das Verfahrensprinzip. Im Anschluss an die Aldehydbehandlung werden die Erythrozyten mehrere Male gewaschen. Falls sie nicht unmittelbar weiterverarbeitet werden sollen, können die derartig vorbehandelten Erythrozyten mit einem antimikrobiell wirksamen Agens, beispielsweise Natriumtimerfonat in einer Konzentration von 0,01 bis 0,05%, versetzt werden und als 10- bis 30%ige, vorzugsweise 25%ige, Suspension bei 4 C aufbewahrt werden. Für die Behandlung mit einem Chrom-II- oder Chrom-III-salz werden die mit Aldehyd behandelten Erythrozyten in einem wässerigen Milieu suspendiert. Zweckmässig wird hiefür Wasser verwendet. Die Konzentration der Erythrozyten beträgt im allgemeinen 0, 5 bis 25%, vorzugsweise 1, 25%. Dieser Erythrozytensuspension wird eine wässerige Chromsalz-Lösung in einer Konzentration von 0, 0001 bis 2, 0% zugesetzt und nach dem Vermischen 5 bis 30 min bei 5 bis 450C belassen. Danach werden die Erythrozyten durch Sedimentation oder Zentrifugation abgetrennt. Zur Entfernung von überschüssigem Chromsalz wird mehrmals gewaschen. Als Chromsalze im Sinne der Erfindung kommen alle wasserlöslichen Chrom-II- und ChromIII-Salze in Frage wie Chrom-II- oder Chrom-III-chlorid, -sulfat, -nitrat, -phosphat oder -acetat. Die Reihenfolge der Anwendung von Aldehyd und Chromsalz kann ohne nachteiligen Einfluss auf das Ergebnis vertauscht werden. Ebenso erfolgreich können Aldehyd und Chromsalz gleichzeitig zur Anwendung gebracht werden. Die auf diese Weise erhaltenen Formaldehyd-und Chromsalz-behandelten Erythrozyten sind geeignet, mit verschiedenen Antigenen beschichtet zu werden. Im allgemeinen werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigenen in einer wässerigen Lösung überzogen, die auf einen PH-Wert unter 7, zweckmässig auf einen schwachsauren PH-Wert zwischen 5, 5 und 6, 5, eingestellt wird. Unter Antigenen sollen die verschiedensten Substanzen verstanden werden, deren Nachweis im Blut oder Harn von Interesse ist. Zu den beispielhaft ausgewählten Antigenen, die erfolgreich zum Überziehen der stabilisierten Erythrozyten-Präparate verwendet werden können, gehören insbesondere Proteinantigene, vor allem die Plasmaproteinantigene menschlicher oder tierischer Herkunft, mikrobielle Antigene, beispielsweise Toxoplasma-Antigene, wie sie durch Ultraschalleinwirkung erhalten werden können, oder Treponema-pallidum-Antigene, <Desc/Clms Page number 3> die aus infizierten Kaninchenhoden gewonnen werden, und andere. Es ist ein besonderer Vorteil der gemäss der Erfindung verwendeten Erythrozyten-Präparation, dass sie für das Überziehen von Substanzen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen geeignet ist. Die mit den Antigenen beschichteten stabilisierten Erythrozyten werden zweckmässig in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung, beispielsweise einer 0,1-1%gen Gummi arabicum-Lösung oder einer entsprechenden Lösung eines Gelatine-Abbau-Produkts oder Polyvinylpyrrolidon zweckmässig in Gegenwart weiterer stabilisierender Substanzen wie Aminosäuren, z. B. Natriumglutaminat, oder Glycin in einer Konzentration von 1 bis 10% und/oder eines tierischen Serums in einer Konzentration von 0, 5 bis 20% suspendiert. In dieser Suspensionsflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei Kühlschranktemperatur, also etwa 4 C, gelagert oder aber nach dem Einfrieren lyophil getrocknet werden. Nach Auflösung des getrockneten Präparats in destilliertem Wasser steht das Reagenz für die Durchführung von Hämagglutinationstesten in der gleichen Qualität zur Verfügung, wie dies vor der Trocknung der Fall war. Die Durchführung der Hämagglutinationsuntersuchungen ist dem Fachmann bekannt. Im allgemeinen wird dazu eine Serumprobe, welche den vermuteten Antikörper enthält, mit dem entsprechenden antigenbeschichteten Erythrozyten-Präparat in einem wässerigen Milieu vermischt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt. Die Agglutinationsreaktion wird vorteilhaft in Mikrotiterplatten durchgeführt. Dazu wird beispielsweise 0,05 ml Serum bzw. Serumverdünnung mit 0, 025 ml der erfindungsgemässen mit Antigen beschichteten Erythrozyten (1, 25% zig) vermischt und 30 s bis 1 min geschüttelt. Bei Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung der beschichteten Erythrozyten kann die Ablesung der Testergebnisse bereits nach 30 min erfolgen. Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäss verwendeten stabilisierten ErythrozytenPräparationen mit Proteinantigenen beschichtet sein. Dies bedeutet, dass sie auch mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden können, so dass bei nachfolgender Hämagglutinationsuntersuchung die Erythrozyten in Gegenwart des entsprechend spezifischen Antigens agglutinieren. Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, um bakterielle Infektionen nachzuweisen, für die Entdeckung von Virusinfektionen, für die Bestimmung der Histokompatibilität, für die Entdeckung von Autoimmunitätserkrankungen und andern vergleichbaren Phänomenen. Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Beispiel 1 : a) Stabilisierung der Erythrozyten 300 ml Hühnerblut werden in 100 ml 3, 5%iger Citratlösung aufgefangen und noch am gleichen Tag verarbeitet. Die Erythrozyten werden bei zirka 2000 x g abzentrifugiert und fünfmal in 10 Volumina kalter (zirka 10. C) 0, 85%iger NaCl-Lösung gewaschen. Dabei soll Schaumbildung vermieden werden. Das gewaschene Zellsediment wird in 8 Volumina 0, 85%iger NaCl-Lösung mit einem PH von 6,8 suspendiert. 1/4 des Volumens der Zellsuspension einer 14% igen Formaldehydlösung PH=5, 5 wird in einen Zellophan-Dialyseschlauch gegossen (Breite 2, 5 cm) und an einem Ende verschlossen. Dabei wird etwa 1/3 des Schlauches leer belassen. Die Luft wird ausgedrückt, das offene Ende zugebunden, der Schlauch auf den Boden eines Bechers gelegt und die Erythrozytensuspension darüber gegossen. Der Becher wird bei Raumtemperatur auf einem mechanischen Schüttler (orbital shaker) bewegt. Die Geschwindigkeit wird so reguliert, dass starke Mischung bei geringster Schaumbildung erreicht wird. Nach 3 h wird der Zellophansack entfernt, sein Inhalt in den Becher gegossen und weitere 16 bis 18 h geschüttelt. Danach werden verklumpte Zelltrümmer auf der Oberfläche der Flüssigkeit und an den Becherwandungen gefunden, die durch vorsichtiges Dekantieren entfernt werden können. Zu der homogenen Zellsuspension wird 1/2 Volumen isotonische NaCl-Lösung gegossen und dann sechsmal mit jeweils 750 ml gewaschen. Schliesslich wird das gewaschene, formalinisierte Zellsediment in phosphatgepufferter Kochsalzlösung PH = 7, 2 (PBS) mit 0, 02% Natriumtimerfonat suspendiert, so dass eine 25%ige Lösung entsteht, die bei 40C aufbewahrt wird. Für die Behandlung der aldehydbehandelten, gewaschenen, stabilisierten Erythrozyten mit CrCl3 werden sie in einer zirka 1 : 4 verdünnten gepufferten Kochsalzlösung pu = 7, 5 suspendiert. <Desc/Clms Page number 4> Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen einer wässerigen Chrom (III)-chlorid-Lösung in einer Konzentration von 0, 002% zugesetzt und der Ansatz 10 min bei 370C belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen in physiologischer Kochsalzlösung. b) Beschichtung mit Antigen 1. Ein durch Ultraschalleinwirkung (2 x 1 min 22 KHz) aus Toxoplasmen erhaltener und durch Zentrifugation von partikulären Bestandteilen gereinigter Antigenextrakt wird in geeigneter Verdünnung, die in einem Vorversuch ermittelt wird, mit der Aldehyd-Chrom (III) chlorid-behandelten Erythrozytensuspension (1, 259Fig) versetzt und für eine Einwirkungszeit von 1 h bei 370C belassen. Der PH-Wert wird dabei auf 6,4 gehalten. EMI4.1 Glutaminat und 15% Kaninchenserum zugesetzt ist. Die Suspension enthält 1,25% Erythrozyten. In dieser Suspensions- und Stabilisatorflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei +4 C gelagert oder lyophil getrocknet werden. Die Auflösung erfolgt in dem Originalvolumen destillierten Wassers. EMI4.2 Kaninchenhoden einsetzt und die Serumverdünnung in einem Absorptionsmedium durchführt. Beispiel 2 : Frisch gewonnene Schaferythrozyten werden in dem 2fachen Volumen der Alsever's Lösung folgender Zusammensetzung suspendiert : 20,5 g Dextrose 8 g Natriumcitrat (Na. C. Hs 07. 2H. 0) 0, 552 g Citronensäure (HC. HsO,. H O) 4,2 g Natriumchlorid ad 1000 ml mit Aqua dest. Danach werden die Erythrozyten bei zirka 2000 x g abzentrifugiert und fünfmal in 10 Vol.-Teilen kalter phosphatgepufferter 0, 15 molarer Kochsalzlösung vom PH-Wert 7,2 gewaschen. Nach dem Waschen werden die Erythrozyten bis zu einer Konzentration von 8% (v/v) in 0, 15 molarer gepufferter Kochsalzlösung vom PH-Wert 7,2 suspendiert. Zu einem Volumenteil dieser Erythrozyten-Suspension wird das gleiche Volumen einer 3%igen Glutardialdehydlösung in gepufferter Kochsalzlösung vom PH -Wert 7,2 tropfenweise unter langsamem Rühren der Zellsuspension zugesetzt. Danach lässt man 17 h bei Raumtemperatur rühren, wäscht die Suspension anschliessend fünfmal mit gepufferter Kochsalzlösung von PH = 7, 2 und resuspendiert die aldehydbehandelten Erythrozyten in Kochsalzlösung, so dass eine 15% ige (v/v) Suspension der auf diese Weise stabilisierten Erythrozyten entsteht. Für die Behandlung der aldehydbehandelten, gewaschenen, stabilisierten Erythrozyten mit Chrom (II) chlorid werden sie in einer zirka 1 : 4 verdünnten gepufferten Kochsalzlösung von PH = 7, 2 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen einer wässerigen Chrom (II) chlorid-Lösung in einer Konzentration von 0, 05% zugesetzt, der Ansatz bei 37 C 30 min belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung. Die Beschichtung mit Antigen kann in der gleichen Weise wie unter Beispiel Ib) beschrieben vorgenommen werden. Geeignete Erythrozyten-Präparationen für die Beschichtung mit Antigen erhält man auch, wenn statt Glutardialdehyd, wie im vorliegenden Beispiel ausgeführt, Methylglyoxal verwendet wird.
Claims (1)
- PATENTANSPRÜCHE : 1. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation, die durch gleichzeitiges oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander erfolgendes Behandeln von in einer wässerigen isotonischen Lösung suspendierten Erythrozyten mit einem niedrigen aliphatischen Aldehyd 1 bis 24 h in einer Konzentration von 0, 1 bis 10% (Gew. /Vol.) und einem wasserlöslichen Salz des 2- oder 3wertigen Chroms 5 bis 30 min in einer Konzentration von 0, 001 bis 2% bei 5 bis 45 C, Inkontaktbringen der behandelten Erythrozyten in schwach saurer wässeriger Lösung mit einem Antigen, Abwaschen des überschüssigen Antigens und Resuspendieren derselben in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung erhalten worden ist, zur Durchführung eines Hämagglutinationstests.2. Verwendung einer wie im Anspruch 1 angegeben erhaltenen Erythrozyten-Präparation, wobei als niedriger aliphatischer Aldehyd ein solcher mit 1 bis 6 C-Atomen verwendet worden ist, für den im Anspruch 1 angegebenen Zweck.3. Verwendung einer wie im Anspruch 1 oder im Anspruch 2 angegeben erhaltenen Erythrozyten-Präparation, wobei als wasserlösliches Salz des 2wertigen Chroms Chrom (II) chlorid verwendet worden ist, für den im Anspruch 1 angegebenen Zweck.4. Verwendung einer wie im Anspruch 1 oder im Anspruch 2 angegeben erhaltenen Erythrozyten-Präparation, wobei als wasserlösliches Salz des 3wertigen Chroms Chrom (III) chlorid verwendet worden ist, für den im Anspruch 1 angegebenen Zweck.5. Verwendung einer wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 angegeben erhaltenen Erythrozyten-Präparation, deren behandelte Erythrozyten in schwach saurer Lösung mit einem ToxoplasmaAntigen in Kontakt gebracht worden sind, für den im Anspruch 1 angegebenen Zweck.6. Verwendung einer wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 angegeben erhaltenen Erythrozyten-Präparation, deren behandelte Erythrozyten mit einem Treponema pallidum-Antigen in Kontakt gebracht worden sind, für den im Anspruch 1 angegebenen Zweck.
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