-
Verfahren zur Herstellung von Vakzinen Beanspruchte Priorität : USA
Ser. No. 396 373 vom 14. September 1964 und USA Ser. No. 420 130 vom 21. Dezember
1964 Die Erfindung betrifft die HersteDung von somatischen Antigenvakzonen. Diese
somatischen Antigenvakzine sind Präparate von lysierten inaktivierten Bakterien,
welche die Bildung von Antikörpern im Patienten induzieren.
-
Eine typische Methode zur Herstellung von bakteriellen Vakzinen besteht
darin, Bakterien auf geeigneten Kulturmedien
zu zUchten, das erhaltene
Wachstum zu ernten, die Konzentration an Organismen zu standardisieren und dann
die Bakterien mittels Hitze, einem Konservierungsmittel oder sowohl Hitze und Konservierungsmittel
zu inaktivieren oder abzutöten.
-
Bakterienvakzine können aus Laboratoriumsstämmen von Bakterien oder
aus Bakterien hergestellt werden, die direkt von dem das Vakzin erhaltenden Patienten
stammen. Im letzteren Fall werden sie als autogene Vakzine bezeichnet. Vakzine,
welche mehrere Bakterienstämme enthalten, werden polyvalente Vakzine genannt.
-
Vakzine, welche Bakterien enthalten, die zu zwei oder mehr Species
gehören, werden als gemischte Vakzine bezeichnet.
-
Vakzine können auch aus Fraktionen der Bakterien oder aus bakteriellen
Exsudaten hergestellt werden. Beispiele für letztere sind Diphterie-und Tetanustoxide.
Im Fall der vorliegenden Erfindung werden die Bakterien vollständig lysiert, so
daß alle bakteriellen Antigene, die inneren und äußeren, in wirksamer Form vorliegen.
Diese Art von Vakzin sei somatisches Antigenvakzin genannt. Vakzine, die erfindungsgemazez
hergebe !)' !. !, sind, können vom monovalenten, polyvalenten oder gemischen Typ
sein.
-
In der Patentschrift....... (US-Patentanmeldung Ser. No.
-
260 057 vom 20. 2. 1963) ist ein Verfahren zur Herstellung von somatischen
Antigenvakzinen beschrieben, das die Lyse von
abgetöteten Zellen
von pathogenen Bakterien umfaßt, indem sie der Einwirkung eines proteolytischen
Enzyms, wie Dornase (desoxyribonuclease) unterworfen werden, was die Lyse der Zellen
ohne Zerstörung der Antigenwirkung hervorruft.
-
Es wurde nun gefunden, daß die Lyse der Zellen stark erleichtert werden
kann, indem die Zellen in einem Medium gezüchtet werden, das einen Aminosäurebestandteil
oder Aminosäurebestandteile enthält, der bzw. die die Entwicklung von geschwächten
Zellwänden begünstigt bzw. begunstigen. Als Ergebnis davon werden die geschwächten
Bakterien sehr leicht lysiert, wenn sie erst einmal durch ein geeignetes Konservierungsmittel
oder Bakterizid, wie Thimerosal, inaktiviert sind. Thimerosal ist der Gattungs-oder
Handelsname fUr Natriumathylmercurithiosalicylat ur wird zur Zeit als Konservierungsmittel
oder Abtötungsmit-el bevorzugt, doch könen auch andere, wie Thymokresol, Benzalkoniumchlorid
und Phenol, verwendet werden. Im vorliegenden FaDe wurde Thimerosal verwendet, das
von der Firma Eli Lilly & Co. unter dem eingetragenen Warenzeichen Merthiolate
hergestellt wird.
-
Die Verwendung von Glycin beim Aufbrechen der Bakterienzellen Murde
schon von E. S. Maculla und P. B. Cowles in"Science," Band 107, Seite 376 (1948)
beschrieben. In dieser Veröffentlichung wird das Glycin in verhältnismäßig hohen
Kontentrationen zur Zellmasse nach der Ernte zugegeben. Wie sich jedoch durch
mikroskopische
Prüfung ergibt, ist das Aufbrechen minimal und die erhaltenen Extrakte sind wahrscheinlich
auf die Elution von intrazellularem Material in die Glycinlösung zurückzuführen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Glycin anfänglich
zum Züchtungsmedium zugegeben, so daß die erhaltenen Bakterien Zellwdnde haben,
die der Lyse besonders zugänglich sind. Tatsächlich wurde gefunden, daß in einigen
Fällen Zellen eine ausreichende Atolyse erleiden, um das Erfordernis von zusdtzlichen
Behandlungen zu vermeiden, Versuche, somatische Antigenvakzine nach der Arbeitsweise
von Maculla und Cowles herzustellen, waren in den Laboratorien der Anmelderin nicht
erfolgreich. Es wurde eine Reihe von Versuchen mit gewissen Staphylococcus-Organismen
durch Zugabe von Glycin zu Lebendkulturen bei Konzentrationen von 0, 5 % bis 3,
5 durchgeführt. Ein weiterer Versuch wurde mit typhoiden Organismen durchgefuhrt,
und in diesem Falle wurde eine Konzentration von 7, 5 % Glycin angewandt. Bei keinem
dieser Versuche war eine Lyse der Zellen nachweisbar, noch wurde ein wirkliches
Aufbrechen der Zellen erhalten, obwohl angenommen wird, daß die Konzentration an
Proteinstickstoff in der Uberstehenden Lbsung zunahm. Anschließende Priifungen der
Potenz bzw. Aktivität in Versuchstieren zeigten, daß die auf diese Weise hergestellten
Staphylococcus-Vakzine und
Typhus-Vakzine keine merkliche immunisierende
Aktivitdt besaßen.
-
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein verbeseertes Verfahren
zur Herstellung von somatischen Antigenvakzinen aus Bakterien, wobei Bakterien in
einem Nährmedium gezüchtet werden, das eine oder mehrere der Aminosäuren enthält,
die bei der Synthese der Zellstrukturen durch diese Bakterien verwertet werden oder
diese Synthese begleiten, und zwar in ausreichender Menge, um zur Bildung von Bakterien
zu führen, die empfindlicher gegen Lyse sind.
-
Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die
Herstellung eines Mastitis-Vakzins zur Verwendung fü die Immunisierung von Kuhen
gegen Mastitis. Mastitis wird gewöhnlich durch Staphylokokken-'oder Streptokokkenorganismen
oder durch ein Gemisch der zwei Arten hervorgerufen. Mastitis kann auch wenigstens
teilweise durch andere Organismen, wie Escherichia Coli, hervorgerufen werden. Dengem§B
kann das erfindungsgemäß erhältliche Mastitis-Vakzin ein Staphylokokken-Vakzin,
ein Streptokokken-Vakzin, ein gemischtes Streptokokken-und Staphylokokken-Vakzin,
oder irgendeines der drei, zu welchem das somatische Antigenvakzin von E. Coli zugegeben
wurde, sein. Das erfindunggemaß erhältliche somatiache Antigenvakzin von E. Coli
wird durch aine Kombination der anf§-nglichen ZUchtung in
Glycin
und der nachfolgenden Lyse, unterstützt durch sin geeignetes proteolytisches Enzym,
wie beispielsweise Pronase (eingetragenes Warenzeichen) hergestellt. Eine weitere
Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Herstellung eines somatischen Antigenvakzine
mit Chlostridium. So wurde beispielaweise Chlorstridium Chauvoei-Vakzin für Rauschbrand
bei Rindvieh auf eine Weise ähnlich der, wie sie für E. Coli-Vakzin angewandt wurde,
hergestellt und mit Erfolg geprUft.
-
Ale weiteren Aspekt ergibt ee die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung von somatischem Antigenvakzin von Bakterien, die aus der Gruppe
Staphylococcus, Streptococcus und Neisseria und Qlostridium gewählt sind, das die
Stufen der Züchtung der Bakterien in einem Glycin in einer die Lyse begunstigenden
Konzentration von zwischen etwa 0, 01 und 5, 0 % Gewicht/Volumen enthaltenden Medium
umfaßt.
-
Als weiteren zusätzlichen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung von somatischem Antigenvakzin von Bakterien, die aus
der Gruppe Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria und Clostridium gewählt sind,
wobei das Glycin im Züchtungsmedium in ausreichender Menge, um die Bildung von Bakterien
mit geschwächten Zellwänden hervorzurufen, vorliegt, wodurch die Lyse solcher Zellen
erleichtert wird, wenn einmal die Bakterien durch geeignete Konservierungsmittel
inaktiviert
sind. Vorzugsweise sollte das Züchtungsmedium zwischen etwa 0, 1 und etwa 5, 0 Gew.
% Glycin enthalten.
-
Somatische Antigenvakzine wurden gemäß der hier beschriebenen Erfindung
hergestellt und untersucht. Einige Beispiele von typischen Präparaten und von Untersuchungen,
die an den Ergebnissen dieser Präparate durchgeführt wurden, sind hier wiedergegeben.
Diese Beispiele und Prüfungen sollen die Erfindung in keiner Weise beschranken.
-
Ohne daß dadurch eine Festlegung oder eine Beschränkung auf /sei diese
Erklärung vorgenommen wird angenommen, daß der hohe Grad an Antigenwirkung, der
sich bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ergibt, auf die Retention derjenigen
Antigensubstanzen in dem Vakzin zurückzuführen ist, von denen -man annimmt, daß
sie für die Immunität verantwortlich sind.
-
Die Vakzine sind im allgemeinen verhältnismäßig klar bei praktischer
Abwesenheit von Sediment und ganzen Zellen.
-
Die optimale Konzentration von Glycin kann in weitem Umfang schwanken,
je nach dem Organismus. FUr die meisten untersuchten Organismen fiel die optimale
Konzentration in den Bereich von etwa 0, 1 bis 5, 0 % Gewicht/Volumen. Es wurde
beobachtet, daß im allgemeinen die Lyse umso schneller
erfolgt,
je höher der Gehalt an Animosäure ist, der ohne nachteilige Beeinflussung des Wachstums
verwendet werden kann.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
-
Beispiel 1 Zwar ist das zur Herstellung der Vakzine einiger der folgenden
Beispiele verwendete Medium ein modifiziertes Frantz-Medium ('Natson & Scherp.
J. Immunol., 81, Seite 331 (1958)), doch ist ersichtlich, daß in einigen Fällen
andere Medien bevorzugt sein können.
-
Lösung A-Casaminosäuren (technisch) DIFCO 10 g Cystin (1, 2 %-ige
Lösung in 0, 1 n-HC1) 1, 0 ml KC1 0, 090 g NaH2HP04. 12 H20 6, 5 g Phenolrot 0,
1 %-ige Lösung 8,0 ml Destilliertes Wasser ad 1000 ml Lösung B-MgS04. 7 H20 2, 4
g Glukose 20, 0 g Destilliertes H20 ad 100 ml
Casaminosäuren sind
ein Caseinhydrolysat, das Material von niedrigem Molekulargewicht enthält. Jede
Ldsung wird mit NaOH auf pH 7, 4 eingestellt und für 15 Minuten bei 121° C im Atoklaven
behandelt. Normalerweise wird bei Verwendung des Frantz-Mediums die Lösung B aseptisch
zur Lösung A in einer Menge von 0, 25 ml/Liter für allgemeine Verwendungszwecke
zugegeben. Die Erfahrung hat gezeigt, daß es fUr einige Species von Bakterien besser
ist, wenn dieser Mengenanteil geändert wird. Ho wurde beispielsweise gefunden, daß
die folgenden Mengenanteile für folgende verschiedene Organismen bevorzugt werden
: Neisseria 50 ml B zu 1 1 A Staphylococcus 15 ml B zu 1 1 A Streptococcus 40 ml
B zu 1 l A Beispiel 2 Herstellung von Meningococcus-Vakzin Die Impfkulturen wurden
direkt aus lyophilisierten Ampullen in Kolben übertragen, die 250 ml des Mediums
von Beispiel 1 enthielten, und bei 37° C über Nacht (etwa 18 Stunden) auf einer
Schüttelmaschine, die auf 40 Upm eingestellt war, inkubiert. 20 ml aus den Impfkolben
wurden in Literkolben eingeimpft, die 500 ml des modifizierten Frantz-Mediums, das
1 % Gewicht/Volumen Glycin enthielt, aufwiesen. Das Glycin kann zur LUsung A zum
Zeitpunkt der Herstellung der aseptis¢h
zum Gemisch vor der Beimpfung
zugegeben werden. Die beimpften Kolben wurden dann in gleicher Weise wie die Impfkolben
auf einer Schüttelmaschine, die auf 40 Upm eingestellt war, für 18 bis 20 Stunden
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kolben aus dem Inkubator genommen, und
eine 1 : 100 Lösung von Merthiolate wurde zu jedem 500 ml-Kolben zugegeben, so daß
sich eine Endkonzentration von 1 : 10. 000 Merthiolate ergab. Die Kolben wurden
dann eine Woche bei Zimmertemperatur belassen. In dieser Zeitspanne hatte sich das
Vakzin, das zu Beginn gewöhnlich eine Nephelometerablesung entsprechend einem Mc
Farland Standard von 3 aufwies, vollständig geklärt und zeigte die Ablesung 0. Die
Vakzine wurden dann auf Sterilität, Unschädlichkeit, Toxizität, Pyrogenität und
Aktivität gepruft (vgl. Beispiel 6).
-
Meningococcus ist der übliche Name für Neisseria menigitidis der Familie
Neisseriaceae. PUr dieses Beispiel wurden die folgenden Meningococcusstämme verwendet
: M 1027 (S. Branham) Z 1 (Lapeyssonnie) M 129 (Lapeyssonnie) Beispiel 3 Herstellung
von Staphylococcus-Vakzinen Staphylococcus-Vakzine werden im wesentlichen wie in
den Beispielen
1 und 2 hergestellt, doch wurde gefunden, daß verschiedene
Konzentrationen an Glycin für optimale Lyse der verschiedenen Stämme erforderlich
sind, wie anschließend angegeben ist.
-
% Stämme im Phagengruppe Stamm No. Phagentypus % Glycin Humanvakzin
1 584763 (80/81) 3, 5 30 II 596535 (3A/3B/3C) 3, 5 30 III 596510 7/47/53/54/75 3,5
30 IV 596297 42 D 4, 5 5 ? ? 6032 KS 6 3, 5 5 Die Staphylococcus-Vakzine halten,
wie gefunden wurde, ihre Aktivität nach der Behandlung im Autoklaven bei 120 C und
1, 41 atü (20 psig) Druck für 15 Minuten bei.
-
Beispiel 4 Herstellung von Mastitis-Vakzin Dieses Vakzin, das eine
Kombination von Staphylococcus-und Streptococcusorganismen ist, unterschied sich
bei seiner Herstellungsweise darin, daß die Organismen auf einem festen Medium statt
in einer Flüssigkeit gezüchtet wurden. Die Impfstämme wurden zuerst auf 2 % Nähragarschrägkulturen
für 18 Stunden bei 37°C für etwa 20 Stunden gezüchtet, und das Wachstum wurde entweder
mit sterilem destilliertem
Wasser oder 0, 5 %-iger Salzlösung abgewaschen.
Bei Verwendung von Salzlösung erfordert die Lyse eine längere Zeit. Die Ernteorganismen
haben eine Konzentration von etwa 3 x 1010 Organismen je ml und ergeben eine Ablesung
von 10 auf einem Mc Farland-Nephelometer. Es ist ersichtlich, daß Zellen auch in
einer Nährbruhe statt auf festem Nähragar gezüchtet werden können, in welchem Fall
die Zellkonzentration in der Größenordnung von etwa 1 x 108 # je ml sein kann. Die
Zellen waren praktisch vollständig zwischen 7 und 10 Tagen nach der Zugabe von Merthiolate
zu einer Endkonzentration von 1 : 10. 000 lysiert. Die optimale Konzentration von
Glycin für die Bewirkung der Lyse schwankt mit dem Organismus. Es wurde die Erfahrung
gemacht, daB die geeignetsten Konzentrationen für Glycin für verschiedene Stämme,
die auf Nähragar gezüchtet wurden, die folgenden sind : % der Stämme in Mastitis-Vakzin
Staph. Stamm 584763 - 3,0 % Glycin 15 ""596535-3, 0 %"10 "596510-3, 0 %"15 " " 6032
- 3,5 % " 20 " " 596297 - 3,5 % " 10 Staph. Hundestamm-1, 5 %"10 Strep. A 36 (1118)-1,
0 % " 10 "C (1628)-1, 5% 10
Wenn andererseits die Streptococcusorganismen
A 36 (1118) und C (1628) weggelassen werden, wäre eine geeignete Kombination wie
folgt : % der Stämme in Mastitis-Vakzin Stamm 584763-3, 0 % Glycin 15 " 596535 -
3 0 %"15 "596510-3, 0 %"25 6032-3, 5 »"30 " 596297 - 3,5 % " 10 Staph. Hundestamm
- 1,5 % Glycin 5 Beispiel 5 Herstellung von Streptococcus-Vakzin Verwendete menschliche
Stämme : Typ A 36 1118 Typ A 19 616 Typ A 12 602 Mit lyophilisierten Ampullen wurden
Flaschen von Herzinfusionsbrühe beimpft und uber Nacht bei 37° C gezunhtet. 10 ml
Impfkultur wurden zu jeweils 500 ml-Ansätzen von Frantz-Medien, die 2 % Glycin enthielten,
zugegeben, und diese wurden dann bei 37Q C auf Schüttelvorrichtungen für 20 Stunden
inkubiert.
-
Bakterienzählungen der lebenden Organismen wurden durchgeführt, und
es wurde genug von einer 1 : 100 Merthiolate-Stammlösung zugegeben, um eine Endkonzentration
von 1 : 10. 000 zu ergeben.
-
Die Kolben wurden dann bei Zimmertemperatur gehalten, bis die Lyse
beendet war. Dies erforderte 7 bis 10 Tage.
-
Prufungen auf Bakteriensterilität, Toxizität, Sicherheit und Aktivität
wurden durchgefuhrt, nachdem die Organismen vollständig lysiert waren.
-
Beispiel 6 Ergebnisse Die folgenden Tabelle I und II sind Beispiele
von Ergebnissen, die bei Prüfungen erhalten wurden, die an Kaninchen mit Mastitis-Vaksin
durchgeführt wurden, das sowohl aus Staphylococcus-als auch aus Streptococcusorganismen
erhalten war. Vier Kaninchen wurden für die Einzelgruppe verwendet.
-
Jedes Kaninchen erhielt 1 ml Vakzin intramuskulär und 0, 2 ml intradermal
in jede von 5 Stellen vF dem Rücken des Kaninchens. Zwei Wochen später wurden zwei
der Versuchstiere intradermal mit einer 0, 1 ml-Dose von 15 verschiedenen Stämmen
von Staphylococcus und die restlichen zwei mit einer 0, 1 ml-Dosis von 15 verschiedenen
Streptococcenstämmen auf Immunität geprüft.
-
Vier Kontrollkaninchen (nicht mit Vakzin behandelt) erhielten die
gleiche Dosis der gleichen Stämme zur gleichen Zeit und in der gleichen Weise wie
die mit Vakzin behandelten Tiere injiziert. Zwei Tieren wurden die Staphylococcen
und den anderen zwei die Streptococcen injiziert. Die Kaninchen wurden zwei bis
vier Tage beobachtet. Am Ende dieser Zeitspanne sollten die Kontrolltiere einen
großen nekrotischen Bereicn
bei jeder Injektionsstelle haben, während
die Injektionsstellen bei den immunisierten Kaninchen sauber oder verhältnismäßig
sauber sein sollten. In den folgenden Tabellen sind die Ergebnisse der beim tatsächlichen
Versuch erhaltenen Zonengrößen wiedergegeben. Die Größen sind in mm angegeben, ein"x"zeigt
das Vorhandensein von Pustelbildung und Nekrose.
-
Tabelle I Mit Staphylococcus-Vakzin (menschlich) geimpfte und mit
15 Styphylococcusstämmen in einer Verdünnung von 1 : 75 aus lyophilisierten Ampullen
von 0, 1 ml je Stelle auf Immunität geprüfte Kaninchen.
-
Kontrollkaninchen Staph. P. S. A. Vakzincharge 7-3 (getrockn.
-
Kaninchen Kaninchen Kaninchen Kaninchen No. 4 No. 3 No. 5 No. 6 Staph.
Staph. Staph. Staph.
-
20x10 20 x 25 x 15 x 20 x 0 0 0 0 0 0 15x15x25 x 20 x 20 x 25 x 0
5 0 0 0 5 45x10 25 x 15 10 25 x 0 0 0 5 0 0 20x20x25 x 15 x 15 25 x 5 0 5 5 5 5
25x25x20 x 25 x 25 x 15 x 10 10 0 5 5 0
Tabelle II Mit Mastitis-Vakzin
geimpfte und intradermal mit 15 Staphylococcen-oder 15 Streptococcenstämmen auf
Immunität geprufte Kaninchen.
-
Kontrollkaninchen Mit Mastitis-Vakzin No 4-3G geimpfte geimpfte Kaninchen
Staph. Strep. Staph. Strep.
-
10x25x20x 20x15 10 0 0 10 20x 0 5 15x30 0 30x25x20 10 10 5 0 10 5
5 50x10 10 15 10 10 5 5 0 0 0 35x20x40x 10 20xl0x 10 0 5 0 0 0 40x30x30x 25x20x15
5 5 5 0 0 0 Rötung keine Rötung festgestellt festgestellt Staph. ImmunitätsprUfung
: 15 Stämme 1 : 75 Verdünnung 0, 1 ml je Stelle Strep. Immunitätsprüfung : 1 : 50
Verdünnung 0, 1 ml je Stelle Es ist ersichtlich, daß ein hoher Grad an Schutz bei
Verwendung der erfindungsgemäß erhältlichen Vakzine erzielt wird. Es wurde gefunden,
daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten somatischen Antigenvakzine
im allgemeinen wirksamer sind als entsprechende übliche Ganzbakterienvakzine und
weniger Nebenreaktionen bei Menschen hervorrufen als Ubliche Ganzbakterienvakzine.
-
Das PrUfungsverfahren fUr Meningococcus-Vakzine beatand darin, 60
Niuse zu immunisieren, wobei 20 Mäuse jeweils fUr drei getrennte Verdünnungen, wie
in Tabelle III angegeben, verwendet wurden. 20 Mäuse wurden als Kontrolle gehalten.
Zwei bis drei Wochen später wurden die Tiere mit einem lebenden virulenten Meningooccus-Stamm
(Neiseeria Meningitidis) der Immunitätsprüfung unterzogen, und die Tiere wurden
fUr eine Zeitspanne von einer Woche beobachtet. Die Ergebnisse einer typischen PrUfung
sind in Tabelle III aufgezeichnet.
-
Der Immunitätsprüfungsstamm für diesen Versuch war der Stamm Z 1 des
Hygienischen Laboratoriums des Kanadischen GeSundheits-und Sozialministeriums (Canadian
Dept. of Health and Nelfare Laboratory of Hygiene's strain Z 1). Es wurde eine in
Frantz-Medium auf einer Schüttelmaschine gezüchtete und bei 37° C inkubierte 4-Stunden-Kultur
verwendet. Die Immunitätsprüfungsdosis war in 4 % Mucin suspendiert und wurde intråperitoneal
bei 1, 0 ml je Maus verabreicht.
-
Tabelle III Todesfälle Verdiinnung 24 Std. 48 Std. 72 Std. 144 Std.
Über lebe@ de Vakzine von unverdunnt 0/20 2/20 2/20 2/20 18/20 Memingo SA No. 1
1-5 3/20 6/20 6/20 6/20 14/20 Gruppen 2 u. 3 zusammenge- 1- 10 6/20 7/20 9/20 10/20
10/20 nommen Vakzine von unverdunnt 2/18 2/18 2/18 2/18 16/18 Meningo PSA No. 1
1 - 5 0/20 0/20 0/20 0/20 20/20 Gruppen 4 u. 5 zueammenge-1-10 5/20 11/20 11/20
11/20 9/20 nommen Kontrollen 15/20 18/20 18/20 18/20 2/20 Die Ergebnisse in Tabelle
III zeigen, daß dieses somatische Antigenvakzin M§usen guten Schutz verleiht.
-
Beispiel 7 Stämme von Escheria coli (E. coli) wurden auf einem modifizierten
Frantz-Medium wie in den Beispielen 1 und 2 gezUchtet.
-
Es wurde ausreichend Glycin zum Medium zugegeben, um eine Konzentration
von 1, 5 % Gewicht/Volumen zu liefern. Die Inkubation
betrug 18
bis 24 Stunden bei 37° C auf einer SchUttelmaschine. Dann wurde Merthiolate zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 : 10. 000 zu ergeben. Die Kulturen wurden dann wieder
auf der SchUttelmaschine für 18-24 Stunden inkubiert. Prüfungen der Keim-bzw. Entwicklungsfähigkeit
wurden zu diesem Zeitpunkt durchgeführt um zu gewährleisten, daß alle Bakterien
inaktiviert waren.
-
Noch auf der Schüttelmaschine wurde ein Proteaseenzym, das aus Streptomyces
griseus stammte, zu den Kolben in einer oder zwei Stufen zugegeben. Insgesamt wurden
10 Mikrogramm des Enzyms bei 24-stündigem Schütteln zwischen den Zugaben zugefügt.
Das Schütteln wurde 1-3 Tage lang fortgesetzt, bis die Lyse praktisch vollständig
war. Es wurde ein verhältnismäßig klares Vakzin erhalten, das sich als wirksam m
für den Schutz von Mäusen gegen die Immunitätsprüfung mit Stämmen von E. coli, die
dem Vakzinstamm homolog waren, erwies. Ein Beispiel einer typischen Prüfung ist
in Tabelle IV gezeigt. Dieses Vakzin kann in kleinen Mengenanteilen zu Mastitis-Vakzin
zugegeben werden, da einige Fälle von Rindermastitis auf E. coli zurückzuführen
sein können. Es kann auch Verwendung in der Humanmedizin zum Schutz vor infantiler,
durch E. coli hervorgerufener Diarrhöe, finden.
-
Ergebnisse Tabelle IV Escherichia coli Stamm : Ergebnisse der Immunitätsprüfung
# Immunitäts-Anzahl der Stamm Vakzin prüfung Mäuse Überlebende Nr.
-
A 634760 0-26 0-26 10 9 Kontolle-0-26 10 0 B 634760 0-26 0-26 9 7
Kontrolle-0-26 10 0 Beispiel 8 Herstellung von Vakzin gegen Rauschb@and Impfmaterial
Fünf Stämme von Chlorstridium chauvoei, z. B."WHW","F", Deal Oklahoma und Tosper,
werden auf Leberthioglykolatbrühe bei 37° C für 24 Stunden gezüchtet. Diese Impfkulturen
werden dann zur Beimpfung des Produktionsmediums in einer Menge von 1, 0 ml je 100
ml Medium verwendet. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums ist wie folgt :
Bestandte
@il % Gew./Vol.
-
Trypton 4 0 Natriumchlorid 0, 5 Hefeextrakt 0, 5 (Amber X) L-Cystein
0, 05 (Amber X) Glycin 0,25 - 0,75 (wechelt mit dem Stamm) MgSO4#7H2O 0,5 Dextrose
0, 5 (aseptisch aus steriler 50% iger Stammlösung zugefügt) Der pH-'Nert wird mit
5 n NaOH auf 7, 8 eingestellt, bevor bei 121° C 15 Minuten lang zur Sterilisation
im Autoklaven behandelt wird.
-
Literatur : J. Comp. Path. 67, 157 (1957) Produktion Die Produktionskulturen
werden bei 37° C fUr 24 Stunden gezüchtet und dann mit 0, 5 %-igem Formalin inaktiviert.
-
Dann wird Pronase in einer Menge von 5, 0 mcg/ml aus einer Stammlösung,
die 0, 25 mg/ml enthält, zugegeben. Nach der Zugabe des Enzyme wird der pH-Wert
mit 5 n NaOH auf 8, 0 eingestellt. Dieses wird bei 45° C fUr eine Stunde in einem
Wasserbad aktiviert und dann bei Zimmertemperatur 7-10 Tage stohen gelassen, tAglich
auf Änderungen des pH-Wertes boobachtet und erforderlichenfalls aingeetellt, und
der
Fortechritt der Lyse wird beobachtet. Nach beendeter Lyse wird
das Lysat auf Sterilität, Sicherheit und Aktivität in iiblicher Weise geprüft.
-
Prüfung-Aktivität 5 Meerschweinchen wurden intramuskular mit 1, 0
ml Chlorstridium chauvoei-Vakzin geimpft, das aus lysierten ganzen Zellen, wie oben
beschrieben, hergestellt war. 10 Tage später wurde eine 1, 0 ml-Wiederholungaimpfung
auf gleiche Weise verabreicht. 10 Tage nach der Wiederholungsimpfung wurden diese
5 Meerschweinchen zusammen mit 5 nichtgeimpften Kontrollmeerschweinchen intramuskulär
mit 0, 5 ml einer Standard Clostridium chauvoei-Sporensuspension, die 10 M. L. D.
-
(min. let. Dosis) in 0, 5 ml Suspension enthielt, auf Immunitdt geprUft.
Vier (80 %) der fünf geimpften Meerschweinchen überlebten. Alle fUnf nichtgeimpften
Meerschweinchen starben.
-
Beispiel 9 Lyse mit anderen Aminosäuren Zwar ist Glycin eine bevorzugte
Aminosäure, doch können auch andere Aminosäuren die Lyse von Bakterienzellen in
einer ähnlichen Weise unter Bildung von wertvollen Vakzinen begünstigen. Dies ist
in Tabelle V gezeigt.
-
Tabelle V Aminosäure Konzentration Anzahl der Organismen Staph. Stamm
Staph. Stamm Lyse No. 584763 No. 596297 L-Arginin 1, 0 7 x 107 8, 5 x 107 + D,L-Asparaginsäure
2,5 1 x 107 3 x 107 + L-Histidin 1, 5 1 x 107 8 x 107 + D, L-Valin 3, 0 5 x 107
8 x 107 + L-Prolin 3, 0 2 x 107 6 x 107 + Glycin (Kontrolle) 3,5 2 x 107 12 x 107
+ Weitere Stämme von Bakterien, die bei der Herstellung wertvoller Vakzine verwendet
werden, sind die folgenden : Staphylococcus 1645, 591714, 598022, 597497, 595354,
598074, 6003.
-
Streptococcus 1510T35, 589T1, 601T11, 618T22, 599T9.
-
Meningococcus D2 (Lapeyssonnie), M 111, N1 (Lapeyssonnie), 962 (Brannon)
M132 (Lapeyssonnie) Bakterien von besonderem Interesse sind diejenigen der Familien
Micrococcacene, Lactobacteriaceae, Bacillaceae, und Enterobacteriaceae.
-
In diesen Familien finden sich die Genus Neisseria, Staphylococcus,
Streptococcus, Escherichia und Clostridium.
-
PatentansprEche :