<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung bezieht sich auf die vitro-Diagnostik und insbesondere auf den Nachweis von
Fibrinogen oder Fibrinspaltprodukten oder das Binden von Immunglobulin bzw. dessen -Fragment und damit auf die Bestimmung eines Antigens.
Mikroorganismen enthalten bekanntlich eine Vielzahl von Substanzen, die zu unterschiedlichen
Reaktionen Anlass geben können. Wegen der häufigen Überschneidung derartiger Reaktionen sind
Einzelabläufe selten beobachtbar. Es besteht oft der Wunsch, differenzierte, durch Einzelbezirke bedingte Reaktionen zu beobachten, wozu unerwünschte Bestandteile entfernt werden müssen.
Es ist bekannt, dass eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen sowohl mit Fibrinogen als auch mit den Abbauprodukten des Fibrins unter Verklumpung zu reagieren vermögen. Der für die Reaktion verantwortliche Faktor ist als Clumping-Faktor (CF) bekannt. Die Clumping-Faktor-
Reaktion hat wegen der Einfachheit ihrer Durchführung zur Diagnose der erhöhten Fibrinolyse praktische Bedeutung erlangt. Zur Durchführung der Clumping-Faktor-Reaktion hat man bisher nur ausgewählte CF-positive Staphylokokken verwendet. Insbesondere ist es nicht erwünscht, dass die betreffenden Staphylokokken neben CF auch lösliche Koagulase bilden. Eine Reihe von
Staphylococcus aureus Stämmen zeigt zudem die unerwünschte Eigenschaft einer Spontan-Agglutination, für die bestimmte, nicht charakterisierte Proteine verantwortlich gemacht werden.
Es besteht demnach ein Bedarf an Clumping-Faktor enthaltenden Staphylokokken, die weder lösliche Koagulase enthalten noch Spontan-Agglutination zeigen.
Es ist ferner bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen ein Polypeptid besitzen, das den soge- nannten Fc-Teil von Antikörpermolekülen zu binden vermag. Bei Staphylokokken wird dieses Poly- peptid Protein A genannt. -bindendes Polypeptid enthaltende Mikroorganismen werden, um störende
Nebenreaktionen auszuschalten, zur Gewinnung des Polypeptids aufgearbeitet, wobei das Polypeptid in der Regel an einen festen Träger gebunden wird. Es besteht ein Bedarf an trägergebundenem
Polypeptid zur Bindung des Fc-Teils von Antikörpermolekülen, welches eine störungsfreie Verwendung bei der Bestimmung von Antigenen gestattet.
Die Aufgaben werden erfindungsgemäss im Rahmen von in der in vitro-Diagnostik verwendbaren diagnostischen Mitteln durch die Verwendung von Staphylokokken gelöst, die einem besonderen Extraktionsverfahren unterworfen worden sind.
Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung von Staphylokokken, vorzugsweise Staphylococcus aureus, der mit einer 4- bis 8-molaren, vorzugsweise 6-molaren, wässerigen Lösung eines Guanidinsalzes extrahiert wurde, als diagnostisches Mittel in der in vitro-Diagnostik. Der mit dem Guanidinsalz extrahierte Staphylokokkus wird zweckmässig danach von diesem freigewaschen.
Gegebenenfalls kann danach lyophilisiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden im Hinblick auf ihre Verwendung entweder ClumpingFaktor positive Staphylokokken oder Fc-Teil bindendes Peptid enthaltende Staphylokokken, insbesondere Protein A enthaltende Staphylokokken, verwendet.
Zum Einsatz als CF-Reagens werden die Staphylokokken zweckmässig in einer Pufferlösung, die gewünschtenfalls einen Suspensionsstabilisator enthält, suspendiert. Als Pufferlösungen können hiefür die bei biochemischen Arbeiten üblichen Puffersysteme verwendet werden, beispielsweise Trishydroxymethylaminomethan-Hydrochlorid, Imidazol-Kochsalzpuffer oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Sofern Suspensions-Stabilisatoren erwünscht sind, werden zweckmässig Proteine vom Albuminoidtyp, beispielsweise Serumalbumin, bevorzugt Rinder-Serumalbumin, verwendet. Deren . Konzentration liegt bei etwa 0, 005 bis 0, 1, vorzugsweise 0, 01% Rinderserumalbumin.
Die Keimkonzentration der Staphylokokken in der betreffenden Pufferlösung, die vorteilhaft
EMI1.1
Als Suspensionsstabilisator und als Stabilisator zur Konservierung der Aktivität des gefriergetrockneten Produktes haben sich mehrwertige Alkohole als besonders geeignet erwiesen. Die Konzentration des mehrwertigen Alkohols in der für die Suspension der Staphylokokken verwendeten wässerigen Pufferlösung vom bevorzugten pH-Wert 7,0 bis 7, 7 liegt bei 3 bis 50%. Die geeigneten mehrwertigen Alkohole umfassen einen Molekulargewichtsbereich von 62 bis 500000. Beispielsweise handelt es sich um folgende Substanzen : Glyzerin, Glukose, Mannit, Polyäthylenglykol, Dextran
<Desc/Clms Page number 2>
und Ficoll. Bei den letztgenannten haben sich jene als besonders geeignet erwiesen, die ein
Molekulargewicht von 70000 bis 400000 besitzen.
Während es beispielsweise für Glyzerin besonders vorteilhaft ist, 50% in die Suspension einzubringen, kann mit Mannit, Polyäthylenglykol, Dextran und Ficoll bereits mit 3% eine hervorragende Stabilisierung der Suspension und der Lagerungs- beständigkeit der extrahierten Staphylokokken erreicht werden.
Die Bestimmung wird zweckmässig im Titrierverfahren vorgenommen. Günstig ist hiebei ein
Mikro-Titrierverfahren, bei dem jeweils zu etwa 20 pl der gepufferten Keimsuspension von etwa
0, 15 bis 0, 3% etwa 50 pm einer fortlaufenden Verdünnungsreihe der zu bestimmenden Lösung, bei- spielsweise Blutplasma oder Blutserum, insbesondere Humanplasma oder Humanserum, zugesetzt werden.
Überraschenderweise wurde bei der nachfolgenden Inkubation des Gemisches gefunden, dass die Empfindlichkeit hinsichtlich der Nachweismöglichkeit von Fibrin-Spaltprodukten wesentlich erhöht werden kann, wenn die Reaktionsgemische intensiv geschüttelt werden.
Eine zeitliche Begrenzung der Schütteldauer bis zur Ablesung des Endpunktes der Reaktion hat sich als vorteilhaft erwiesen. Beim Mikro-Titrierverfahren werden dabei etwa 3 bis 10 min eingehalten.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wurde gefunden, dass die Verklumpungsreaktion der Staphylokokken besonders deutlich ablesbar wird, wenn die Staphylokokken, mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt werden. Geeignete Farbstoffe im Sinne der Erfindung sind solche, die eine ausreichende Affinität zu Proteinen zeigen, direkt aufziehen, Oxydations- und Alkalibeständigkeit besitzen und infolge Fehlens reaktiver Gruppen nicht zur Agglutination der Staphylokokken beitragen. Besonders günstig hat es sich erwiesen, die Mikroorganismen, mit Farbstoffen der Colour Index Bezeichnung (CI) Basic Red 23, Basic Blue 45 oder Basic Orange 30 einzufärben.
Zur Färbung werden die erfindungsgemäss verwendeten extrahierten Staphylokokken in einer wässerigen Lösung suspendiert, mit einer verdünnten Lösung des betreffenden Farbstoffes versetzt und nach einer experimentell als günstig ermittelten Einwirkdauer von der Farbstofflösung getrennt.
Zeckmässig werden die Keime zur Abtrennung der Farbstofflösung hochtourig zentrifugiert, beispielsweise bei etwa 10000 bis 20000 x g. In einem der oben beschriebenen Puffer suspendiert und mit einem Suspensions-Stabilisator versetzt sind die gefärbten Staphylokokken besonders geeignete Reagenzien-Bestandteile für den Nachweis von Fibrin-Spaltprodukten. Gewünschtenfalls können die gefärbten Staphylokokken in gefriergetrockneter Form aufbewahrt und unmittelbar vor dem Gebrauch resuspendiert werden.
Die Einfärbung der Staphylokokken führt zu besonders günstiger Ablesung der Reaktion, da die gefärbten Partikel zur Erhöhung des Kontrastes gegenüber der Umgebung bedeutend beitragen.
Vorteilhaft wirkt sich weiterhin die Möglichkeit aus, die Konzentration der Staphylokokken im Testsystem herabsetzen zu können. Die Empfindlichkeit kann gesteigert werden, die Endpunkte der Reaktion werden schärfer.
Clumping-Faktor-positive Staphylokokken sind aus der Literatur bekannt. Durch Hitze inaktivierte Clumping-Faktor-positive Staphylokokken werden zur Bestimmung von Fibrinspaltprodukten verwendet. All diese literaturbekannten Stämme von Staphylokokken sind nach Durchführung der oben angegebenen Extraktion mit Guanidinsalz für die erfindungsgemässe Verwendung geeignet. Es können aus ihnen Reagenzien mit verminderter Störanfälligkeit hergestellt werden. Besonders günstige Ergebnisse hinsichtlich der Empfindlichkeit und einer geringen Störanfälligkeit des Verfahrens zum Nachweis von Fibrinogen und Fibrin-Spaltprodukten liefert ein Staphylococcus aureus mit der Bezeichnung K 807 (ATCC-Nr. 31243) dessen Charakteristica in folgender Weise beschrieben werden :
Der Stamm wurde von einer an Mastitis erkrankten Kuh isoliert.
In flüssigem Nährmedium wächst er diffus. Er ist grampositiv. Weitere charakteristische Eigenschaften :
Kristallviolett : Typ A
EMI2.1
<tb>
<tb> Clumping <SEP> Faktor <SEP> +
<tb> Koagulase <SEP> +
<tb> Protein <SEP> A <SEP> +
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
Panton Valentine Leukozidin (PVL)
EMI3.1
<tb>
<tb> PVL <SEP> R <SEP> (Rind) <SEP> +
<tb> Hämolysine <SEP> a <SEP> +
<tb> ss <SEP> +
<tb> 6
<tb> Saure <SEP> Phosphatase <SEP> +
<tb> Alkalische <SEP> Phosphatase
<tb> Fibrinolysin <SEP> +
<tb> Eigelbfaktor
<tb> Penicillinase
<tb> Nuclease <SEP> + <SEP>
<tb>
Wachstum auf festen Medien :
Staphylococcus Medium 110 (Baltimore Biological Lab.) : gutes Wachstum, weisslich-graue Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm.
Pferdeblutagar : gutes Wachstum, weisslich-graue Kolonien, kaum hämolytisch.
Nähr-Agar : weisslich-graue Kolonien, zuweilen unregelmässig ausgebildet.
Mac Concey-Agar Nr. 3 (Oxoyd) : kein Wachstum.
Antibiogramm :
EMI3.2
<tb>
<tb> Chloramphenicol <SEP> empfindlich
<tb> Erythromycin <SEP> empfindlich <SEP>
<tb> Sulphafurazol <SEP> resistent
<tb> Methicillin <SEP> empfindlich
<tb> Penicillin <SEP> empfindlich
<tb> Ampicillin <SEP> empfindlich
<tb> Streptomycin <SEP> empfindlich
<tb> Tetracyclin <SEP> empfindlich
<tb>
Der Stamm Staphylococcus aureus K 807 zeigt folgende Stoffwechsel1eistungen : Vergärung von :
EMI3.3
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> nach <SEP> 6 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 370C <SEP> ++
<tb> Lactose <SEP> nach <SEP> 6 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C <SEP> ++
<tb> Saccharose <SEP> nach <SEP> 6 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C <SEP> ++
<tb> Maltose <SEP> nach <SEP> 6 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C <SEP> ++
<tb> Mannit <SEP> nach <SEP> 6 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C <SEP> ++
<tb> Salizin <SEP> nach <SEP> 13 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C
<tb> Inulin <SEP> nach <SEP> 13 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C
<tb> Äskulin <SEP> nach <SEP> 13 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C
<tb>
Wachstum in Gegenwart von NaCI:
EMI3.4
<tb>
<tb> 4% <SEP> +
<tb> 5% <SEP> +
<tb> 6% <SEP> +
<tb> 7% <SEP> +
<tb> 8% <SEP> +
<tb>
Im besonderen ist demnach Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines Reagens zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukten, das als wesentlichen Bestandteil eine 0, 1 bis 10%ige Suspension homogen verteilter, wie oben angegeben extrahierter Clumping-Faktorpositiver Staphylokokken, vorzugsweise eines Clumping-Faktor-positiven Staphylococcus aureus,
<Desc/Clms Page number 4>
insbesondere den Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243) enthält, der gegebenenfalls mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der genannten Staphylokokken-Suspension für die in-vitro-Bestimmung von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukten in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Plasma oder Serum, nach bekannten Verfahren. Nach Inkubation je eines Anteils der Reagentiensuspension mit je einem Anteil der zu bestimmenden Lösung in steigender Verdünnung werden die Ansätze vorteilhaft wenige Minuten geschüttelt und diejenige höchste Verdünnung der
Körperflüssigkeit registriert, die noch eine positive Verklumpung der Keime aufweist. Wird dieser
Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Personen erhaltenen Wert in Beziehung ge- setzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden.
Zur Bestimmung von Antigenen sowohl in Lösung wie auch an der Oberfläche von feinen Teilchen, wie Bakterien oder Viren, werden Staphylokokken, die den F c-Teil von Immunglobulinen zu binden vermögen, nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert. Über die antigenbindenden Teile der Immunglobuline entsteht eine wirksame Bindung mit den zu bestimmenden Antigenen. Die Agglutination der mit dem Immunglobulin beladenen Staphylokokken kann leicht beobachtet und registriert werden. Ein besonders geeigneter Staphylokokkus mit einem -bindenden Polypeptid ist, wie erwähnt, Staphylococcus aureus. Ausserdem seien noch einige Stämme des Streptococcus pyogenes als Polypeptid-Träger genannt, die mit dem F c-Teil von Immunglobulinen zu reagieren vermögen.
Diese Staphylokokken lassen sich nach der oben angegebenen Extraktion zur Diagnostik von physiologischen oder pathologischen Zuständen, an denen ein Antigen beteiligt ist, einsetzen u. zw. sowohl für die Diagnostik bei Tieren als auch bei Menschen. Dabei wird eine Probe, die das Antigen enthält, mit spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, die an die Oberfläche der Staphylokokken gebunden sind. Es erfolgt eine Agglutination, wenn die Probe ein entsprechendes Antigen enthält.
Guanidiniumchlorid-extrahierte unbekapselte Staphylokokken (S. aureus und S. epidermidis) aktivieren den Komplementfaktor C3 und adsorbieren ihn an ihrer Oberfläche. Das erfolgt nach Inkubation in frischem Menschen- und Meerschweinchenserum. Die mit aktivierten C3 behafteten Staphylokokken bilden Rosetten mit B-Lymphozyten von Menschen. Damit ermöglichen die guanidiniumchloridextrahierten Staphylokokken die Erkennung und Isolierung von B-Lymphozyten. Ebenso können guanidiniumchloridextrahierte protein A-positive Staphylokokken direkt dafür verwendet werden.
Die Bestimmung kann als quantitative Bestimmung nach üblichen Agglutinationsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise, indem man eine Verdünnungsreihe von Proben testet und das Ergebnis mit einer Probe von bekannten Antigenkonzentrationen vergleicht. Der Agglutinationstest wird im allgemeinen in einer wässerigen Lösung, beispielsweise in einer physiologisch gepufferten Salzlösung mit einem neutralen PH-Wert durchgeführt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können die extrahierten Mikroorganismen,
EMI4.1
Beobachtung der Agglutination zu erleichtern.
Mit den erfindungsgemäss verwendeten Staphylokokken kann nach an sich bekannten Verfahren der Agglutination, des Radioimmunoassay oder des enzymmarkierten Immunossay, um nur einige beispielhaft zu nennen, ausgeführt werden.
Die Erfindung soll im nachstehenden Beispiel näher erläutert werden :
Beispiel : Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243) wird in einem Medium folgender Zusammensetzung vermehrt :
Vorkultur : TSB (Tryptone Soya Broth, Oxoyd)
100 ml in 1000 ml Erlenmeyer-Kolben
Hauptkultur : 14 l TSB in 16-1-Fermenter unter Zusatz von 0,25% Liebig
Fleischextrakt (B. B. L. B.) ;
Beimpfung mit 6 Vorkulturkolben.
Die Keime werden nach Zentrifugation bei 74000 x g gewonnen, danach 2mal in destiliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Aus einem 16 l Fermenter werden zirka 50 g Staphylokokken erhalten. Die Bakterien aus einem Fermenter werden mit 200 ml 6 M Guanidinhydrochloridlösung 18 h stehengelassen. Danach werden die Keime von der Guanidinhydrochloridlösung abgetrennt und die Behandlung mit Guanidinhydrochlorid insgesamt 4mal wiederholt. Schliesslich werden die
<Desc/Clms Page number 5>
Staphylokokken so lange gewaschen oder dialysiert, bis mit alkalischer 1, 2 Naphthochinon-4-Sulfonsäure und Hydroxylamin nach Sullivan und Hess (1936) in Hoppe Seyler Thierfelder, Physiologie und Pathol. Chemische Analyse 10. Aufl. Band III, 2, S. 1091. Guanidinhydrochlorid nur noch in Spuren nachweisbar ist.
Nach Resuspension der Staphylokokken in destilliertem Wasser werden die Keime lyophilisiert.
Zur Färbung werden die lyophilisierten, extrahierten Keime in einer Konzentration von 1, 5 mg/ml in 0, 14 M NaCI suspendiert und pro ml mit 0, 3 ml einer 0. 1% i n Lösung von Astrazonrot
EMI5.1
in 0, 14 M Kochsalzlösung versetzt und 5 min gerührt. Danach werden die Staphylokokken bei 14600 x g abzentrifugiert und die Keime in dem ursprünglichen Volumen 0, 14 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung PH = 6,4 suspendiert. Der Puffer enthält 0,05% Rinderserumalbumin.
Für die Clumping-Faktor Reaktion im Röhrchentest werden die Staphylokokken in einer l% igen Suspension, beispielsweise in 0, 05 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan-Puffer PH = 7, 4 mit einem Zusatz von 0,01% Rinderserumalbumin eingesetzt.
Im Mikrotitrationsverfahren nach Leavelle : (Amer. J. Clin. Path., Vol. 55, S. 452 bis 457
EMI5.2
eingesetzt. Für die Mischung des Reaktionsansatzes hat sich besonders vorteilhaft ein Plattenschüttler (Mikro-Shaker AM 69 der Flow Laboratories, Bonn) erwiesen.
Für Nachweisverfahren von Antigenen haben sich extrahierte, Protein A enthaltende Staphylokokken, besonders der Staphylococcus aureus Stamm COWAN I (NCTT 8530), bewährt. Er wird in der gleichen Weise wie K 807 extrahiert.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verwendung von Staphylokokken, die mit einer 4 bis 8 molaren wässerigen Lösung eines Guanidinsalzes extrahiert wurden, als diagnostisches Mittel in der in vitro-Diagnostik.