DE1806418A1

DE1806418A1 - Eiweissartiges Reagens und Herstellungsverfahren hierfuer

Info

Publication number: DE1806418A1
Application number: DE19681806418
Authority: DE
Inventors: Adams Jun Ernest Clarence; Ind Elkhart; Papenmeier Gerald Jerome; Rozman Margret Julianne
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1967-11-01
Filing date: 1968-10-31
Publication date: 1969-06-26
Also published as: IL30997A0; FR1590466A; IL30997A; GB1237268A; NL6815548A; ES359805A1

Description

DR. ING. F. WUESTIlO FK 1OfIC/ IQ 8 MÜNCHEN 9O

»IPL·. ING. G. PtILS lOVVH IQ SCHWEIOEHSTBASSK 2

DR.E.V.PECHMANN τ.ι-ΐίκοκ 32θββ1 DR. ING. D. BEHRENS PATENTANWlME Ρβοτ*οτΡΑτ«κτ Μΰκοιτκκ

1Α-35 330

Beschreibung zu der Patentanmeldung

Miles Laboratories, Inc., 1127 Myrtle Street, ELkhart, Indiana 46514-, U.S.A.

betreffend

Eiweissartiges Reagens und Herstellungsverfahren

hierfür

Die vorliegende Erfindung betrifft ein unlösliches chemisches Reagens, in welchem eine eiweissartige Substanz chemisch an ein eiweissartiges Trägerteilchen gebunden ist, insbesondere ein Reagens, in welchem die eiweissartige Substanz eine immunologische Substanz ist und das zur Durch« führung immunologischer Untersuchungen Anwendung findet.

Chemische Reagentien, die eiweissartige Substanzen enthalten, wurden bereits als Immuno-Adsorbentien, Mittel für enzymatische Umwandlungen und Reagentien für immunologische Versuche verwendet. Bei zahlreichen dieser Anwendungen ist eine eiweissartige Substanz auf der Oberfläche von im allgemeinen fein zerteilten Trägerteilchen, z.B. roten Blutkörperchen adsorbiert und eine Flüssigkeit, die das zu behandelnde Material enthält, wird dann

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über die roten Blutkörperchen, die die eiweissartige Substanz tragen, geleitet. Ein Problem bei dieser Art der Verwendung ist, daß die adsorbierte eiweissartige Substanz von der Oberfläche der roten Blutkörperchen getrennt und mit dem zu behandelnden Material vermischt wird. Dies führt besonders dann zu Störungen, wenn hochreine Endprodukte erforderlich sind oder wenn immunologische Untersuchungen durchgeführt werden. Im letzteren Falle wird die eiweissartige Substanz, ein Antigen oder ein Antikörper, von der überfläche der Trägerteilchen, z.B. roteiBlutkörperchen abgelaugt und verfälscht die Untersuchungsergebnisse.

Es wurde bereits versucht, diese Schwierigkeiten durch chemisches Kuppeln der eiweissartigen Substanz mit den Trägerteilchen zu vermeiden. Dabei wurden Kupplungsmittel wie Difluordinitrobenzol und Toluoldiisocyanat verwendet, um Antigene mit roten Blutkörperchen chemisch zu verbinden. Solche Kupplungsmittel sind aber ausserordentlich reaktionsfähig und müssen sehr sorgfältig den damit zu kuppelnden Stoffen zugesetzt werden, um Probleme wie ein Zellen an Zellen Kuppeln zu vermeiden. Ein anderer Nachteil liegt darin, daß sie nicht zur Herstellung von unterstützenden Trägerteilchen verwendet werden können, deren Reaktionsfähigkeit künstlich induziert wurde und die gelagert, verschifft und dann mit eiweissartigen Substanzen gekuppelt werden können.

Es wurde weiterhin bereits beschrieben, daß tetrazotierte Verbindungen mit eiweissartigen Substanzen reagieren (Howard, A.N. und Wild, P.: Biochemical Journal 6j5 651, 1957) und das zahlreiche lösliche Proteinsubstanzen, nachdem sie mit solchen tetrazotierten Verbindungen umgesetzt wurden, mit anderen löslichen Proteinen gekuppelt werden können, öle zuvor mit Pyrrol umgesetzt worden sind (Howard,

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Α«Ν_β und Wild, F«1 Brit. J« Exptl. Pathol. Bd. 38, So b40 3, 1957)· Es wurde aber bisher nicht erkannt, daß ein dreistufiges Kupplungsverfahren angewandt werden kann, um eiweißartige Stoffe mit unterstützenden Trägerteilchen chemisch zu verbinden und auf diese vVeise außerordentlich brauchbare, unlöslich gemachte eiweißartige Reagentien herzustellen«

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein ύ Verfahren zum Herstellen eines ei;veißartigen .Reagens, wobei eine eiweißartige Substanz mit einer tetrazotierten Verbindung oder einer Brückenverbindung behandelt wird, die einen aromatischen Teil aufweist, der leichter elektrophil substituiert werden kann, als ein etwa vorhandener eiv.eißartiger aromatischer Teil, worauf dann die nichtumgesetzte dieser beiden Verbindungen mit einem unterstützenden Trägerteilchen gekuppelt und schließlich die beiden- vorbehandelten Substanzen zu einem brauchbaren eiweißartigen Reagens umgesetzt werdeno

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist

ein nach obigem Verfahren hergestelltes eiweißartiges ™

Reagens·

Die für die Umwandlung in eine unlöslich gemachte feste Reagensform gewählte eiweißartige Substanz wird in einem flüssigen Medium gelöst und dann mit einer der beiden Verbindungen, nämlich einer tetrazotierten Verbindung oder einer Brückenverbindung behandelt, deren aromatischer Teil leichter elektrophil substituiert werden kann, als jeder vorhandene eiweißartige aromatische Teile Entweder das eine

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oder das andere der beiden Reagentien reagiert mit der eiweissartigen Substanz und wird an diese gebunden. Die verbleibende Verbindung wird dann mit einem eiweissartigen Trägerteilchen gekuppelt, das ausreichend reaktionsfähig ist, um mit dieser verbleibenden Verbindung zu reagieren und das in unlöslicher Form vorliegt. Die beiden derart behandelten Substanzen werden dann durch Vermischen miteinander zur Umsetzung gebracht, so daß die nicht umgesetzten Azogruppen dee· tetrazotierten Verbindungsteile mit den-, aromatischen Teilen der Brückenverbindung reagieren können. Das auf diese Weise gebildete Reagens enthält die eiweissartige Substanz chemisch an das eiweissartige Tragerteilchen gekuppelt und liegt somit in fixierter, unlöslich gemachter fester Form vor und kann mit anderen Stoffen zur Reaktion gebracht werden. Da der aromatische Teil der Brückenverbindung leichter elektrophfl. substituiert werden kann, als die in den Träger-teilchen oder der damit zu kuppelnden eiweissartigen Substanz vorhandenen aromatischen Teile, reagiert die Azogruppe der tetrazotierten Verbindung vorzugsweise mit der Brückenverbindung. Der Tyrosinteil der natürlich vorkommenden Proteine ist am leichtesten der elektrophilen Substitution zugänglich und der aromatische Teil der Brückenverbindung musste deshalb der elektrophilen Substitution noch leichter zugänglich sein, als Tyrosin.

Die Trägerteilchen können Teilchen mit eiweissartiger Oberfläche wie rote Blutkörperchen, Mikrobenzellen und unlösliche Teilchen mit eiweissartiger Oberfläche sein. Diese Teilchen sind besonders vorteilhaft wenn mit dem Reagens immunologische Versuche durchgeführt werden sollen.

Die eiweissartige Substanz kann ein Antigen, ein Antikörper oder ein Enzym sein.

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Die verschiedenen Verfahrensstufen, die zur Bildung des erfindungsgemässen eiweissartigen Reagens führen, werden mit Bezug auf die bevorzugte Durchführungsform erläutert,* dabei wird gemäß folgender Reaktionsgleichung die tetrazotierte Verbindung mit den unterstützenden Trägerteilchen (Part.) umgesetzt und die eiweissartige Substanz (Prot.) mit der Brückenverbindung behandelt:

(D	Part.	+ Ar—N
(2)	Prot.	+ Ar¹—Y
Hierbei	ist Ar	eine-/

-> Part, -Ar-

oder

Gruppe, worin R ein Wasserstoffoder Halogenatom, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe, Z eine -NR¹-, -S- oder -O-Gruppe und R¹ ein Wasserstoffatom oder ein eAlkylgruppe bedeutet; Y steht für die Gruppen

0 η

-C- Ν«, - C - R¹, -C-Z-G-Ar¹, «Ν

O=

N-

Il

X₁

, -C- X, oder -SO₂X, worin X ein Halogen-

atom ist, Ar¹ ist die Gruppe R

R oder

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[1 I worin R¹ und Z die oben angegebene Bedeutung

JJIl- '

R¹ eine
haben und R" ringaktivierende Gruppe wie -OH, -OCH,, und

0 ist. ^J

-NH-CCHo / Die Strukturformel Ar-N₂ ⁺ für die tetrazotierte Verbindung in der Reaktionsgleichung (1) bezeichnet solche tetrazotierten aromatischen Verbindungen, die die Proteine chemisch miteinander kuppeln,können. Zwar umfasst das erfindungsgemässe Verfahren nicht dieses unmittelbare Kuppeln, die Bedeutung gilt aber für die erfindungsgemäß zu verwendenden tetrazotierten Verbindungen»

Zusätzlich zu den oben angegebenen Brückenverbindungen

kann der Y Teil der Reaktionsgleichung (2) eine OO
η κ

-C-OH, -C-NHNH₂J -NHNH₂ oder -NH₂ Gruppe sein; in diesem Falle muß die Umsetzung zwischen der Brückenverbindung und dem Protein durch einen Carbonsäureaktivator, z.B. ein Carbodiimid, Äthoxyaoetylen, Cyanamid, Ketenlmid oder Isoxazoliumsalz (Woodward',s Reagens) aktiviert werden.

Die beiden behandelten Materialien werden dann bei Raumtemperatur (25°C)in einem flüssigen Medium miteinander vermischt und umgesetzt,entsprechend der Reaktionsgleichung für die dritte Stufe:

(3) Part. - Ar - N₂ ⁺ + Ar' - Y - Prot. —) Part. - Ar - N = N-Ar' - Y - Prot.

worin die verschiedenen Symbole die oben angegebene Bedeutung haben.

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Die bei der Herstellung des erweissartigen Reagens verwendete tetrazotierte aromatische Verbindung kann also aus der Gruppe Bisdiazobenzidin, Bisdiazodianisidin und tetrazotiertes ^,^'-Diphenylamin neben anderen tetrazotierten aromatischen Verbindungen, die Protein chemisch miteinander kuppeln können, ausgewählt sein.

Als Brückenverbindung, die in der obigen Reaktionsgleichung mit Ar'-Y angegeben wird, wird vorzugsweise Pyrrol-2-carbonsäureazid, Thiophen-2-carbonsäureazid, 2-Thiophensulfonylchlorid und Furan-2-carbonsäure verwendet. Natürlich ^ können auch andere Brückenverbindungen, die der angegebenen Strukturformel entsprechen, Verwendung finden, z.B. Furan-2-carbonsäureanhydrid, 2,^-Dimethoxybenzaldehyd, 3-Methyl-2-thiophenisothiocyanat, N-Methyl-2~pyrroloxazolidin-2,5-dion und N-(^,6-Dichlor-i_f3,5-triazinyl-2)-2,i|-diacetylaminoanilin.

Das Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemässen eiweissartigen Reagentien kann unter sehr milden Bedingungen durchgeführt werden, z.B. bei Raumtemperatur und in einem gepufferten flüssigen Medium, z,B. einem phosphatgepufferten Medium oder einer Salzlösung, wobei nur wenig gerührt wird» Infolge des einzigartigen Charakters des Dreistufenverfahrens, wie es durch die Reaktionsgleichungen (1), (2) und (3) wiederge- I geben wird, sind keine besonders niederen Temperaturen erforderlich und die Umsetzungen müssen auch nicht in besonderer Weise gesteuert werden, z.^Cffi/^ecfiLe Trägerteilchen und die eiweissartige Substanz, die mit ihnen gekuppelt werden soll, im gleichen flüssigen Medium gleichzeitig vorliegen, bevor die tetrazotierte Verbindung und die Brückenverbindung zugegeben werden.

Nach beendeter Reaktion (3) kann das gebildete eiweissartlge Reagens ©us dem flüssigen Medium gewonnen und in trockener Form bereitet werden; in dieser Form ist es beständig und wird weder verändert noch schlecht. Eine beständige trockene

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Form des eiweissartigen Reagens ist besonders wünschenswert, um technisch brauchbare enzymatisch© Beagensjnaterialien und immunologische Testreagentien herstellen zu können. Das flüssige Medium kann aus dem eiweissartigen Indikator durch Sprühtrocknen bei niederen Temperaturen oder durch Lyophilisieren entfernt werden.

Werden rote Blutkörperchen als Trägerteilchen für die eiweissartige Substanz verwendet, so können diese aus zahl*- reichen Tieren gewonnen werden, z.B. aus Oppossum, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Menschen, Ziegen, Schafen, Hühnern, Alligatoren und Schildkröten. Gewonnen werden die roten Blutkörperchen, indem dem Tier eine Blutprobe entnommen und die roten Blutkörperchen vom Blutserum durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Sie werden dann gesammelt und in physiologischer Kochsalzlösung gelagert, bis sie entweder mit der tetrazotierten Verbindung oder der Brückenverbindung wie oben behandelt werden. Gegebenenfalls können die Zellen mit Formaldehyd oder Phenol konserviert werden.

Mikrobenzellen, die als Trägerteilchen brauchbar sind, können beliebige sich selbst reproduzierende Mikroorganismen sein, die sich abhängig oder unabhängig von anderen Organismen fortpflanzen. In Frage kommen grampositive und gramnegative Bakterien. Es können auch Zellen von Fungi und Protozoen Verwendung finden, ebenso wie die Virusteilchen. Im allgemeinen sind dies einzellige Organismen, die gelegentlich in Klumpen oder Aggregaten zusammengeballt sind. Die Zellen können in dieser Form verwendet werden, wenn die Klumpen nicht so grgfoß sind, daß die damit erhaltenen Träger für den speziellen vorgesehenen Zweck nicht verwendet werden können. Sollen Etazyme mit den Mlkrobenzellen gekuppelt werden * und bei chemischen Umwandlungsprozessen Anwendung finden, so ist die Klumpengröße im allgemeinen unbegrenzt. Soll aber das eiweissartige Reagens in einem immunologischen Agglutinationstest verwendet werden, so darf die Zusammenbali dung der Teilchen nicht|so groß sein, daß· das

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Reagens in Gegenwart einer immunologischen Substanz, die homolog ist der an die zusammengeballten Zellen gekuppelten eiweissartigen Substanz, nicht agglutiniert.

Bevorzugte Mikrobenzellen sind Bakterienzellen oder Zusammenballungen dieser Zellen, die gleichmässig geformt und gleichmässig groß sind und deren maximale Ausdehnung in einer Richtung zwischen etwa 0,2 und 10 ax liegte Ein Gemisch von verschiedenen, aber gleichmässigen Zellen wird zwar nicht bevorzugt, kann aber Verwendung finden. Diese verwendbaren Mikrobenzellen umfassen die •Bakterien der Abteilung I des Pflanzenreiches einschließlich der Klassen 1, 2 und 3, Ordnung 1. Die Mikrobenzerllen der Klasse 3> Ordnung 1 umfassen die intrazellularen Virenteilchen mit Ausmaßen von etwa 0,2/U.

Für eine vollständige Aufzählung der brauchbaren Bakterienzellen sei auf Bergey's Handbuch der bestimmenden Bakteriologie von R, S. Breed, E.G.D. Murray, N.H. Smith, ?. Auflage, 19^7, Williams und Wilkins Company verwiesen. Besonders brauchbar sind die Bakterien der Klasse 2, Unterordnung 2, Familie k {Pseudomonadacecäß) und der Klasse 2, Ordnung ^, Familie ^ (Enterobacteriaceae). Alle Stämme 1-5 sind erfindungsgemäss bevorzugte Mikrobenzellen. Bevorzugt werden auch Klasse 2, Ordnung k, Familien 5 (Brucellaceae), 10 (Lactobacillaceae) und 13 (Bacillaceae). Werden kleinere Teilchen von etwa 0,2 ax oder darunter gewünscht, so können die Ordnungen 1 und 2 der Klasse 3 Verwendung finden. Insbesondere Virales der Ordnung 2 haben kleine Ausmasse, die ihre Brauchbarkeit beschränken. ·

Insbesondere werden Bakterienzellen folgender Arten bevorzugt: Bruceila abortus, Eseherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi. Die Hefewachsturnsphasen der Fungizellen werden ebenfalls für die erfindungsgemässen Zwecke

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bevorzugt, insbesondere die allgemein verfügbare Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Die Mikrobenzellen können in ihrem natürlichen Zustand verwendet werden, d.h. die tetrazotierte Verbindung oder die Brückenverbindung können mit ihnen umgesetzt und dann die eiweissartige Substanz wie oben beschrieben gebunden werden. Sind aber die pathogenen Merkmale von einigen dieser Mikrobenzellen gefährlich, so kann die natürliche Antlgenität und infolgedessen die pathogenen Merkmale durch Behandeln oder Abtöten der Mikrobenzellen mit einem Kons er·* Vierungsmittel ausgeschaltet werden. Die üblichsten Konservierungsmittel sind Formaldehyd und Phenol, Es sei darauf hingewiesen, daß, wenn Mikrobenzellen mit einem Konservierungsmittel vorbehandelt und dann weiter durch das Verbinden der eiweissartigen Stoffe mit ihnen verändert wurden, die auf den Zellenoberflächen natürlich auftretenden Antigengruppen ausreichend modifiziert sind, um sie inaktiv zu machen.

Gegebenenfalls können die Mikrobenzellen oder anderen Trägerteilchen gefärbt werden, um das damit hergestellte eiweiss*· artige Reagens von dem umgebenden Hintergrund besser visuell unterscheiden zu können. Hierfür können die üblichen Farbstoffe wie Hematoxylin, Fuchsin und Kristallviolett verwendet werden. Wahlweise können' die Zellen auch mit organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, Äthern usw„ ge.wasehen werden, um etwaig vorhandene Polysaccharide oder Wachs.schichten zu entfernen. ,

Die unlöslichen Teilchen mit eiweissartiger Oberfläche können durch Überziehen von Teilchen in einer Teilchengröße von etwa 0,1 *· 10/U mit einer eiweissartigen Substanz wie Gelatine, z.B. durch Koazervierung oder.Verkapselung gebildet werden. So können z.B. Polystyrolteilchen gemäß USA-Patentschrift Nr. 3 23^ 096 durch Emulgieren in einer Gelatinelösung und Sprühtrocknen der Emulsion verkapselt werden. Es

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braucht nur ein dünner Gelatinefilm auf den Oberflächen der Teilchen abgeschieden zu werden, so daß die tetrazotierte Verbindung und die Brückenbindung damit umgesetzt werden kann.

Alle oben beschriebenen Trägerteilchen sind an der Oberfläche ausreichend reaktionsfähig, um mit der tetrazo tier ten Verbindung und/oder der Brückenverbindung zu reagieren. Dabei brauchen die verwendeten Teilchen nicht die oben beschriebenen Teilchen zu sein, da als einziges Erfordernis gilt, daß die Teilchen die angegebene funktionel- j Ie Reaktionsfähigkeit aufweisen.

Als eiweissartige Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung können beliebige der zahlreichen immunologischen Stoffe Verwendung finden. Im folgenden seien einige Beispiele angeführt: Rinderserumalbumin, Humanserumalbumin, Ovalbumin, Humanchoriongonadotropin (HGG), Blutgruppen A und B Antigene, T -Globuline, ß-Globuline, ß-Lipoprotein unddv-Globuline der Humanplasmafraktionen, anti~C-reaktives Protein von entweder Ziegen oder Schafen, Diphtherieantitoxin, Tetanusantitoxin, Humantransferrin, Trichinellaantigen, Thyroglobulin u.a. Antigenstoffe von entweder pathogenen oder natürlichen Organismen, MyoglobineH^mo- J globin, Gelbkörperhormon und Insulin. Gegebenenfalls können auch die immunologischen Gegenstücke zu diesen Stoffen als eiweissartige Stubstanzen für das erfindungsgemässe Reagens Verwendung finden. Diese Gegenstoffe sind entweder ein Antigen oder ein Antikörper, der spezifisch mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen reagiert.

Ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens zum Herstellen eines eiweissartigen Reagens liegt darin, daß Antigene, die üblicherweise in dem für die Durchführung einstufiger Kupplungsverfahren verwendeten flüssigen Medium

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unlöslich sind, nun in gekuppelter Form zur Verwendung kommen können, infolge des Umstandes, daß ihre Unlöslichkeit durch Einstellen des pH-Wertes des im vorliegenden Verfahren verwendeten flüssigen Mediums überwunden werden kann. So kann z„ B₀ Myoglobin, das bei pH»Wert 7 unter den üblichen Kupplungsbedingungen für Bisdiazobenzidin unlöslich ist, nach dem erfindungsgemässen Verfahren gekuppelt werden, indem ein flüssiges Medium mit pH-Wert 9-10 verwendet und seine Behandlung mit einer der Brückenverbindungen wie Pyrrol» carbonsäureazid oder Thiophencarbonsäureazid vorgenommen wird,

Die an die Trägerteilchen gekuppelte eiweissartige Substanz; kann ein Enzym sein, z.B. Diastase, Maltase, Zymase, Amylase oder andere Enzyme und/oder Coenzyme. Wird ein Enzym an ein Trägerteilchen gekuppelt, so kann es zur Durchführung enzymatischer Umwandlungsprozesse in einer bevorzugten Weise verwendet werden. So können die ersten drei der oben aufgeführten Enzyme in einem Dreistufenverfahren zur Umwandlung von Stärke in Alkohol Anwendung finden und das letzte aufgeführte Enzym zur Umwandlung von Stärkeauf schlämmungen in Zuckersyrup» Ein Vorteil bei der Verwendung der Enzyme, die durch das erfindungsgemäss© Kuppeln mit festen Trägerteilchen unlöslich gemacht worden sindj, liegt darin, daß die Enzyme nicht mit dem verarbeitenden Material vermischt werden, wenn die Teilchen in einer fixierten Stellung gehalten oder in einem Bett eingeschlossen sindj durch das der umzuwandelnde Stoff geführt wird. Ein anderes Beispiel für einen enzymatischen Umwandlungsprozess sind "black-strap" Melassen, die in Alkohol umgewandelt werden können, in jiem sowohl Invertase als auch Zymase an Trägerteilchen gekuppelt und die Melassen dann darüber geleitet werden«

Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die tetrazotierte Verbindung oder die Brückenverbindung so gewählt werden kann, daß sie mit yerschiedenen Gruppen auf der eiweissartigen Substanz reagieren kann, je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck des gebildeten eiweissartigen Reagens. So kann die -13

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zum Kuppeln des Antigen- oder Antikörperstoffes verwendete tetrazotierte Verbindung oder Brückenverbindung so gewählt werden, daß sie in der vorteilhaftesten Weise kujhpelt, d.h. derart, daß ein Kuppeln nahe den Antigenstellen, die an der Antigen-Antikörperreaktion dieser besonderen immunologischen Reaktion teilnehmen, vermieden wird. Aufgrund dieser Fähigkeit können Antikörper.oder Antigene auch auf mehreren verschiedenen Wegen an dieselben Trägerteilchen gekuppelt werden, um alle verfügbaren Antigensteilen zu exponierenj dies ist bedeutsam, weil bekanntlich verschiedene Tiere Antikörper verschiedene«· Teile der Antigenmolekel bilden.

Im allgemeinen wird vorzugsweise die eiweissartige Substanz mit der erfindungsgemässen Brückenverbindung behandelt, die tetrazotierte Verbindung mit den Trägerteilchen gekuppelt und dann die beiden vorbehandelten Stoffe unter Bildung des eiweissartigen Reagens miteinander umgesetzt. Ein spezifisches Beispiel für dieses bevorzugte Verfahren ist die Behandlung von Myoglobin mit Pyrrol-2-carbonsäureazid, gelöst in Dioxan und V/asser. Gleichzeitig können von einem Schaf erhaltene, mit Formalin behandelte rote Blutkörperchen mit Bisdiazobenzidin gelöst in einem Acetat gepufferten wässrigen Medium umgesetzt werden. Das behandelte Myoglobin kann durch Dialyse gereinigt und dann mit den gekuppelten roten Blutkörperchen zu dem gewünschten eiweissartigen Indikator umgesetzt werden»

Der Indikator kann dann bei Versuchen über die Verhinderung der Agglutination Verwendung finden, um Myoglobin in Serumproben nachzuweisen; dabei wird gemäß den allgemein üblichen immunologischen Testverfahren zur Verhinderung von Agglutinationtitrationen gemäß USA-Patentschrift 3 236 732 gearbeitet.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele noch näher erläutert.

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Beispiel 1:

In diesem Beispiel wird die Herstellung eines eiweißartigen Reagens beschrieben, bei welchem rote Blutkörperchen (Erythrocyten) als unterstützende Trägerteilchen und Myo*-» globin als eiweißartiges Material verwendet wirdo Das entstandene Reagens konnte durch Anwendung eines Testverfahrens zur Verhinderung der Agglutination, bei welchem das Reagens zusammen mit dem Antikörper für Myoglobin.eingesetzt wurde,, zum Nachweis des Antigens toffee Myoglobin Verwendung finden,,

■7.

24 mg rohes Myoglobin wurden in 10 cm 0,15m Phosphatpuffer mit pH-Wert 7»4 gelöst und mit 100 mg Natriumbicarbonat versetzt» Darauf wurde der pH-Wert mit 0,1η Natronlauge auf 9-10 eingestellt» Dann wurden 100 mg Pyrrol-2-carbonsäureazid in 4 cm eines Gemisches aus gleichen Volumina Dioxan und Wasser/gelöst. Die Pyrrolazidlösung wurde tropfenweise unter Rühren zu der Myoglobinlösung gegeben» Während der Zugabe wurde der pH-Wert durch Zugabe von 0,1η Natronlauge zwischen 9 und 10 gehalten« Nach beendeter Pyrrolazidzugabe wurde das Reaktionsgemisch etwa 72 h gegen 2 1 mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7» dialysiert, wobei die Kochsalzlösung zweimal täglich ausgewechselt wurde» Die verwendete phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem 22,7 om 0_s5m Na^HPO. und 1,6 cm 4m NaH₂PO. mit isotonischer Kochsalzlösung auf 2 1 aufgefüllt wurdesa Das auf diese 7/eise behandelte Myoglobin bestand aus Myoglobinmolekülen, die entsprechend der obigen Reaktionsgleichung 2 chemisch an die Brückeverbindung gebunden waren₀

Die Trägerteilchen wurden mit der tetrazotierten Verbindung in folgender Weise gekuppelt _o 7 cm einer 1Obigen Suspension von mit Formaldehyd konservierten/Blutkörperchen des Schafes wurden, zentrifugiert und erneut in

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8 cm Acetatpufferlösung suspendiert, die durch Zugabe von 20 cnr 2m Nairiumacetat und 33,7 cm 3,5m Essigsäure zu isotonischer Salzlösung, ausreichend für 2 1 und Einstellen des pH-Wertes auf 3»5 mit Eisessig erhalten worden war. Nach der Zugabe der roten Blutkörperchen zur Pufferlösung wurde der pH-Wert der Suspension mit Eisessig auf 3-4 eingestellt, soweit erforderlich*

Eine tetrazotierte Verbindung, Bis-diazobenzidin (BDB)

3 wurde in folgender Weise hergestellt» 10 cm destilliertes ^

Wasser wurden mit 0,680 g NaNOp versetzt· Diese Lösung ™

wurde dann in ihrem Behälter in ein Ssbad eingetaucht und vor ihrer Verwendung auf unter 4⁰C gekühlt« Dann wurden 0,640 g Benzidin · HCl in 100 cm verdünnter Salzsäure (15 cm conzentrierter Salzsäure je 1) gelöst. Diese zweite Lösung wurde in ihrem Behälter in ein Eisbad gestellt und gerührt, bis die Temperatur der Lösung 4⁰C betrug. Dann wurden 5 cm der obigen Natriumnitritlösung in eine Pipette aufgezogen und tropfenweise gleichmäßig der Benzidinlösung im Verlauf von 7-10 min unter Rühren zugesetzte Nach weiteren 20 min langem Rühren war die Lösung zum unmittelbaren Gebrauch bereite

Dann wurden 2 cm der BDB-Lösung mit 1 cnr Acetatpufferlösung von pH-Wert 3,5 und zusätzlich mit 1 cnr Wasser verdünnte Diese BDB-Verdünnung wurde tropfenweise zu der wie oben hergestellten Suspension roter Blutkörperchen gegeben. Der pH-Wert wurde auf 3-4 eingestellt und das Gemisch bei Raumtemperatur langsam 30 min lang bewegte Darauf wurden die Blutkörperchen abzentrifugiert, einmal mit der Acetatpufferlösung pH-Wert 3»5 gewaschen und dann erneut in 8 cm isotoniacher Salzlösung suspendiert« Diese Suspension enthielt die roten Blutkörperchen gekuppelt mit der tetrazotierten Verbindung BDB und entsprach somit der Strukturformel auf der rechten Seite der oben angegebenen Reaktionsgleichung 1. ~ 16 -

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Das eiweißhaltige Reagens schließlich wurde hergestellt, indem das dialysierte Myoglobin-Pyrrolmaterial langsam unter Rühren der Suspension der roten. Blutkörperchen zugesetzt wurde* Der pH-Wert wurde/Natriumhydroxid auf 6-7 eingestellt und das Gemisch A - 8 h bei Raumtemperatur (25⁰C) rotiert und dann in einem gekühlten Behälter gelagert· Zur Verwendung wurde das erhaltene Konjugat

■viermal mit isotoner Salzlösung gewaschen und erneut, in 40 om Salzlösung suspendiert· Dieses eiweißhaltige Reagens konnte bei einem immunologischen Versuch verwendet werden, bei welchem Myoglobin unter Anwendung des Testverfahrens der Verhinderung der Agglutination nachgewiesen wird«

Das eiweißhaltige Reagens zeigte eine typische rote Farbe, die anzeigte, daß die BDB-Kupplungshälfte auf den roten Blutkörperchen mit dem aromatischen Kern der an das Myoglobin gebundenen Brückenverbindung gekuppelt war und nicht unmittelbar an die Myoglobinstruktur gebunden; im letzteren Falle zeigte das Reagens in gleicher Konzentration ein bräunliches Aussehen.

Beispiel 2:

Es wurde eine Anzahl von eiweißhaltigen Reagentien gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 hergestellt, Dabei wurden die tetrazotierte Verbindung, die Brückenverbindung und die mit den roten Blutkörperchen gekuppelte eiweißhaltige Substanz ersetzt. Die verwendeten Substanzen und die dabei erhaltenen Reagentien sind in der folgenden Tabelle zusammengestellte

~ 17 -

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. 17 ~

Tabelle

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Reagens

Tetrazotierte
Verbindung

Backenverbindung

Eiweißhaltige Substanz

A	Bis-diazoben- zi din	Thiophen-2-car- bonsäureazid	Myoglobin
B	It	Pyrrol-2-carbon- säureazid	Choriongona dotropin
G	ti	Il	Haemoglobin
D	I!	Thiophen-2~car- bonsäureazid	Il
E	Bis-diazodi- anisidin	Pyrrol-2-carbon- säureazid	Myoglobin
1	Il	TMophen-2-car- bonsäureazid	It
G	Il .	Pyrrο1-2-carbon säur eazid	Choriongona dotropin
H	Il	Il	Haemoglobin
I	Il	Thiophen-2-car«- bonsäureazid	Il

Bei der ,Herstellung der in der obigen Tabelle aufgeführten Reagentien gemäß Beispiel 1 wurden die tetrazotierte Verbindung, Brückenverbindung und eiweißhaltige Substanz jeweils wie in Beispiel 1 angegeben gehandhabt mit Ausnahme des Choriongonadotropins, das wie folgt verwendet wurde· 5 mg Choriongonadotropin des Menschen (Vitamerican Company), Stärke 2000 - 3000 IB/mg wurden in einem 0,15m Phosphatpuffer mit pH-Wert 7»4 gelöst, dem 100 mg Natriumbicarbonat zugesetzt worden war» Diese Lösung wurde anstelle des

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Myoglobinpräparates gemäß Beispiel 1 verwendet·

Die eiweißhaltigen Heagentien wurden dann als Reagentien für immunologische Versuche in der im Versuch*eil der USA-Patentschrift Nr. 3 236 732 beschriebenen Weise gemäß- folgenden spezifischen Schritten verwendet. Es wurden eine Reihe von Vertiefungen für die Versuche und Kontrollen hergestellt. In jede Vertiefung wurde eine entsprechende Menge veronalgepufferte Salzlösung^verdünnung des gegen jede» spezifische Antigen (eiweißhaltige Substanz) der Testreagentien hergestellten Antiserums gegeben· Jeder Vertiefung würde ein Tropfen einer biologischen, die Antigene enthaltenden Probe zugesetzt» Für jede Versuchsvertiefung

die wurde eine Kontrollvertiefung hergestellt, indem- anstelle der biologischen Probe, ein Tropfen einer physiologischen Kochsalzlösung zugegeben wurde« Als Kontrollen für die Anti serumv. erbindungen diente übliches Kaninchenserum- oder Rinderserumalbumino Jeder dieser vorbereiteten Versuchsund Kontrollvertiefungen wurde 1 Tropfen der oben hergestellten Reagentien A-I zugegeben und die durch diese Reagentien gebildeten Muster in dem Zeitraum etwa 30 min bis etwa 2 h nach der letzten Zugabe beobachtet. Enthielt die zu untersuchende Probe das in derTabelle aufgeführte Antigen in ungebundenem Zustand, so zeigte sich am Boden der Versuchsvertiefungen ein Zellenring oder Zellenfleckj enthielt die Versuchsprobe kein Antigen, so trat in den Vertiefungen ein Agglutinationsmuster auf. Beim ersten Mal, wenn die Versuchsprobe das freie Antigen enthielt, hieß es also, daß der Indikator ausfällt«

Aus diesen Versuchen wurden geeignete Antiseraver-

dünnungen für jeden einzelnen Indikator bestimmt und darauf

, ■ , Pepton

diese Verdünnungen als 2#ige Peptonlösung (2 g in einer veronalgepufferten Kochsalzlösung) angesetzt und eingefroren„

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Die hergestellten immunologischen Testreagentien wurden zentrifugiert und in Ί # Rinderserumalbumin in veronalgepufferter KochsaLzlösung suspendiert« Dann wurden die bereiteten Peptonverdünnungen der Antisera in einen Reaktions-"bereich einer Reihe von Reaktionskapseln gegeben, von denen jede 2 reagensenthaltende Bereiche aufwies und in den anderen Reaktionsbereich jeder Kapsel ein Tropfen der Testreagenssuspension. Diese Kapseln wurden dann auf Aluminiumgestelle gegeben und in einer handelsüblichen Lyophilisiervorrichtung auf -4O⁰O gekühlt» Nach einer entsprechenden Zeitdauer, · * während der das Wasser aus den Kapseln entfernt wurde, wurden diese aus dem Gefriertrockner herausgenommen, in einen Bereich mit wenig Feuchtigkeit gebracht und teilweise geschlossen und mit Trockemitte'lpäckchen abgepackt.

Nachdem zunächst die entsprechenden Antiseraverdünnungen und die lyophilisierten Testreagentien bereitet wurden, wurde so eine Handelsform bereitgestellt, die für den Letzverbraucher bei der Durchführung immunologischer Versuche verpackt werden kann«

Dieses Beispiel zeigt, daß verschiedene eiweißartige Reagentien bereitet werden können; mit diesen Reagentien können dann technisch brauchbare abgepackte immunologische Testsysteme, die in trocknem Zustand gelagert und verschifft werden können, hergestellt werden*

Beispiel 3«

Die eiweißartigen Reagentien von Beispiel 1 sowie A, 0 und D von Beispiel 2 wurden mit Bakterienzellen anstelle der in diesen Beispielen verwendeten roten Blutkörperchen hergestellt» Die als Träger für die an ihrer Oberfläche

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gebundenen Antigene verwendeten Bakterienzellen werden Escherichia coli-Bakterien, die aus einer Eingeweideprobe eines toten Laboratoriumskaninchens in einer Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) gezüchtet wurden. 3 1 BHI wurden nach vorangegangener Sterilitätskontrolle mit 68 cm einer gut wachsenden Kultur (18 h) geimpfte Dann wurden die Zellen 4 1/2 h bei 37⁰C unter Schütteln inkubiert» Die erhaltenen Zellen waren in Größe undForm einander gleiche Diese Zellen wurden mit einer etwa 37$igen lormaldehydlösung, die mit Oalciumcarbonat behandelt worden war, inaktivierte Dann wurden sie in derselben Weise wie die roten Blutkörperchen in den Beispielen 1 und 2 verwendet«

Da die nach; diesem Beispiel hergestellten eiweißartigen Reagentien kleiner waren, konnten sie für Agglutinationsteste auf dem Objektträger verwendet werden₀ Bei diesem Versuch wurde 1 Tropfen der wie oben zusammengesetzten Reagentien auf einem Objektträger mit einem Tropfen einer Verdünnung des entsprechenden Antiserums und einem Tropfen der zu prüfenden Probe vermischte Das Nichtauftreten einer Agglutination zeigte die Anwesenheit des in der Versuchsprobe nachzuweisenden Antigens an«

Beispiel 4:

Es wurde ein eiweißartiges Reagens hergestellt, bei welchem rote Blutkörperchen mit Rinderserumalbumin (BSA) ■ gekuppelt waren; als tetraz.otierte Verbindung wurde Bis-diazobenzidin, als Brückeverbindung Furan-2-carbonsäure und als Säureaktivator N-Äthyl-5«phenylisoxazolium-3'~sulfonat, bekannt als Woodward's Reagens K, verwendet»

224 mg Furan-2- carbonsäure wurden in 10 cnr 0,1η NaOH-Lösung gelöst und dann 30 min mit 506 mg Woodward's •Reagens K umgesetzt. Zu dieser Lösung wurden dann 25 mg BSA

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in 10 cm Wasser gegeben und das Gemisch 2 h bei Raumtemperatur (25⁰C) reagieren gelassen, bevor es bei 4⁰C 3 Tage lang dialysiert wurde« Das Endvolumen der behandelten

■5 eiweißartigen Substanz wurde auf 25 cm eingestellt und' in der folgenden Beschreibung 5 cnr als 5 mg Protein verwendete

Mit Formalin inaktivierte rote Blutkörperchen vom Schaf wurden zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit verworfen und die Zellen in 17 cm Acetatpufferlösung (pH 4,0) suspendiert* Zu dieser Suspension wurde 1 cnrBDB hergestellt gemäß Beispiel 1 und verdünnt in 5,0 cnr Acetat« puffer gegeben und das Gemisch 30 min gerührt_o Das gekuppelte Produkt wurde dann dreimal in Salzlösung gewaschen und 3 cm einer lO^igen Suspension wurden dann auf 17 cm Gesamtvolumen verdünnte

Es wurden gleiche Volumina und zwar 5 cm des BSA-Furanproduktes und des Phosphatpuffers gemäß Beispiel 1 zu 17 cm. der an BDB gekuppelten roten Blutkörperchen gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur etwa 24 h lang rotiert, darauf wurde es über Nacht bei 4⁰C gelagert« Das erhaltene Reagens wurde viermal mit Salzlösung gewaschen und gegen 2 verschiedene Anti-BSA-Seraverdünnungen titrierte Beide Titrationen zeigten, daß das Reagens durch eine 0,l$ige BSA-Iösung vollständig inhibiert wurde,,

Beispßl 5t

Es wurden 3 spezifische Abwandlungen des Reagens gemäß Beispiel 4 wie folgt hergestellt:

Gemäß der ersten Abwandlung wurde das BDB durch das gleiche Volumen einer Lösung ersetzt, die 18 mg Zinkchloriddoppelsalz von Bis-(4)~diazoniunihenylamin gelöst in 15 ciir

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destilliertem Wasser enthielt«

Gemäß der zweiten Abwandlung wurden 20 mg Rindergamma-Grlobulin in Salzlösung gelöst und mit 100/uJL 2-Thiophensulfonylchlorid behandelt und dann etwa 17 h lang gerührte Darauf wurde das behandelte eiweißartige Material 3 Tage lang dialysiert, wobei das destillierte Wasser häufig gewechselt wurde. Dann wurde es wie in den früheren Beispielen mit den an BDB gekuppelten roten Blutkörperchen zur Reaktion gebrachte

Die dritte Abwandlung entsprach der zweiten mit dem Unterschied, daß nur 10/u^l der Brückenverbindung 2-Thiophensulfonylchlorid verwendet wurden«

Beispiel £i

Ein eiweißartiges Reagens, mit dem sich der Insulinspiegel oder der Insulinantikörperspiegel im Serum bestimmen ließ, wurde wie folgt hergestellt!

50 mg Insulin wurden mit 10 cm destilliertem Wasser und ausreichend 0,ln_ HGl, damit alles Insulin gelöst wurde und dann mit 10 cm Boratpufferlösung mit pH-Wert 9,0 vermischt« Dieser Lösung wurden langsam 500 mg Pyrrol-2-carbonsäureazid, gelöst in gleichen Volumina Dioxan und Wasser (insgesamt 8 cur) zugesetzt,, Der pH-Wert wurde mit O₉In NaOH bei 9-10 gehaltene Nach beendeter Behandlung des Insulins wurde der pH-Wert mit NaOH-Lösung auf 9$8 angehoben. Die Suspension wurde dann filtriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, lyophilisierto

3 cnr einer 10%igen Suspension von mit Formalin inaktivierten roten Blutkörperchen wurden zentrifugiert und die

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überstehende Lösung verworfene Die Zellen wurden in 8,0 cm

*

Acetatpufferlösung mit pH-Wert 3»5 suspendiert und mit 1 em

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Bis-diazobenzidin gelöst in 1 cm Pufferlösung und 1 cm destilliertem Wasser "behandelt. Die erhaltene Suspension wurde 30 min bewegt, dann wurden die Zellen viermal mit der obigen Acetat-pufferlösung gewaschen« Die Zellen wurden erneut in 10 cm Acetatpufferlösung suspendierte

Eine Lösung aus 5- mg Insulin behandelt mit Pyrrolsaureazid wurde in 10 cm Natriumphosphatpufferlösung mit pH-Wert 7,4 gelöst und zu den mit BDB gekuppelten roten Blutkörperchen vom Schaf gegeben. Es wurden wBitere 10 cnr Pufferlösung zugesetzt und der pH-Wert auf 8,0 eingestellt» Das erhaltene Gemisch wurde 4 Tage in Bewegung gehalten und dann etwa 17 h stehen gelassen· Die Zellen wurden viermal mit

etwa 25 er mit veronalgepufferter Salzlösung gewaschen und

erneut in 18 cm .mä-fc veronalgepuff erter Salzlösung suspendierte

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl von eiweißartigen Reagentien herstellen lassen_e Diese können aus einer Vielzahl von Trägerteilchen und eiweißartigen Stoffen gebildet sein und es können beliebige der für das beschriebene Dreistuf enverfabren beanspruchten tetrazotierten Verbindungen und Brückenverbindungen Verwendung finden,»

Pat en tan sprüche

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Claims

Patentansprüche

1. Eiweißartiges Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß ein eiweißartiges Trägerteilchen und eine eiweißartige Substanz über je eine kovalent gebundene tetrazotierte aromatische Verbindung und eine Brückenverbindung mit einem aromatischen Teil, der leichter elektrophil substituiert werden kann als ein etwa vorhandener eiweißartiger aromatischer Teil, chemisch miteinander verbunden sind©

.

2. Verfahren zum Herstellen des Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine eiweißartige Substanz mit einer tetrazotierten aromatischen Verbindung oder einer Brückenverbindung umsetzt, die einen aromatischen Teil enthält, der leichter elektrophil substituiert werden kann als ein vorhandener beliebiger eiweiß-

- artiger aromatischer Teil, daß man die nicht umgesetzte Verbindung mit einem eiweißartigen Trägerteilchen kuppelt und schließlich die behandelte eiweißartige Substanz mit dem gekuppelten Trägerteilchen zu dem eiweißartigen Reagens umsetzt.

3» Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzelnen Verfahrensschritte in einem flüssigen Medium durchführt and das Reagens dann in trockener Form isoliert.

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4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die eiweißartige Substanz mit der Brückenverbindung behandelt und die tetrazotierte Verbindung mit dem Trägerteilchen kuppelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Trägerteilchen rote Blutkörperchen, Mikrobenzellen und unlösliche Teilchen mit eiweißartiger Oberfläche verwendet.

6β Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als eiweißartige Substanz ein Antigen, einen Antikörper oder ein Enzym verwendet,

7 ο Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als tetrazotierte Verbindung Bisdiazobenzidin, Bisdiazoanisidin und/oder tetrazotiertes 4,4^t-Diphenylamin verwendete

8. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Brückenverbindung _, Pyrrol-2-carbonsäureazid, Thiophen-2-carbonsäureazid, f 2-Thiophensulfonylchlorid und/oder Puran-2-carbonsäure verwendet»

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