DE60213785T2

DE60213785T2 - Saponin inaktivierte mykoplasma impfstoffe

Info

Publication number: DE60213785T2
Application number: DE60213785T
Authority: DE
Inventors: Vet.Labs Agency Robin Ashley John Surrey NICHOLAS
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2001-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2022-05-04
Also published as: GB0110851D0; DK1387693T3; US20040170652A1; CA2445997A1; MXPA03010053A; EP1387693B1; WO2002089838A1; ES2269672T3; DE60213785D1; ATE335505T1; PT1387693E; CY1107538T1; EP1387693A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen inaktivierten Stamm von Mycoplasma bovis, der ein ursächlicher Erreger von Rinderpneumonien ist, welcher als ein Impfstoff bei Rindern verwendbar ist, Verfahren zur Herstellung desselben und dessen Verwendung.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen inaktivierten Stamm von Mycoplasma bovis.
Mycoplasmen sind Mikroorganismen ohne Zellwände und sind deshalb a) pleomorph und b) beständig gegen Antibiotika der β-Lactamingruppe, wie Penicillin. Mycoplasmen variieren beträchtlich in ihrer Zusammensetzung von ihrer Zellmembran und insbesondere in der Menge von darin eingebautem Cholesterin. Die Membran von M. mycoides SC ist von einer Kohlenhydratschicht (Galactan) umgeben. Außerdem haben Mycoplasmen innewohnend starke Mutationsraten und können somit schnell Systeme entwickeln, die Inaktivierung bekämpfen können (beispielsweise Herstellung von Enzymen usw.), wie in ihrer Reaktion auf Antibiotika ersichtlich wurde, wo Resistenz schnell entwickelt wurde.
Mycoplasma bovis ist eine primäre Ursache für Kalbspneumonien, Arthritis, Mastitis, Augenkrankheit und andere Zustände weltweit, und es wurde geschätzt, dass es die Rinderindustrie jährlich Millionen Pfund Verluste aufgrund Mortalität und Rückfall kostet. Kalbspneumonie ist ein komplexes Syndrom, das Bakterien, Viren und Mycoplasmen einschließt. Es wird angenommen, dass in Europa zwischen 25–33 der Kalbspneumonien Mycoplasma bovis einbeziehen.
Neue Stämme von Mycoplasma bovis zeigen erhöhte Resistenz gegen einen Bereich von Antibiotika (Ayling R. et al. (2000) Veterinary record 146, 745–747), und es gibt deshalb einen Bedarf für einen wirksamen Impfstoff.
Impfstoffe, die von inaktivierten Stämmen von Viren oder Bakterien abgeleitet sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Der pathogene Mikroorganismus wird mit einer Chemikalie, wie Formaldehyd, der den Organismus schädigt, zu einem solchen Ausmaß behandelt, dass er bei dem behandelten Tier keine Infektionskrankheit verursachen kann. Beispielsweise kann die Fähigkeit des Organismus, sich fortzupflanzen, irreparabel geschädigt werden. Jedoch antigene Schlüsselregionen des Organismus werden beibehalten, was eine Immunreaktion in dem Lebewesen stimuliert. Diese Reaktion kann eine Schutzwirkung bereitstellen, wenn das Lebewesen später mit einem potenten Stamm des Organismus provoziert wird.
Verschiedene inaktivierende Mittel haben verschiedene Wirkmodi, um die gewünschte Wirkung zu erreichen. Einige Mittel binden DNA, andere zerstören oder inaktivieren essentielle Proteine und eine weitere Klasse von inaktivierenden Mitteln kann die Zellmembran zerstören. Die Wirkung der Mittel wird im einzelnen Fall von der Beschaffenheit des Mikroorganismus abhängen. Somit werden die erreichten Ergebnisse im Ergebnis der innewohnenden Variabilität der Mikroorganismen variabel sein.
Rurangirwa et al. Veterinary Record (1987) 121, 397–402, und Tola et al., Vaccine 17 (1999) 2764–2768, beschreiben experimentelle Impfstoffe, die auf inaktivierten Stämmen von F38 Mycoplasma bzw. Mycoplasma agalactiae basieren. WO01/34189, das nicht an dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde und so unter Art. 54(3) EPC fällt, beschreibt Impfstoffe für Mycoplasma bovis.
Es ist nicht klar, ob die Anwendung von einem besonderen inaktivierenden Mittel das gewünschte Ergebnis in jedem einzelnen Fall erzeugen wird. Dies ist insbesondere der Fall bei verschiedenen Spezies, wo die Reaktion auf ein einzelnes inaktivierendes Mittel sehr verschieden sein kann. Dies gilt insbesondere im Fall von Komplexorganismen, wie Mycoplasma bovis.
Ein experimenteller vierwertiger Impfstoff, der mit Formalin abgetötete Antigene von Mycoplasma bovis und M. dispar zusammen mit viralen und bakteriellen Komponenten enthielt, wurde untersucht (Howard et al. (1987) Veterinary Record 121, 372–376). Der Impfstoff schloss Quil A als Hilfsmittel bzw. Adjuvans ein, und, obwohl wirksam, war es nicht erfolgreich genug, um kommerziell hergestellt zu werden. Formalin inaktivierte Impfstoffe unter Einbezug von M. bovis und Mannheima haemolytica (Urbaneck et al. (2000) Der Praktische Tierarzt 81, 756–763) und unter Einbezug von zwei Stämmen von M. bovis (Rosenbusch R. (1998) Proceedings of 12^th Congress of the International Organisation of Mycoplasmology, Sydney, Seite 185), wurden mit gemischtem Erfolg ebenfalls mitgeteilt. Ein mit Formalin behandelter Mycoplasma bovis-Impfstoff gegen Kalbsarthritis unter Einbezug von Saponin als Hilfsstoff war immunogen und verminderte die Ausbreitung von Infektion auf andere Gelenke bei einer kleinen Anzahl von Kälbern (Poumarat F. et al. (1999) Proceedings of International Symposium of Ruminant Mycoplasmas, Toulouse, Juni 1999, Seite 65).
GB 1 074 920 betrifft einen Impfstoff für einen Pleuropneumonie artigen Organismus (PPLO), der zur Humanverwendung geeignet ist, und ein Wachstumsmedium für Mycoplasma pneumoniae. In diesem Fall wird das Mycoplasma pneumoniae in einem sterilen Medium inkubiert, das verdampften Chloroformextrakt von verdicktem Eigelb einschließt, bis Antikörper induzierende Aktivität verliehen wird, durch Anwendung von Formalin inaktiviert, und auf konzentriert. Solche mit Formalin behandelten Impfstoffe werden jedoch allgemein nicht als wirksam angesehen. Außerdem ist der beschriebene Impfstoff für ein spezifisches Human-Mycoplasma und würde gegen Rinderpneumonien bei Lebewesen nicht ausreichend schützend sein.
Eine Vielzahl von Versuchen wurde ausgeführt, um einen Impfstoff für Mycoplasmen zu formulieren, die der ursäch liche Erreger für Rinderpneumonien sind. Keiner war jedoch besonders erfolgreich.
Die Anmelder haben jedoch überraschenderweise gefunden, dass durch Inaktivieren eines Stamms von Mycoplasma bovis, der einen ursächlicher Erreger für Rinderpneumonien darstellt, mit Saponin besonders wirksame Impfstoffe hergestellt werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Stamm von Mycoplasma bovis bereitgestellt, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, welcher durch Behandlung mit Saponin inaktiviert wurde.
Wenn Saponin angewendet wird, wird die Zellmembran vorzugsweise nur teilweise zerstört und ist nicht vollständig zerstört. Auf diese Weise werden die Zellen am Wachsen gehindert, behalten aber dennoch die antigen Schlüsselregionen der Organismen bei, welche die Immunreaktion in dem Lebewesen stimulieren.
Im Gegensatz zur Herstellung von einigen anderen Impfstoffen, die den Schritt der Lyophilisierung einschließen können, ist es nicht notwendig, das Mycoplasma zu lyophilisieren, um den erfindungsgemäßen Impfstoff herzustellen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Saponin" auf Sapogeninglycoside, die von Pflanzen, wie Quillagarinde, abgeleitet sein können. Eine Vielzahl von Saponinen, die verschiedene Mengen an Sapogenin enthalten, ist von Sigma erhältlich.
Diese Verbindungen sind für ihre hämolytische Wirkung bekannt und können als Hilfsstoffe für Impfstoffe verwendet werden.
Der Stamm von Mycoplasma, der einen ursächlichen Erreger für Rinderpneumonien darstellt, ist ein Stamm von Mycoplasma bovis. In dieser Hinsicht wird ein inaktivierter Stamm von M. bovis in Impfstoffen verwendet, um gegen Pneumonien, die durch M. bovis verursacht werden, zu schützen.
Stämme von Mycoplasma bovis sind aus einer Vielzahl von Quellen erhältlich. Jedoch geeignete Stämme können aus Rind isoliert werden, insbesondere von den Lungen des Rinds, die unter Pneumonie gelitten haben. Mycoplasma bovis Stamm 96B/96, der in der vorliegenden Anmeldung verwendet wurde, wurde aus den Lungen eines Kalbes isoliert, das an Pneumonie verendet war.
Die erfindungsgemäßen Stämme können in Impfstoffen verwendet werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie überraschenderweise einen hoch wirksamen Impfstoff darstellt. Da die erfindungsgemäßen Impfstoffe inaktiviert sind, sind sie außerdem als Lebendimpfstoffprodukte inhärent sicherer und stabiler.
Somit umfasst ein weiterer Aspekt der Erfindung eine veterinäre Zusammensetzung, umfassend einen inaktivierten Stamm von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien, wie vorstehend beschrieben, darstellt, in Kombination mit einem veterinär verträglichen Träger.
Der Träger kann, in Abhängigkeit von dem vorgesehenen Verabreichungsmodus des Impfstoffs, fest oder flüssig sein. Im Allgemeinen ist der Impfstoff jedoch zur parenteralen Verabreichung vorgesehen. Flüssige Träger, wie sterile wässrige oder ölige Träger, für das intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Dosieren können deshalb bevorzugt sein.
Somit liegen die erfindungsgemäßen veterinären Zusammensetzungen in geeigneter Weise in Form einer sterilen injizierbaren, wässrigen oder öligen Suspension vor, die gemäß bekannten Verfahren, unter Anwendung von einem oder mehreren der geeigneten dispergierenden oder Netzmittel und suspendierenden Mittel, formuliert werden kann. Eine sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral verträglichen Verdünnungsmittel, beispielsweise eine Suspension in 1,3-Butandiol, sein.
Beispiele für suspendierende Mittel, die in der erfindungsgemäßen Formulierung verwendet werden können, schließen Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxy propylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanthgummi und Akaziengummi ein. Die wässrigen Suspensionen können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel (wie p-Hydroxybenzoesäureethyl- oder -propylester) oder Antioxidantien (wie Ascorbinsäure) enthalten.
Vorzugsweise umfasst die veterinäre Zusammensetzung nur einen Stamm von Mycoplasma gemäß der vorliegenden Erfindung und Saponin in einer gepufferten Salzlösung.
Ölige Suspensionen können durch Suspendieren des Wirkbestandteils in einem Pflanzenöl (wie Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl) oder in einem Mineralöl (wie flüssigem Paraffin) formuliert werden.
Dispergierbare Pulver und Granulate, die zur Herstellung einer wässrigen Suspension durch Zusatz von Wasser geeignet sind, enthalten im Allgemeinen den Wirkbestandteil, zusammen mit einem Dispergier- oder Benetzungsmittel, suspendierenden Mittel und einem oder mehreren Konservierungsmittel(n).
Die Menge des Wirkbestandteils, der mit einem oder mehreren Exzipienten zur Herstellung einer einzelnen Dosierungsform kombiniert wird, wird notwendigerweise mit dem behandelten Wirt und dem besonderen Verabreichungsweg variieren. Beispielsweise wird eine flüssige Formulierung, die zur subkutanen Verabreichung an Rinder und insbesondere Kälber vorgesehen ist, im Allgemeinen beispielsweise 0,1 mg bis 0,5 mg/ml eines Stamms von inaktiviertem Mycoplasma bovis, der einer ursächlichen Erreger für Rinderpneumonien darstellt, angemischt mit einer geeigneten und passenden Menge an Exzipienten enthalten. Dosierungseinheitsformen werden im Allgemeinen etwa 0,1 mg bis etwa 2 mg, geeigneter Weise etwa 0,2 mg bis 1 mg eines Stamms von inaktiviertem Mycoplasma, das einen ursächlichen Erreger für Rinderpneumonienstamm darstellt, enthalten. In dieser Hinsicht wird ein inaktivierter Stamm von M. bovis in Impfstoffen verwendet, um gegen Kalbspneumonien, die in Europa vorkommen, zu schützen.
Die Größe der Dosis für prophylaktische Zwecke wird natürlich gemäß der Beschaffenheit, dem Alter des Lebewesens und dem Verabreichungsweg, gemäß gut bekannten Prinzipien der Medizin variieren. Im Allgemeinen wird die Zusammensetzung jedoch an junge Kälber verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weitere Komponenten umfassen, die auf dem Fachgebiet bekannt sein würden. Beispielsweise können sie Hilfsstoffe bzw. Adjuvantien, wie Aluminiumverbindungen oder Freund'sches unvollständiges Adjuvants, einschließen. Saponin, falls in der Zusammensetzung vorliegend, als ein Ergebnis seiner Anwendung als ein inaktivierendes Mittel, wird jedoch auch eine Hilfswirkung aufweisen, und es ist deshalb unwahrscheinlich, dass weitere Hilfsstoffe erforderlich sein würden.
Falls vorliegend, wird Saponin geeigneter Weise in einer flüssigen Zusammensetzung der Erfindung in einer Menge von mindestens 1 mg/ml vorliegen, um eine Hilfswirkung zu erzeugen. Vorzugsweise wird es in einer Menge von etwa 1–10 mg/ml und geeigneter bei etwa 2 mg/ml vorliegen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines inaktivierten Stamms von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, wie vorstehend beschrieben, bereit, wobei das Verfahren Inkubieren eines Stamms von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, in Gegenwart von Saponin umfasst.
Die Menge des die Zellmembran zerstörenden Mittels, das während der Inkubation vorliegt, sollte ausreichend sein, um den Stamm zu inaktivieren, und dies wird deshalb zu einem großen Ausmaß von der Konzentration des Stamms innerhalb der Kultur, der genauen Beschaffenheit des Stamms, dem besonderen verwendeten Mittel usw. abhängen. Wenn jedoch Saponin das Mittel bzw. Adjuvans darstellt, sollte es im Allgemeinen in der Inkubationskultur in einer Menge von etwa 0,5–10 mg/ml, vorzugsweise bei etwa 2 mg/ml, vorliegen.
Einmal auf diese Weise behandelt, kann der inaktivierte Stamm isoliert und, wie vorstehend erörtert, formuliert werden. Jedoch kann das direkte Produkt als eine Impfstoffformulierung verwendet werden, vorausgesetzt, alle Komponenten sind veterinär verträglich.
Wenn dies der Fall ist, liegt Saponin in der Formulierung vor und kann eine Hilfswirkung ausüben.
Deshalb kann Verhinderung von Krankheit beim Rind, die durch einen Stamm von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, verursacht wird, durch Verabreichen einer wie vorstehend beschriebenen veterinären Zusammensetzung an das Rind erreicht werden. Geeigneter Weise wird die Zusammensetzung als eine einzelne Dosis verabreicht, jedoch können, falls erforderlich oder notwendig, Auffrischungsdosen verabreicht werden und diese können durch übliche klinische Verfahren bestimmt werden. Zur parenteralen Verabreichung können wie vorstehend beschriebene Dosierungseinheiten verwendet werden.
Die Erfindung wird nun genauer mit Hilfe von Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von Mycoplasma bovis Impfstoff
Eaton's Brühenmedium wurde durch Auflösen von Difco PPLO-Brühengrundlage (21 g) (ohne Kristallviolett) in 700 ml destilliertem Wasser hergestellt. Frisch hergestellter Hefeextrakt (100 ml) wurde, zusammen mit unbehandeltem Pferdeserum (200 ml), Glucose (10 g) und Penicillin (0,5 ml von 200 000 IU/ml), 0,2% Phenolrot (12,5 ml) und 0,02% DNA, zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,6–7,8 eingestellt und durch Filtration sterilisiert.
Ein Universalbehälter mit einer gefrorenen aliquoten Menge der Masterimpfzubereitung (10. Passage von Mycoplasma bovis-Stamm 86B/96, isoliert aus den Lungen eines Kalbs, das an Pneumonie verendete), gehalten in 10 ml Volumen bei –70°C, wurde vollständig in warmem Wasser aufgetaut.
Dies wurde zu 90 ml Eaton's Brühenmedium, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, gegeben und 48 Stunden bei 38,5°C inkubiert. Dies wurde in 900 ml Volumen Eaton's Medium subkultiviert und bei 38,5°C für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden bei 10 000 G für 30 Minuten zentrifugiert und in dem gleichen Volumen von Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS pH 7,2) resuspendiert. Die Zellen wurden wie vorher zentrifugiert, in 1/10 des ursprünglichen Volumens in PBS resuspendiert und eingestellt, um ungefähr 0,5 mg/ml (ungefähr 10⁸ Kolonie bildende Einheiten pro ml) zu enthalten.
Die Mycoplasmazellen wurden mit Saponin bei 2 mg/ml über Nacht bei 37°C inaktiviert. Die Suspension wurde in aliquote Mengen von 20 ml Volumen aufgeteilt und bei 4°C gelagert.
Beispiel 2
Biologisches Testen
Der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Impfstoff (2 ml) wurde subkutan in jedes Kalb von vier Gruppen von sieben oder acht Kälbern mit einem Alter von etwa 4 Wochen inokuliert.
Die vier Gruppen Rinder wurden getrennt gehalten.

• Gruppe A (geimpft/provoziert), enthaltend 7 Kälber, wurde mit 2 ml Impfstoff subkutan inokuliert und 3 Wochen später mit Aerosolverabreichung von virulentem M. bovis (Stamm 5063) an aufeinander folgenden Tagen provoziert.
• Gruppe B (nicht geimpft/provoziert), enthaltend 7 Kälber, wurde mit Placebo injiziert und dann wie für Gruppe A provoziert.
• Gruppe C (nicht geimpft/nicht provozierte Kontrollen), enthaltend 8 Kälber, wurde als nicht inokulierte Kontrollen gehalten.
• Gruppe D (geimpft/nicht provoziert), enthaltend 7 Kälber, wurde wie für Gruppe A immunisiert, jedoch nicht provoziert. Diese wurden auf Nebenwirkungen und Antikörperreaktion verfolgt.

Der Impfstoff erwies sich für Kälber als sicher und verursachte keine klinischen Nebenwirkungen in Gruppen A und D. Er zeigte starke virulogische Reaktionen in Gruppen A und D innerhalb 2–3 Wochen nach Verabreichung. Alle Kälber in Gruppe B entwickelten klinische Anzeichen von Pneumonie, während Gruppe A geringere Anzeichen zeigte. Es gab einen signifikanten Rückgang in der Körpergewichtszunahme in Gruppe B, verglichen mit Gruppe A, und eine signifikante Erhöhung von Lungenläsionen und Rektaltemperaturen der Kälber von Gruppe B.
Insgesamt erzeugte der M. bovis Impfstoff einen signifikanten Schutzgrad gegen eine virulente Provokation.

Claims

Stamm von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt und der durch Behandlung mit Saponin inaktiviert wurde.
Veterinäre Zusammensetzung, umfassend einen inaktivierten Stamm von Mycoplasma bovis nach Anspruch 1, in Kombination mit einem veterinär verträglichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die zur parenteralen Verabreichung geeignet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin der veterinär verträgliche Träger ein flüssiger Träger ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, die weiterhin eines oder mehrere von einem dispergierenden Mittel, einem Benetzungsmittel oder einem Suspendiermittel umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, die weiterhin ein Hilfsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin das Hilfsmittel Saponin ist.
Verfahren zur Herstellung eines inaktivierten Stamms von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, wobei das Verfahren Inkubieren eines Stamms von Mycoplasma bovis, der einen ursächlichen Erreger von Rinderpneumonien darstellt, in Gegenwart von Saponin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Saponin in der Inkubationskultur in einer Menge von etwa 0,5–10 mg/ml vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Saponin in einer Menge von etwa 2 mg/ml vorliegt.
Verwendung eines Stamms von Mycoplasma bovis nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Lebewesen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel zur Prophylaxe von Rinderpneumonien, die durch einen Stamm von Mycoplasma bovis verursacht werden, vorgesehen ist.