DE2031759C3 - Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase und deren Verwendung - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase und deren VerwendungInfo
- Publication number
- DE2031759C3 DE2031759C3 DE2031759A DE2031759A DE2031759C3 DE 2031759 C3 DE2031759 C3 DE 2031759C3 DE 2031759 A DE2031759 A DE 2031759A DE 2031759 A DE2031759 A DE 2031759A DE 2031759 C3 DE2031759 C3 DE 2031759C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- asparaginase
- culture
- amino acid
- culture medium
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase durch
Kultivierung L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium sowie die
Verwendung der erhaltenen L-Asparaginase für pharmazeutische Mittel.
Das Enzym L-Asparaginase (3.5.1.1-L-Asparaginamidohydrolase nach der Nomenklatur der International
Enzyme Commission) wurde bereits aus zahlreichen tierischen und bakteriellen Kulturen gewonnen (vgl.
etwa R. E. Perterson, A. Ciegler, Applied Microbiology,
17 [1969], 929/930). Seine Antitumorwirkung wurde an
dem aus Meerschweinchenserum oder Bakterienkulturen von Escherichia coli oder Serratia marcescens oder
(vgl. die Patentanmeldung P 19 42 833.2) aus Bakterienkulturen der Gattung Erwinia, insbesondere Erwinia
carotovora, gewonnenen Enzym nachgewiesen, die normalerweise in komplexen Kulturmedien auftreten,
die Nährstoffquellen wie etwa Hefeextrakt oder Peptine enthalten.
L-Asparaginase dieser bakteriellen Herkunft wird zur Zeit für klinische Versuche zur Behandlung gewisser
Typen von Leukämie und disseminiertem Karzinom verwendet Die Nachfrage nach dem Enzym übersteigt
jedoch bei weitem die derzeitige Verfügbarkeit, da der
Erzeugung dieses Enzyms im technischen Maßstab ausgehend von E. coti und S. marcescens seine niedrige
Aktivität in den Kulturen dieser Bakterien und die mit seiner Isolierung verbundenen Schwierigkeiten entgegenstehen. .
Auf die Ermittlung der Bedingungen für eine Optimierung der Ausbeute an L-Asparaginase aus
verschiedenen Bakterien wurden große Anstrengungen verwandt. So wurde beispielsweise angegeben, daß die
Ausbeute an L-Asparaginase aus Escherichia coli dadurch gesteigert werden kann, daß die Bakterien auf
einem Kulturmedium wie etwa Getreideeinweichliquor mit hohem Aminosäuregehalt einschließlich einem
Gehalt von mindestens freier L-Glutaminsäure, freiem L-Methionin und freier Milchsäure in einer Menge von
typischerweise 6,5 mg/ml kultiviert werden (vgl. Roberts et al, J. Bact, 95 [1968J 2117-2123). Bakterien
der Gattung Erwinia liefern allgemein höhere Ausbeuten an L-Asparaginase als Escherichia coli (vgl. die
DE-Patentanmeldung P 19 42 833.2). Es wurde nun
festgestellt, daß diese Ausbeute etwa auf das Vierfache (auf 80 IU/ml gegenüber 24 IU/ml nach der Patentanmeldung P 19 42 833.2) gesteigert werden kann, wenn
die Bakterien in einem Medium kultiviert werden, das ergänzend mit hohen Konzentrationen von bis zu
30 mg/ml an Glutaminsäure, Threonin, Serin oder Asparaginsäure versetzt ist, ohne daß die Konzentrationen der übrigen Aminosäuren und anderen Nährbestandteile entsprechend gesteigert werden.
Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß die
Ausbeute an L-Asparaginase durch Zumischen von zumindest einer der Aminosäuren Asparaginsäure,
Threonin, Serin oder Glutaminsäure zu einer Kultur eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus in
einem geeigneten Kulturmedium stark erhöht werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultivierung eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus in einem
geeigneten Nährmedium ist mithin dadurch gekennzeichnet, daß zu diesem Medium zusätzlich eine
wirksame Menge von zumindest 3 mg/ml zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Serin, Threonin
oder Asparaginsäure zugegeben wird.
Die L-Asparaginase wird dann durch irgendein geeignetes zellzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der im einzelnen in der Patentanmeldung
P 19 42 900.6 beschriebenen Methode gewonnen.
Gehalt des Nährmediums an spezieller Aminosäure verstanden, der ausreicht, eine merkliche Verbesserung
der L-Asparaginaseausbeute der Kultur eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus verglichen mit
der Ausbeute bei Abwesenheit dieser wirksamen Menge herbeizuführen. Die minimale wirksame Menge hängt
jeweils vom gewählten Kulturmedium, den kultivierten Mikroorganismen und den Wachstumsbedingungen
sowie davon ab, ob die Kultivierung kontinuierlich oder diskontinuierlich bzw. absatzweise, in tiefen oder
flachen Kulturen usw. durchgeführt wird.
Für absatzweise Kultivierung wurde gefunden, daß typisch verbesserte Enzymausbeuten mit einem L-Asparaginase
erzeugenden Mikroorganismus erhalten werden, wenn das Kulturmedium während der diskontinuierlichen
Kultivierung durch zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise 12 bis 30 mg/ml
ergänzt wird. Diese Ergänzung des Kulturmediums kann in unterschiedlicher Weise erreicht werden.
Beispielsweise kanu die gesamte ergänzende Aminosäure vor der Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden
Mikroorganismus oder während einer anfänglichen Kultivierungsstufe zum Nährsubstrat hinzugefügt werden.
Alternativ kann eine relativ geringe, aber wirksame Menge Aminosäure kontinuierlich oder in Abständen
während einer gewünschten KultivieruDgsperiode zugegeben werden, wobei die Zugabegeschwindigkeit so
eingerichtet wird, daß sie etwa der Geschwindigkeit des Verbrauchs durch den Mikroorganismus entspricht Es
wurde gefunden, daß letztere Verfahrensweise nor- jo
malerweise höhere L-Asparaginaseausbeuten liefert; sie
wird daher bevorzugt, obgleich die Durchführung nicht ganz so bequem ist Eine dazwischenliegende Verfahrensweise,
bei der die Kultur zu Anfang p-.it Aminosäure versetzt und später mit weiterer Aminosäure ergänzt
wird, wenn die Geschwindigkeit der Zunahme der L-Asparaginase abnimmt kann in der Praxis auch von
Vorteil sein.
Bei kontinuierlicher oder fortlaufender Aminosäurezugabe zu der absatzweise kultivierten Kultur sollten
Zufuhrgeschwindigkeit und Gesamtzufuhr erfindungsgemäß derart eingerichtet werden, daß insgesamt
mindestens 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise etwa 12 bis 30 mg/ml zugegeben werden.
Obgleich Gehalte über etwa 30 mg/ml angewandt werden können, wird im allgemeinen dadurch kein
Vorteil erzielt; es wurde sogar gefunden, daß das Wachstum eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus
durch überschüssige Aminosäuregehalte ernstlich gehemmt werden kann. w
Bei kontinuierlicher Kultivierung, bei der Kulturmedium fortlaufend in ein L-Asparaginase erzeugende
Mikroorganismen enthaltendes Kulturgefäß eingeführt und L-Asparaginase von der kontinuierlich »geernteten«
bzw. abgezogenen Kultur abgetrennt wird, können γ,
verbesserte Ausbeuten erreicht werden, wenn ein Kulturmedium kontinuierlich zugeführt wird, das mit
zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium und vorzugsweise mit etwa 7 bis 20 mg/ml ergänzt wurde.
Bei einer solchen kontinuierlichen Kultivierung wird die hn
Aminosäure in dem damit versetzten zugeführten Kulturmedium entsprechend kontinuierlich verbraucht
und wieder ersetzt; die jeweilige Konzentration der Aminosäure in unmittelbarer Umgebung der wachsenden
Mikroorganismen kann daher ohne schädliche t» Wirkung zu irgendeinem Stadium des Verfahrens
beträchtlich unter die minimal erforderliche Konzentration im zugeführten Kulturmedium sinken.
Einige Kulturmedien, insbesondere komplexe Medien natürlichen Ursprungs wie von Hefeextrakt, können
geringe Mengen von einer oder mehreren der angegebenen Aminosäuren enthalten. Von derart
zufälligen, mehr oder minder vernachlässigbaren Gehalten herkömmlicher Kulturmedien unterscheidet sich
jedoch die Erfindung durch die gezielte, gegebenenfalls ergänzende Zugabe dieser Aminosäuren in wirksamen,
d. h. die L-Asparaginaseausbeute beachtlich steigernden. Mengen, die bedeutend höher liegen als die bisher
in solchen Medien natürlicherweise vorhandenen Mengen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die L-Asparaginaseausbeute — ausgedrückt in Internationalen
Einheiten pro ml Kultur — zwischen etwa 40 und 600% höher liegen als bei Verfahren, bei denen ein nicht
erfindungsgemäß ergänztes Medium unter sonst identischen Bedingungen verwendet wird. Die Steigerung der
Ausbeute rührt nicht allein von der Erhöhung der Zahl der Zellen der im ergänzten Kulturmedium gezüchteten
Mikroorganismen her, sondern auch von einer Zunahme der pro Zelle erzeugten L-Asparaginasemenge, was
bedeutet, daß die Enzymaktivität pro Zelle des Mikroorganismus und damit die vom Bakterium
erzielbare Enzymaktivität pro mg Protein (spezifische Aktivität) erhöht ist
Die angegebenen Aminosäuren können dem Kulturmedium in irgendeiner zweckmäßigen Form zugesetzt
werden. Wenn die Löslichkeit der Aminosäure in Wasser gering ist, wird diese häufig mit Vorteil in Form
eines Salzes oder Esterhydrochlorids zugegeben, das
innerhalb des Substrats die freie Aminosäure in Freiheit setzen kann. Unter diesen Bedingungen können
beträchtliche Mengen an Puffersubstanz zur Unterdrükkung freigesetzter Ionen sowie auch zur Aufrechterhaltung
des pH-Wertes im Kulturmedium auf einen für die Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus
geeigneten Wert erforderlich sein. Wenn beispielsweise Natrium- oder Kahtmsalze einer
der genannten Aminosäuren verwendet werden, kann Phosphorsäure als Puffer hinzugefügt werden. Die
maximale Grenze, bis zu der Aminosäurederivate erhöhte Enzymausbeuten ergeben, wird erreicht, wenn
der L-Asparaginase erzeugende Mikroorganismus infolge der erhöhten Pufferkonzentration nicht mehr
wachsen kann. So können in Anwesenheit von einigen Puffersubstanzen maximale Ausbeuten bei Zugabe von
bedeutend weniger als 3% (G/V) an zum Kulturmedium hinzugefügter Aminosäure erreicht werden.
Zu den L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismen gehören die Bakterien Escherichia coli und Serratia
macescens und bei bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung Pflanzenpathogene der Gattung Erwinia wie
Erwinia carotovora, Erwinia aroideae, Erwinia atrosepticaund
Erwinia chrysanthemi.
Geeignete Kulturmedien enthalten normalerweise eine organische Stickstoffquelle, obgleich chemisch
einfach definierte Medien, die Stickstoff in anorganischer Form und Kohlenstoffquellen wie Glucose,
Glycerin oder dergleichen enthalten, verwendet werden können. Die Kultivierung der zur Gattung Erwinia
gehörenden Bakterien wird üblicherweise in Mischung mit komplexen stickstoffhaltigen Medien initiiert, die
Peptone. Eiweißhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten; wenn jedoch das Wachstum in Gang
gekommen ist, kann das Kulturmedium durch allmähliche Verdünnung mit einem einfachen Medium und
Abzug des komplexen Mediums ausgetauscht werden.
bis die Bakterien praktisch im einfachen Medium wachsen. Zu den verfügbaren Medien, die beim
erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören Hefeextrakt, Getreideeinweichliquor,
Trypton, Erbseneinweichliquor, Fischmehl, Fleischmehl, Casein, Bouillonpulver, Malzextrakt, Sojabohnenmehl
und Getreidemehl.
Es wird angenommen, daß bestimmte handelsübliche Nährmedien wie beispielsweise einige Hefeextrakte
Spuren von einer oder mehreren der gewünschten Aminosäuren enthalten können, die aber durch die
üblichen Sterilisationsverfahren für Nährmedien zerstört
oder in der Mer.ge verringert werden. Es kann jedoch sein, daß die Menge an zuzufügender Aminosäure
bei Verwendung solcher Medien herabgesetzt werden kann; gemäß der Erfindung besteht ein weiteres
Merkmal des Verfahrens darin, daß zumindest ein Teil der wirksamen Menge an Aminosäure durch ein
Nährmedium geliefert wird, das merkliche Mengen, d. h.
mindestens 0,1 Gew.-%, der gewünschten Aminosäure enthält
Es wurde gefunden, daß die beachtlichen Steigerungen der L-Asparaginaseausbeute beim erfiridungsgemäßen
Verfahren mit den L-Isomeren der genannten Aminosäuren erhalten werden. Die D- oder DL-Isomeren
können jedoch beim erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls verwendet werden, obgleich im allgemeinen
die L-Isomeren sowohl billiger als auch bequemer erhältlich sind.
Bei bevorzugten Verfahrensweisen gemäß der jo
Erfindung ist die bevorzugte Aminosäure normalerweise L-Glutaminsäure, die im allgemeinen (wegen ihrer
geringen Wasserlöslichkeit) in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes in Verbindung mit einem geeigneten
Puffermittel wie Phosphorsäure zur Unterdrückung der freigesetzten Natrium- oder Kaliumionen verwendet
wird. Wenn beispielsweise das Kulturmedium beim diskontinuierlichen Verfahren ein komplexes Medium
ist, liegt der auf das Substrat bezogene optimale Zusatz an Natrium-L-glutamat, wie gefunden wurde, bei etwa
2% (G/V). Obgleich die prozentuale Konzentration an L-Glutaminsäure (Natriumsalz) über etwa 2% erhöht
werden könnte, kann dann die ebenfalls notwendige Erhöhung der Phosphorsäurekonzentration anfangen,
das bakterielle Wachstum nachteilig zu beeinflussen. Typischerweise kann bei einem absatzweisen Verfahren,
bei dem Erwinia carotovora unter Zumischung von Bierhefe-Autolysat gezüchtet wird, eine anfängliche
Zugabe von etwa 2% Natrium-L-glutamat zu einer etwa 5fach erhöhten L-Asparaginaseausbeute führen. Der
Zusatz von 7 bis 8 kg Natrium-L-glutamat zu 4001 mit Bierhefe-Autolysat versetzten Kulturmedium erhöht,
wie gefunden wurde, die L-Asparaginaseausbeute unter normalen Arbeitsbedingungen von 7 Enzymeinheiten/ml
auf 40 Enzymeinheiten/ml Kultur.
Bei kontinuierlicher Kultivierung wurde gefunden, daß typischerweise ein mit etwa 15% Natrium-L-glutamat
versetztes Nährmedium optimale L-Asparaginaseausbeuten liefert. Wenn beispielsweise ein Medium für
kontinuierliche Kultur mit etwa 5% Bierhefe-Autolysat «)
unter Zusatz von etwa 1,5% Natrium-L-glutamat verwendet wird, kann die Ausbeute an L-Asparaginase
80 ΙΕ/ml (Internationale Einheiten/ml) betragen.
Es folgen typische Beispiele füir die Gewinnung von
L-Asparaginase gemäß der Erfindung; diese erfindungs- tv",
gemäße Erzeugung wird mit gleichen Verfahren ohne Zusatz wirksamer Mi igen der genannten Aminosäuren
verglichen.
Beispiel 1
Kulturgefäß
Kulturgefäß
Die nachfolgend beschriebenen Versuche wurden in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus
rostfreiem Stahl mit einem Heizmantel und Einrichtungen zur Überwachung der Temperatur des Inhalts
durchgeführt.
Am oberen Ende und am Boden dieses Gefäßes waren Einlaßöffnungen für den Zutritt steriler Luft
vorgesehen. Der dicht verschließbare Deckel des Gefäßes hatte Einfüllöffnungen, durch die Antischaummittel,
Puffer, Impfmaterial und die Ergänzungszusätze zugeführt werden konnten. Der Behäherinhalt wurde
mit einem Rührer aus rostfreiem Stahl umgewälzt, ferner war ein pH-Kontrollgerät vorgesehen. Die
pH-Kontrolle konnte auf den erforderlichen pH-Wert eingestellt werden; bei einem Anstieg des pH-Wertes
während der Kultivierung konnte 3.2 m Phosphorsäure-Puffer mit Hilfe einer Peristaltikpumpe bei Bedarf
eingepumpt werden.
Herstellung der Impfkultur
150 ml gekochte Fleischbouillon nach Robertson wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von
Erwinia carotovora (N.GP.P.B 1066) geimpft und über Nacht (17 Stunden lang) bei 37°C inkubiert und bei 4°C
gelagert. Roux-Flaschenagarplatten (Kulturoberfläche
10 cm χ 20 cm; mit 2,4% »Oxoid-Agar Nr. 3« (getrocknetes hydrophiles, kolloidales Polysaccharid
aus Algen) verfestigte bzw. eingedickte Nährbouilion von 3% Trypton-Soyaagar-Körnern wurden mit 5 ml
Nährkultur geimpft und 12 Stunden lang bei 37° C inkubiert und wiederum für bis zu 4 Wochen bei 4° C
gelagert Unmittelbar vor Gebrauch wurden 4 Roux-Flaschen mit 50 ml destilliertem Wasser in eine
Keimflasche ausgespült und der Inhalt mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der Inhalt der Keimflasche
wurde zur Beimpfung von 151 eines sterilen Mediums (525 g helles Bierhefe-Autolysat, 3,5%) verwendet,
das vor der Sterilisierung auf pH 6,8 bis 7,0 gebracht und vor der Verwendung auf 37° C vorgewärmt
worden war. Die Inkubation erfolgte bei 37° C über 12 Stunden in einem Wasserbad unter Belüftung
mit 12 l/min durch ein Einleitungsrohr von 0,64 mm lichter Weite und führte zu einer Impfkultur in einer für
die Zugabe zu sterilen Kulturmedien in Kulturgefäßen geeigneten Form.
Herstellung des Kulturmediums
Das Kulturmedium wurde in folgender Wdse hergestellt: 163 kg Bierhefe-Autolysat wurden in 501
heißem Leitungswasser gelöst, gerührt und in in einem
sterilen Kulturgefäß enthaltenes Leitungswasser überführt, wobei auf 369 I aufgefüllt wurde. Zur Einsteilung
des pH-Wertes auf 6,8 bis 7 wurde Sodalösung (0,3 I;
10 n) gegeben. Das Medium wurde unmittelbar darauf durch 30 Minuten langes Rühren bei 121°C sterilisiert,
wobei die Temperatur mit Hilfe eines Dampfmantels oder durch Einblasen von Dampf kontrolliert wurde.
Das Medium wurde dann abgekühlt, wobei rler Druck im Gefäß durch Einlaß von steller Luft über
Atrnosphärendruck gehalten wurde. Nach Einstellung der Temperatur auf 37°C und des pH-Werts auf 6,8 bis
7,0 wurde eine Af.tischaummittelzufuhr angeschlossen. Das Antischaummittel bestand aus einer 25vol.-%igen
wäßrigen Silikonemulsion, die unter Druck gesetzt und aseptisch über den Deckel des Kulturgefäßes zugeführt
wurde. Der Druck im Kulturgefäß wurde dann abgelassen, worauf dem Medium durch das Einlaßrohr
am Boden des Kulturgefäßes 10 l/min sterile Luft zugeführt wurden. Das Medium wurde mit einem
Flügelrührer mit einer Geschwindigkeit von 385 LJ/niiii
umgewalzt.
Erzeugung von L-Asparaginasc
15 ί Impfflüssigkeit wurden dann durch den Einlaß im
Gefäßdeckel in das Kulturgefäß eingebracht. Die pH-Kontrolle wurde auf einen pH-Wert von 6.8 bis 7
und die Temperaturregelung auf 370C eingestellt. Der
Ablauf des Verfahrens wurde durch Messung der Geschwindigkeit der Kohlendioxideiuwicklung und mit
Hilfe von Enzymtests verfolgt.
Die Ergebnisse der Tests des En/ymgeh.iltes /eigen,
daß die Enzymausbeute (gemessen in IL/tnl Kultur)
nach etwa 8 Stunden in diesem nicht ergänzten Medium konstant bleibt. Bei Erreichen dieses Stadiums wurden
pH- und leiiiperaturrcgelung .ibi:. (.haltet und die
Luftzufuhr zum sterilen Abschluß an das obere Ende des Kulturgefäßes verlegt. Es wurde weiter geruh" u'id die
Kultur in etwa einer Stunde durch t.■ m!a>i'" >■· η .«.uliem
Wasser durch den Doppelmatitel auf M ( ah^-.-kuhh.
Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der zeilKiitig··
Bodensatz in einen Mixer ubeiluhri F-. ι η Pud ι .hi.
1OmM Tris-lfCI. 3OmM Natriumc'ilm I und . n\
Äthylendiamintetraessigsäure von [ill 7.'' :ιηιι 2 I
wurde mit dem Zellschlamm in einer MoH6C '.on 1 I
Puffer je I kg Zellschlamm vermischt. Aus der resultierenden gepufferten Mischung wurde die 1 -'.spa
raginase dann nach dem in der Patentanin·.. n..int'
P H 42 900.6 angegebenen Verfahren isoliert. Im Prinzip
umfaßt dieses Verfahren die Lyse der /eilen mit starkem Alkali, Zentrifugieren und eine Salzfällung in
der überstehenden Flüssigkeit zur Isolierung des Enzyms.
Die Ergebnisse für 7 Kulturen sinrl in tier nachfolgenden
Tabelle I zusammengefaßt.
(icwonnene Menge | Zeüschlamm | H5PO4 | Zellcrcmc | L-Asparaginaseaktivität | CO:·) | Creme | Troekcnge«. |
(I) | (Mega-Einheiten) | (%) | 3,50 | ||||
(I) | (kg) | 2.4 | (I) | Kultur | 1.6 | 3,05 | (g/l) |
375 | 3.91 | 1,65 | 6.81 | 3.42 | 1.5 | 3.92 | 2,80 |
355 | 3.52 | 2.4 | 6,18 | 2.80 | 1.6 | 3.46 | 2.72 |
375 | 4,45 | 2.4 | 7,76 | 4.08 | 1,6 | 1,79 | 2,90 |
390 | 4,34 | 1,08 | 7,56 | 2.70 | 1,5 | 3,32 | 2,95 |
380 | 3,09 | 2.34 | 5,55 | 1,54 | 2,0 | 3,85 | 2.10 |
390 | 4,14 | 2,50 | 7,21 | 3,10 | 2,25 | 3.98 | 3.0 |
380 | 4,08 | 2,40 | 7,21 | 3.05 | 2.3 | 3,52 | 2.9 |
355 | 4.22 | 2,40 | 7.43 | 3.00 | 1,7 | 4.29 | 3,14 |
360 | 4,11 | 2,45 | 7,13 | 3.19 | 2,3 | 2.96 | |
375 | 4.20 | 7.40 | 3,75 | max. | 2,37 ( | ||
Tabelle 1 (Fortsetzung) | |||||||
Gewonnene Menge | Antischaummittel | (g/l) Stickstoffgehalt | |||||
(I) | (1) | in Medium i | |||||
375 | 0,2 | 2.30 | |||||
355 | 0,93 | 2,01 | |||||
375 | 0.50 | 2,21 | |||||
390 | 0,55 | 2,09 | |||||
380 | 1.25 | 2,21 | |||||
390 | 0,15 | 2,13 | |||||
380 | 0,15 | 2,21 | |||||
355 | 0.36 | 2,55 ; | |||||
360 | 0,80 | 2,46 : | |||||
375 | 0,200 | 2,42 ; | |||||
Ciesamt- | |||||||
TrnckengLuicht | |||||||
1,05 | |||||||
5,97 | |||||||
1,09 | |||||||
.15 | |||||||
3.80 | |||||||
.17 | |||||||
1,10 | |||||||
,14 | |||||||
,07 | |||||||
),89 | |||||||
η der übersteh. Fl | |||||||
,90 | |||||||
.74 | |||||||
,96 | |||||||
1,89 | |||||||
,93 | |||||||
,85 | |||||||
,93 | |||||||
>,04 | |||||||
!,02 | |||||||
!,07 |
Mittlere Enzym-Aktivitäten
In der Kultur
bezogen auf das Trockengewicht (TG)
bezogen auf Protein unter der Annahme, daß das Protein
70% des TGs ausmacht
*) Peak-Ablesung am CCh-Analysator im abgehenden Luftstrom.
- 8,2 IE/ml
- 2,9 ΙΕ/mg trockene Zellen
- 4.1 ΙΕ/mg Protein
Wie man sieht, wird eine mittlere L-Asparagiruise-Aktivität
von 82 IF pro ml Kultur oder von 2.9 IF./mg
der trockenen Zellen erhalten. Nimmt man an. daß 70% des Gewichts der trockenen Zellen durch Protein
gebildet werden, so liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität
bei 4.1 ΙΕ/mg Protein.
7 Kulturchargen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch unter Zugabe von 6,5 bis 8 kg
Natrium-L-glutamat-monohydrat. das als Lösung in 40 I Wasser zum Kulturmedium vor dem Auffüllen auf 369 I
10
hinzugegeben wurde.
In dem so ergänzten Medium wurden zwei Hauptwachstumsphasen
beobachtet, von denen die erste, einem Wachstum in 4,5% Bierhefe-Autolysat entsprechende
nach 5 bis 6 Stunden und die zweite nach etwa 18 bis 22 Stunden einen Peak bei der Kohlendioxidentwicklungsgeschwindigkeit
ergab. Nach Abfall der Kohlendioxidentwicklung hinter dem zweiten Peak nach 20 bis
25 Stunden Wachstum wurde die Kultur in der gleichen Weise aufbereitet, wie bereits für das nicht ergänzte
Medium beschrieben wurde.
Die Ergebnisse für diese 7 Kulturen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Gewonnene | Zellschlamm | H1PO4 | Zetlcreme | I | (I) | L-Asparaginase-Aktivitiit Einheiten | Kultur | 41,4 | pro mg | Trocken | Gesanit- |
Menge | 18,9 | iiMega-Einheiten) | Creme pro ml | 40,0 | trock. | gewicht | Trocken- | ||||
18,3 | 40,0 | Zellen | gewicht | ||||||||
21,7 | Kultur | 13,9 | 41,1 | 4,6 | |||||||
(I) | (kg) | (I) | 19,6 | 13,4 | 50,6 | 4,7 | (g/l) | (kg) | |||
400 | 10,21 | 21,4 | 16,6 | 11,7 | 46,8 | 4,7 | 9,04 | 3,62 | |||
385 | 10,26 | 20,1 | 15,4 | 13,7 | 51,9 | 5,0 | 8,61 | 3,31 | |||
420 | 11,08 | 19,6 | 16,8 | 18,4 | 6,4 | 8,46 | 3,55 | ||||
400 | 11,58 | 16,4 | 16,1 | Stickstoffgehalt (g/l) | 5,5 | 8,34 | 3,34 | ||||
406 | 11,91 | Antischaum | 20,5 | 15,8 | im Medium in der | 6,4 | 7,95 | 3,23 | |||
4OC | 12,06 | mittel | 18,7 | steh. | 8,49 | 3,40 | |||||
400 | 11,40 | 20,8 | bei der | 8,12 | 3,25 | ||||||
Tabelle 2 (Fortsetzung) | Gewinnung | über | |||||||||
Gewonnene | (I) | - Alter | Gebrauchtes | End-Glutamin- | |||||||
Menge | Flüssigkeit | Na-L-glut- | säuregehalt | ||||||||
(h) | amat-mono- | ||||||||||
hydrat | |||||||||||
(D | (kg) | (mg/1) | |||||||||
400
385
420
400
406
400
400
385
420
400
406
400
400
17,35 | 0,25 |
14,00 | 0,38 |
13,15 | 0,35 |
11,75 | 0,38 |
14,60 | 0,70 |
14,25 | 0,55 |
14,15 | 1,68 |
25
21
24
23
20
22,5
21 4,42
3,79
3,81
3,89
3,75
4,00
3,90
3,79
3,81
3,89
3,75
4,00
3,90
4,39
2,78
3,82
3,93
3,67
3,92
3,68
2,78
3,82
3,93
3,67
3,92
3,68
8,00
6,50
7,00
7,00
7,25
7,25
7,25
6,50
7,00
7,00
7,25
7,25
7,25
40 40 20 40
Mittlere Enzym-Aktivitäten
In der Kultur
bezogen auf Trockengewicht (TG)
bezogen auf Protein unter der Annahme, daß das Protein
70% des TGs ausmacht
- 44,5 IE/ml
- 5,3 ΙΕ/mg trockene Zellen
- 7,6 ΙΕ/mg Protein
Wie man sieht, liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität
bei 443 ΙΕ/ml Kultur oder 53 IE pro mg trockene
Zellen. Wenn man wiederum annimmt daß der Proteingehalt 70% des Trockengewichtes ausmacht, so
liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei 7.6 I E/mg Protein.
Die Ausbeute pro ml Kultur wird also durch die Erfindung um einen Faktor von mehr als 5 verbessert
Eine Kultur von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066) wurde in 43% Bierhefe-Autolysat mit Zusatz von 63 kg
Natrium-L-glutamat-monohydrat wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet Enzymtests während des
Wachstums ergaben die in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengefaßten Ergebnisse.
Π | 20 31 759 | Zusatz von 3,2 m | 12 | % COi im | |
1-1.,1'O4 | Kulturabgas | ||||
Tabelle 3 | Bakterien- | ||||
Alter der | Trocken- | L-Asparuginase L-As- | |||
Kultur | gewicht | paragi- | |||
nase | (I) | ||||
(I H /mg | Null | 0,10 | |||
(mg/ml) | trock. | Null | 0,10 | ||
(h) | (H'/ml! /eilen) | Null | 0,18 | ||
O | Null | 0,55 | |||
I | 0,45 | 1,30 | |||
2 | 1,40 | 1,35 | |||
3 | 7,10 | 0.80 | |||
4 | 2,20 | 0,60 | |||
5 | 2,70 | 2,20 | 0,55 | ||
6 | 7,3 7,1 | 2,75 | 0,60 | ||
7 | 3,50 | 0,65 | |||
8 | 3,88 | 0,60 | |||
9 | 4,25 | 0,60 | |||
10 | 4,80 | 0,70 | |||
11 | 3,84 | 5,15 | 0,85 | ||
12 | 12,9 3,4 | 5,90 | 1,05 | ||
13 | 7,40 | 1,35 | |||
14 | 8,90 | 1,85 | |||
15 | 10,40 | 2,05 | |||
16 | 12,15 | 1,95 | |||
17 | 7,47 | 13,45 | 1,50 | ||
18 | 34,0 4,6 | 14,00 | 0,50 | ||
19 | |||||
20 | 8,61 | ||||
21 | 40,0 4,6 | ||||
Die ausgeprägte Abnahme der Kohlendioxidentwick-
in der Nähe des Endes einer Wachstumsperiode befindet; obgleich nach diesem Stadium noch ein
leichtes Weiterwachsen beobachtet wird, findei prak-
*icr*K Uoine iiieitara Ctpiffonin»» Aar- I . Λ rno t-i n\ η ο roe \m
..«. _ Μ.·.ον. o __. — . ._, _o..._ j..
these statt.
Die L-Asparaginaseausbeuten von 20 1 Kulturen von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066) — gezüchtet in
Bierhefe-Autolysat mit und ohne Ergänzungszusatz und nach 20 Stunden aufbereitet — wurden bestimmt. Sie
sind in der nachfolgenden Tabelle 4 wiedergegeben. Da das eingesetzte Bierhefe-Autolysat nach Angabe bis zu
6,5% L-Glutaminsäure enthält, ist der tatsächliche Glutaminsäuregehalt der Nährlösung höher als bei
einem aminosäurefreien Nährmedium. In der nachfolgenden Tabelle 4 wird daher eine geschätzte Glutaminsäure-Gesamtkonzentration
angegeben.
Tabelle 4 | Zugesetztes Natriumglutamat Ch) |
Korrigierter Glutaminsäure gehalt |
L-Asparaginase pro ml Kultur (IE) |
mg trock. Zellen pro ml (IE) |
L-Asparaginase (IE) pro mg trock. Zeller |
Zugesetztes Bier hefe-Autolysat (%) |
0,28 0,34 kein Zusatz |
0,45 0,55 0,29 |
Ii,I 16,7 8,2 |
3,2 4,0 2.8 |
3,5 4,2 2.9 |
3,5 4,3 4,5 |
|||||
Der L-Asparaginascgehalt und Glutaminsäuregehalt
der in 3 V>k Bierhefe-Autolysat unter Zusatz von 0.28% Natriuni-L-glutamat-monohydrat gezüchteten Kultur
wurde während des Wachstums zu verschiedenen Zeiten bestimmt. Die erhaltenen Werte sind in der
nachfolgenden Tabelle 5 wiedergegeben.
4h
h
12h
16h
20 h
L-Asparaginase (IE/ml) Glutaminsäure (%)
0,15
5,8 | 6,8 | 9,9 | 11,1 |
0,14 | 0,09 | 0.02 | Spuren |
«0,005 |
.Wie man diesen Ergebnissen entnimmt, wird die beträchtliche, vor dem Wachstum vorhandene Menge
L-Asparaginasebildung durch den Zusatz von L-Gluta- Glutaminsäure während der ersten 4 Stunden verloren-
mat verstärkt und hält weiter ;an, bis das Glutamat >o geht, was wahrscheinlich auf eine Zersetzung während
verbraucht ist. Es wird ebenfalls deutlich, daß eine der Sterilisation des Kulturmediums zurückzuführen ist.
Eine Kultur von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066)
wurde in kontinuierlicher Kultur in einem Gerät für kontinuierliche Kulturen vom »Portionstyp« gezüchtet,
wie es von Herbert, Phipps jnd Tempest (Laboratory practice, 1965, 14, 1150-1161) beschrieben wurde. Die
mit Rührer versehene Vorrichtung (Rührfermenter) war mit einer automatischen Einrichtung zur Kontrolle von
Temperatur und pH-Wert ausgerüstet, die bei 370C
bzw. pH 7,0 gehalten wurden. Als Kulturmedium wurde 5% Bierhefe-Autolysat allein oder mit Zusatz verschiedener
Mengen L-Glutaminsäure verwendet. Die Herstellung des Kulturmediums und der Impfkulturen
erfolgte in gleicher Weise wie bei den vorangehenden Beispielen.
Nach Beimpfen des im Gerät enthaltenen Kulturmediums und anfänglich absatzweiser Züchtung der Kultur
fh l h
Jj
Gang gesetzt. Die Verdünnungsrate D. d. h. f/v, wobei /
die Strömungsgeschwindigkeit (l/h) und ν das Kulturvolumen (1) ist, wurde einige Tage lang bei D=OJh1
konstantgehalten, bis Gleichgewichtsbedingungen erreicht waren, wie durch die Konstanz des Bakterientrokkengewichts
und des Gehalts an L-Asparaginase bei wiederholten Proben festgestellt wurde. Das Kulturmedium
wurde dann mit 0.5% L-Glutaminsäure ergänzt und ein neues Gleichgewicht eingestellt. Weitere
Zusätze für Gehalte von 1% und 1,5% L-Glutaminsäure wurden vorgenommen und für entsprechende Gleichgewichtseinstellungen
gesorgt. Die Ergebnisse (bestimmt wurden das Bakterientrockengewicht und der L-Asparaginasegehalt)
für dk jeweiligen Gleichgewichtszustände sind in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.
Zufließendes Kulturmedium | Bakterien- Trockengewicht |
L-Asparaginase | IE/mg |
(mg/ml) | (IE/ml) | ||
5% Bierhefe-Autoiysiit | 2,6 | 24 | 9,2 |
5% Bierhefe-Autoiysiit + 0,5% L-Glutaminsäure |
5,5 | 48 | 8,7 |
5% Bierhefe-Autolysat +1,0% L-Glutaminsäure |
8,0 | 62 | 7.8 |
5% Bierhefe-Autolysat +1,5% L-Glutaminsäure |
9,7 | 80 | 8,3 |
Absatzweise Kulturen von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066) wurden in einem Bierhefe-Autolysat
enthaltenden Medium mit bzw. ohne Zugabe von ergänzender Aminosäure kultiviert. Die resultierenden
Asparaginaseausbeuten sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
15
Tabelle 7 | Asparaginaseausbeute |
Kulturmedium | (IE/ml) |
6,7 | |
5% Bierhefe-Autolysat | 10,7 |
5% Bierhefe-Autolysat | |
+1% Serin | 16,1 |
5% Bierhefe | |
+1% Asparaginsäure | 20,2 |
5% Bierhefe-Autolysat | |
+1% Glutaminsäure | |
In den vorangehenden Beispielen wurde ein bei der National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,
England, unter der Nummer N.CP.P.B. 1066 hinterlegter
Stamm von Erwinia carotovora verwendet, da diese Spezies eine besonders hohe spezifische Wirksamkeit
(d. h. ein besonders hohes Verhältnis von enzymatischer
Aktivität btzogen auf mg erzeugtes Protein) liefert.
Andere Bakterien der Gattung Erwinia, die b^m
erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wurden, sind:
etwa 6 und 8 durchgeführt Die Bakterien werden üblicherweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet, sie
können jedoch auch unter geeigneten Umständen unter anaeroben Bedingungen gebildet werden.
Die gemäß der Erfindung von Bakterien der Gattung
Erwinia erzeugte und wie in der Patentanmeldung P 19 42 900.1 beschrieben gewonnene und gereinigte
L-Asparaginase bildet ein Produkt, dss nach der
Nomenklatur der International Enzyme Commission als 3.5.1.1-L-Asparagin-amidohydrolase bezeichnet wird,
aber in seinen Eigenschaften bedeutend von bislang bekannten L-Asparaginasen abzuweichen scheint, die
sich beispielsweise von Escherichia coli ableiten. Die Aminosäurebestimmung bei Proben von L-Asparaginase von E coli ergab im Vergleich mit Proben, die
ausgehend von Erwinia carotovora erhalten wurden, folgende Ergebnisse:
Erwinia aroidea Erwinia aroidea Erwinia atroseptica
Erwinia carotovora erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia carotovora
Erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia caroiovora
Erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia carotovora Erwinia carotovora
Erwinia chrysanthemi
N.CP.P.B. 1274 N.CP.P.B. 1380 N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B.
N.C.P.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. N.CP.P.B. 1065 N.CP.P.B. 1120
N.CP.P.B. 1280 N.CP.P.B. 1281 N.CP.P.B.
JO
}5
Bakterien anderer Gattungen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind:
Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli
Escherichia coli Escherichia coli Serraiiä mafcescens
Serratia marcescens Serratia marcescens Serratia marcescens Serratia marcescens
Serratia marcescens
A.T.C.C 11303 M.R.E M.R.E. N.C.T.C 8164 N.C.T.C. 8 J
N.C.T.C 9001 N.CI.B. 1377 N.C.I.B. 4612 N.CI.B. 8266
N.CI.B. 8889 N.C.I.B. 9155 M.R.E. UK/8
30
A.T.CC. - American Type Culture Collection, USA. M.R.E. » Microbiological Research Establishment.
Salisbury, England, N.CI.B. - National Collection of Industrial Bacteria,
Aberdeen, Scotland. N.CP.P.B. - National Collection of Plant Palhogcnic
Bacteria. England. N.C.T.C. =■ National Colleclion of Type Cultures.
USA.
Das erfinüungsgemäße Verfahren wird normalerweise bei Temperaturen zwischen 10 und 400C, vorzugsweise bei 25 bis 35°C, und einem pH-Wert zwischen
Aminosäure | Escherichia coli | Erwinia carotovora |
Asp | 180 | 131 |
Thr | 120 | 89 |
Ser | 60 | 64 |
GIu | 84 | 80 |
Pro | 48 | 49 |
GIy | 108 | 123 |
AIa | 120 | 105 |
VaI | 120 | 98 |
Cys | 6 | 2 |
Met | 24 | 33 |
He | 48 | 61 |
Leu | 84 | 104 |
Tyr | 54 | 48 |
Phe | 36 | 27 |
Lys | 84 | 67 |
Nis | 12 | 25 |
Arg | 36 | 68 |
Trp | 12 | 0 |
Ebenso gab die vergleichende Bestimmung der isoelektrischen Punkte durch isoelektrische Fokussierung unterschiedliche Werte, und zwar wurde ein Wert
von etwa pH 5,2 für Präparate aus E. coli und von etwa
pH 8,5 für Präparate ausgehend von Er. carotovora gefunden. Weiter lagen die Glutaminase-Aktivitäten bei
2 bis 3% der Asparaginase-Aktivität für E. coli und bei 5 bis 7% für Er. carotovora. Darüber hinaus sind die
beiden Asparaginasen serologisch deutlich voneinander verschieden. Mit den jeweiligen Präparaten erhaltene
Antisera sprechen nicht auf die andere Asparaginase an, Der klinische Nutzen, der daraus gezogen werden kann
besteht darin, daß in Fällen, in denen die Behandlung mil einer Asparaginase zur Ausbildung einer Überempfindlichkeit (allergische Reaktion) führt, die Behandlung mit
der zweiten Asparaginase fortgeführt werden kann. Die Molekulargewichte der von Erwinia abgeleiteten
Asparaginase liegen normalerweise zwischen etwa 130 000 und 150000.
Die Behandlung von Leukämie und disseminierter Karzinomen erfolgt üblicherweise durch Injektion vor
L-Asparaginase in Form einer physiologischen Lösung wie physiologischer Salzlösung, obwohl unter gewissen
Umständen orale Verabreichungen möglich sein können. Eine typische Lösung für iniravenöse Injektionen
enthält 15 mg L-Asparaginase pro ml physiologischer
Salzlösung. Typische Dosierungen liegen zwischen etwa 0,05 und 5.0 mg pro kg Körpergewicht der behandelten
Person.
030 265/4'
Claims (9)
1. Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase
durch Kultivierung L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen der Gattung Erwinia in einem
geeigneten Nährmedium und Zerstörung zumindest eines Teils der resultierenden Bakterienzellen zur
Freisetzung der L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß diesem Medium zusätzlich
eine wirksame Menge von zumindest 3 mg/ml zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure,
Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der Gattung
Erwinia Erwinia carotovora oder Erwinia aroidea ist.
3. Verfahren nach Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung diskontinuierlich durchgeführt und das Kulturmedium mit 12 bis
30 mg Aminosäure pro mi Kulturmedium versetzt wird.
4. Verfahren -nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Aminosäuremenge dem Kulturmedium vor Beginn der
Kultivierung oder in einem frühen Kultivierungsstadium oder auch kontinuierlich oder in gewissen
Abständen während der Kultivierung zugegeben wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung
kontinuierlich durchgeführt und das Kulturmedium mit 7 bis 20 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium
versetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, a
dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Form eines Salzes oder Ester-hydrochlorids zugegeben wird, das innerhalb des Kulturmediums freie
Aminosäure freisetzen kann, insbesondere als Natrium- oder Kaliumsalz.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines
Aminosäuresalzes wie des Natrium- oder Kaliumsalzes Phosphorsäure als Puffer zugegeben wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 7. dadurch gekennzeichnet, daß die L-Isomeren der
Aminosäuren verwendet werden.
9. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche erzeugten L-Asparaginase für
pharmazeutische Mittel mit insbesondere antileukämischer Wirkung oder einer Wirksamkeit gegen
disseminierte Karzinome, insbesondere in Form einer physiologischen Salzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein pro ml Lösung.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB3255469 | 1969-06-27 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2031759A1 DE2031759A1 (de) | 1971-01-07 |
DE2031759B2 DE2031759B2 (de) | 1980-05-14 |
DE2031759C3 true DE2031759C3 (de) | 1981-01-29 |
Family
ID=10340428
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2031759A Expired DE2031759C3 (de) | 1969-06-27 | 1970-06-26 | Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase und deren Verwendung |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS4911079B1 (de) |
AT (1) | AT308033B (de) |
BE (1) | BE752607A (de) |
CA (1) | CA949479A (de) |
CH (1) | CH544148A (de) |
DE (1) | DE2031759C3 (de) |
DK (1) | DK127438B (de) |
FR (1) | FR2051410A5 (de) |
GB (1) | GB1314530A (de) |
IE (1) | IE34343B1 (de) |
NL (1) | NL169500C (de) |
-
1969
- 1969-06-27 GB GB3255469A patent/GB1314530A/en not_active Expired
-
1970
- 1970-06-25 DK DK330570AA patent/DK127438B/da not_active IP Right Cessation
- 1970-06-26 DE DE2031759A patent/DE2031759C3/de not_active Expired
- 1970-06-26 NL NLAANVRAGE7009490,A patent/NL169500C/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-06-26 CH CH971870A patent/CH544148A/de not_active IP Right Cessation
- 1970-06-26 FR FR7023885A patent/FR2051410A5/fr not_active Expired
- 1970-06-26 IE IE835/70A patent/IE34343B1/xx unknown
- 1970-06-26 CA CA086,603A patent/CA949479A/en not_active Expired
- 1970-06-26 BE BE752607D patent/BE752607A/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-06-26 JP JP45055571A patent/JPS4911079B1/ja active Pending
- 1970-06-29 AT AT584770A patent/AT308033B/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL7009490A (de) | 1970-12-29 |
CA949479A (en) | 1974-06-18 |
NL169500C (nl) | 1982-07-16 |
IE34343B1 (en) | 1975-04-16 |
JPS4911079B1 (de) | 1974-03-14 |
GB1314530A (en) | 1973-04-26 |
AT308033B (de) | 1973-06-25 |
IE34343L (en) | 1970-12-27 |
CH544148A (de) | 1973-11-15 |
DK127438B (da) | 1973-11-05 |
FR2051410A5 (de) | 1971-04-02 |
DE2031759A1 (de) | 1971-01-07 |
DE2031759B2 (de) | 1980-05-14 |
BE752607A (fr) | 1970-12-01 |
NL169500B (nl) | 1982-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3891417C5 (de) | Verfahren zur Veränderung eines L-Threonin produzierenden Mikroorganismus und Verwendung eines so erhaltenen Mikroorganismus zur Herstellung von L-Threonin | |
DE2010654C3 (de) | Normalisierung der Darmflora von Mensch und Haustier | |
DE2444849C2 (de) | Verfahren zur Herstellung organischer Säuren durch biologische Hydrolyse | |
DE2314984C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat mit hohem Gehalt an freien Aminosäuren und dessen Verwendung als Würze oder Lebensmittelzusatz | |
DE2208279A1 (de) | Enzymatischer Abbau von Nucleinsäuren in SCP Materialien | |
WO1988007580A2 (en) | Biophysically derived ascomycetes, schizomycetes and yeast preparation, process for the manufacture thereof and fodder and plant hormones containing this preparation, and use of the preparations for skin treatment and probiotic activation | |
DE2031759C3 (de) | Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase und deren Verwendung | |
EP0290716A2 (de) | Verfahren zur Konservierung von Geflügel- und Frischfleischprodukten mit Hilfe eines bakterienlysierenden Enzymprodukts aus Streptomyceten | |
Wyss et al. | Mutants of Azotobacter that do not fix nitrogen | |
DE1942833C3 (de) | Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel | |
DE2363285B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure aus Fumarsäure | |
DE2554407A1 (de) | Herstellung thermostabiler lactase | |
DE3539702A1 (de) | Bakteriolytisches enzym und verfahren zu seiner herstellung | |
DE1493442A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Alanin auf enzymatischem Wege | |
DE2051945C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit etwa gleich großer Glutaminase- und Asparaginase-Aktivität | |
RU2333948C2 (ru) | Питательная среда для выращивания возбудителя туляремии | |
DE2366505C2 (de) | Verwendung des Stammes Pseudomonas ATCC 21973 zur in situ-Herstellung einer Aminotransferase | |
EP0014364A2 (de) | Verfahren zum mikrobiologischen Abbau von Acrylnitril in wässrigen Dispersionen | |
CH505200A (de) | Verfahren zur Herstellung von Primycin | |
DE1171559B (de) | Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten von Brucella abortus | |
DD154367A1 (de) | Verfahren zur herstellung von biomasse fuer die impfstoffproduktion | |
DE1202240B (de) | Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsaeure | |
DE909985C (de) | Wachstumsfoerdernder Zusatz zu Naehrloesungen bei der biologischen Herstellung von Penicillin | |
DE2659878B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase | |
EP0211014B1 (de) | Verfahren zur submersen züchtung von pseudomonas aeruginosa-bakterienstämmen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OGA | New person/name/address of the applicant | ||
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |