DE2010654A1 - Substanz zur Regulierung der mensch liehen und/oder tierischen Darmflora sowie Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Substanz zur Regulierung der mensch liehen und/oder tierischen Darmflora sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

PATENTANWÄLTE
DR. MAX SCHNEIDER
DR. ALFRED EITEL ERNST CZOWALLA
DIPL. ING. - DIPL. LDW.
NÜRNBERG
Fernsprech-Sammal-Nr. 20 39 31 Bankkonten: Deutsche Bank A.G. Nürnberg
und Hypobank Nürnberg
Postscheck - Konto: Amt Nürnberg Nr. 383 05 Drahtanschrift: Norispatent
Diess.Nr. 23 120/Mü-Hi
8500 NÜRNBERG, den ^ gs 3. ?ü Königstraße 1 (Museumsbrücke)
Firma AB Cernelle, Vegeholm 6250 262 00 Ängelholm/Schweden
"Substanz zur Regulierung der menschlichen und/oder tierischen Darmflora sowie Verfahren zu ihrer Herstellung11
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz zum Zwecke der Regulierung der Darmflora von Mensch und Tier.
Die charakteristischen Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die Züchtung eines Stammes des Streptococcus faecium in einer wässrigen Nährlösung
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mit Kohlehydraten, einer Quelle organischen Stickstoffs und einer Quelle bzw. einem Ausgangsstoff von Wachstumssubstanzen, unter submersen anaeroben Bedingungen. Die Eigenschaften des Streptococcus faecium, welcher hier als '•Streptococcus faecium Cernelle 68" bezeichnet wird, werden in der Beschreibung erläutert. Dieser Stamm wurde in der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, unter der Registriernummer NCIB 10 415 hinterlegt. Das Verfahren umfaßt außerdem das Trennen der erhaltenen Bakterienmenge von der so erzielten Kulturflüssigkeit und gegebenenfalls das Gefriertrocknen der isolierten Bakterienmenge.
Der zu dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Organismus ist eine Subkultur, welche man ursprünglich unter der Klassifizierung lactobacillus acidophilus erhielt. Die anfängliche Bestimmungshypothese wurde infolge mikroskopischer Eigenarten des Organismus und seiner gezeigten hohen Widerstandafähigkeit gegen Hitze umgestoßen. Auch brachte das morphologische Bild Zweifel, da die Zellen sehr unregelmäßig sind und deshalb eine größere Ähnlichkeit mit Mikrobakterium als mit Streptococcus aufweisen. Die negativen Ergebnisse des Benzidintestes führten auch zur Aufgabe der vorherigen Alternative, und das Vermögen des untersuchten Stammes,bei 1O0C zu wachsen, ergab/ eine
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weitere negative Indikation. Infolgedessen wurde trotz der morphologischen Unregelmäßigkeit geschlossen, daß der Organismus ein Streptococcus und im einzelnen ein Streptococcus der Enterococcusgruppe sei (hohe Widerstandsfähigkeit gegen Hitze, Wachstum bei 100C und bei 450C). Weitere Versuche festigten diese Schlußfolgerung. So konnte gezeigt werden, daß der Organismus die Fähigkeit hat, auf Slanetz*sehen und BarOey'sehern Nährboden zu wachsen. Aus diesen und anderen Gründen muß der Organismus als ein Enterococcus angesehen werden. Auch die folgenden Eigenschaften konnten gezeigt werden; Wachstum bei einem pH-Wert von 9,6; Wachstum in Medien mit einer NaCl-Konzentration von 6,5#J Wachstum in einem 40 $igen Gallen-Agar bzw. Nährboden. Alle diesen Eigenschaften werden bekanntlich als spezifische Identifikationsmerkmale für Enterococci angesehen. Um einen Vergleich zu ermöglichen, schlossen sämtliche Versuche auch, die Verwendung eines Stammes von dem zur Enterococcusgruppe gehörenden Streptococcus durans (ATCC 6056) ein, und außerdem einige Enterococcusstämme, die speziell für diese Aufgabe von Dünger isoliert worden waren.
Es wurde eine ausgedehnte Übereinstimmung zwischen dem Stamm Streptococcus durans und dem untersuchten Stamm
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festgestellt und infolgedessen anfänglich die Identität "beider angenommen. Jedoch ergab fortgesetztes diesbezügliches Suchen in der Literatur und außerdem Vergleichsstudium, daß der Organismus mit größerer Wahrscheinlichkeit als Streptococcus faecium bestimmt werden könnte; nach Deibel (Bact. Reviews 28, 330-336, 1964) kann der Streptococcus durans im einzelnen als eine Variante des Streptococcus faecium angesehen werden. Diese Schlußfolgerung basierte hauptsächlich auf der Tatsache, daß der untersuchte Stamm bei 500C wächst und Arabinose in GäKrung bringt, wohingegen er Sorbit nicht in Gärung versetzt und Zitrat nicht als Kohlenstoffquelle verwendet. Die vier aufgezeigten Merkmale stimmen mit den Eigenschaften dee Streptococcus faecium überein, jedoch nicht mit denen des Streptococcus faecalis. Wie oben erwähnt, ist es von geringerer Bedeutung, ob der Organismus als Streptococcus durans oder als Streptococcus faecium klassifiziert wird.
Verglichen mit dem sogenannten, sehr JJ-haemoly tischen Stamm Streptococcus durans muß der untersuchte Stamm als praktisch nicht haemolytisch angesehen werden. Deshalb ist auch unter diesem Aspekt die Klassifizierung des Stammes als Streptococcus faecium als korrekt
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anzunehmen. Darüberhinaus läßt der untersuchte Stamm Milch nicht gerinnen. Die Säurebildung in Milch ist schwach, z.B. im Vergleich mit dem Referenzstamm Streptococcus durans. Der End-pH-Wert in Milch war 5,5 bzw. 4,4.
Es sei herausgestellt, daß der Streptococcus faecium in der letzten Ausgabe von Bergeyfs Manual of Determinative
Bacteriology, 1957 , nicht als selbständige Spezies betrachtet wird. Viele in den letzten Jahren durchgeführten Versuche haben jedoch sehr die Notwendigkeit einer Revision der Enterococcusgruppe in Bergey's Handbuch aufgezeigt und außerdem, daß diese Gruppe aus zwei verschiedenen Spezies bestehen sollte, nämlich dem Streptococcus faecalis einerseits und dem Streptococcus faecium andererseits. Der Streptococcus faecium ist vom Streptococcus faecalis dadurch sehr leicht unterschieden, daß ersterer Folsäure erfordert, letzterer jedoch nicht.
Eine Untersuchung der morphologischen und Züchtungseigenschaften des "Streptococcus faecium Oernelle 68M hat die in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnisse gezeitigt;
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Medium etc.
Eigenschaften
Morphologie
Lemco-Agar, Blut-Agar und Brühe
Gramfärbung positiv kokkoid, oft lanzettartig. Einzeln, als Paare und Ketten verschiedener Länge. Nicht bewegungsfähig.
Wachstum
KuItivationstemperatur Temperaturbereich
-Atmosphäre, Blut-Agai
Blut-Agar, 24 h bei 250C
Kohlenhydrate in Peptonwasser (7 Tage bei 300C 30 - 45UC
15 - 450C (über 450C nicht geprüft)
gutes Wachstum, 7 Tage bei 30°C
Punktförmige Kolonien, Kreisförmig ι ebenι feucht| wenig konvexj gänzlich umrandetj opak und farblos ο Butterartig, jl-haemolytisch.
Säure, aber kein Gas von Glukose, Sucrose, Lactose, Maltose, Mannit und Trehalose. Weder Säure noch Gas von Stärke, Glyzerin und Dulcit.
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Hugh, und Leifson, Glukose (7 Tage bei 25°C)
MRS Schmutzboden ("sloppjf
Lackmusmilch
Harnstoff
Zitrat (Koser'e) Indol
Voges-Proskauer Methylrot
Nitrat zu Nitrit von Trypton
Gelatine-Agar- bzw. Nährbodenplatte Stärke-Nährbodenplatte Milch-Nährbodenplatte
Säure in offenen und geschlossenen Rohren
Gutes Wachstum. Keine Gasblasen mit heißem Draht-Homofermentiv.
Säure, weder Gerinnung noch Ausscheidung.
- (geringes Wachstum)
Klärung, aber Niederschlag mit HgCl2.
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? Π1 Q 6 5
Katalase
Zellfarbstoff-Oxydase Oxydase (Kovac's)
(50 Sekunden).
Bei mit "Streptococcus faecium Cernelle 68M durchgeführten Züchtungsversuchen haben sich die folgenden zehn Aminosäuren als notwendige Wachstumsfaktoren für diesen Stamm erwiesen: Arginin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Jsoleucin, Leucin, Methionin, Threonin, Tryptophan und Valin.
Vier B-Vitamine waren wichtige Wachstumsfaktoren: Riboflavin, Niacin, Pantotensäure und Folsäure.
Die folgenden Ergebnisse gaben Bestimmungen für die Resistenz des Organismus in vitro gegen einige Antibiotika und Chemotherapeutika:
Antibiotika und Chemotherapeutika: Gruppe:
1. Sulfaisodimidin IV
2. Penicillin III
3. Ampicillin III 4-. Streptomycin IV 5. Chlortetracyclin (Aureomycin) II
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6. Oxitetracyclin (Terramycin) I
7. Chloramphenicol II
8. Polymyxin ■ IV
In dieser Tabelle haben die verschiedenen Gruppen die folgenden Bedeutungen:
Gruppe I: "empfindlieh1* (allgemeine Infektion, übliche Dosierung)$
Gruppen: "ziemlich empfindlich11 (allgemeine Infektion, hohe Dosierung);
Gruppelll:"gering empfindlich" (lokalisierte Infektion, Konzentrierung des Chemotherapeutikums an der Infektionsstelle - beispielsweise bei Harntrakt-Infektionen) {
GruppelV: "Resistent" (wahrscheinlich der Chemotherapie nicht zugänglich).
Die Erfindung besteht in der Züchtung eines neuen Stammes von Streptococcus faecium, welcher hier als "Streptococcus faecium Cernelle 68" bezeichnet wird, unter submersen anaeroben Bedingungen bei 30 bis 45°C, worzugsweise 34 bis 400C, unter Rühren in Medien, welche Kohlehydrate enthalten, wie Dextrose, eine Quelle für organischen
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7010R54
- ίο -
Stickstoff, beispielsweise Pepton, und einen Ausgangsstoff für Wachsturnssubsanzen, beispielsweise Hefeextrakte. Die Züchtung findet vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 5,8 und 7,2 statt, wobei vorteilhafterweiae Ammoniumhydroxid als Säureregulator Verwendung findet. Die Zeit für die Züchtung beträgt zwischen 10 und 30 Stunden. Die optimalen Bedingungen sind 37°C und 16 Stunden.
Ist das Wachstum vollendet, wird die Bakterienmenge vorzugsweise unter Zuhilfenahme eines Separators abgetrennt und bevorzugtermaßen in Wasser suspendiert, dann gefriergetrocknet und abgepackt.
Das gemäß der Erfindung hergestellte Bakterium hat die Fähigkeit, sich im menschlichen oder tierischen Darm zu ver-
und / mehren und kann deshalb in der Humanmedizin'als Zugabe zu tierischen Futtermitteln Verwendung finden, insbesondere zur Verhütung der Enteritis.
Der in Frage stehende Organismus produziert Milchsäure, ist für den Darm natürlich und besitzt eine so hohe Lebensfähigkeit, daß er andere Darmbakterien hemmt und hierduch die Darmflora normalisiert.
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Wenn das erfindungsgemäße Gemisch Futtermitteln für Tiere beigegeben wird, dann ruft es auf biologische Art einen physiologischen Effekt hervor, welcher zu den gleichen od?r zu "besseren Ergehnissen führt als die Fütterung von Antibiotika, welche häufig Tierfutter beigemischt werden. Jenes Gemisch reduziert die Darminfektionen und vermehrt das Wachstum der Tiere je Gewichtseinheit des Futtermittels. Gleichzeitig wird die Anzahl der zum Erreichen des Endgewichts erforderlichen Fütterungstage vermindert.
Das Gemisch hat sich als besonders vorteilhaft für die Aufzucht von Ferkeln und Kälbern erwiesen. Seine Beimischung zum Futter anstelle von Antibiotika hat zu einem schnelleren Erreichen des Verkaufsgewichts bei Ferkeln geführt, als dies ohne jede Beimengung möglich gewesen wäre.
Deshalb kann das Gemisch als Ersatz für Antibiotika und Chemotherapeutika im Futter Verwendung finden. Dies ist von besonderer Bedeutung, da es die antibiotisch resistenten Bakterien am Wachstum hindert. Dieses Wachstum tritt häufig bei der Beimengung von Antibiotika zu Futter auf. Die so entwickelten antibiotisch resistenten Stämme bilden in der Humanmedizin ein wachsendes Problem.
Im folgenden wird ein Beispiel aufgeführt, um das Züchten von "Streptococcus faecium Cernelle 68" und die Zusammensetzung des Produktes zu verdeutlichen.
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2Q10654
Beispiel:
Die "Streptococcus faecium Cernelle 68"-Kultur wird vorzugs weise als Strichkultur in Tomatensaft-Agar gehalten,welcher auf 5°C gekühlt ist. Die Röhrchen werden einmal je Monat auf neue sterile Röhrchen zurückgestochen. Nachdem das Wachsen erkennbar geworden ist, wird ein Test mit Gram-Färbung und Aufstreichen auf eine Tomatensaft-Agarplatte sowie eine Nährstoff-Agarplatte durchgeführt.
Eine Vorkultur mit folgenden Mengen wurde präpariert:
NaGL 5 g
Pepton 10 g
Fleischextrakt 3 g
Dextrose 5 g
Wasser 1000 ml
und auf vier 250 ml-ErIenmeyerkolben aufgeteilt sowie 20 Minuten bei 1210C sterilisiert. Unter sterilen Bedingungen wurde eine Platinschlinge von der Kultur zur Brühe gebracht. Die Inkubation dauerte 27 Stunden bei 240C. Nach dem Wachsen wurde eine Kontrolle mit Gramfärbung, Aufstreichen auf eine Tomatensaft-Agarplatte sowie in einem Phasenkontrastmikroskop durchgeführt.
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Eine ETeutralisierungslösung 6 $ ΚΉ.ΟΗ wurde bereitet und mittels eines Sterilisationsfilters Seitz, Type EKS I, sterilisiert. Mit dem IJH4OH enthaltenden Kolben war ein Glasröhrchen mittels eines an eine Schlauchpumpe anschließbaren Schlauches steril verbunden.
17 Liter des Substrates wuden zur schichtweisen Kultivierung hergestellt durch Abwiegen von
Pepton 51Og
Dextrose ■ 765 g
Hefe-Extrakt 119 g
Wasser 1700 ml
Die festen Bestandteile wurden in Wasser gut gelöst und die Lösung Sterilisationskesseln aus rostfreiem Stahl zugeführt, welche eine Verbindung zum sterilen Hinübertreiben der Flüssigkeit in den Züchtungskessel aufwiesen. Das Substrat wurde 50 Minuten bei 1210C (10 Liter) sterilisiert bzw. 40 Minuten bei 1210O (7 Liter). Der Züchtungskessel war bei 18O0G 4 Stunden sterilisiert worden.
Das Substrat wurde durch sterile Luft unter 0,5 atm. Druck von den Sterilisationskesseln zum Züchtungskessel gedrückt. Das Inokulat wurde zugefügt. Die Entlüftung des Kessels wurde in steriler Form durchgeführt. Die mit einem
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pH-Regulator verbundene pH-Elektrode wurde angeschlossen. Der pH-Wert wurde in einem Bereich von 5,8 bis 7,2 konstant gehalten. Der Regulator sandte Impulse zur Schlauchpumpe, welche die NH.OH-Fliissigkeit durch die sterile Verbindung zum Kessel transportierte. Ein Kontaktthermometer war mit dem Kessel verbunden und die Temperatur wurde bei etwa 370C gehalten. Der Motor des Rührwerkes wurde in Bewegung gesetzt und die Züchtung begonnen.
Das Wachsen wurde während etwa 16 Stunden bei konstantem pH-Wert und unter Rühren ermöglicht. Anfangs war das Substrat von dunkler Farbe und am Ende bekam es eine leuchtend gelbe Färbung. Es wurden etwa 3000 ml 6#ige NH-OH verwendet.
Die erhaltene Kultur wurde einem Separator zugeführt und bei 10 000 min" separiert. Die im Separator abgetrennte Bakterienmenge wurde unter aseptischen Bedingungen suspendiert. Die Suspension wurde bei 0,01 mm Hg während 20 Stunden gefriergetrocknet und das trockene Pulver in sterile Glasflaschen verpackt.
Die erhaltene Kultur wurde im Mikroskop mit Gramfärbung und nach dem Wachsen auf Tomatensaftagar, Hahrstoffagar und VRA-Agar überprüft. Die gefriergetrocknete Menge wurde zusätzlich durch Züchtungsversuche überwacht.
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Claims (6)

- 15 Patentansprache
1) Substanz zur Regulierung der Darmflora von Mensch und Tier, gekennzeichnet durch das Ergebnis einer Züchtung eines Stammes von Streptococcus faecium - hier als "Streptococcus faecium Cernelle 68" bezeichnet - «tae in einer wässerigen Nährlösung mit Kohlehydraten, einer Quelle für organischen Stickstoff sowie einer Quelle von Wachstumssubstanzen unter submersen anaeroben Bedingungen sowie anschließender Trennung der entstandenen Bakterienmenge von der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit und gegebenenfalls darauffolgenden Gefriertrocknens der i solierten Bakterienmenge.
2) Verfahren zur Herstellung einer Substanz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von "Streptococcus faecium Cernelle 68" in einer wässerigen nährlösung mit Kohlehydraten, einer Quelle organischen Stickstoffs und einer Quelle von Wachstumssubstanzen, unter submersen anaeroben Bedingungen gezüchtet und anschließend die entstandene Bakterienmenge von der so erhaltenen Züchtungsflüssigkeit getrennt sowie die abgetrennte Menge gegebenenfalls gefriergetrocknet wird.
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- 16 -
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur zwischen 34 und 4O0C sowie einem pH-Wert von 5,8 his 7,2 während einer Zeit von 10 bis 30 Stunden erfolgt.
4) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3,dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei 370C innerhalb etwa 16 Stunden erfolgt.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Zugabe von Ammoniumhydroxid eingestellt wird.
6) Verwendung der Substanz gemäß Anspruch 1 als Zusatz zum Putter zur Verbesserung des Wachstums von Haustieren, insbesondere Ferkeln und Kälbern.
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