DE1942833A1

DE1942833A1 - L-Asparaginase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1942833A1
Application number: DE19691942833
Authority: DE
Inventors: Wade Henry Ebenezer; Denis Herbert
Original assignee: WADE HENRY EBENEZER
Current assignee: WADE HENRY EBENEZER
Priority date: 1968-08-23
Filing date: 1969-08-22
Publication date: 1970-04-02
Also published as: DK123488B; IE33302B1; GB1258062A; CA936485A; AT295451B; SE367022B; FR2016311A1; US3686072A; DE1942833C3; DE1942833B2; BE737858A; CH518363A; IE33302L

Description

Die Erfindung betrifft das Enzym !-Asparaginase und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Das Enzym L-Asparaginase (3.5.1.1.-L-Asparaginamidohydrolase in der Nomenklatur" der Internationalen Enzym-Kommission I96I) hat, falls es von bestimmten Ausgangssubstanzen abgetrennt wird, eine Antitumorwirkung und bietet sich als neue, erfolgversprechende Therapie für einige formen von Leukämie und ausgebreitetem (disseminated) Krebs-, an (vgl. z. B. Hill et al in J.A.M.A. 1967, 202, iir. 9> S· 116). Die Antitumorwirkung wurde zuerst in Meerschweinchenserum entdeckt, später auch in Kulturen der !bakterien Escherichia coli und Serratia marcescens.

L-Asparaginase wird normalerweise kommerziell durch Abtrennung aus Kulturen Escherichia ooli gewonnen. Die Kommerzielle Herstellung wird jedoch durch den relativ ge-

293-(JV31O1)-HdBk(7) 009814/16 50

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ringen Wirkungspegel von L-Aspäraginase in diesen Kulturen beeinträchtigt, so daß L-Asparaginase nur in sehr geringen Mengen verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung dieses Enzyms sehr erschwert·

Der Erfindung liegt die Entdeckung einer weiteren Bakteriengattung zugrunde, die medizinisch brauchbare L-Asparaginase normalerweise in beträchtlich größeren Mengen als die Bakterien Escherichia coil und Serratia marcescens enthält.

Gemäß der Erfindung wird therapeutisch wirksame L-Asparaginase aus Bakterien der Gattung Erwinia isoliert, die" an sich als pathogen für Pflanzen bekannt sind. Die L-Asparaginase wird zweckmäßigerweise aus Bakterien dieser Gattung isoliert, indem die. Bakterien auf einem geeigneten Nährboden gezüchtet werden, bis sie in einer gewünschten Menge vorliegen, und ^anschließend die L-Asparaginase entweder durch übliche Zellzerreißverfahren oder _: vorzugsweise durch ein Verfahren abgetrennt wird, wie es in der am gleichen Tag eingereichten deutschen Patentanmeldung der gleichen Antnelderin (Britische Priorität 40344/68) beschrieben ist.

Die Enzymwirkung der Erwinia-Arten, insbesondere von Stämmen der Art Erwinia carotovora, ist oft sehr hoch und kann bedeutend höher als die Enzymwirkun^ von L-Asparaginase sein, die aus den bisher verwendeten Äusgangssubstanzen gewonnen wird. .

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die L-Asparaginase aus Bakterien der Gattung Brwinia gewonnen werden, die unter irgendeiner der Bedingungen gezüchtet worden sind·,, die gewöhnlich zur Züchtung benutzt werden. Die Züch tung von Erwinia ist von Bergey in seinem "Manual of

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Determinative Bacteriology", 7. Aufl. 1957, auf S. 355 abgehandelt worden. Die Bakterien können in verschiedenen festen oder flüssigen Nährböden oder Kulturmedien gezüchtet werden, wobei letztere zur Erzeugung größerer Mengen bevorzugt weiten· Es können chemisch einfache Nährböden, die Stickstoff in anorganischer form enthalten, und Kohlens tof fq_uellen wie Glucose, Glycerol oder dergleichen, verwendet werden. Wahlweise können die Bakterien in komplizierter aufgebauten Nährböden gezüchtet werden, die Peptone, Proteinhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten· Wahlweise oder zusätzlich können Stickstoff- oder Kohlenstoffquellen verwendet werden. Wenn die Bakterien in einem flüssigen Nährboden gezüchtet Werden, kann entweder von einer chargenweisen oder kontinuierlicheVi Kultivierung Gebrauch gemacht werden. Die Kulturen werden auf einer Temperatur von 10 - 40 ⁰O, vorzugsweise 25 - 35 ⁰G, und auf einem pH-Wert von etwa 6 - ti gehalten. Die .bakterien werden normalerweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet, können aber auch bei geeigneten Umständen anaerob gezüchtet werden.

Im folgenden Ausführungsbeispiel werden Arten von Escheriohia coli, Serratia marcescens und Erwinia unter identischen Bedingungen gezüchtet, und -die" spezifische "Wirkung der erzeugten L-Aspara.jinase wird in Tabelle I verglichen.

Ausführung be is pie! T

Die unten in der Tabelle I angegebenen Bakterien wurden sämtlich auf einen» Agar-Agar-Nährboden (Plate Jount A_t-ar, Oxoid Ltd.) Dei 30 ⁰G während 4- h gezüchtet. Teile der Bakterien wurden mit einem Platinbügej. in einen 0,05 Ι·ι Boratpuffer (0,05 M in bezug aui Na.) bei einem pH-Wert

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BA* ORiSfIWAL

von 8,5 bis zu einer Konzentration von 0,5 - 2 mg Protein/ ml (bestimmt nach Lowry) eingebracht. Davon wurde ein Teil weiter auf etwa 10 - 50 /u. g Protein/ml in 0,05 M Boratpuffer verdünnt, und das Protein wurde bestimmt. Ein zweiter Teil wurde auf 10 - 50 /Ug Protein/ml mit 0,05 M Boratpuffer verdünnt, der 50 /ug/ml Rinderserum-Albumin-Fraktion Y (Armour Chemical Co.) für die Bestimmung der L-Asparaginase enthielt. Diese Untersuchung wurde durch Brüten einer Suspension der verdünnten gepufferten Bakterienkultur mit 10 tnM L-Asparagin während 20 min bei 37 ⁰C durchgeführt. Das erz'eugte Ammoniak wurde nach Kessler bestimmt. Die spezifische Wirkung der Kultur wurde dann als' das Verhältnis der £ /uMol erzeugtes Aiömoniak/minJ Pi fbht

zu Protein L¹¹⁵Sl berechnet	Bacterium	I *	T.C.O	C T. G	. 11303	Spezifische	48
I		TABEELE I	R.E.	G. T. G	163	Wirkung	27
Escherichia coli	Hinter-	.■ M. R. E..	CvT. C	164	0,	65
Escherichia coli		N.	G.I.B	. 8164	0,	46
Escherichia coli		■, ■ M.	C.I.B	. 8196	, 0,	36 *
Escherichia coli		N.	C.I.B	. 9001	0,	47
Escherichia coli	legungs-Nr.	IU	C.I.B	. 1377	0,	05
Escherichia coli ■·■	. A.	"N.	C.I.B	. 4612 ..	0,	05
Serratia marcescens	M,	" M.	Ii.E.	. fc266	< 0,	2
Serratia marcescens	K ♦	CP.P		<Q,	15
Serratia marcescens	W.	CP.P	.9155	0,	15
Serratia marcescens	M.	C.P.P	UK/b	0,	26
Serratia marcescens	K.	•B. 1274	0,	54
Serratia., marcescens	K'..	.B. 1 ~ycQ	0,	15
Brwinia aroideae	Li.	.B. 549	0,	54
Erwinia aroideae		1,
Erwinia atrcseptica		0,

OÖ9ÖU-/r6SO

Erwinia carotovora I.O.P.P.B 31 0,53

Erwinia carotovora W.G.P.P.B. 312 1,5

" Erwinia carotovora N.G.P.P.B» 392 0,6

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 438 1,0

Erwinia carotovora H.C*P.P.B. 468 0,51

Erwinia carotovora N.O.P.P.B. -491 0,95

Erwinia carotovora N.G.P..P.B. 569 0,79

Erwinia carotovora I.G.P.P.B. 708 4,9

Erwinia carotovora N.O.P.P.B. 898 . 1,2

Erwinia carotovora N.C.P.P.B.10§5 4,1

Erwinia carotovora Ü.G.P.P.3.1Q66 6,3

Brwinia carotovora N.C.P.P.B.1120 3,0

Erwinia carotovora N.G.P.P.B.1280 1,5

Erwinia carotovora N.C.P.P.B.1281 1,0

Erwinia chrysanthemi EUG.P.P.B· 516 0,68

*) Fortsetzung siehe Seite 5a
Es sollen jetzt Ausführungsbeispiele der Erzeugung

von L-Asparaginase in Tiefkultur sowohl chargenweise als auch kontinuierlich angegeben werden.

Ausführungsbeispiel 2

150 ml Robertson's Kochfleischbrühe wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von Erwinia carotovora (W.O.PiP.B. 1066) geimpft und über Wacht (17 h.lang) bei 37 ⁰C gezüchtet und bei-4 ⁰G gelagert. Roux-i'laschen-Agar-Agar-IPladen (flats) (XuIturoberflache 10 cm χ 20 cm, enthaltend eine Brühe von 30 fo Oxoid-CM-129-G-ranulat, verfestigt mit 2,4 ^c/° Oxo id-A gar Wr. 3) wurden mit 5 ml Brühenkultur geimpft und bei 37 ⁰O während 12 h gezüchtet und anschließend wieder bei 4 ⁰O bis zu 4 Wochen gelagert. Unmittelbar vor Gebrauch wurden vier Roux-Jlaschen mit 50 ml destilliertem Wasser in eine Impfflasche ausgewaschen und mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der Inhalt der Impfflasche wurde verwendet, um 15 1 sterilen Nährboden (525 g "light grade Yeatex", 3,5 1<>) zu impfen, der

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*) Portsetzung von. Seite 5

A.T.ö.C. Am er ic· an iype Culture Collection, U.S.A.

M.R.E. ■' Microbiological Research Establishment, Salisbury, England

N.C.I.B. National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Scotland

N.C.P.P.B. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England

F.C.T.C. National Collection of Type Cultures, U.S.A.

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auf einen pH-Wert von 6,8 - 7,0 vor der Sterilisierung eingestellt und auf 37 G vor seiner Verwendung vorgewärmt worden war. Eine Brutdauer von 12 h bei 37 ⁰O in einem Wasserbad bei einer Belüftung von 12 l/min durch ein Rohr mit einer Bohrung von 0,625 cm (0,25 Zoll) ergab den Impfstoff in einer für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Form.

Die Kultur wurde in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl aufbewahrt, das mit einem Heizmantel und einer Einrichtung zur Regelung der Temperatur des Inhalts versehen war.

Ein geeignetes Kulturgefäß hat oben und unten sterile Lufteinlaßschlitze. Der Deckel, durch den das Gefäß luftdicht abgeschlossen werden kann, hat Einlaßschlitze, durch die ein Schaumverhütungsmittel, ein Puffer, der Impfstoff und zusätzliche Stoffe eingeführt werden können. Ein rostfreier Stahlrührer dient zum Umrühren des Inhalts des Gefäßes, ferner ist ein pH-wert-Regler vorhanden. Der pH-Wert-Regler kann auf den gewünschten pH-Wert eingestellt werden, und wenn während der Kultivierung der pH-Wert steigt, gibt eine peristaltische Pumpe bei Bedarf einen autoklaveingeschlossenen 3»2 M Phosphorsäure puffer ab.

Der Nährboden wurde durch folgendes Verfahren hergestellt: 16,3 kg (36 Ib) Yeatex (English Grains Co. Ltd.) wurden in 50 1 he'ißetn Leitungswasser aufgelöst, umgerührt und in Leitungswasser gebracht, das in -;inera sterilen KulturgefäS enthalten war, um das Volumen auf 369 1 aufzufüllen. Kaustische Soda (0,5 1 10 n) wurde zugesetzt, um den pH-Wert auf 6,8 - 7 einzustellen. Der Kährboden wurde sofort; durch Umrühren während 30 min bei 121 ⁰G sterilisiert, wotei die Temperatur durch einen- Dampfmantel,

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'.. Dampfzufuhr oder —ablassen geregelt wurde· Der Nährboden . wurde dann gekühlt, mnd der G-efäßdruck wurde über dem Atmosphärendruck durch Einleitung steriler Luft gehalten. Die Temperatur und der pH-Wert wurden auf 37 ⁰G bzw. 6,8 - 7,0 eingestellt, und ein Schaumverhütungsmittel wurde zugeführt. Das Schaumverhütungsmittel war eine 25 Vol. fo-wässrige Silikon-MS-Emulsion RD (Warenzeichen von Hopkin an Williams Ltd·), die autoklaveingeschlossen aseptisch in den KuIturgefäßdeekel geleitet wurde· Der Druck im Kulturgefäß' wurde abgelassen, und 10 l/min sterile Luft wurden in den Nährboden des Kulturgefäßes eingeleitet. Der Nähr-hod'en. wurde durch den Rührer mit 385 ü/min umgerührt. ',

15 1 Impfstoff wurden dann in das Kulturgefäß über -. einen Schlitz im Deckel eingeleitet. Der pH-Wert-Regler war auf einen pH-Wert von 6,8 - 7 und der Temperaturregler auf 37 ⁰C eingestellte Der Ablauf des Verfahrens wurde durch Messen der Kohlendioxyd-Entwicklung und durch Enzymuntersuchungen verfolgt.

Diese Untersuchungen zeigten, daß die Enzymwirkung, gemessen in internationalen Einheiten (IeU.)/ml Kultur, nach etwa 8 h in diesem nicht ergänzten Nährboden unverändert blieb· Nach Erreichen dieses konstanten Werts wurden der pH-Wert- und Temperaturregler abgeschaltet und die Luftzufuhr zum oberen Ende des Kulturgefäßes umgeleitet, um eine sterile Dichtuni- zu erreichen». Das Umrühren wurde fortgesetzt, und die Kultur würde auf 20 ⁰G in etwa 1 h durch Umwälzen von Kühlwasser durch den Mantel abgekühlt. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der Zellbrei in einen Mischer gefüllt. Ein Puffer, der 10 mM Tris-HCl, 30 mM Natriumchlorid und 1 mM ithylendiamintetraessigsäure enthielt, wurde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Tempe-

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ratur von 20 ⁰C rait dem Zellbrei in einem Verhältnis von 1 1 Puffer/kg Zellbrei schaumig gemischt. Die !-Asparaginase wurde dann aus der erhaltenen gepufferten Mischung durch das in der bereits erwähnten Anmeldung der gleichen Änmelderin beschriebene Verfahren abgetrennt. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen im Auflösen der Zellen durch eine starke alkalische Reagenz,im Zentrifugieren und Salzausfallen der Supernatanz oder schwimmenden Deckschicht, um das Enzym zu isolieren« Die. Ergebnisse für 7 Kulturen sind in Tabelle II angegeben.

Ausführungsbeispiel 3

Eine Kultur Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066) wurde in einer kontinuierlichen Kultur in einem "Porton Type"-Kulturgefäß für kontinuierliche Kulturen gezüchtet, wie es von Herbert, Phippa und Tempest (Laboratory-Practice 1965, H, 1150-1161) beschrieben worden ist. Das mit einem Rührwerk versehene Gärgefäß wurde mit einer automatischen Einrichtung zur Regelung der Temperatur und des pH-Wertes ausgerüstet, die bzw. der auf 37 ⁰G bzw. 7,0 gehalten wurde. Der Nährboden war 5$iges Yeatex, und die Herstellung des Nährbodens und der Impfkulturen wurde wie im Ausführungsbeispiel 2 vorgenommen.

Nach dem Impfen des Gärgefäßes, das einen 5$igen Yeatex-Nährboden enthielt, und dem chargenweisen Züchten der Kultur wurde frischer steriler Nährböden eingeleitet· Die Verdünnungsrate D = f/v, wobei f die Durchflußmenge Cl/hJ und ν das Kulturvolumen [/lj| bedeuten, wurde konstant auf D =0,5 h für einige d gehalten, bis.ein stationärer Zustand eingestellt war, der sich durch Konstanz des !Bakterientrockengewichts und der L-Asparaginase-Pegel in den wiederholt entnommenen Proben zeigte*. Die Durch-

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TABELLE II

Ausbeute

375 355 375 390 380 390

__ 380, *- 355 ^ 360

, Zell	Zell	Wirkung von.	nase	Schaum	Trocken	Trocken	Ή ρο	Schaum-	CO₂*	uj-g/il	in Su
brei	schaum L-Asparagi-		3,50	gewicht	gewicht	3 4	verhü-	max.	Nähr	per— γιο Ί"θΐί i7
Ik Ι?! L CLJ	03	Diegaeinhei-	3,05		ingesamt .	LiJ	tungs-	DC	boden	*U.a. iicillzi*
		Eultur	3,92				mittel cn
		3,42,,	3,46				0,2
3,91	6,81	2,80	1,79	2,80	1,05	2,4	0,93	1,6	2,30	1,90
3,52	• 6,18.	4,08	3,32	2,72 ,	0,97	1,65	0,50	1,5	2,01	1,74
4,45	7,76	2,70	3,85	2,90	1,09	2,4	0,55	1,6	2,21	1,96
4,34	7,56	1,54	3,98	2,95	1,15	2,4	1,25	1,6	2,09	1,89
3,09	5,55	3,10	3,52	2,10	0,80	1,08	0,15	1,5	2,21	1,93
4,14-	7,21	3,05	4,29	3,0	1,17	2,34	0,15	2,0	2,13	1,85
4,08	7,21	3,00	34,6b	2,9	1,10	2,50	0,36	2,25	2,21	1,93
4,22	7,43	3,19	3,14	Ϊ,Η	2,40	0,80	2,3	2,55	2,04
4,11 -	■7,13	3,75	2,9b	1,07	2,40	0,20	1,7	2,46	2,02
4,20	7,40	30,63	2,37	0,39	2 ,45		2,3	2,42	2,07
40,06	70,24		10,43

.Mittlere Enzymwirkung

In Kultur · Bezogen auf Trockengewicht Bezogen auf Protein unter der

-i.9 I.U./mg¹Trockenzellen

-4V1 Ι·ϋ·/πι^ Protein Annahme, daß Protein 70 °/o des Trockengewichts ausmacht

Maximale Anzeige des COp-Arialysators im Abluftstrom

■■- 9 -

schnittswerte des Bakterientrockengewichts und der L-Asparaginaseproben im stationären Zustand waren wie folgtί

Bakterientrockengewicht = 2,6 mg/ml L-Asparaginase = 24 I.U./ml I.TJ./mg = 9,2

Der L-Asparaginase, wie sie durch die Erfindung hergestellt und durch das in .der Patentanmeldung vom gleichen Tag der gleichen Anmelderin beschriebene Verfahren abgetrennt und gereinigt ist, entspricht einem Produkt, das mit 3·5.1·1.-L-Asparaginamidohydrolase in der Terminologie der Internat ionalenEnzym-Kommis si on bezeichnet ist, weicht jedoch in seinen Eigenschaften von den bisher bekannten Asparaginasen ab, die z. B. aus Escherichia coli gewonnen sind. Die Aminosäureanalyse von Proben von L-Asparaginase, gewonnen aus E· coli (hergestellt von Farbenfabriken Bayer A.G·), verglichen mit denen aus Erwinia carotovora, hatte folgendes Ergebnis:

Aminosäure	Esch. coil	Er«carotovora
Asp	180	131 .
Thr	120	89
Ser	60	6.4
GIu	84	80
Pro GIy	48 108	49 123
AIa	120	105
VaI	120	98
OyS	6	<2
Met	24	35
He	.48	61
Leu	84	104

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Tyr	54
Hie	36
Lys	84
His	/12
Arg	36
Tr ρ ■	12

• 19Λ2833

48 27 67 25 68 O

Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen, des isoelektrischen Punkts (durch isoelektrische Fokussierung) einen pH-Wert von etwa 5,2 ^für B.coli) und etwa 8,5 (für Er. carotovora) sowie GlutaminaseWirkungen von 2 - 3 $ der ¹ Asparaginasewirkung (für E. coli) verglichen mit 5 - \i° (für Er. carotovora). Außerdem sind die beiden Asparaginasearten serologisch ziemlich verschieden. Für beide erzeugte Antisera führen zu keiner Gegen(cross)reaktion in bezug auf die andere Asparaginase» Das hat den klinischen Vorteil, daß in Fällen, in denen die Behandlung mit einer Asparaginase eine Empfindlichkeit entstehen läßt (eine, allergische Reaktion),mit der zweiten Asparaginase die Behandlung fortgesetzt werden kann. Das Molekulargewicht von Asparaginase, die aus der Gattung Erwinia hergestellt ist, liegt normalerweise bei etwa 13Ο·00Ο 150.000. ' ■ .."■■'.,

Die Behandlung von Leukämie und ausgebreitetem Krebs wird normalerweise durch Injektion von L-Asparaginase in einer physiologischen Lösung wie einer Kochsalzlösung vorgenommen, obwohl unter gewissen Bedingungen auch eine orale Verabreichung möglich ist. Eine ·typische Lösung für eine intravenöse Injektion ist eine 15 mg/ml-LÖsung voji L-Asparaginase in physiologischer Kochsalzlösung. Typische Dosen sind 0,05 - 5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten. .

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase aus einer Bakterienkultur, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienkultur Bakterien der Gattung Erwinia enthält.

2.' Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t ', daß die Bakterien von der Art Erwinia carotovora sind.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien von der Art Erwinia chrysanthemi sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennze ichnet , daß die Bakterien von der Art Erwinia aroideae sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Bakterien von der Art Erwinia atroseptica sind.

6. Verfahren zur Herateilung von L-Asparaginase,' d a durch -gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattung Erwinia in einem Nährboden gezüchtet werden, daß mindestens ein Teil der entstandenen Bakterienzellen aufgebrochen wird, um L-Asparaginase freizusetzen, und daß die freigesetzte L-Asparaginase isoliert wird.

7· Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Bakterien von der Art nach einem der Ansprüche 2 - 5 sind*

β. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dad u r c h £ e k e η η ζ ei ο h η e t , daß der Nährboden Stick-

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stoff- und Kohlenstoff quellen-enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e - k e η n«z e i c h η e t , daß die Stickstoffquelle in anorganischer Form vorliegt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch

g e k e η η ζ e i c h η β t , daß die Kohlenstoffquelle Glucose oder Glycerol ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h gekennzeichnet , d aß die Stickstoff- und Kohlenstoffquellen Peptone, Hefeautolysate oder Proteinhydrolysate sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 - 11, d a -

d u r c hg e k e η η ζ e i c h η e t , daß der Nährboden fest ist.

13» Verfahren nach einem der Ansprüche 6 - 11, d a durch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß der Nährboden flüssig ist.

14·. Verfahren nach einem der Anspruchs 6 - 13_f d a du r c h g e k e η η ζ e i c.'h-n e t, daß die Temperatur auf etwa 10 - 40 ⁰O gehalten wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dad ure h g e k e η η ζ e ic h η e t , daß die Temperatur auf 25 35 ⁰C gehalten wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche '6 - 15, d a durch gekennzeichnet , daß der pH-Wert auf etwa 6 - 8 gehalten wird. ■

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17» Verfahren nach einem der Ansprüche 6 - 16, d a durch gekennzeichnet, daß das Verfahren unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

18· L-Asparaginase, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

19· Ii-Asparaginase, hergestellt aus Bakterien der Gattung Erwinia, mit einem Molekulargewicht von 130.000 150*000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 8,5 sowie einem Aminosäuregehalt und einer Glutaminasewirkung, wie im wesentlichen oben angegeben.

20. lösung einer L-Asparaginase nach Anspruch 18 oder

19 in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 10 - 20 mg Protein/ml Lösung.

21. L-Asparaginase nach einem der Ansprüche 18 - 20 in einer therapeutischen Dosis zur Behandlung von Leukämie oder ausgebreitetem Krebs beim Menschen.

22. L-Aaparaginase nach Anspruch 1ό oder 19 in einer therapeutischen Dosis von etv/a 0,05 - 5 mg/kg zur Behandlung von Leukämie oder ausgebreitetem Krebs beim Menschen.

23» L-Asparaginase nach Anspruch 1S oder 19 in einer therapeutischen Dosis als Medikament in der Human- und Veterinärmedizin.

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