DD202623A5 - Verfahren zur herstellung von sporen-polyosiden - Google Patents

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DD202623A5
DD202623A5 DD82242065A DD24206582A DD202623A5 DD 202623 A5 DD202623 A5 DD 202623A5 DD 82242065 A DD82242065 A DD 82242065A DD 24206582 A DD24206582 A DD 24206582A DD 202623 A5 DD202623 A5 DD 202623A5
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polyosides
polyoside
culture
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Demetre Yavordios
Mireille Cousin
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Berri Balzac
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von immunisierenden Sporen-Polyosiden aus Bakteriensporen, in denen sie enthalten sind. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines allgemeinen, einfachen, wenig zerstoerenden Verfahrens, mit dem Polyoside sehr hoher Molekularmasse hergestellt werden koennen. Erfindungsgemaess wird in synthetischem oder halbsynthetischem Naehrmedium eine Bakterienkultur gezuechtet, man am Ende der Wachstumsphase dieser Kultur die Mikroben von einer oben schwimmenden Phase getrennt, diese oben schwimmende Phase einer Filtrierung durch eine Membran unterzogen, die die Molekuele eines Molekulargewichts gleich oder ueber 100000 Dalton zurueckhaelt, wodurch ein an Sporen-Polyosiden reiches Retentat erhalten wird und die Proteine, die Nukleinsaeuren und die Lipide aus diesem Retentat eliminiert werden, so dass ein reines Sporen-Polyosid erhalten wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sporen-Polyosiden, die durch dieses Verfahren gewonnenen Polyoside und die Verwendung dieser Polyoside zur Herstellung von Impfstoffen«
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Bekanntlich kann der Kampf gegen die Infektionskrankheiten auf zwei Ebenen geführt werden: entweder durch eine direkte Wirkung auf den Krankheitskeim (Antibiotika, Antiseptika) oder durch eine indirekte Wirkung durch Stärkung der Abwehrkräfte des Organismus (Impfung, Serumtherapie, Immunmodulation).
Die Anwendung von direkt wirkenden Mitteln stößt oft auf bestimmte Schwierigkeiten, die ihre Wirkung einschränken können (vor allem Giftigkeit des Moleküls und Widerstandskraft der Bakterien).
Dagegen weist die Stärkung der Abwehrkräfte des Organismus durch Erwerben der spezifischen Antikörper gewisse Vorteile vor allem vom Standpunkt der Schutzdauer und der Spezifizität - auf· Jedoch ist die Impfung mit ganzen Mikroben nicht immer ohne Nachteile: Erscheinungen der Überempfindlichkeit, schlechte Verträglichkeit oder Piebererzeugung sind die häufigsten· Sie hängen mit dem Vorhandensein von verschiedenartigen Antigenen der Bakterie zusammen·
Somit ist die Aufmerksamkeit, die die Forscher auf die Isolation des verantwortlichen Antigens der schützenden Antikörper richten, ganz natürlich.
m. ι η μ α ft ο η ^ η ο ι, * /. η
7/ On rr C -Z- 61097
2.4 L U 6 5 O 24·1·83
Im Falle der Bakteriensporen erweisen sich die Sporen-PoIyoside mit wenig Hebenwirkungen beim Menschen als immunisierend.
Eine erste Anwendung dieser Sporen-Polyoside beim Menschen ist die Entwicklung des Yakzins antimeningococcus A und C und erst vor kurzem des polyvalenten Vakzins, das die reinen Polyoside von 14 serologischen Typen von Pneumococcus enthält.
Mehrere andere Bakteriensporen spielen in verschiedenen Krankheitsprozessen eine Rolle, so z. B,:
- Hemophilus influenzae, Typ b
- Klebsieila pneumoniae
- Escherichia coli
- Streptococcus, Gruppe B
und entsprechende Impfstoffe können aus ihren Sporen-Polyosiden hergestellt werden·
In der europäischen Patentanmeldung 0 002 404 wurde ein Verfahren zur Herstellung von Sporen-Polyosiden aus Streptococcus pneumoniae beschrieben·
Gemäß diesem Verfahren wird der Mikroorganismus in komplexen Hahrböden gezüchtet· Dann erfolgt nach Inaktivierung mittels Phenol, ohne die Mikroorganismen vom Hährboden zu trennen, ein erster Zusatz von Alkohol wie z, B. Ethanol. Danach trennt man die gefällten Fremdstoffe und setzt ein zweites MaJL Alkohol zu, um nun das Polyosid zu fällen·. Aus dem wieder in Suspension verwandelten Polyosid werden danach die Verunreinigungen (Proteine, Nukleinsäuren) durch enzymatische Behandlung oder durch Behandlung mit einem kationischen supraaktiven Mittel (Zitroniumbromid), die durch eine Ultrafiltration ergänzt werden können, entfernt.
2/OnrCC-3- 61 097 11
41 U ο b b . 24.1-83
Dieses Verfahren ist nicht allgemein, denn die spezifischen Bedingungen Jedes Stadiums ändern sich mit dem zu trennenden Polyosid* Deshalb müssen Vortests durchgeführt werden, um die Bedingungen der verschiedenen Fällungen zu bestimmen· Außerdem kann dieses Verfahren auf Grund der Verwendung von bestimmten Nährböden zur Zerstörung der Polyosid-Ketten führen·
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines allgemeineren, einfacheren und weniger zerstörenden Verfahrens, mit dem Polyoside sehr hoher Molekularmasse hergestellt werden können,
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe, zugrunde, eine neue Technologie zur Herstellung derartiger Polyoside aufzufinden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Sporen-Polyosiden aus Bakteriensporen, in denen sie enthalten sind, zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem synthetischen oder halbsynthetischen lährmedium Bakterien gezüchtet werden, am Ende der Wachstumsphase dieser Bakterienkultur die Mikroben von einer oben schwimmenden Phase getrennt werden, diese oben schwimmende Phase einer Filtration durch eine Membran unterzogen wird, die die Moleküle eines Molekulargewichts gleich oder über 100 000 Dalton festhält, wodurch ein an Sporen-Polyosiden reiches Retentat gewonnen wird, und die Proteine, die Nukleinsäuren und die Lipide von diesem Hetentat getrennt werden, so daß ein reines Sporen-Polyosid gewonnen wird.
24 2 0 65 6 "4- 6109711
24.1.83
Somit erfolgt gemäß einer Hauptcharakteristik dieser Erfindung die Kultur der Bakterien auf synthetischem oder halbsynthetischem Nährboden· Mit synthetischem Hahrboden bezeichnet man wäßrige Lösungen bekannter chemischer Verbindungen von geringem Molekulargewicht, die in bestimmten Verhältnissen vorhanden sind.
Mit halbsynthetischem Hährboden bezeichnet man einen zum vorhergehenden analogen Nährboden, der aber außerdem einen geringen Anteil (im allgemeinen weniger als 0,5 Gew.-%) an natürlichen Stoffen wie Proteinhydrolysate enthält.
Darüber hinaus erfolgt die Extraktion der Polyoside erfindungsgemäß aus der oben schwimmenden Phase der von Mikroben befreiten Kultur und nicht aus dem gesamten Uährboden.
Durch Filtration durch eine Membran, deren Porosität die Moleküle eines Molekulargewichts gleich oder über 100 000 Dalton zurückhalten kann, kann schnell ein Retentat hergestellt werden, das insbesondere die Polyoside sowie in geringen Mengen Proteine, Nukleinsäuren und Lipide einschließt.
Die Eliminierung der Unreinheiten wird auf folgende Weise günstig vorgenommen: man unterzieht das Retentat einer enzymatischen Hydrolyse^ insbesondere durch ein Gemisch aus Pronase,. RNase und DJKTase, gibt ein Butanol-Chloroform-Gemisch (vorzugsweise ein Gemisch im Volumen 1 : 1) hinzu, trennt die wäßrige Phase, unterzieht die wäßrige Phase einer Dialyse und führt durch eine Membran, die die Moleküle mit einem Molekulargewicht gleich oder über 100 000 Dalton zurückhält, eine Filtration durch.
Das reine Polyosid kann auf bekannte Weise vom Retentat getrennt werden^ und zwar durch Fällung durch einen Alkohol wie z. B, Ethanol»
2 0 65 6 -5- 6109711
24.1.83
Ausführungsbeispiel
Die folgenden Beispiele veranschaulichen diese Patentanmeldung j
Beispiel 1
Polyosid pneumococcus, Typ 3
Man geht von einem lyophilisierten Stamm Streptococcus pneuffioniae vom Typ 3 aus,
a) Herstellung von Kultur-Losen
Der lyophilisierte Stamm wird in Bouillon T eingebracht· Die Kultur erfolgt 16 Stunden bei 37 0C. Man mischt 5 ml der erhaltenen Kultur mit 15 ml sterilisierter Magermilch. Das Ganze wird auf Ampullen verteilt, und zwar im Verhältnis von 0,5 ml je Ampulle, und lyophilisiert. Die Loyphilisate werden bei +4 0C konserviert.
b) Vorkultur
Man bringt ein Kultur-Los (Ampullen-Lyophilisat) in einen Kolben ein, der 200 ml des weiter oben angegebenen hylsynthetischen Mhrbodens enthält, und führt die Zucht 6 Stunden bei 37 0C durch.
Hährboden:
Casein-Pankreatpepton (IBP) 1500 mg
β -Zystin 150 mg
dl-Tryptophan 20 mg
Z, -Tyrosin 200 mg
prim. Kaliumphosphat 4960 mg
d-Glykose, wasserfrei 12500 mg
Magnesiumsulfat, 7 HpO 500 mg
Bisenvitriol, 7 H„0 5 mg
Zinksulfat, 7 H2O 0,8 mg
Mangansulfat, 7 H2Q 0,3 mg
242 0 65 6 -6- 6109711
24.1.83
Chlorwasserstoffsäure, r. ρ, rauchend 17,8 mg
d-Biotin 15 mg
nikotinsäure 1 mg
Pyridoxin 1 mg
Riboflavin 1 mg
Thiamin 1 mg
Kalziumpentothenat 5 mg
Adenin HCl 10 mg
Urazil 10 mg
Cholinchlorid 10 mg
Asparagin 100 mg
destilliertes Wasser, q. s, p. · 1000 ml
c) Kultur
Die eigentliche Kultur erfolgt in einem Fermentiergefäß, das 18 ml des unter b) definierten Nährbodens enthält. Man beginnt die Kultur mit 1 % der Vorkultur, Die Kultur erfolgt bei 37 0C beim pH-Wert 7,4 unter Rühren im allgemeinen etwa 16 Stunden bis zum Ende der exponentiellen Y/achstumsphase,
d) Trennung der oben schwimmenden Phase
Am Ende der exponentiellen Phase trennt man sofort die oben schwimmende Phase durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 5000 U/min· Die oben schwimmende Phase wird einer sterilisierenden Filtration durch eine Milliporen-Membran 0,22 /U ausgesetzt und sofort verwendet oder bei -25 0G konserviert.
e) Extraktion
Ein Volumen von etwa 20 Liter der oben schwimmenden Phase wird durch Filtrieren durch eine Milliporen-Membran 10 , die die Moleküle eines Molekulargewichts gleich oder über 100 000 Dalton zurückhalten kann, konzentriert. Das so erhaltene Retentat wird durch eine Diaflon-10 -Membran ultrafiltriert, nachdem 5 Liter steriles und pyrogenfreies destillier tes Wasser zugesetzt wurden, um die Trennung nach dem Molekulargewicht zu vervollständigen·
c C
- 7 - 61.097 11
24.1.83
Mehrere nacheinander durchgeführte Dltrafiltrationen ermöglichen, auf etwa 350 ml zu konzentrieren, die in 1-Liter-Kolben iyophilisiert werden· Alle diese Arbeitsgänge werden bei einer Temperatur von höchstens 8 0C durchgeführt·
f) Reinigung
Das lyophilisierte Zwischenprodukt wird in 900 ml Phosphat-Tampon 0,01 M - pH-Wert 7 gelöst. Dann gibt man 20 mg Blase, Typ 1, 20 mg Pankreat-DUase und 180 yul (20 Einheiten/ml) RNase T1 hinzu. Danach erfolgt 4 Stunden bei 37 0C die Inkubation. Man gibt nun 170 mg Pronase, Typ 8, 900 /ul reines Phenol und 2 Tropfen Toluen hinzu· Man inkubiert das Gemisch eine lacht bei 37 0G. Danach wird die Reaktion gestoppt und es wird ein gleiches Volumen (900 ml) eines Butanol - Chlorform - Gemisches 1 : 1 zugegeben. Man rührt 1 Stunde, Uun werden die zwei Phasen durch Zentrifugieren bei 10 000 U/min 30 Minuten dekantiert. Die wäßrige Phase, die das Polyosid enthält, wird 60 h durch 20 Liter steriles destilliertes Wasser dialysiert· Das Dialysat wird durch eine Membran Amicon 10 ultrafiltriert. Das Retentat-Volumen beträgt 1140 ml. Man gibt 16O ml 40 %iges Hatriumazetat (Endkonzentration 5 %) und 3,9 Liter reines Ethanol (3 Volumenteinheiten) hinzu, Die Ausfällung wird durch ,Zentrifugieren bei 12 000 ü/min 30 Minuten aufgefangen· Diese Ausfällung löst man in pyrogenfreiem destilliertem Wasser. Man verteilt die Lösung auf Kolben mit einem Volumen von je 4 ml··- Es erfolgt eine Vakuum^ Lyophilisierung. Man erhält 9 g Produkt. Das ist der reine PoIysaccharid, der enthält:
- Zucker 64 %
- Proteine 0,8 %
- Hukleinsäure 0,8 %.
Alle Arbeitsgänge (außer die Inkubationen) erfolgen bei einer Temperatur zwischen 0 und +4 0C
242065 6
Beispiel 2
Polyosid pneumococcus vom Typ 23
Man geht von einem lyophilisierten Stamm Streptococcus pneumoniae vom Typ 23 aus» Die Kultur und die Trennung der oben schwimmenden Phase werden unter den in Beispiel 1 definierten Bedingungen durchgeführt (Stadien a bis d).
Die Extraktion und die Reinigung des Polyosids werden folgendermaßen vorgenommen:
e) Extraktion
Ein Volumen von 15 Litern der oben schwimmenden Phase wird unter den im 1, Beispiel definierten Bedingungen auf ein Volumen von 1,5 Liter konzentriert· Drei nacheinander durchgeführte Ultrafiltrationen ermöglichen die Konzentration und anschließend die Lyophilsierung. lan erhält 1,8 g Produkt mit folgender Zusammensetzung:
- Zucker 60 %
- Proteine 19 %
- Hukleinsäure 3,6 %.
f) Reinigung
Das lyophilisierte Zwischenprodukt wird mit 200 ml Phosphatpuffer 0,01 mol - pH-Wert 7 aufgenommen· Man gibt 1 mg Rlfese, 1 mg DHase und 20 Einheiten RNase T1/ml hinzu· Man inkubiert 3 Ii bei 37 0G. Hun erfolgt der Zusatz von Pronase Typ 8 (180 yug/ml), 1 /ul/ml Phenol und einem Tropfen Toluen,
inkubiert eine Nacht bei 37 0C.
Man führt nacheinander drei Extraktionen mit dem gleichen Volumen eines Gemisches (200 ml) Butanol/Chloroform 1 : 1 durch· Das Gemisch wird mechanisch bewegt·
Die wäßrige Endphase wird etwa 60 Stunden mit 4 1 sterilem und pyrogenfreiem destilliertem Wasser dialysiert.
24 2 0 85 6 -9- 6109711
24.1.83
Das Dialysat wird durch eine Membran Amicon 1O^ ultrafiltriert. Man konzentriert auf 50 ml« Man gibt nun 3 Volumeneinheiten reines Ethanol und latriumazetat (Endkonzentration 5 %) hinzu· Das Ganze läßt man eine Hacht bei -20 0C ruhen·
Die Ausfällung wird durch Zentrifugieren aufgefangen· Sie wird in sterilem, pyrogenfreiem destilliertem Wasser gelöst und anschließend lyophilisiert·
Man erhält 1050 g eines Produkts, das enthält:
- Zucker 75 %
- Proteine 1,7 %
- lukleinsäure 0,7 %
Alle Arbeitsgänge werden - falls nicht anders vorgeschrieben - zwischen 0 und +6 0G durchgeführt·
Beispiel 3
Polyosid pneumococcus Typ 19
Man geht von einem lyophilisierten Stamm Streptococcus pneumoniae vom Typ 19 aus· Die Kultur und die Trennung der oben schwimmenden Phase erfolgen unter den in Beispiel 1 definierten Bedingungen (Stadien a bis d).
Die Extraktion und die Reinigung des Polyosids werden folgendermaßen durchgeführt:
e) Extraktion
Indem man wie im Beispiel 1 vorgeht, konzentriert man ein Volumen von 75 Litern oben schwimmender Phase durch drei ültrafiltrationen auf 2 Liter. Man erhält 2,3 g mit folgender. Zusammensetzung:
- Zucker 30 %
- Proteine 15 %
24 2 0 65 6-10-
- Hukleinsäure 3,4 %·
f) Eeimigung
Das lyophilisierte Zwischenprodukt wird mit 150 ml Phosphatpuffer 0,01 mol - pH-Wert 7 gelöst. Man gibt 3 mg DUase, 3 mg RUase und 30 /Ul Rlase T1 zu. Man inkubiert dann 4 h bei 37 0C, Danach werden 62 mg Pronase, 150 /Ul Phenol und ein Tropfen Toluen zugesetzt. Das Ganze läßt man eine Hacht bei 37 0G reagieren· Nun erfolgt die Entproteinisierung durch das 1 : 1 - Chloroform-Butanol-Gemisch gleichen Volumens (3 Extraktionen hintereinander). Die wäßrige Phase wird 60 Stunden mit 4 Litern sterilen und pyrogenfreien destillierten Wassers dialysiert. Es erfolgt eine ultrafiltration des Dialysats durch eine Membran Amicon XM 100. Das Retentat wird durch 3 Volumeneinheiten Ethanol, das 5 %iges Uatriumazetat enthält, ausgefällt. Hach einer Uacht Verbleiben im Gefrierapparat wird das Präzipitat in sterilem und pyrogenfreiem Wasser gelöst und lyophilisiert. Man erhält 730 mg Produkt, das enthält:
- Zucker 73 %
- Proteine 0,2 %
- Efukleinsäure 0,5 %.
Auch hierbei werden alle Arbeitsgänge (außer Inkubationen) bei einer Temperatur zwischen 0 und +4 0C durchgeführt.
Beispiel 4
Polyosid pneumococcus vom Typ 1
Man geht von einem lyophilisierten Stamm Streptococcus •pneumoniae vom Typ 1 aus. Die Kultur und die Trennung der oben schwimmenden Phase erfolgen unter den Bedingungen von Beispiel 1·
r\ r\ r C C - H - 61 097 11
ZUuD O 24.1.83
Die Extraktion und die Reinigung des Polyosids werden folgendermaßen durchgeführtϊ
e) Extraktion
100 liter oben schwimmende Phase der Kultur werden durch PeI-licon-Kassetten (Millipore, Membran 10*) ultrafiltriert· Das Volumen des Endretentats beträgt 3 Liter, Die Lyophilisierung erfolgt in Kolben· Man erhält 6,1 g Produkt, das enthält:
- Galakturonsäure 46,5 %
- Proteine 7,7 %·
f) Reinigung
Man löst das erhaltene Produkt in 800 ml pyrogenfreiem EDS (steriles destilliertes Wasser). Es werden zugesetzt:
- 16 mg RNase
- 16 mg Dlase
- 16O /Ul RNase T1- '
Man inkubiert 4 Stunden bei 37 0C Dann gibt man 300 /Ul Phenol, 2 !Tropfen Toluen und 150 mg Pronase Typ 8 hinzu· Man inkubiert eine nacht bei 37 0C. Dann werden die Proteine noch durch Ghloroform-Butanol-Gemisch (1 : 1) gleichen Volumens extrahiert. Die wäßrige Phase wird 60 Stunden dialysiert. Die Ultrafiltration erfolgt durch eine Membran Amicon XM 100· Das Volumen des Endretentats ist 150 ml. Man fällt die Lösung durch 3 Volumeneinheiten kaltes Ethanol, das 5 %iges 2Jatriumazetat enthält.
Der Rückstand wird mit 250 ml pyrogenfreiem EDS wiederaufgenommen· In Glasfläschen erfolgt die Vakuumlyophilisation. Man erhält 3,7 g reines Polyosid, das enthält:
- Galakturonsäure 55,5 % (was 85 % Zucker entspricht) -Proteine 1 %
242065 6 -«-
Der Terteilungskoeffizient des Polyosids m Gel ICn ist 0,05·
7 Das Molekulargeivicht ist sämit mindestens 2 χ 10 »
Beispiel 5
Polyosid von K· pneumoniae vom Typ 2
Man geht von einem Stamm Klebsiella pneumoniae vom Typ 2 aus,
Die Kultur der Mikroorganismen und die Trennung der oben schwimmenden Phase erfolgen unter den im Beispiel 1.definierten Bedingungen (Stadien a bis d), jedoch verwendet man als Nährmedium den folgenden künstlichen Hährboden: Trinatriumzitrat 0,85 g
Ammoniumsulfat 0,17 g
Magnesiumsulfat 0,17 g
Glutaminsäure 0,17 g
d-Glukose 16,70 g
sek. Kaliumphosphat 10 g
prim. Kaliumphosphat 6,66 g
destilliertes Wasser, q.s.p. 1000 ml End-pH-Wert: 6,8
Die Extraktion und die Reinigung des Polyosids werden folgendermaßen durchgeführt:
e) Extraktion
Man verwendet 90 liter oben schwimmende Phase der Kultur» Es erfolgt eine ultrafiltration durch eine Pellicon-Kassette (2 Kassetten, Membran 10^). Dann werden 3 Spülungen mit 10 Liter Wasser vorgenommen, nachdem auf 1,5 Liter konzentriert wurde. Das Endretentat ist 2,6 Liter· Man lyophilisiert in Kolben und erhält 6,1 g Produkt, das enthält: - Zucker 50 %
-Proteine 15 %
24 2 0 65 6 " 13~ 61097
£.** ^. U U J U 24.1.83
f) Reinigung
Das erhaltene Produkt wird in 350 ml Wasser gelöst» Es werden zugesetzt:
- 7 ml Phosphatpuffer 0,5 mol, pH-Wert 7,0
- 7 mg RNase
- 7 mg DHase
- 70 /Ul RHase I1 .-
(vorherige Filtrierung der Enzyme durch 0,22 /u).
Man inkubiert 4 Stunden bei 37 0C. Danach gibt man 70 mg Protease vom Typ 8, 350 /Ul Phenol und 1 Tropfen Toluen hinzu· Man inkubiert eine Nacht bei 37 0C. Dann wird die Reaktion gestoppt und die Entproteinisierung durch 3 Extraktionen mit Butanol-Chloroform (1 : 1) zu Ende geführt· Man dialysiert die wäßrige Phase 60 Stunden durch pyrogenfreies EDS. Dann folgt die Ultrafiltration durch die Membran Amicon XM 100« Das Volumen des Endretentats ist 150 ml. Die Lösung wird durch 3 Volumeneinheiten kaltes reines Ethanol, das 5 $iges Uatriumazetat enthält, gefällt. Die durch Zentrifugieren aufgefangene Ausfällung wird in 250 ml Wasser gelöst, danach in Glasflaschen vakuumlyophilisiert· Man erhält ein reines Polyosid folgender Zusammensetzung:
- Zucker 76 (Hexosen/tEronsäure = 3:1)
- Proteine 3,8 %
Der Yerteilungskoeffizient Kn des erhaltenen Polyosids ist
XJ η
0,1· Das Molekulargewicht liegt somit über 10.
Beispiel 6
Polyosid von H. influenzae vom Typ b
Man geht von einem lyophilisierten Stamm Hemophilus influenzae vom Typ b aus.
24 2 0 65 6 -^- 61097
24.1.83
Die Kultur und die Trennung der oben schwimmenden Phase werden unter den im Beispiel 1 definierten Bedingungen durchgeführt (Stadien a bis d), jedoch wird als Mhrmedium der folgende halbsynthetische Mhrboden verwendet: Proteose Pepton 5 g
Natriumchlorid 3>5 g
d-Glukose 4g
prim, Kaliumphosphat 1,3 g
sek· Kaliumphosphat 3,5 g
MD (Mkotinadenosindinukleotid) 0,001 g Globulinextrakt 50 ml
destilliertes Wasser q*s.p· 1000 ml
Die Extraktion und die Reinigung des Polyosids werden folgendermaßen durchgeführt:
e) Extraktion
Man verwendet 30 liter oben schwimmender Phase der Kultur· Man führt eine Ultrafiltration durch eine Membran Millipore 100 000 (2 Kassetten) durch· Die erste Konzentration führt zu einem Volumen von 1 Liter. Man spült 3 mal mit 10 Liter EDS. Es folgt eine Konzentration auf 1,3 Liter. Man lyophilisiert in Kolben und erhält schließlich 3,9 g eines Produktes, das enthält:
- Zucker 53 %
- Proteine 13 %
Das erhaltene Produkt wird in 200 ml gelöst· Man setzt (nach
Piltrierung durch 0,22 /u) zu:
4,5 ml Phosphatpuffer 0,5 mol, pH-Wert 7,0 4 mg Blase
4 mg DUase
40 /ul KHase T*
24 2 0 65 6
- 15 - 61 097 11
24.1.83
Hun erfolgt 4 Stunden bei 37 0C eine Inkubation· Danach werden 65 mg Protease Typ 8, 200 /Ul Phenol und 2 Tropfen Toluen zugesetzt, lan inkubiert eine lacht bei 37 0G. Die Reaktion wird durch 3 Extraktionen mit Butanol-Chloroform-Gemisch (1 : 1) gestoppt. Die wäßrige Phase fängt man durch Zentrifugieren bei 12 000 ü/min, 30 Minuten bei +4 0C auf. Man dialysiert 60 Stunden mit p'yrogenem EDS (häufige Wechsel des Dialysemediums). Dann wird eine Konzentration durch die Membran Amicon XM 100 vorgenommen« (2 Spülungen χ 100 ml) Das Volumen des ültrafiltrats ist 100 ml· Das ültrafiltrat wird durch 3 Volumeneinheiten kaltes reines Ethanol, in dem 5 %iges latriumazetat enthalten ist, gefällt· Die durch Zentrifugieren aufgefangene Ausfällung wird in 100 ml pyrogenfreiem EDS aufgenommen. Die Lösung wird in Glasflaschen vakuumlyophilisiert»
Man erhält 1,3 g reines Polyosid folgender Zusammensetzung:
- s Zucker (PHP) 63 %
- Proteine 2 %
s Das Verhältnis der Bestandteile des Polyosids ist folgendermaßen: Eibose: Ribitol: Phosphor =0,9; 1; 0,98 (theoretisches Verhältnis =1:1:1).
Der. Verteilungskoeffizient Kg liegt nahe 0,1, was einem Molekulargewicht von etwa 10' entspricht.
Die erfindungsgemäß hergestellten immunisierenden Sporen-Polyoside können zur Herstellung von Impfstoffen zur vorbeugenden (oder heilenden) Anwendung bei Menschen und Tieren verwendet werden. Die Impfstoffe können physiologisch verträglichen Trägerflüssigkeiten wie z, B. einer physiologischen lösung oder Injektionsflüssigkeit beigemengt werden.
24 2 0 65 6
Zu diesem Zweck kann man ein oder vorzugsweise mehrere erfindungsgemäß erhaltene reine Sporen-Polyoside aus verschiedenen serologischen Grundformen zusetzen* Des weiteren können durch Zusatz von zwei oder mehreren aus verschiedenen Keimen erhaltenen reinen Sporen-Polyosiden polyvalente Impfstoffe hergestellt werden.
Im nachstehenden werden Versuchsergebnisse gegeben, die die imunisierende Wirkung der erfindungsgemäß erhaltenen PoIyoside zeigen·
a) Titration der Serum-Antikörper bei Mäusen
- Swiss-Mäuse männlichen Geschlechts von 20 g wurden auf Lose von 10 Tieren verteilt:
1 Vergleichslos wurde keinerlei Behandlung unterzogen.
1 Vergleichslos wurde durch mehrmalige intraperitoneale Verabfolgung einer Dosis Polyosid von Beispiel 1 an jedes Tier behandelt.
Die Titration der agglutinierenden Antikörper wurde gemäß den in der Literatur beschriebenen Techniken vorgenommen, zu denen durch das Polyosid mit Hilfe von Chromchlorid sensibilisierte rote Blutkörperchen von Schafen verwendet wurden.
Die Ergebnisse in der Tabelle I zeigen eine Zunahme des Serumtiters der agglutinierenden Antikörper bei den mit schwachen Dosen behandelten Tieren im Vergleich zu den Vergleichstieren und eine klassische Immunitätsparalyse bei starken Dosen*
- Analoge Versuche wurden bei Musen mit dem Polyosid von Beispiel 5 (Polyosid von Klebsieila pneumoniae, Typ 2) durchgeführt;
Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.
1 128 4 7 ,8 O O O 64 6 7,5 4096 8 13 ,9
2 128 + 1 7 ,84 O O 8 3 1,85 2048 + 2 12 ,02
3 128 7 O O 512 9 128 7
4 16 4 O O 32 5 128 7
5 4 2 O O 512 9 256 8
6 8 3 O O 256 8 128 7
7 64 6 O O 256 8 256 8
8 64 6 O O 1024 10 64 6
9 O O O O 128 6 256 8
10 64 6 O O 2048 11 4096 13
±
Tabelle 1 Mäuse - Serum-Titer der agglutinierenden Antikörper
Vergleiohstiere Behandelte Tiere Behandelte Tiere Behandelte Tiere CD
77 /Ug/Maus 0,77 /Ug/Maua 0,077 /Ug/Maus ^^
ρ 0,05 0,01
(1) Agglutinierende Antikörper umgekehrt zur Verdünnung f" ""*
(2) Agglutinierende Antikörper logg umgekehrt zur Verdünnung *ω v>
Tabelle II
Mr· Vergleichstiere (1) (2)
Behandelte Tiere Behandelte Tiere /Ug/kg Behandelte Tiere /Ug/kg Behandelte Tiere /ug/kg
1630 /Ug/kg 163 (2) 16,3 (2) 1,63 (2)
(1) (2) (1) (1) 3 (1)
O O 8 4 O 4
O O 16 5 16 4
O O 32 4 16 5
O O 16 3 32 6
O O 3 8 4 64 5
O 8 16 4 32 4
O O 1 16 4 16 5
O 2 16 5 32 6
O O 32 6 64 4
O O 64 16
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
10 0
cn
4,2 + 0,69 4,3 + 1,28
0,001 0,001
ro er»
(1) Agglutinierende Antikörper - umgekehrt zur Verdünnung
(2) Agglutinierende Antikörper - log0 des umgekehrten V/ertes zur Verdünnung co -j
24 2 0 65 6
- 19 - 61 097 11
24.1.83
b) Titration der Serum-Antikörper bei Ratten
Die gleiche ühtersuchung wurde an Ratten Sprague Dawly männlichen Geschlechts von 400 - 450 g durchgeführt.
Die 10 Tiere umfassenden Lose erhielten eine Injektion i. p. von 2 und 20 ,ng Polyosid von Streptococcus pneumoniae, Typ 3, je Tier.
Die Titration der agglutinierenden intikörper wurde am 4·, 6. und 14· Tag nach der Verabfolgung vorgenommen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle III gegeben·
In Übereinstimmung mit der Literatur nimmt der Titer allmählich zu und erreicht am 6. Tag seine Maximalhöhe«,
Tabelle III
Ratten - Serum-Titer - agglutinierende Antikörper logp des umgekehrten Wertes zur Verdünnung
Ur4, Vergleichstiere
'14
1 O O O
2 O O O
3 O O O
4 O O O
5 O O / O
6 O O O
7 O O O
8 O O O
9 O O O
Behandelte Tiere 2 /Ug/ßatte
J4 J6 J14
7 7 6 5 7 5 4 6
7 8 6 7 6
5 6 6 8
5 7 3 6
4 2 5 3 7
5,7 6,55 4,66 +0,89 +0,82 +1,46 0,001 0,001 0,001 Behandelte Tiere /Ug/Ratte
5 6 8
9 10
6 10
5 6
7,22 +1,66 0,001
'14
0 0 2 0 3 0 3 0 0
24 2 0 65 6 -21- 61097
24.1.83
c) Spezifischer Schutz
lose von 10 männlichen Mäusen Schweizer Herkunft wurden mit gemäß Beispiel 4 erhaltenen Polyosid von Streptococcus pneumoniae Typ 1 subkuten Immunisiert (zwei Injektionen in einer Woche Abstand); injizierte Dosen: 0,47 - 4,7 - 47 470 /Ug/kg.
Am 10· Tag nach der 2· Immunisierung wurden die Tiere mit virulenten Pneumococcus Typ 1 subkutan infiziert (1250 Keime/ Tier),
Die Mortalität nach zehn Tagen Beobachtung war folgende:
- nicht behandelte Tiere 100 %
- mit 0,47 /ug/kg behandelte Tiere 30 %
- mit 4,70 /Ug/kg behandelte Tiere 10 %
- mit 47,0 /Ug/kg behandelte Tiere 30 %
- mit 470 /Ug/kg behandelte Tiere 40 %
Lose von 10 männlichen Mäusen Schweizer Herkunft wurden subkutan mit dem Polyosid von KP« immunisiert (2 Injektionen in einer Woche Abstand - injizierte Dosen: 53.>- 533 - 5332/Ug/Jsg),
Am 8. Tag nach der letzten Verabfolgung wurden die Tiere mit dem Stamm von Klebsiella pneumoniae Typ 2 im Verhältnis von 650 Keimen je Tier injiziert· Die Mortalität nach 10 Tagen Beobachtung war folgende:
- nicht behandelte Tiere 100 %
- behandelte Tiere 53 /Ug/kg 0 %
- behandelte Tiere 533 /ug/kg 0 %
- behandelte Tiere 5333 / ug/kg 0 %
Die erfindungsgemäß erhaltenen Polyoside können insbesondere zur Herstellung folgender Impfstoffe verwendet werden:
24 2 0 65 6
a) Impfstoffe zur vorbeugenden und heilenden Behandlung von akuten und chronischen Atemleiden, die einen der reinen PoIyoside enthalten, die jedem der folgenden Keime entsprechen: Streptococcus pneumoniae Hemophilus influenzae. Typ b Klebsieila pneumoniae Escherichia coli
Als Beispielt
1) Mischung von Polyosiden von S· pneumoniae, Typen 1, 6, 14, 23 50 yug Polyosid von K· pneumoniae, Typ 2 20 Polyosid von H. influenzae, Typ b 20 Endvolumen 0,5 ml physiologisches Wasser
2) Mischung von Polyosiden von S, pneumoniae, Typen 1, 6, 14, 23 25 /Ug Polyosid von K, pneumoniae, Typ 2 10 /Ug Polyosid von H· influenzae, Typ b 10
b) Yakzin antipneumococcus, der die reinen Polyoside der Typen von Streptococcus pneumoniae enthält:
1, 3, 4, 6A, 7P, 8, 91, 12P, 14, 181, 19F, 23, 2, 11A, 15i".
Als Beis-piel;
Mischung a 50 /Ug, in einem Volumen von 0,5 ml physiologischem Wasser,
Mischung a 25 /Ug, in einem Volumen von 0,5 ml physiologischem Wasser·

Claims (3)

Erfindungsanspruch
1. Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Sporenpolyosiden aus Bakteriensporen, in denen sie enthalten sind, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Bakterienkultur in synthetischem oder halbsynthetischem Boden züchtet, am Ende der Wachstumsphase dieser Kultur die Mikroben einer oben schwimmenden Phase trennt, diese oben schwimmende Phase einer Filtration durch eine Membran aussetzt, die die Moleküle einer Molekularmasse gleich oder über 100 000 Dalton zurückhält, man auf diese Weise ein an Sporen-Polyosiden reiches Retentat erhält, man die Proteine, die Nukleinsäuren und die Lipide aus diesem Retentat eliminiert, wodurch man schließlich ein reines Sporenpolyosid erhält,
2« "Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Elimination der Proteine, Nukleinsäuren und Lipide aus dem Retentat dieses einer enzymatischen Hydrolyse unterzieht, man ein Butanol-Chloroform-Gemisch zusetzt, die wäßrige Phase abtrennt, sie einer Dialyse unterzieht und eine Filtration durch eine Membran durchführt, die die Moleküle mit einer Molekülmasse über 100 000 Dalton zurückhält·
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Kultur auf halbsynthetischem Boden züchtet, der weniger als 0,5 Gew»-% natürliche Stoffe enthält·
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