DE68914362T2

DE68914362T2 - Impfstoff, geeignet zur Verhütung bzw. Kontrolle der durch Haemophilus pleuropneumoniae verursachte Schweinekrankheit und Verfahren zu dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE68914362T2
Application number: DE68914362T
Authority: DE
Inventors: Elbarte Margriet Kamp; Leengoed Leonardus Adrianu Van
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Instituut
Current assignee: Centraal Diergeneeskundig Instituut
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1989-08-11
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2009-08-12
Also published as: JPH0725697B2; JPH02152930A; US5254340A; AR243385A1; ATE103816T1; DK394889A; DE68914362D1; CA1334388C; NL8802007A; DK394889D0; ES2055010T3; EP0354628B1; EP0354628A1

Description

Die Erfindung betrifft Impfstoffe, die zur Prophylaxe bzw. Kontrolle der durch Haemophilus pleuropneumoniae verursachten Erkrankung bei Schweinen geeignet sind, sowie ein Verfahren zur Gewinnung eines extrazellulären proteinartigen Materials aus Haemophilus pleuropneumoniae, das zur Verwendung in solchen Impfstoffen geeignet ist.
H. pleuropneumoniae ist das ursächliche Agens von Haemophilus-Pleuropneumonie bei Schweinen, die derzeit als eine der wichtigsten Störungen der Bronchialröhren bei diesen Tieren betrachtet wird (siehe inter alia, Maudsley J.R. et al. Can. J. Microbiol. 32 (1986), Seiten 801-805). Die Hauptsymptome des akuten Stadiums dieser Krankheit bestehen in dem Auftreten von hohem Fieber und einer extensiven, fibrinösen, hämorrhagischen, nekrotischen Lobärpneumonie, die mit einer fibrinösen Pleuritis einhergeht. Es wird angenommen, daß ein oder mehrere Toxine, die von H. pleuropneumoniae produziert werden, bei der obigen Pathogenese eine bedeutende Rolle spielen. Insbesondere wurde beobachtet, daß die endobronchiale Verabreichung von sowohl ultraschallbehandelten nichtvermehrungsfähigen H. pleuropneumoniae Zellen als auch eines zellfreien Überstandes, der aus Kulturmedium für H. pleuropneumoniae erhalten wurde, bei Schweinen zu einer lokalen Pneumonie führt, die der Pneumonie entspricht, die bei experimentell infizierten Schweinen auftritt. Der Artikel von Maudsley J.R. et al. (Can. J. Mikrobiol., 32, 801-805 (1986) konzentriert sich insbesondere darauf, ein Hämolysin-Produkt zu erhalten, das von H. pleuropneumoniae mit Hilfe eines chemisch definierten Mediums (CDM) produziert wird, das keine Proteine enthält, so daß das mit Hilfe des H. pleuropneumoniae-Stammes 12863 (Serotyp 3) erhaltene extrazelluläre Hämolysin-Produkt auf relativ einfache Weise abgetrennt werden kann. Das gemäß Maudsley et al. gefundene Produkt scheint in Experimenten ein hitzelabiles Protein zu sein, das derzeit jedoch nicht zu Impfzwecken verwendet werden kann. Das genannte Hämolysin-Produkt löst bei Mäusen eine hämorrhagische Pneumonie aus.
In "Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology", Bd. 87, Nr. 0, 1987, S. 40, Zusammenfassung Nr. B-91, P.J. Fedorka et al., wird angegeben, daß ein hämolytischer Faktor und ein zytotoxischer Faktor aus den H. pleuropneumoniae- Serotypen 1 und 5 identifiziert wurde, deren Faktoren hitzelabil und pH-empfindlich waren. Nach deren Verabreichung an Schweinelungen-Makrophagen oder Mäuse zeigten die genannten Faktoren offenbar die relevante Aktivität. Am Ende dieser Zusammenfassung wird angegeben, daß die Isolierung dieser Virulenzfaktoren die Impfstoff-Entwicklung und Krankeitsaufklärung fördern kann. Jedoch wird nichts darüber erwähnt oder sogar vorgeschlagen, was einen Universalimpfstoff betrifft, der den größten Teil oder sogar alle Serotypen von H. pleuropneumoniae bekämpfen kann.
Außerdem wird in "Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology", Bd. 88, 8.-13. Mai 1988, Nr. 0, S. 35, Zusammenfassung B-37, P.J. Fedorka et al., erwähnt, daß ein dialysiertes Hämolysin, das von dem H. pleuropneumoniae-Serotpyp 1 stammt, als aktive Komponente eines Impfstoffes geeignet war. Ein solcher Impfstoft würde einen deutlichen Schutz gegenüber einer klinisch manifestierten Krankheit und Lungenpathologie nach einer Provokation mit dem in Frage kommenden Serotypstamm bereitstellen. Am Ende dieser Zusammenfassung wird angegeben, daß das Hämolysin offenbar das Hauptimmunogen zum Schutz vor der durch H. pleuropneumoniae ausgelösten Krankheit darstellt. Diesbezüglich wird jedoch betont, daß in dieser letztgenannten Referenz nichts über den zytotoxischen Faktor des in Frage kommenden Mikroorganismus oder die Entwicklung eines Universalimpfstoffes gegen die vielen verschiedenen Serotypen von H. pleuropneumoniae erwähnt ist.
In Anbetracht des Bedarfs nach einer angemessenen Therapie für H. pleuropneumoniae bei Schweinen, hat der Anmelder, da diese Krankheit, die durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wird, einen endemischen Verlauf und eine hohe Sterblichkeitsrate aufweist, eine ausgedehnte Forschung bezüglich der Entwicklung eines Impfstoffes betrieben, der zur Prophylaxe bzw. Kontrolle eines großen Teils der bekannten Serotypen von H. pleuropneumoniae und vorteilhafterweise aller Serotypen von H. pleuropneumoniae geeignet sein sollte. In diesem Zusammenhang wird angemerkt, daß derzeit 12 Serotypen von H. pleuropneumoniae bekannt sind, während das Auftreten dieser Serotypen sich hinsichtlich der Regionen unterscheiden kann.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die obige Aufgabe mittels eines Impfstoffes erfüllt werden kann, der durch einen wirksamen Gehalt eines Gemisches aus extrazellulärem proteinartigem Material gekennzeichnet ist, das aus dem Kulturmedium von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm stammt, der einerseits aus der Gruppe der Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 ausgewählt ist, und andererseits extrazelluläres proteinartiges Material enthält, das aus dem Kulturmedium von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm stammt, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8.
Die in Frage kommenden Impfstoffe können folgendermaßen hergestellt werden:
(a) Anziehen eines H. pleuropneumoniae-Stammes, ausgewählt aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11, auf einem Kulturmedium, dem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zugegeben worden ist;
(b) Überführen der in (a) erhaltenden H. pleuropneumoniae-Organismen in ein Kulturmedium, das mit Serum oder Serumprodukten angereichert ist und kein NAD enthält;
(c) steriles Filtrieren dieses Mediums, so daß sich ein Filtrat ergibt, das das extrazelluläre proteinartige Material enthält; und
(d) Zusammenbringen des extrazellulären proteinartigen Materials, das von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 einerseits, und von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8 andererseits, stammt.
Das auf obige Weise erhaltene Filtrat kann, wo es sich als notwendig erweist, folgenderweise weiterverarbeitet werden:
1) Konzentrieren des in Frage kommenden Filtrats, beispielsweise durch Vermischen mit einer salzhaltigen Lösung, wie einer Ammoniumsulfatlösung (vorteilhafterweise eine mehr als 50 % gesättigte Lösung), um einen Niederschlag zu ergeben;
2) Auflösen des in (1) erhaltenen Niederschlags in einer physiologischen phosphatgepufferten Salzlösung (PBS); und
3) Dialysieren des in (2) erhaltenen Produkts gegen PBS, um ein dialysiertes proteinartiges Material zu ergeben.
Es wurde gefunden, daß das auf obige Weise erhaltene Filtrat oder proteinartige Material die Fähigkeit besitzt, bei Schweinen Antikörper zu erzeugen. Als Ergebnis dessen werden Schweine, die mit einem Gemisch aus den erfindungsgemäßen proteinartigen Materialien geimpft worden sind, gegenüber einer Infektion mit H. pleuropneumoniae immun.
Insbesondere wird Haemophilus pleuropneumoniae in dem obigen Schritt (a) auf beispielsweise Agar mit Schafblut gezogen, dem 0,1 % Nicotinamidadenindinucleotid (NAD, Flucka) zugesetzt worden ist. Die Blutagarplatten werden nach einer Inkubation von beispielsweise 6-8 Stunden bei etwa 37 ºC und ± 5-10 % CO&sub2; gewaschen. Die so erhaltenen Organismen werden gemäß dem obigen Schritt (b) verwendet, um ein flüssiges Medium, das Serum oder Serumprodukte und kein NAD enthalt, anzuimpfen. Das Ganze wird bei einer Temperatur von etwa 37 ºC inkubiert. Das angeimpfte Medium wird anschließend beispielsweise mit Hilfe einer Filtration sterilisiert.
Im Handel erhältliche Filter können verwendet werden, um die Filtration während des erfindungsgemäßen Schrittes (c) durchzuführen. Beispiele dafür sind Millex GV- Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um und außerdem der Mini-Kapselfilter von Gelman mit einer Porengröße von 0,45 um (Gelman Sciences Inc.).
Das erhaltene Filtrat kann, wenn nötig, noch weiter durch eine tropfenweise Zugabe von einem Volumenteil einer gesättigten Salzlösung, beispielsweise einer Ammoniumsulfatlösung, zu einem Volumenteil Filtrat bearbeitet werden. Der Niederschlag wird anschließend durch Zentrifugieren gesammelt. Der erhaltene Niederschlag wird sodann in PBS aufgelöst und gegen PBS dialysiert. Das dialysierte Material kann dann zur Herstellung des Impfstoffes verwendet werden. Außerdem kann dieses dialysierte Material zur Charakterisierung spezifischer, darin vorkommender Toxine, wie des zytotoxischen Toxins (CT) und des hämolysierenden Toxins (HT) verwendet werden.
Der Verlauf der Produktion des obigen Toxins CT und, sofern vorhanden, HT kann bestimmt oder überwacht werden, indem die Proben des angeimpften Mediums aus Schritts b mit Lungenmakrophagen oder Erythrozyten inkubiert werden. Beispielsweise können Lungenmakrophagen von Schweinen und Schaferythrozyten für diesen Zweck verwendet werden. Die Verdünnung der Probe, die nur zu einem Zelltod der Makrophagen oder zu einer Lyse der Erythrozyten führt, ist ein Maß für die Toxinkonzentration in dem Medium. Die biologische Aktivität von CT bzw. HT wird so verstanden, daß der Zelltod durch CT bzw. Lyse der Erythrozyten durch HT verursacht wird.
Das auf obige Weise erhaltene Produkt kann folgendermaßen charakterisiert werden:
1) Biologische Eigenschaften: Das gegen PBS dialysierte Produkt besitzt eine zytotoxische Aktivität und je nach kultiviertem Serotyp eine Hämolyse-Aktivität. Ferner verursacht das dialysierte Produkt, wenn es Schweinen endobronchial verabreicht wird, eine Pleuropleumonie, die histologisch mit der Pleuropneumonie identisch ist, die von H. pleuropneumoniae-Organismen ausgelöst wird.
2) Temperatur: Einfrieren des dialysierten Produkts bei -20 ºC oder -70 ºC für 48 Stunden hat keinen Einfluß auf die CT-Aktivität und auf die HT-Aktivität, die vorhanden sein können. Nach einem einstündigen Erhitzen des Produkts bei 120 ºC sind die biologische Aktivität von CT in Lungenmakrophagen von Schweinen und die möglicherweise vorhandene Aktivität von HT in Schaferythrozyten nicht mehr nachweisbar.
3) pH: pH-Änderungen mit NaOH und HCl für 2 Stunden bei Raumtemperatur führen nicht zu einer Inaktivierung von CT und des möglicherweise vorhandenen HT des dialysierten Produkts.
4) Proteolytische Enzyme: Die Inkubation des dialysierten Produkts bei -37 ºC für eine Stunde mit Dyspase II, einer Protease, inaktiviert die CT- und die möglicherweise vorhandene HT-Aktivität.
5) Lagerfähigkeit: Die CT- und möglicherweise vorhandene HT-Aktivität des nicht dialysierten und dialysierten Produkts halten mehrere Monate lang bei -20 ºC an.
6) Molekulargewicht von CT und HT: Natives CT/HT der Serotpypen 2 und 9 weist ein Molekulargewicht auf, das etwa höher liegt als 200 kD bzw. 400 kD mit einer Superose 6-Säule oder einer Superose -12-Säule. Dieser Unterschied wird wahrscheinlich durch eine Komplexbildung verursacht. Bei einer SDS-PAGE besteht das gereinigte CT/HT des Serotyps 9 aus zwei Banden, die beide ein Molekulargewicht von 100 ± 10 kD besitzen. CT/HT passiert ein pM 30 000- Amicon-Filter nicht.
7) Schutz: Schweine, die mit dem dialysierten Produkt geimpft worden sind, entwickeln Antikörper, die die CT- und HT-Aktivität neutralisieren. Schweine mit diesen neutralisierenden Antikörpern entwickeln nach Infektion mit einer H. pleuropneumoniae-Kultur keine akute Pleuropneumonie.
Wie oben erwähnt sind bisher 12 Serotypen von H. pleuropneumoniae bekannt. Die Erforschung von Wildtypstämmen von H. pleuropneumoniae hat gezeigt, daß die Unterschiede bei der Toxinproduktion (CT und möglicherweise HT) vom Serotyp und nicht vom Stamm abhängen.
Tabelle A, wie unten angegeben, zeigt die Ergebnisse der Kreuzneutralisation des Hämolysins, produziert von Referenzstämmen von H. pleuropneumoniae-Serotypen durch Antiseren, die gegen Zytotoxin/Hämolysin-Präparationen der genannten Stämme erzeugt wurden. Tabelle B im Anschluß daran zeigt die CT-Produktion von 11 Serotypen von H. pleuropneumoniae und die Neutralisationstiter mit Hilfe eines Antiserums, das in Kaninchen mit Hilfe des auf obige Weise dialysierten Produkts erzeugt wurde. TABELLE A Kreuzneutralisation von Hämolysin, produziert von Referenzstämmen von H. pleuropneumoniae-Serotypen durch Antiseren, die gegen Zytotoxin/Hämolysin- Präparationen dieser Stämme erzeugt wurden. Antiserum gegen Zytotoxin/Hämolysin-Präparationen des Serotyps Hämolysin von Stamm Serotyp a: Homologe Neutralisationstiter werden als reziproker Wert der höchsten Verdünnung ausgedrückt, die weniger als 50 % Hämolyse zeigt. +: Der heterologe Titer unterscheidet sich um weniger als das Vierfache von dem homologen Titer. -: Keine Neutralisation. TABELLE B Kreuzneutralisation von Zytotoxin, produziert von Referenzstämmen von H. pleuropneumoniae-Stämmen durch Antiseren, die gegen Zytotoxin/Hämolysin- Präparationen dieser Stämme erzeugt worden sind. Antiserum gegen Zytotoxin/Hämolysin-Präparationen des Serotyps Zytotoxin von Stamm Serotyp a: Homologe Neutralisationstiter werden als reziproker Wert der höchsten Verdünnung ausgedrückt, die weniger als 50 % Hämolyse zeigt. +: Der heterologe Titer unterscheidet sich um weniger als das Vierfache vom homologen Titer. -: Keine Neutralisation. ±: Der heterologe Titer unterscheidet sich um mehr als das Vierfache vom homologen Titer. b: Serotyp 12 war zur Zeit der Antiserum-Herstellung und während des größten Teils dieser Studie nicht erhältlich. Darum wird kein homologer Titer angegeben, und es wird zwischen + oder ± unterschieden.
Eine Kreuzneutralisation zwischen den Serotpyen 1, 5, 9 und 11 scheint deutlich aus den obigen Tabellen A bzw. B hervorzugehen. *Serotyp 6, der selbst kein CT bildet, erzeugt dennoch ein Antiserum mit Antikörpern, die zu den Stämmen der genannten Serotypen 1, 5, 9 und 11 gehören. Die Gruppe mit den Serotpyen 2, 3, 4 und 8 wird als zweite Gruppe von untereinander verwandten Serotypen erwähnt.
Schließlich nimmt der Stamm der Serotypen 7 und 12 eine getrennte Stellung ein. Stämme dieser Serotypen werden tatsächlich durch Antiseren aus den zwei oben angegebenen Gruppen, nämlich 1, 2, 4, 5, 6, 9 und 11, jedoch nicht durch die Seren der Serotypen 3, 8 und 10 neutralisiert. Außerdem neutralisiert Antiserum, das von dem Stamm des Serotyps 7 stammt, Stämme der Serotypen 7 bzw. 12.
Zusammenfassend kann aus den obigen Tabellen A und B entnommen werden, daß Impfstoffe, die aus den oben erwähnten Gruppen aufgebaut sind, nämlich einerseits aus den Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 und andererseits aus den Serotypen 2, 3, 4 und 8, einen Neutralisationseffekt erzeugen, der für alle Serotypen geeignet ist. Die Erfindung betrifft darum insbesondere Impfstoffe auf der Grundlage einer Kombination von extrazellulärem proteinartigem Material, das auf obige Weise aus H. pleuropneumoniae-Stämmen erhalten wurde, von denen wenigstens ein Stamm zu der zuerst genannten Gruppe der Serotypen 1, 5 , 6, 9 und 11, beispielsweise zu Serotyp 9, und der andere Stamm zu der letztgenannten Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8, beispielsweise zu Serotyp 8, gehört.
Darum folgt aus dem oben Gesagten, daß es mit Hilfe der oben angegebenen Kombination möglich ist, einen Impfstoff zu entwickeln, der eine Wirkung gegen alle bisher erforschten Serotypen, nämlich gegen die Serotypen 1 bis 12, aufweist, so daß die Erfindung einen Impfstoff bereitstellt, der praktisch universell anwendbar ist.
Die Verfahren und Materialien, die auf diesem Gebiet aus der bisherigen Technik bekannt sind, sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Präparationsverfährens geeignet. Insbesondere kann ein "chemisch definiertes Medium" (CDM), dessen Zusammensetzung in dem oben erwähnten Literaturzitat Can. J. Mikrobio., Bd. 32, (1986), Seite 802, angegeben ist, als Wachstumsmedium bei Schritt (a) des obengenannten erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Weitere Wachstumsmedien sind Trypticase- Sojabohnenagar mit 0,6 % Hefeextrakt (TSBYE) und Herzinfusionsagar (Difco), angereichert mit 5 % defibriniertem Schafblut (HIS).
Außerdem können aus der Literatur bekannte Stämme, wie ATCC 27088 (Serotyp 1) bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die bei dieser Forschung verwendeten H. pleuropneumoniae-Stämme wurden entweder von dem Anmelder tituliert oder von auf diesem Gebiet arbeitenden Forschungsinstituten erhalten. Insbesondere wurden die Stämme Shope 4074, 1536, 1421 (ATCC 27090), M62 (ATCC 33378) und K17 (ATCC 33377), die Referenzstämme für die Serotypen 1 bis 5 darstellen, von J. Nicolet (Universität Bern, Schweiz) erhalten. Der Stamm Fem∅, der den Referenzstamm für Serotyp 6 darstellt, wurde von R. Nielsen, State Veterinary Serum Laboratory, Kopenhagen, Dänemark (ATCC 33590) erhalten. Stamm WF83, der der Referenzstamm für Serotyp 7 ist, wurde von S. Rosendal (Dept. Vet. Microbiol., University of Guelph, Ontario) erhalten. Die Stämme 405, D13039 und 8329, die die Referenzstämme für die Serotypen 8, 10 und 12 sind, wurden von R. Nielsen (State Veterinary Serum Laboratory, Kopenhagen, Dänemark), und die Stämme 13261 und 56153, die die Referenzstämme für die Serotypen 9 und 11 sind, wurden von dem Anmelder selbst erhalten. Die Klassifizierung der Stämme in die bestimmten Serotypen ist aus der Technik im allgemeinen bekannt. Hinweise dafür sind in Veterinary Microbiology 13 (1987), Seiten 249-257, angegeben.
Die Erfindung wird noch unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert.

BEISPIEL I

Schritt (a)

Herstellung der Inokula

Der H. pleuropneumoniae-Stamm 13261 wurde auf Schafblutagar, angereichert mit 0,1 % Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) (SBV) gezogen. Die SBV-Platten wurden unter 5 % CO&sub2; und bei 37 ºC 6 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Platten mit 5 ml Eagle's Minimum-Essential-Medium (EMEM) mit Earle's Salzen abgespült, und die resultierende Bakteriensuspension wurde über Nacht bei 4 ºC aufbewährt und am nächsten Tag verwendet. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) wurde bestimmt, indem 10fache Verdünnungen der Bakteriensuspension auf SBV angeimpft wurden.

Schritt (b)

Der Herstellungsschritt für das Zytotoxin und Hämolysin (HT) wurde folgendermaßen durchgeführt.
12 Medien, wie in Tabelle C gezeigt, wurden mit 2 x 10&sup8; CFU H. pleuropneumoniae 13261 pro ml angeimpft. Die Kulturen wurden bei 37 ºC in einem Schüttelinkubator 6 Stunden lang inkubiert.

Schritt (c)

Sterilfiltration des Bakterienmediums

Nach dem Zentrifugieren (10 Minuten bei 800 x g) der Bakteriensuspensionen wurden die Überstände mit Hilfe eines Filters (0,2 um Gelman) sterilisiert, wonach die CT- und HT- Titer bestimmt wurden. Der CT-Titer wurde als reziproker Wert der maximalen Verdünnung des Überstandes, der alle alveolaren Makrophagen-Verdünnungen mit Nigrosin angefärbte, ausgedrückt, und der HT-Titer wurde als reziproker Wert der maximalen Verdünnung, die 50 % SRBC (Schaferythrozyten) hämolysierte, ausgedrückt. TABELLE C Medien CT-Titer HT-Titer EMEM (Eagle's Minimum-Essential-Medium) EMEM + 10 % Serum Plus (KC Biologicals) EMEM + 10 % Serum Plus + 0,1 % NAD EMEM + 100 %% SPF Schweineserum (SWS) EMEM + 0,1 % Glucose EMEM + 1 % BSA (Sigma) EMEM + 1 % hydrolisertes BSA EMEM + 10 % KC2000 (KC Biologicals) EMEM + 0,5 % Transferrin (Sigma) PBS + 10 % Serum Plus (KC Biologicals)
Die 2 x 10&sup8; CFU/ml H. pleuropneumoniae 13261, die im CT- und HT-Herstellungsschritt (Schritt b) verwendet wurden, stehen, wie in Figur 1 gezeigt, mit dem Optimum für die CT- und HT-Produktion in Verbindung. Wie aus dieser Figur hervorgeht, führt ein Animpfen mit einer Bakteriensuspension von mehr als 10&sup9; CFU/ml nicht zu einer höheren Toxinproduktion.
Wie aus Tabelle C oben entnommen werden kann, ergeben die mit Serum oder mit einem Serumprodukt angereicherten Medien, die kein NAD enthalten, weitaus die höchsten CT- und HT-Titer. Diese Titer weisen einen solchen Wert auf, daß wirksame Impfstoffe gegen Haemophilus pleuropneumoniae aus den erhaltenen Überständen gegebenenfalls nach einer weiteren Bearbeitung, wie Konzentrieren, hergestellt werden können.
Das obige erfindungsgemäße Verfahren wurde mit weiteren Stämmen der Serotypen 1 bis 12, die in den Tabellen A und B angegeben sind, wiederholt. Diese Tests zeigten jedoch, daß alle Stämme, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert worden sind (außer Stamm Fem∅ des Serotyps 6), das Zytotoxin produzieren, während die Produktion von Hämolysin nur im Falle der Stämme der Serotypen 1, 5, 9, 10 und 11 beobachtet werden konnte.

BEISPIEL II

Dieses Beispiel zeigt die Immunität von SPF-Schweinen, die mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff gegen H. pleuropneumoniae geimpft worden sind.

Schritt (a)

Herstellung der Inokula

Der H. pleuropneumoniae-Stamm 13261 wurde auf Schatblutagar, angereichert mit 0,1 % (NAD) (SBV), gezogen. Die SBV-Platten wurden unter 5 % CO&sub2; und bei 37 ºC 6 Stunden lang inkubiert. Danach wurde jede Platte mit 5 ml Eagle's Minimum-Essential- Medium (EMEM) mit Earle's Salzen abgespült. Die resultierende Bakteriensuspension wurde über Nacht bei 4 ºC aufbewahrt und am nächsten Tag verwendet.

Schritt (b)

Toxinherstellungsschritt

Serum Plus (Hazleton Research Products Inc., Lenexa, Kansas, USA) wurde gegen EMEM (V/V 9:1) dialysiert, während ununterbrochen 24 Stunden gerührt wurde 2,5 % Serum Plus wurde zu dem konditionierten EMEM gegeben, und das Animpfen wurde mit 2 x 10&sup8; CFU/ml der in Schritt (a) hergestellten Bakteriensuspension durchgeführt. Die Kultur wurde 6 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Die Kultur wurde anschließend zentrifugiert (15 min x 4000 g), wonach ein gleiches Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfätlösung langsam zu dem Überstand hinzugegeben wurde. Der Überstand wurde über Nacht bei 4 ºC unter kontinuierlichem Rühren aufbewahrt und am nächsten Tag zentrifugiert (60 min x 8000 g). Der Niederschlag wurde in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS, 0,123 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,0032 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,2) aufgelöst und 24 Stunden lang gegen PBS dialysiert, filtriert (Gelman, 0,2 um), um ein steriles Produkt zu ergeben, und schließlich in Öl emulgiert (V/V 1:1).

Schritt (c)

Impfung von Schweinen

Spezielle pathogenfreie (SPF) 6 Wochen alte Schweine (Kreuzung aus Great Yorkshire x Dutch Landrace) wurden für den Impftest verwendet. In diesem Test wurden 6 Schweine von 6 und 10 Wochen intramuskulär geimpft, während 4 Schweine als Kontrolltiere verwendet wurden. Vier Tage vor der Infektion in der 12. Woche wurde den Schweinen in die Ohrvene ein Katheter eingeführt, um eine häufige Blutabnahme zu ermöglichen. Die Blutproben wurden aus dem Katheter in der Ohrvene in evakuiertem EDTA-, Li- Heparin- und Serum-Röhrchen gesammelt. Die Proben wurden den Schweinen vor dem Impfen 2 x täglich während der vier Tage vor der Inokulation und 0, 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 32 und 48 Stunden nach der Inokulation (PIH) entnommen. Die Körpertemperatur der Schweine wurde nach der Entnahme der Blutproben bestimmt. Die Schweine wurden auf klinische Anzeichen hin untersucht. 48 Stunden nach der Inokulation wurden die Schweine mit Hilfe einer intravenösen Barbituratinjektion getötet und sofort einer Nekropsie unterzogen.
Die Infektion fand mittels einer endobronchialen Inokulation statt. Hier wurden die Schweine mit Diazepam (Hoffman La Roche) ruhiggestellt und ihr Kopf in eine vertikale Lage gebracht. Ein Katheter (Cordis Europa N.V., Netherlands) wurde anschließend durch den Kehlkopf in die Bronchien eingeführt, wonach 100 ml der Inokulationsflüssigkeit, die 10³ CFU des H. pleuropneumoniae-Stammes 13261 enthielt, langsam injiziert wurden. Der Katheter wurde anschließend schnell entfernt, und der Hals der Schweine wurde massiert, um ein Husten zu verhindern.

ERGEBNISSE

Nach der endobronchialen Inokulation mit 10³ CFU H. pleuropneumoniae-Stamm 13261 wurden alle nichtgeimpften Schweine infiziert und zeigten Schwierigkeiten beim Atmen von PIH 9 an aufwärts, während die geimpften Schweine kein Anzeichen einer klinisch manifestierten Krankheit zeigten.
Im Gegensatz zu den geimpften Schweinen, die kein Fieber entwickelten, zeigten die nichtgeimpften Schweine einen Fieberhöhepunkt bei PIH 12 (siehe Figur 2).
Geimpfte Schweine entwickelten neutralisierende Antikörper gegen Hämolysin und Zytotoxin des H. pleuropneumoniae-Stammes 13261 (siehe Figuren 3 und 4).
Bei der Nekropsie zeigten alle nichtgeimpften Schweine eine akute fibrinöse, hämorrhagische, nekrotische Pleuropneumonie des rechten Membranlappens der Lunge, der etwa 75 g wog. Keines der geimpften Schweine entwickelte eine Pneumonie, außer einem Schwein, das eine lokale katarrhale Pneumonie mit Konzentrationen von Hämorrhagien an der Inokulationsstelle entwickelte. Es wurden keine Induration oder weitere Abnormalitäten der Zervikalmuskeln an der Impfstelle beobachtet.
Daraus geht hervor, daß die mit Zytotoxin und Hämolysin geimpften Schweine gegen eine Infektion mit 10³ CFU H. pleuropneumoniae-Stamm 13261 geschützt waren. Im Gegensatz dazu liefert die Immunisierung von Schweinen mit Impfstoffen aus ganzen Zellen oder mit Impfstoffen, die einen Kapselextrakt von H. pleuropneumoniae aufweisen, keinen vollstandigen Schutz gegen eine homologe Infektion. (Rosendal, S., et al., 1986, Protective efficacy of capsule extracts of Haemophilus pleuropneumoniae in pigs. Vet. Microbiol., 12, Seiten 229-240.)
Zusammenfassend kann geschlossen werden, daß die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen H. pleuropneumoniae-Impfstoffe auf ihrer Fähigkeit beruht, neutralisierende Antikörper gegen H. pleuropneumoniae-Toxine und nicht gegen ihre Serotypen-spezifischen Antigeneigenschaften zu erzeugen.

Legende

Fig. 1: graphische Darstellung der CT- und HT-Produktion bei einer Inokulation mit einer Bakteriensuspension des H. pleuropleumoniae-Stammes, 13261 von 10&sup7; bis 10&sup9; CFU/ml.
Fig. 2: graphische Darstellung der rektalen Temperaturen (± SEM) geimpfter und nichtgeimpfter Schweine nach einer Endobronchialinfektion mit 10³ CTF des H. pleuropleumoniae-Stammes, 13261.
Fig. 3: graphische Darstellung der neutralisierenden Antikörper gegen Hämolysin des H. pleuropleumoniae-Stammes, 13261, in geimpften und nichtgeimpften Schweinen.
Fig. 4: graphische Darstellung der Menge von neutralisierenden Antikörpern gegen das Cytotoxin des H. pleuropleumoniae-Stammes, 13261, in geimpften und nichtgeimpften Schweinen.

Claims

1. Universalimpfstoff, der zur Prophylaxe und Kontrolle von Haemophilus pleuropneumoniae bei Schweinen geeignet ist, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt eines Gemisches aus einem extracellulären proteinartigen Material, das aus dem Kulturmedium von wenigstens einem H. pleuropneumoniae- Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 einerseits, und einem extracellulären proteinartigen Material, das aus dem Kulturmedium von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8 andererseits, stammt.

2. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

a) Kultivieren eines H. pleuropneumoniae-Stammes, ausgewählt aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11, auf einem Kulturmedium, zu dem Nicotinamidadenin-Dinucleotid (NAD) hinzugegeben worden ist;

b) Überführen der Organismen H. pleuropneumoniae, die in (a) erhalten worden sind, auf ein Kulturmedium, das mit Serum und/oder Serumprodukten angereichert ist und kein NAD enthält, und Kultivieren;

c) Sterilfiltration dieses Mediums, um ein Filtrat zu ergeben, das das extracelluläre proteinartige Material enthält; und

d) Kombinieren des extracellulären Proteinmaterials, das von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 einerseits, und von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8 andererseits, stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Stufe (a) und/oder (b) angegebene Inkubation bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 40 ºC, vorzugsweise bei 37 ºC, durchgeführt wird.

4. Verfahren zur Verarbeitung des durch das Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3 erhaltenen Filtrats, dadurch gekennzeichnet, daß

(1) das in Frage kommende Filtrat konzentriert wird, beispielsweise durch Vermischen mit einer salzhaltigen Lösung, wie einer wenigstens 50 gew.-%igen Ammoniumsulfätlösung, um einen Niederschlag zu ergeben;

(2) der in (1) erhaltene Niederschlag in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) aufgelöst wird; und

(3) das in (2) erhaltene Produkt gegen PBS dialysiert wird, um ein dialysiertes proteinartiges Material zu ergeben.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine gesättigte Ammoniumsulphatlösung in Stufe (1) verwendet wird.

6. Impfstoff, der zur Prophylaxe und Kontrolle von H. pleuropneumoniae bei Schweinen geeignet ist, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt von einem Gemisch aus proteinartigem Material, das aus dem Kulturmedium von wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 1, 5, 6, 9 und 11 einerseits, und aus wenigstens einem H. pleuropneumoniae-Stamm, ausgewählt aus der Gruppe der Serotypen 2, 3, 4 und 8 andererseits, stammt, wobei die proteinartigen Materialien nach einem oder mehreren der Ansprüche 2-5 erhalten werden.