DE1942833C3 - Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel - Google Patents

Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel

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DE1942833C3 DE1942833A DE1942833A DE1942833C3 DE 1942833 C3 DE1942833 C3 DE 1942833C3 DE 1942833 A DE1942833 A DE 1942833A DE 1942833 A DE1942833 A DE 1942833A DE 1942833 C3 DE1942833 C3 DE 1942833C3
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel.
Das Enzym L-Asparaginase (3,5,1,1-L-Asparaginamidohydrolase in der Nomenklatur der Internationalen Enzym-Kommission 1961) hat, falls es von bestimmten Ausgangssubstanzen abgetrennt wird, eine Antitumorwirkung und bietet sich als neue, erfolgversprechende Therapie für einige Formen von Leukämie und ausgebreitetem Krebs (Metastasen) an (vgl. zum Beispiel Hill et al. in »J. A. M. A.« 1967, 202, Nr. 9, S. 116). Die Antitumorwirkung wurde zuerst in Meerschweinchenserum entdeckt, später auch in Kulturen der Bakterien Escherichia coli und Serratia marcescens.
L-Asparaginase wird normalerweise kommerziell durch Abtrennung aus Kulturen Escherichia coli gewonnen. Die kommerzielle Herstellung wird jedoch durch den relativ geringen Wirkungspegel von L-Asparaginase in diesen Kulturen beeinträchtigt, so daß L-Asparaginase nur in sehr geringen Mengen verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung dieses Enzyms sehr erschwert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase zu entwickeln, bei dem die eingesetzten Bakterien eine größere Ausbeute an medizinisch brauchbarer L-Asparaginase als die bekannten Bakterien Escherichia coli und Serratia marcescens liefern, und die so erzeugte L-Asparaginase als therapeutisches Mittel zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung, womit diese Aufgabe
ίο gelöst wird, ist zunächst ein Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, gemäß dem man Bakterien in einem Nährmedium aerob züchtet mindestens einen Teil der entstandenen Bakterienzelien zwecks Freisetzens der L-Asparaginase aufbricht und die freigesetzte L-Asparaginase isoliert, mit dem Kennzeichen, daß man Bakterien der Gattung Erwinia einsetzt
Vorzugsweise setzt man Bakterien einer der Arten Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia aroideae und Erwinia atroseptica ein.
Die Bakterien der Gattung Erwinia sind an sich als pathogen für Pflanzen bekannt Die L-Asparaginase wird aus Bakterien dieser Gattung isoliert indem man die Bakterien auf einem geeigneten Nährboden züchtet bis sie in einer gewünschten Menge vorliegen, und anschließend die L-Asparaginase entweder nach üblichen Zellzerreißverfahren oder nach einem Verfahren abtrennt wie es in der am gleichen Tag eingereichten deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6-41 beschrieben ist
Vorzugsweise züchtet man die Bakterien in einem flüssigen Nährmedium.
Die Temperatur wird beim Züchten vorteilhaft im Bereich von 10 bis 40° C gehalten.
Der pH-Wert des Nährmediums wird vorzugsweise im Bereich von 6 bis 8 gehalten.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem L-Asparaginase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung auch ein Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs bei Lebewesen, mit dem Kennzeichen, daß es aus einer Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 9 in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung besteht.
Die Enzymwirkung der Erwinia-Arten, insbesondere von Stämmen der Art Erwinia carotovora, ist oft sehr hoch und kann bedeutend höher als die Enzymwirkung von L-Asparaginase sein, die aus den bisher verwendeten Ausgangssubstanzen gewonnen wird.
so Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die L-Asparaginase aus Bakterien der Gattung Erwinia gewonnen werden, die unter irgendeiner der Bedingungen gezüchtet worden sind, die gewöhnlich zur Züchtung benutzt werden. Die Züchtung von Erwinia ist von Bergey in seinem »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage 1957, auf S. 355 abgehandelt worden. Die Bakterien können in verschiedenen festen oder flüssigen Nährböden oder Kulturmedien gezüchtet werden, wobei letztere zur Erzeugung größerer Mengen bevorzugt werden. Es können chemisch einfache Nährböden, die Stickstoff in anorganischer Form enthalten, und Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Glycerol oder dergleichen, verwendet werden. Wahlweise können die Bakterien in komplizierter aufgebauten Nährböden gezüchtet werden, die Peptone, Proteinhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten. Wahlweise oder zusätzlich können Stickstoffoder Kohlenstoffquellen verwendet werden. Wenn die
Bakterien in einem flüssigen Nährboden gezüchtet werden, kann entweder von einer chargenweisen oder kontinuierlichen Kultivierung Gebrauch gemacht werden. Die Kulturen werden auf einer Temperatur von 10-400C. vorzugsweise 25-35°C, und auf einem pH-Wert von etwa 6—8 gehalten. Die Bakterien werden normalerweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet, können aber auch bei geeigneten Umständen anaerob gezüchtet werden.
Im folgenden Ausführungsbeispiel werden Arten von Escherichia coli, Serratia marcescens und Erwinia unter identischen Bedingungen gezüchtet, und die spezifische Wirkung der erzeugten L-Asparaginase wird in Tabelle I verglichen.
Ausführungsbeispiel 1
Die unten in der Tabelle I angegebenen Bakterien wurden sämtlich auf einem Agar-Agar-Nährboden bei 30° C während 48 h gezüchtet. Teile der Bakterien wurden mit einem Platinbügel in einen 0,05 M Boratpuffer (0,05 M in bezug auf Na+) bei einem pH-Wert von 8,5 bis zu einer Konzentration von 0,5 — 2 mg Protein/ml (bestimmt nach L ο w r y) eingebracht Davon wurde ein Teil weiter auf etwa 10—50 μg Protein/ml in 0,05 M Boratpuffer verdünnt, und das Protein wurde bestimmt. Ein zweiter Teil wurde auf 10-50 μg Protein/ml mit 0,05 M Boratpuffer verdünnt, der 50 μg/ml Rinderserum-Albumin-Fraktion V für die Bestimmung der L-Asparaginase enthielt Diese Untersuchung wurde durch Brüten einer Suspension der verdünnten gepufferten Bakterienkultur mit 10 mM L-Asparagin während 20 min bei 37° C durchgeführt. Das erzeugte Ammoniak wurde nach N e s s 1 e r bestimmt. Die spezifische Wirkung der Kultur wurde dann als das Verhältnis der (μΜοΙ erzeugtes Ammoniak/min) zu Protein (mg) berechnet.
Bacterium
Hinterlegungs-Nr.
Spezifische Wirkung
Tabelle I Hinterlegungs- Spezifische
Bacterium . Nr. Wirkung
A.T.CC. 11303 0,48
Escherichia coli M.R.E. 163 0,27
Escherichia coli M.R.E. 164 0,65
Escherichia coli N.CT.C. 8164 0,46
Escherichia coli N.CT.C 8196 036
Escherichia coli N.CT.C. 9001 0,47
Escherichia coli N.C.I.B. 1377 <0,05
Serratia marcescens N.C.I.B. 4612 <0,05
Serratia marcescens N.C.I.B. 8266 0,2
Serratia marcescens N.C.I.B. 8889 0,15
Serratia marcescens N.C.I.B. 9155 0,15
Serratia marcescens M.R.E. UK/8 0,26
Serratia marcescens N.C.P.P.B. 1274 0,54
Erwinia aroideae N.C.P.P.B. 1380 1,15
Erwinia aroideae N.C.P.P.B. 549 0,54
Erwinia atroseptica N.C.P.P.B. 31 0,53
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 312 1,5
Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 392 0,6
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 438 1,0
Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 468 0,51
Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 491 0,95
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 569 0,79
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 708 4,9
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 898 1,2
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 1065 4,1
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 1066 6,3
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 1120 3,0
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1280 1,5
Erwinia carotovora N.CP.P.B. 1281 1.0
Erwinia chrysanthemi N.C.P.P.B. 516 0,68
A-T.GC. American Type Culture Collection, U.S.A.
M.R.E. Microbiological Research Establishment Salisbury, England
N.CI.B. National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen,
Scotland
N.CP.P.B. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,
England
N.CT.C National Collection of Type Cultures, US.A.
Es sollen jetzt Ausführungsbeispiele der Erzeugung von L-Asparaginase in Tiefkultur sowohl chargenweise als auch kontinuierlich angegeben werden.
Ausführungsbeispiel 2
150 ml Robertsons Kochfleischbrühe wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von Erwinia carotovora (N. C P. P. B. 1066) geimpft und über Nacht (17 h lang) bei 37" C gezüchtet und bei 4° C gelagert. Roux-Flaschen-Agar-Agar-FIaden (flats) (Kulturoberfläche 10 cm χ 20 cm, enthaltend eine Brühe von 30% Oxoid-CM-129-Granulat, verfestigt mit 2,4% Oxoid-Agar Nr. 3) wurden mit 5 ml Brühenkultur geimpft und bei 37°C während 12 h gezüchtet und anschließend wieder bei 40C bis zu 4 Wochen gelagert Unmittelbar vor Gebrauch wurden vier Roux-Flaschen mit 50 ml destilliertem Wasser in eine Impfflasche ausgewaschen und mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der Inhalt der Impfflasche wurde verwendet, um 15 I sterilen Nährboden (525 g Brauerhefeautolysat, 3,5%) zu impfen, der auf einen pH-Wert von 6,8-7,0 vor der Sterilisierung eingestellt und auf 37° C vor seiner Verwendung vorgewärmt worden war. Eine Brutdauer von 12 h bei 370C in einem Wasserbad bei einer Belüftung von 12 l/min durch ein Rohr mit einer Bohrung von 0,625 cm (0,25 Zoll) ergab den Impfstoff in einer für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Form.
Die Kultur wurde in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl aufbewahrt, das mit einem Heizmantel und einer Einrichtung zur Regelung der Temperatur des Inhalts versehen war.
Ein geeignetes Kulturgefäß hat oben und unten sterile Lufteinlaßschlitze. Der Deckel, durch den das Gefäß luftdicht abgeschlossen werden kann, hat Einlaßschlitze, durch die ein Schaumverhütungsmittel, ein Puffer, der Impfstoff und zusätzliche Stoffe eingeführt werden können. Ein rostfreier Stahlrührer dient zum Umrühren des Inhalts des Gefäßes, ferner ist ein pH-Wert-Regler vorhanden. Der pH-Wert-Regler kann auf den gewünschten pH-Wert eingestellt werden' und wenn während der Kultivierung der pH-Wert steigt, gibt eine peristaltische Pumpe bei Bedarf einen autoklaveingeschlossenen 3,2-M-Phosphorsäurepuffer ab.
Der Nährboden wurde durch folgendes Verfahren hergestellt: 16,3 kg Brauerhefeautolysat wurden in 501 heißem Leitungswasser aufgelöst, umgerührt und in Leitungswasser gebracht, das in einem sterilen Kulturgefäß enthalten war, um das Volumen auf 3691 aufzufüllen. Kaustische Soda (0,51 1On) wurde zugesetzt, um den pH-Wert auf 6,8-7 einzustellen. Der Nährboden wurde sofort durch Umrühren während 30 min bei 121°C sterilisiert, wobei die Temperatur
durch einen Dampfmantel, Dampfzufuhr oder -ablassen geregelt wurde. Der Nährboden wurde dann gekühlt, und der Gefäßdruck wurde über dem Atmosphärendruck durch Einleitung steriler Luft gehalten. Die Temperatur und der pH-Wert wurden auf 37° C bzw. 6,8 — 7,0 eingestellt und ein Schaumverhütungsmittel wurde zugeführt Das Schaumverhütungsmittel war eine 25 Vol.-% wäßrige Silikon-Emulsion, die autoklaveingeschlossen aseptisch in den Kulturgefäßdeckel geleitet wurde. Der Druck im Kulturgefäß wurde abgelassen, und 10 l/min sterile Luft wurden in den Nährboden des Kulturgefäßes eingeleitet Der Nährboden wurde durch den Rührer mit 385 U/min umgerührt
15 1 Impfstoff wurden dann in das Kulturgefäß über einen Schlitz im Deckel eingeleitet Der pH-Wert-Regler war auf einen pH-Wert von 6,8 — 7 und der Temperaturregler auf 37° C eingestellt Der Ablauf des Verfahrens wurde durch Messen der Kohlendioxyd-Entwicklung und durch Enzymuntersuchungen verfolgt.
Diese Untersuchungen zeigten, daß die Enzymwirkung, gemessen in internationalen Einheiten (I. U.)/ml Kultur, nach etwa 8 h in diesem nicht ergänzten Nährboden unverändert blieb. Nach Erreichen dieses konstanten Werts wurden der pH-Weri- und Temperaturregler abgeschaltet und die Luftzufuhr zum oberen Ende des Kulturgefäßes umgeleitet, um eine sterile Dichtung zu erreichen. Das Umrühren wurde fortgesetzt und die Kultur wurde auf 20° C Ln etwa 1 h durch Umwälzen von Kühlwasser durch den Mantel abgekühlt Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der Zellbrei in einen Mischer gefüllt Ein Puffer, der
ίο lOmMTris-HCl, 3OmM Natriumchlorid und ImM Äthylendiamintetraessigsäure enthielt wurde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 20" C mit dem Zellbrei in einem Verhältnis von 1 I Puffer/kg Zellbrei schaumig gemischt Die L-Asparaginase wurde dann aus der erhaltenen gepufferten Mischung nach dem in der bereits erwähnten Anmeldung der gleichen Anmelderin P 19 42 900.6 - 41 beschriebenen Verfahren abgetrennt Dieses Verfahren besteht im wesentlichen im Auflösen der Zellen durch ein stark alkalisches Reagenz, im Zentrifugieren und Salzausfällen der Supernatanz oder schwimmenden Deckschicht, um das Enzym zu isolieren. Die Ergebnisse für 7 Kulturen sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle II Zell Wirkung Schaum Trocken Trocken -8,2 I.U./ml H3PO4 (D Schaum- CO2') N (g/l) In
Aus Zell schaum 3,50 gewicht gewicht * 2,4 verhü- max. Nähr Super
beute brei ; von 3,05 insgesamt 1,65 tungs-
mit IfI 		boden natanz
(1) L-Asparaginase 3,92 (g/i) (kg) 2,4 IIULICI
(i) 		(o/o)
(1) (kg) 6,81 (Megaeinheiten) 3,46 2,80 1,05 2,4 0,2 1,6 230 1,90
375 3,91 6,18 Kultur 1,79 2,72 0,97 1,08 0,93 1,5 2,01 1,74
355 3,52 7,76 3,42 332 2,90 1,09 234 0,50 1,6 2,21 1,96
375 4,45 7,56 2,80 3,85 2,95 1,15 2,50 0,55 1,6 2,09 1,89
390 434 5,55 4,08 3,98 2,10 0,80 2,40 1,25 1,5 2,21 1,93
380 3,09 7,21 2,70 3,52 3,0 1,17 2,40 0,15 2,0 2,13 1,85
390 4,14 7,21 1,54 4,29 2,9 1,10 2,45 0,15 2,25 2,21 1,93
380 4,08 7,43 3,10 34,68 3,14 1,14 0,36 2,3 2,55 2,04
355 4,22 7,13 3,05 2,96 1,07 0,80 1,7 2,46 2,02
360 4,11 7,40 3,00 2,37 0,89 0,20 2,3 2,42 2,07
375 4,20 70,24 3,19 10,43 -2,9 I.Uimg Trockenzellen
3735 40,06 Enzymwirkung 3,75 auf Protein unter der Annahme, daß -4,1 I.U.5mg Protein
Mittlere 30,63
In Kultur
Bezogen auf Trockengewicht
Bezogen
Protein 70% des Trockengewichts ausmacht
*) Maximale Anzeige des CO2-Analysators im Abluftstrom.
Ausführungsbeispiel 3
Eine Kultur Erwinia carotovora (N. C. P. P. B. 1066) wurde in einer kontinuierlichen Kultur in einem »Porton Type«-Kulturgefäß für kontinuierliche Kulturen gezüchtet, wie es von Herbert, Phipps und Tempest (Laboratory Practice 1965,14,1150-1161) beschrieben worden ist. Das mit einem Rührwerk versehene Gärgefäß wurde mit einer automatischen Einrichtung zur Regelung der Temperatur und des pH-Wertes ausgerüstet, die bzw. der auf 37°C bzw. 7,0 gehalten wurde. Der Nährboden war Woiges Brauerhefeautolysat und die Herstellung des Nährbodens und der Impfkulturen wurde wie im Ausführungsbeispiel 2 vorgenommen.
Nach dem Impfen des Gärgefäßes, das einen 5%igen Nährboden enthielt, und dem chargenweisen Züchten der Kultur wurde frischer steriler Nährboden eingeleitet. Die Verdünnungsrate D = f/v, wobei f die Durchflußmenge (l/h) und ν das Kulturvolumen (I) bedeuten, wurde konstant auf D= 0,3 h-1 für einige d so gehalten, bis ein stationärer Zustand eingestellt war, der sich durch Konstanz des Bakterientrockengewichts und der L-Asparaginase-Pegel in den wiederholt entnommenen Proben zeigte. Die Durchschnittswerte des Bakterientrockengewichts und der L-Asparaginaseproben im stationären Zustand waren wie folgt:
Bakterientrockengewicht = 2,6 mg/ml
L-Asparaginase = 241. UVmI
I.UVmg = 9,2
Der L-Asparaginase, wie sie durch die Erfindung hergestellt und durch das in der Patentanmeldung vom gleichen Tag der gleichen Anmelderin P 19 42 900.6-41 beschriebene Verfahren abgetrennt und gereinigt ist, entspricht einem Produkt, das mit 3,5,1,1-L-Asparagina.nidohydrolase in der Terminologie der Internationalen Enzym-Kommission bezeichnet isi, weicht jedoch in seinen Eigenschaften von den bisher bekannten Asparaginasen ab, die z. B. aus Escherichia coli
gewonnen sind. Die Aminosäureunalyse von Proben von L-Asparaginase, gewonnen aus E. coli, verglichen mit denen aus Erwinia carotovora, hatte folgendes Ergebnis:
Aminosäure Esch. coli Er. carotovora
Asp 180 131
Thr 120 89
Ser 60 64
GIu 84 80
Pro 48 49
GIy 108 123
AIa 120 105
VaI 120 98
CyS 6 <2
Met 24 33
He 48 61
Leu 84 104
Tyr 54 48
Phe 36 27
Lys 84 67
His 12 25
Arg 36 68
Trp 12 0
Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen des isoelektrischen Punkts (durch isoelektrische Fokussierung) einen pH-Wert von etwa 5,2 (für E. coli) und etwa 8.5 (für Er. carotovora) sowie Glutaminasewirkungen von 2 - 3% der Asparaginasewirkung (für E. coli) verglichen mit 5-7% (für Er. carotovora). Außerdem sind die beiden Asparaginasearten serologisch ziemlich verschieden. Beide erzeugte Antisera führen zu keiner Gegenreaktion in bezug auf die andere Asparaginase.
ίο Das hat den klinischen Vorteil, daß in Fällen, in denen die Behandlung mit einer Asparaginase eine Empfindlichkeit entstehen läßt (eine allergische Reaktion), mit der zweiten Asparaginase die Behandlung fortgesetzt werden kann. Das Molekulargewicht von Asparaginase die aus der Gattung Erwinia hergestellt ist, liegt normalerweise bei etwa 130 000 - 150 000.
Die Behandlung von Leukämie und ausgebreiteten-Krebs wird normalerweise durch Injektion vor L-Asparaginase in einer physiologischen Lösung, wie einer Kochsalzlösung, vorgenommen, obwohl unter gewissen Bedingungen auch eine orale Verabreichung möglich ist. Eine typische Lösung für eine intravenöse Injektion ist eine 15-mg/ml-Lösung von L-Asparaginase in physiologischer Kochsalzlösung. Typische Dosen sine 0,05 - 5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten.

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, gemäß dem man Bakterien in einem Nährmedium aerob züchtet, mindeslsns einen Teil der entstandenen Bakterienzellen zwecks Freisetzens der L-Asparaginase aufbricht und die freigesetzte L-Asparaginase isoliert dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Gattung Erwinia einsetzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man Bakterien der Art Erwinia carotovora einsetzt
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man Bakterien der Art Erwinia chrysanthemi einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man Bakterien der Art Erwinia aroideae einsetzt
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Art Erwinia atroseptica einsetzt
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß man die Bakterien in einem flüssigen Nährmedium züchtet
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß beim Züchten die Temperatur im Bereich von 10 bis 400C gehalten wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß der pH-Wert des Nährmediums im Bereich von 6 bis 8 gehalten wird.
9. L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet daß sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt worden ist
10. Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 9 in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung besteht.
DE1942833A 1968-08-23 1969-08-22 Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel Expired DE1942833C3 (de)

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