DE69333402T2

DE69333402T2 - Impfstoff beinhaltend bacterin und toxoid aus pasteurella haemolytica typ a-1

Info

Publication number: DE69333402T2
Application number: DE69333402T
Authority: DE
Inventors: L. Albert BROWN; Iyengar Krishnaswamy DAYALU; James Thomas KAUFMAN; Steven Rex NEWSHAM
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2013-03-31
Also published as: AU6435596A; JP2776982B2; AU707841B2; DE69333402D1; CA2133108C; ATE258445T1; EP0636030A1; PT636030E; AU3970093A; EP0636030B1; CA2133108A1; BR9306187A; MX9301736A; JPH07505629A; WO1993019779A1; DK0636030T3; EP0636030A4; ES2211866T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Pasteurella haemolytica-Impfstoffen. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoff mit der Fähigkeit, in einer Dosis bei Rinderarten Immunität gegen Infektionen mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 zu induzieren, der Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Zellen, die von Pasteurella haemolytica stammen, umfasst, Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs und Verfahren des Impfens von Rindern.
Hintergrund der Erfindung
Etwa 40% bis 80% aller Erkrankungen von Rindern umfassen das Atemwegssystem (LE Lillie, "The bovine rspiratory disease complex", Can. Vet. J., 15: 233–242, 1974). Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC) ist in der US-Viehwirtschaft ein Hauptproblem. BRDC besteht aus mehreren klinischen Syndromen, wobei die zwei häufigsten Transportfieber von Zuchtrindern und enzootische Kälberpneumonie, die üblicherweise bei Milchkälbern beobachtet wird, sind. Obwohl heute anerkannt ist, dass zahlreiche Viren, belastende Managementpraktiken und Umgebungsfaktoren bei der Genese von Transportfieber wichtig sind, ist jedoch Pasteurella haemolytica-Biotyp A, Serotyp 1 (Typ A-1) das hauptsächliche bakterielle Mittel, das für die klinische Erkrankung und die pathophysiologischen Ereignisse, die zu akuter fibrinöser lobarer Pleuropneumonie und anschließendem Tod führen, verantwortlich ist (WDG Yates: "A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle", Can. J. Comp. Med. 46: 225–263, 1982).
In einer in Saskatchewan, Canada, durchgeführten Zweijahresstudie wurde P. haemolytica Typ A-1 aus den Lungen von 74% der Rinder, die an Transportfieber-Pneumonie starben, isoliert (B. Schiefer, G. E. Ward, R. E. Moffatt: "Correlation of microbiological and histological findings in bovine fibrinous pneumonia", Vet. Pathol. 15: 313–321, 1978). Jahresberichte während des Fünfjahreszeitraums von 1987 bis 1991 von dem Department of Veterinary Science an der South Dakota State University (South Dakota State University, Department of Veterinary Science, Animal Desease Research and Diagnostic Laboratory: Annual Progress Reports 1987–1991. Submitted to the NC107 Technical Committee on Bovine Respiratory Disease.) zeigten, dass P. haemolytica Typ A-1 aus 48,7% der Rinderlungen mit Pneumonie isoliert wurde. Daher scheint dies das hauptsächliche bakterielle Mittel, das Pneumonie bei Rindern verursacht, zu sein.
Der Serotyp Typ A-1 von P. haemolytica ist das Pathogen, das für die bei Transportfieber beobachtete fibrinöse nekrotisierende lobare Pleuropneumonie und die mit enzootischer Kälberpneumonie in Verbindung stehende eitrige Bronchopneumonie verantwortlich ist. Interessanterweise sind andere Serotypen von P. haemolytica (häufig ST2 und ST4 und gelegentlich ST7 und ST11) unschädliche Bewohner in vielen Bereichen der Nasenhöhle oder des oberen Atemwegstrakts (URT) von klinisch normalen Zuchtrindern (G. H. Frank, "When Pasteurella haemolytica colonizes the nasal passages of cattle", Vet. Med. 83: 1060–1064, 1988 und B. N. Wilkie, P. E. Shewen: "Defining the role that Pasteurella haemolytica plays in shipping fever", Vet. Med. 83: 1053–1058, 1988). Bei klinisch normalen Milchkälbern kann P. multocida in der URT-Flora überwiegen, in der sich auch verschiedene Serotypen von P. haemolytica finden können. Im Gegensatz dazu ist P. haemolytica Typ A-1 im URT von Zucht- und Milchkälbern kaum nachweisbar (G. H. Frank: aaO (1988) und B. N. Wilkie, P. E. Shewen: aaO (1988)).
Das Einwirken von Stressfaktoren, wie eine Virusinfektion, Verkauf, Transport, Zuchtbehandlungen und abrupte Klimawechsel, auf Kälber führt zu explosivem Wachstum und Koloniebildung durch P. haemolytica Typ A-1 in allen Bereichen des URT (G. H. Frank: aaO (1988) und B. N. Wilkie, P. E. Shewen: aaO (1988)). Von keinem anderen Serotyp von P. haemolytica ist bekannt, dass er diese Art der Zunahme zeigt. Bei Transportfieber-Pneumonie ist eine Koloniebildung im bzw. Besiedelung des URT mit P. haemolytica Typ A-1 eine wichtige Vorbedingung für die klinische Erkrankung und die folgende fibrinöse nekrotisierende lobare Pleuropneumonie. Id.
Trotz dessen möglicher Bedeutung bei der Pathogenese der Pneumonie ist der Mechanismus der Besiedelung, der die explosive Proliferation von P. haemolytica Typ A-1 im URT ermöglicht, kaum verstanden. Dennoch ist offensichtlich, dass diese Organismen in die Lunge durch das Einatmen von Tröpfchenkeimen, besiedelten abgeschilferten Epithelzellen oder Rachenausscheidungen eintreten. An der University of Minnesota (L. O. Whitely et al.: "Pasteurella haemolytica and boviner respiratory disease: Current thoughts on ist pathogenesis", Vet. Int. Med. 6: 1–12, 1992) wurde ermittelt, dass eine große Zahl von rasch wachsenden Bakterien, die in die Alveolenräume eindringen, mit Alveolenmakrophagen wechselwirken. Das von den Bakterien freigesetzte Endotoxin durchquert die Alveolenwand und aktiviert die pulmonalen intravaskulären Makrophagen, Endothel, Neutrophile, Plättchen, Komplement und Hageman-Faktor, was zu komplexen Wechselwirkungen von Zellen und Entzündungsmediatoren führt. Das Fortschreiten dieser Entzündungsreaktion mit Einfließen von Neutrophilen ist für die akute Lungenläsion, die mit der Erkrankung verbunden ist, verantwortlich. Leukotoxin, einer der Hauptvirulenzfaktoren von P. haemolytica kann ein Überleben der Bakterien ermöglichen, indem es Phagocytenzellen zerstört und Clearancemechanismen der Lunge schädigt. Id.
Die Prävention einer Pneumonie-Pasteurellose wurde in der Vergangenheit durch die Verwendung abgetöteter Bakterienimpfstoffe von P. haemolytica versucht. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine Impfung mit Bakterienimpfstoffen die Entwicklung von fibrinöser Pneumonie nach der Infektionsreizeinwirkung verstärken kann (S. E. Sanford, "Some Respiratory and Enteric Diseases of Cattle; An Update", Mod. Vet. Prac.. 65 (4): 265–268 (1984)). Die Immunisierung mit Lebendimpfstoffen war wegen der geringen Antigenität von Pasteurella haemolytica und der raschen Inaktivierung durch das gesunde Tier im allgemeinen nicht erfolgreich (C. W. Henry, "Shipping fever pneumonia: a new look at an old enemy", Veterinary Medicine, 1200–1206, September (1984)).
In der letzten Zeit konzentrierten sich Versuche zur Entwicklung eines Pasteurella haemolytica-Impfstoffs auf das Leukotoxin von P. haemolytica. In einer Untersuchung zur Bestimmung der Wechselwirkung von P. haemolytica mit Rinderneutrophilen zeigten die Ergebnisse, dass eine optimale Cytotoxinproduktion während der logarithmischen Phase des Bakterienwachstums von P. haemolytica, das in einem Standardgewebekulturmedium gezüchtet wurde, erfolgte. (C. S. Baluyut et al., "Interaction of Pasteurelle haemolytica with Bovine Neutrophils: Identification and Partial Characterization of a Cytotoxin", Am. J. Vet. Res., Band 42, Nr. 11, S. 1920–1926 (1982)). Die Autoren folgerten, dass "... da dieses Toxin die Phagocytenzellen beeinflusste, wurde es als Virulenzfaktor betrachtet". Id., S. 1925.
Das US-Patent 4 957 739 lehrt einen Impfstoff, der ein gereinigtes Antigen von P. haemolytica, beispielsweis eine Leukotoxinkomponente, enthält, wobei das Antigen aus einem zellfreien Überstand gereinigt oder durch DNA-Rekombinationsverfahren erhalten wird. Die WO 91/15237 offenbart eine Impfstoffzusammensetzung, die mindestens ein immunogenes Polypeptid aus der Gruppe von P. haemolytica Fimbrienprotein, Plasminrezeptorprotein, einem 50K-Protein der äußeren Membran und Leukotoxin enthält. Die US 5 055 400 offenbart DNA mit Codierung für P. haemolytica A-1-Leukotoxin, die zur Herstellung von rekombinantem Protein für die Herstellung von Impfstoffen verwendet wird. Die US 5 055 400 betrifft das Schutzvermögen eines cytotoxischen Überstands von P. haemolytica und zitiert die US-Anmeldung mit dem Aktenzeichen 821 197, eingereicht am 27. Januar 1986, jetzt US 5 165 924 , als Beispiel für einen derartigen Impfstoff.
Die Impfung von Kälbern mit einem bakterienfreien cytotoxischen Kulturüberstand von P. haemolytica Typ A-1 induzierte Resistenz gegenüber einem experimentellen Infektionsreiz. (P. E. Shewen et al., "Immunity to Pasteurella haemolytica Serotype 1", in Proceedings of the North American Symposium on Bovine Respiratory Disease (R. W. Loan, Hrsg.), Texas A & M University Press, College Station, Tex. S. 480–481 (1984)). Es wurde gezeigt, dass ein zellfreier Impfstoff, der Leukotoxin und serotypspezifische Oberflächenantigene enthält (Presponse^® Pasteurella haemolytica-Toxoid: American Cyanamid Co., Wayne, N. J.), bei Kälbern, die zweimal beimpft und anschließend intratracheal mit lebenden P. haemolytica gereizt wurden, hinsichtlich einer Prävention von Pneumonie wirksam sind (D. T. Bechtol et al., "Field Trial of a Pasteurella haemolytica Toxoid Administered at Spring Brandin gand in the Feedlot", Agri-Practice, Banfd 12, Nr. 2, S. 6–14 (März/April 1991)).
Auf diesem Gebiet besteht weiterhin ein Bedarf nach verbesserten Pasteurella haemolytica-Impfstoffen, beispielsweise einem Impfstoff, der in einer Einzeldosis aktive Immunität verleiht, wodurch die Notwendigkeit einer kostenaufwendigen wiederholten Verabreichung beseitigt wird, und einem Impfstoff, der den bequemen Vorteil einer subkutanten oder intramuskulären Verabreichung bietet.
Jericho et al. offenbaren (in Vaccine, Band 8, Nr. 4, S. 315–320 (1990)) die Verwendung von durch Formalin inaktivierten Bakterienimpfstoffen von P. haemolytica in einer Impfstoffzusammensetzung. Wie dort beschrieben, wird bei dem Verfahren der Herstellung des Impfstoffs eine Kultur von P. haemolytica wachsen gelassen und dann zentrifugiert. Das gebildete Pellet wird dann resuspendiert und inaktiviert. Der gebildete Überstand wird jedoch filtriert, lyophilisiert, in destilliertem Wasser rekonstituiert, dialysiert und eingefroren, ohne dass er inaktiviert wird. Im Gegensatz dazu umfasst die Herstellung der vorliegend beanspruchten Impfstoffzusammensetzung das Zugeben eines Inaktivierungsmittels direkt zu dem Kulturfluidum, das sowohl Zellen als auch lösliche Komponenten enthält, wodurch eine Impfstoffzusammensetzung gebildet wird, die sowohl Bakterienimpfstoffe als auch inaktivierte lösliche Komponenten einschließlich von Leukotoxoid umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines neuen Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs mit der Fähigkeit, in einer Dosis bei Rinderarten Immunität gegen eine Infektion mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 zu induzieren, der durch Wiederherstellen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen und inaktivierten Zellen von P. haemolytica Typ A-1 umfasst, mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung erhältlich ist.
Ferner erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffzusammensetzung gegen eine Infektion mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten, die im wesentlichen aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen, inaktivierten Zellen, einem Aluminiumhydroxidgel und einer Mineralöl/Lecithin-Emulsion besteht.
Ferner erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung des Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs oder der Impfstoffzusammensetzung gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten, die im vorhergehenden beschrieben sind, das entweder die Stufen:

(a) Kultivieren von Zellen von P. haemolytica Typ A-1 über einen derart ausreichenden Zeitraum, dass die Kultur von P. haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht;
(b) Inaktivieren der Kultur von P. haemolytica;
(c) Ernten des Kulturüberstands hiervon, der Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Zellen von P. haemolytica mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml umfasst;
(d) Zugeben von einem pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel bzw. Verdünnungsmitteln zu dem Kulturüberstand in Stufe (c);
(e) Gefriertrocknen des Produkts von (d); und
(f) Wiederherstellen des gefriergetrockneten Produkts von (e) mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung;

(a1) Kultivieren von Zellen von P. haemolytica Typ A-1 über einen derart ausreichenden Zeitraum, dass die Kultur von P. haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht;
(b1) Ernten des Kulturüberstands hiervon, der Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und Zellen von P. haemolytica mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml umfasst;
(c1) Zugeben von einem Inaktivierungsmittel zu dem Kulturüberstand in Stufe (b1);
(d1) Zugeben von einem pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel bzw. Verdünnungsmitteln zu dem inaktivierten Kulturüberstand in Stufe (c1);
(e1) Gefriertrocknen des Produkts von (d1); und
(f1) Wiederherstellen des gefriergetrockneten Produkts von (e1) mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung

Ferner wird durch die Erfindung der dadurch hergestellte Impfstoff oder die dadurch hergestellte Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt.
Ferner erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer neuen Verwendung von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen und inaktivierten Zellen von Pasteurella haemolytica Typ A-1 bei der Herstellung eines Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rindern, und wobei der Impfstoff in gefriergetrockneter Form vorhanden ist und vor der Verwendung mit mindestens einem Adjuvans wiederhergestellt wird.
Ferner wird durch die vorliegende Erfindung eine biologisch reine Kultur von Pasteurella haemolytica mit der ATCC-Nr. 55318 oder damit identischen Stämmen bereitgestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der hier verwendete Ausdruck "Leukotoxin" bezeichnet ein lösliches Toxin, das durch aktives Züchten von Pasteurella haemolytica gemäß den Lehren in der Literatur produziert wurde. Siehe beispielsweise US-Patent 5 055 400, kanadische Patentanmeldung 91000097 und Gentry et al., "Neutralizing monoclonal antibodies to P. haemolytica leukotoxin affinity-purify the toxin from crude culture supernatants", Microbial Pathogenesis, 10: 411–417 (1991). "Leukotoxoid" ist der zur Beschreibung von inaktiviertem Leukotoxin verwendete Ausdruck. Leukotoxin wird in der Literatur alternativ von anderen Bezeichnern als Exotoxin oder Cytotoxin bezeichnet.
Das hier verwendete "kapselförmige Antigen" bezeichnet ein lösliches kapselförmiges Polysaccharid von P. haemolytica gemäß der Beschreibung in der Literatur. Siehe beispielsweise T. J. Inzana, "Capsules and Virulence in the HAP Group of Bacteria", Can. J. of Vet. Research, 54: S22–S27 (1990; und Adlam et al., "Purification, characterization and immunological properties of the seroype-specific capsular polysaccharide of Pasteurella haemolytica (serotype A1) organisms", J. Gen. Microbiol. 30: 2415–2426 (1984).
Der hier verwendete Ausruck "lösliches Antigen" bezeichnet lösliche Antigene, die während des Wachstums von P. haemolytica außer Leukotoxin und kapselförmigem Antigen ausgeschüttet werden, wie eine Glykoprotease und Neuramindase. Siehe beispielsweise Reggie et al., "Molecular Studies of Ssal, a Serotype-Specific Antigen of Pasteurella haemolytica A1", Infection and Immunity, Band 59, Nr. 10, 3398–3406 (1991).
In einem Aspekt erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs gegen eine Infektion mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten, der durch Wiederherstellen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen und inaktivierten Zellen von P. haemolytica Typ A-1 umfasst, mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung erhältlich ist. Der Pasteurella haemolytica Typ A-1, der für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist ein beliebiger Typ A-1, der nicht abgeschwächt ist. Der bevorzugte Stamm ist derzeit die ATCC-Nr. 55318.
Der Impfstoff dieser Erfindung kann im allgemeinen durch Züchten von Pasteurella haemolytica Typ A-1 für eine optimale Leukotoxinproduktion, vorzugsweise in einem proteinverstärkten Zellkulturmedium, und Ernten der Kulturfluida während der logarithmischen Phase hergestellt werden.
Eines der bevorzugten Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung eines Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs mit der Fähigkeit, in einer Dosis bei Rinderarten Immunität gegen eine Infektion mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 zu induzieren, der eine therapeutisch wirksame Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen und inaktivierten Zellen, die von Pasteurella haemolytica stammen, umfasst. Das Verfahren umfasst das Kultivieren von Pasteurella haemolytica Typ A-1 über einen derart ausreichenden Zeitraum, dass Pasteurella haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht.
Ein zur Verwendung in der Erfindung geeignetes Standardkulturmedium ist ein Zellkulturmedium, das mit Protein verstärkt ist und von einem Fachmann ausgewählt werden kann. Ein Beispiel ist RPMI-1640, das im allgemeinen mit 3% wärmeinaktiviertem Rinderkalbserum, 1% Tryptose und 0,1% Tween 80 (Polysorbat von Sigma, St. Louis, MO) oder dergleichen verstärkt ist. Das Wachstum kann durch die Zugabe von Kohlehydraten, wie Glucose, zu dem Medium stimuliert werden.
Die Bakterien werden in dem Medium vom Beimpfen bis zur log-Wachstumsphase wachsen gelassen. Für eine optimale Leukotoxinproduktion ist die späte log-Wachstumsphase bevorzugt. Diese liegt im allgemeinen im Bereich von 2,5 bis 5 h nach dem Impfen des Mediums mit den Bakterien und sie kann durch die Beziehung zwischen optischer Dichte und Zeit, wie einschlägig bekannt ist, genau bestimmt werden.
Während das Wachstum sich in der späten log-Phase befindet, wird ein Inaktivierungsmittel den Kulturfluida zu gesetzt. Vorzugsweise ist das Inaktivierungsmittel ein Fixativ, wie Formalin (Formaldehydlösung USP), das üblicherweise mit einer relativ niedrigen Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,5% (V/V) verwendet wird.
Die Kulturfluida, die das Leukotoxoid, kapselförmige Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Pasteurella haemolytica-Zellen umfasst, werden dann durch einschlägig bekannte Standardverfahren, wie Zentrifugation, geerntet. Es ist wichtig, dass der Überstand nicht zellfrei ist, und daher liegen Ernteverfahren, wie eine Filtration, die alle Zellen entfernen, nicht innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Die Hauptmenge der Bakterien wird durch Zentrifugation der Zellen zu einer dichten konzentrierten wässrigen Suspension entfernt. Das Zentrifugieren erfolgt vorzugsweise mit einer Kraft von etwa 10 000 × g. Die Verfahren und Bedingungen zur Entfernung des Hauptteils der Zellen aus der Kultur sind einschlägig bekannt.
Die Reihenfolge der Inaktivierung und des Aberntens bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nicht als kritisch angesehen. Derzeit wird die Inaktivierung vor dem Ernten bevorzugt.
Der Überstand wird gewonnen und er enthält etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml Überstand, was vor der Inaktivierung ermittelt wurde. Die Zahl der Zellen ist schwierig zu ermitteln und sie kann von Charge zu Charge beträchtlich variieren. Die Untergrenze wird durch die Notwendigkeit, dass einige Zellen in dem Impfstoff vorhanden sind, um das Bereitstellen der durch den Impfstoff der Erfindung verliehenen Immunität zu unterstützen, bestimmt. Die Obergrenze wird dadurch, dass eine mögliche Hypersensibilisierung von Lebewesen gegenüber einer Impfung vermieden wird, bestimmt. Konzentrationen von bis zu 10⁶ Zellen/ml wurden vor einer Inaktivierung im Überstand nachgewiesen.
Der Überstand, der durch dieses Verfahren hergestellt und für den Impfstoff der Erfindung verwendet wird, ist eine an Leukotoxoid reiche Zubereitung, die auch kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Pasteurella haemolytica Typ A-1-Zellen und -Zellabfälle umfasst.
Der angegebene Impfstoff der Erfindung ist der Kulturüberstand, der konzentriert oder verdünnt sein kann oder auch nicht.
Weitere bevorzugte Impfstoffzusammensetzungen dieser Erfindung ergeben sich aus einer Kombination des Impfstoffs dieser Erfindung mit anderen Impfmitteln, insbesondere Antigenen anderer BRDC-Pathogene. Ein erläuterndes Beispiel ist eine Impfstoffzusammensetzung, die durch die Kombination von Antigenen von Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Clostridium-Arten, Mycoplasma-Arten, Bovine Respiratory Syncytial Virus, Bovine Viral Diarrhea Virus, Bovine Parainfluenza Typ 3-Virus gebildet wird.
Impfstoffe der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des Überstands als Wirkstoff in einem nicht-toxischen und sterilen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten, hergestellt werden.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung wurde gefriergetrocknet und mit einem Adjuvans unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert. Ein derartiger Impfstoff stellt eine erhöhte Stabilität und verringertes freies Endotoxin, was systemische Reaktionen nach der Impfung verringert, bereit. Diese Adjuvanzien umfassen u. a. eine Mineralöl/Lecithin-Emulsion [Amphigen^®, Hydronics, Inc.] gemäß der Lehre in US-Patent Nr. 5 084 269 oder andere dispergierte Öle, Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid und Saponine, wie Quil A.
Gemäß der vorliegenden Erfindung stellt eine pharmazeutische Zubereitung zweckmäßigerweise eine Einheitsdosis von zwischen 0,5 und 3 ml und vorzugsweise etwa 2 ml einer sterilen Zubereitung einer immunogenen Menge der Wirkstoffe und eines Trägers bereit.
Für die Zwecke dieser Erfindung ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Impfstoffs die Menge, die in einer Dosis bei Rinderarten Immunität gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 induziert. Genauer gesagt, kann diese Menge ohne weiteres durch Testen einer Vielzahl von Impfstoffzubereitungen, die gemäß dieser Erfindung hergestellt wurden, bei Rindern und Auswählen der Impfstoffzubereitung, die Immunität in einer Dosis bei einer statistisch signifi kanten Zahl von Rindern, wenn diese mit P. haemolytica geimpft wurden, induzierte, bestimmt werden. Eine impfstoffinduzierte Immunität kann durch die Resistenz gegenüber einem experimentellen Reiz, die durch eine verminderte oder nicht vorhandene Mortalität, nicht vorhandene oder minimale klinische Anzeichen, eine Verminderung oder vollständige Beseitigung von kennzeichnenden Lungenläsionen reflektiert wird, was einem Fachmann geläufig ist, ermittelt werden.
Ein günstiges Dosierungsprotokoll umfasst die Verabreichung von einer Dosis der gewünschten Impfstoffzusammensetzung dieser Erfindung zum Verleihen von aktiver Immunität. Eine Verstärkungsdosis wird als günstig angesehen, wenn eine anschließende Belastung oder Einwirkung wahrscheinlich ist. Die Art und Weise der Verabreichung der Impfstoffe der Erfindung kann ein beliebiger geeigneter Weg sein, der den Impfstoff an den Wirt abgibt. Derzeit wird der Impfstoff vorzugsweise subkutan oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
Der gefriergetrocknete Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise aseptisch mit dem ein Adjuvans enthaltenden sterilen Verdünnungsmittel rehydratisiert. Vorzugsweise wird der Impfstoff an gesunde Rinder mindestens 7–10 Tage vor einem Entwöhnen, Transport oder Einwirken von Stress oder infekiösen Bedingungen verabreicht.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs der Erfindung und zur Herstellung und zum Testen einer Vielzahl von Impfstoffen. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und begrenzen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht.
Ein Impfstoff gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung ist in den Vereinigten Staaten seit etwa 13. Mai 1992 im Handel erhältlich und als One-Shot^TM (Marke von SmithKline Beecham Animal Health, Exton, PA) bekannt.
Hinterlegung von Stämmen, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendbar sind
Eine Hinterlegung von biologisch reinen Kulturen des im folgenden angegebenen Stamms erfolgte bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Die angegebene Hinterlegungsnummer wurde nach er folgreichen Tests der Lebensfähigkeit zugeteilt, und die erforderlichen Gebühren wurden bezahlt. Die Kulturen sind während der Anhängigkeit der Patentanmeldung einer Person zugänglich, deren Berechtigung hierfür nach 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 durch den Commissioner bestimmt wurde. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit entfallen unwiderruflich mit dem Erteilen eines Patents auf der Grundlage der Anmeldung. Ferner werden die angegebenen Hinterlegungen während eines Zeitraums von dreissig (30) Jahren ausgehend vom Hinterlegungsdatum oder während fünf (5) Jahren nach dem letzten Antrag für die Hinterlegung, oder über die in Kraft setzbare Lebensdauer des US-Patents, je nachdem, welcher länger ist, aufrechterhalten. Sollte eine Kultur nicht-lebensfähig oder unabsichtlich zerstört werden oder im Falle von Plasmid enthaltenden Stämmen das Plasmid verlieren, wird sie durch eine lebende Kultur bzw. lebende Kulturen der gleichen taxonomischen Beschreibung ersetzt.
Beispiel 1
Impfstoffherstellung
P. haemolytica T Typ A-1 (Hinterlegung 9. April 1992, ATCC-Hinterlegungsnummer 55318) wurde über Nacht bei 37°C auf Hirn-Herz-Infusions(BHI)-Agar gezüchtet. Anschließende Durchgänge erfolgten in BHI-Nährlösung in einer Reihe von Erlenmeyer-Kolben, 9- und 19-l-Ballonen oder Impffermentern. Das Endproduktionsmedium besteht aus RPMI-1640-Gewebekulturmedium, das Natriumbicarbonat (0,2% (Gew/V)) enthält, das mit 3% wärmeinaktiviertem Rinderkalbserum, 1% Tryptose und 0,1% Tween 80 verstärkt ist. Ein Antischaummittel wurde mit einer Endkonzentration von 0,06% eingearbeitet. Der Endfermenter wurde mit einem Inokulum von 5% geimpft. Die Kulturen wurden 4,5 h lang bei 37°C wachsen gelassen, und der Gehalt der Kultur an gelöstem Sauerstoff wurde überwacht und durch Belüften auf eine Höhe von 40% gesteuert. Die Kultur wurde kontinuierlich gerührt und bei einem pH-Wert von 7,4 gehalten. Das Wachstum wurde durch die Zugabe von steriler 50%iger Glucose 2,5 h, 3,25 h und 4,0 h nach dem Impfen stimuliert. 4,5 h nach dem Impfen (in der späten logarithmischen Wachstumsphase) wurde die Kultur auf 10°C gekühlt und mit Formalin, das mit einer Endkonzentration von 0,1% (V/V) zugegeben wurde, inaktiviert. Die Kulturfluida wurden 1 h lang in dem Fermenter gerührt und dann unter konstantem Rühren während 5 Tagen bei 4°C aufbewahrt, um die Inaktivierung vollständig durchzuführen. Die inaktivierten Fluida wurden zentrifugiert und der Überstand wurde zurückbehalten. Sterile 10% Merthiolat und 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) wurden als Konservierungsmittel mit Endkonzentrationen von 0,01% bzw. 0,07% zugegeben. Der Überstand wurde bei –50 °C aufbewahrt, bevor er zum Zusammenbau aufgetaut wurde.
Der Überstand wurde aufgetaut und auf der Grundlage der Ergebnisse der Quantifizierungstests unter Zugabe von steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung zusammengestellt. Das zusammengestellte Produkt wurde als aliquote Teile in Flaschen gefüllt und lyophilisiert und bei 4°C aufbewahrt.
Das zweiphasige Adjuvanssystem besteht aus 5% (V/V) Adjuvans einer Mineralöl/Lecithin-Emulsion, das unter der Handelsbezeichnung Amphigen^® vertrieben wird, und 12% (V/V) Aluminiumhydroxidgel und Kochsalzlösung (im folgenden als "Adjuvansverdünnungsmittel" bezeichnet). Das Doppeladjuvansverdünnungssystem wurde in Flaschen gefüllt und zur Rehydratisierung des gefriergetrockneten Impfstoffs verwendet.
Der Impfstoff wurde an Rindern auf dessen Schutzvermögen durch ImpfInfektionsexperimente getestet.
Eine Relativeinheits(RU)dosis von 1496 pro Dosis von Leukotoxoid und 2580 von kapselförmigem Antigen wurde dem 1yphilisierten Mengenüberstand zugeteilt, der zur Herstellung des Impfstoffs, von dem ermittelt wurde, dass er in einer Dosis Immunität gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten induziert, wie hier gelehrt wird, verwendet wurde. Beispiel 2 Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoid Einfachimpfung Dosis-Titer-Untersuchung Tabelle I Einzeldosis-Versuchsgestaltung

Tiere: Rinder von 400–550 lbs
Infektion: P. haemolytica A-1, heterologer Stamm, 2,2 × 10⁹ cfu in 500 ml Cherry's Phosphate Buffered Saline (CPBS). Intratracheale Verabreichung
Impfstoffe: 1. Verdünnung auf 800 RU Leukotoxoid und 1380 RU kapselförmiges Antigen pro Dosis mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre Verabreichung. 2. Verdünnung auf 400 RU Leukotoxoid und 690 RU kapselförmiges Antigen pro Dosis mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre Verabreichung. 3. Verdünnung auf 200 RU Leukotoxoid und 345 RU kapselförmiges Antigen pro Dosis mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre Verabreichung. 4. Placebo (Mediumkontrolle). Verdünnung wie Impfstoff Nr. 3 mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre Verabreichung.

Tiere: Rinder von 400–550 lbs
Infektion: P. haemolytica A-1, heterologer Stamm, 1,6 × 10⁹ cfu in 500 ml CPBS. Intratracheale Verabreichung
Impfstoffe: 1. Verdünnung auf 200 RU Leukotoxoid und 345 RU kapselförmiges Antigen pro Dosis mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre (IM) oder subkutane (SC) Verabeichung. 2. Placebo (Mediumkontrolle). Verdünnung wie Impfstoff Nr. 1 mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre Verabreichung.

Tiere: Rinder von 400–550 lbs
Infektion: P. haemolytica A-1, 5 ml von 2,5 × 10⁹ cfu/ml. Bilaterale transthorakale intrapulmonale Injektion.
Impfstoffe: 1. Rehydratisierung mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – intramuskuläre (IM) oder subkutane (SC) Verabeichung. 2. Placebo (Mediumkontrolle). Rehydratisierung mit Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – subkutane Verabreichung.

TABELLE VI Zusammenfassung der Ergebnisse
Beispiel 5
Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoid
Immunitätsuntersuchung einer Dauer von vier Monaten
20 Rinderkälber, die etwa 450 lbs (204,5 kg) wogen, wurden für dieses Beispiel ausgewählt. 10 Rinderkälber (Gruppe 1) wurden subkutan mit einer 2-ml-Dosis von Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoid, wie im folgenden beschrieben, beimpft. Weitere 10 Kälber (Gruppe 2) wurden subkutan mit einer 2-ml-Dosis eines Placebos, das alle Komponenten des Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoids mit Ausnahme von P. haemolytica-Antigenen enthielt und als Kontrollen diente, beimpft. Die Kälber wurden nach 4 Monaten und 7 Tagen nach der Impfung mit einem heterologen Stamm von P. haemolytica (Tabelle VII) intratracheal infiziert. Das Reizinokulum bestand aus einer Nährlösungskultur von P. haemolytica, die 1,2 × 10⁷ koloniebildende Einheiten (cfu) in 500 ml Cherry's Phosphat Buffered Saline (CPBS) enthielt. Kein Tier erlag der Infektion. Eine Nekropsie der Tiere wurde 6 Tage nach der Infektion durchgeführt.
Kontrolltiere zeigten eine deutliche Erhöhung (statistisch signifikant) der Körpertemperatur aufgrund der Infektion während 2 Tagen nach der Infektion, während geimpfte Tiere eine Erhöhung während eines Tags nach der Infektion zeigten. Eine statistische Analyse ergab einen signifi kanten Unterschied hinsichtlich der mittleren Körpertemperaturen an zwei Tagen nach der Infektion zwischen Impflingen und Kontrolltieren.
Das Serum von Blutproben, die von jedem Tier durch Venenpunktur gewonnen wurden, wurde auf Antikörpertiter gegenüber ganzen Zellen von P. haemolytica durch einen Agglutinierungstest, gegenüber Leukotoxin durch einen Leukotoxinneutralisationstest und gegenüber kapselförmigem Antigen durch einen Enzym-gekoppelten Immunsorptionstest (ELISA) getestet. Proben wurden vor der Impfung, 4 Monate nach der Impfung (vor der Infektion) und 6 Tage nach der Infektion (zum Zeitpunkt der Nekropsie) gewonnen. Der geometrische Mittelwert (GM) der Antikörpertiter wurde für jeden Test berechnet und die Ergebnisse ergaben, dass nur die GM-Antikörpertiter gegenüber kapselförmigem Antigen bei den geimpften Tieren (Gruppe 1) 4 Monate nach der Impfung und 6 Tage vor der Infektion im Vergleich zu den Titern vor der Impfung signifikant höher waren.
Bei der Nekropsie wurden die Lungen entfernt und hinsichtlicht Läsionen, die für eine Pneumonie-Pasteurellose charakteristisch sind, bewertet (Tabelle VIII). Die Lungen wurden durch Wiegen der betroffenen Bereiche und Angabe des Prozentwerts der betroffenen Lunge als Prozentsatz des Gesamtgewichts der Lungen zahlenmäßig bewertet. Ferner wurden die Lungen durch optische Betrachtung einschließlich von Zeichnungen der betroffenen Bereiche zahlenmäßig bewertet. Geimpfte Tiere wiesen eine mittlere Lungenkonsolidierung von 2,65% auf, während Kontrolltiere eine mittlere Lungenkonsolidierung von 19,35% aufwiesen, wenn die Bewertung auf der Grundlage des tatsächlichen Gewichts von betroffenem Lungengewebe, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lunge erfolgte. Eine visuelle zahlenmäßige Bewertung von betroffenem Lungengewebe ergab eine mittlere Lungenkonsolidierung von 1,68% der geimpften Tiere und 13,35% für Kontrolltiere. Diese Ergebnisse zeigten eine Verringerung von 86,3% hinsichtlich der Lungenläsionen in Gruppe 1 im Vergleich zu Gruppe 2 auf der Basis des Gewichts und eine Verringerung von 87,42%, wenn eine optische Betrachtung verwendet wurde. Die statistische Analyse zeigte, dass der Un terschied der Lungenkonsolidierung zwischen Impflingen und Kontrollen signifikant ist (p < 0,05).
Die Stellen der subkutanen Injektion wurden bei der Nekropsie sorgfältig geprüft, und keines der Tiere in den beiden Gruppen wies irgendeine sichtbare Gewebereaktion auf. Die Isolierung von Mikroorganismen wurde von läsionstragenden Bereichen von Lungengewebe versucht. P. haemolytica wurde von Lungenläsionen von 4 von 10 Impflingen und 8 von 10 Kontrollen isoliert.
Diese Ergebnisse zeigten, dass dieses Produkt sicher und bis zu 4 Monate nach der Verabreichung einer Einzeldosis des Impfstoffs wirksam ist. Die Impfung von Rindern mit diesem Produkt verstärkte deren Resistenz gegenüber einer Infektionseinwirkung. TABELLE VII Versuchsgestaltung einer Immunitätsuntersuchung mit einer Dauer von 4 Monaten

Tiere: Rinder von > 600 lbs.
Infektion: P. haemolytica A-1, 1,2 × 10⁷ cfu in 500 ml CPBS. Intratracherale Verabreichung.
Impfstoffe: 1. Seriennummer 1 mit Vorlizenz (Seriennummer 24275010, etwa 305 RU Leukotoxoid und etwa 529 RU kapselförmiges Antigen), rehydratisiert mit dem beigefügten Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – subkutane (SC) Verabeichung. 2. Placebo (Mediumkontrolle) rehydratisiert mit dem beigefügten Adjuvansverdünnungsmittel. 2-ml-Dosis – subkutane Verabreichung.

TABELLE VIII Zusammenfassung der Ergebnisse
Beispiel 6
Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoid
Untersuchung des Einsetzens der Immunität
Herstellung des Impfstoffs gemäß der Beschreibung in Beispiel 1. [Leukotoxoidwirksamkeit = 254 Relativeinheiten/Dosis (15 Monate natürliche Alterung), Wirksamkeit des kapselförmigen Antigens = 758 Relativeinheiten/Dosis]
30 Rinderkälber mit einem durchschnittlichen Gewicht von 553 lbs (251 kg) wurden für dieses Beispiel ausgewählt. 10 Kälber (Gruppe A) wurden subkutan mit einer 2-ml-Dosis von Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoid 7 Tage vor einer Infektion geimpft. Weitere 10 Kälber (Gruppe B) wurden auf die gleiche Weise mit einer 2-ml-Dosis des Impfstoffs 3 Tage vor einer Infektion geimpft. Weitere 10 Kälber (Gruppe C) erhielten 7 Tage vor einer Infektion auf subkutanem Weg eine 2-ml-Dosis Placebo, das alle Komponenten des Pasteurella haemolytica-Bakterienimpfstoff-Toxoids mit Ausnahme der P. haemolytica-Antigene enthielt, injiziert und dienten als Kontrolle. Die Kälber wurden intratracheal 7 Tage nach der Impfung (Gruppen A und C) oder 3 Tage nach der Impfung (Gruppe B) mit einem heterologen Stamm von P. haemolytica infiziert. Das Reizinokulum be stand aus einer Nährlösungskultur von P. haemolytica, die 3,0 × 10⁸ koloniebildende Einheiten (cfu) in 500 ml Cherry's Phosphate Buffered Saline (CPBS) enthielt. Ein Tier in Gruppe B und ein Tier in Gruppe C erlagen der Infektion, und von diesen wurde baldmöglichst eine Nekropsie durchgeführt. Von allen anderen Tieren wurde 6 Tage nach der Infektion eine Nekropsie durchgeführt.
Die Körpertemperaturen von 2/3 der Tiere vor der Infektion betrug 40°C, so dass keine deutliche Zunahme der Körpertemperatur aufgrund einer Infektion zu irgendeinem Zeitpunkt nach der Infektion in einer der Gruppen gezeigt wurde.
Serum von Blutproben, die von jedem Tier durch Venenpunktur gewonnen wurden, wurde auf Antikörpertiter gegenüber ganzen Zellen von P. haemolytica durch einen Agglutinierungstest, gegen Leukotoxin durch einen Leukotoxinneutralisationstest und gegenüber kapselförmigem Antigen durch einen Enzym-gekoppelten Immunsorptionstest (ELISA) getestet. Proben wurden vor der Impfung, 7 Tage nach der Impfung (Gruppen A und C) und 3 Tage nach der Impfung (Gruppe B), was unmittelbar vor der Infektion war, und 6 Tage nach der Infektion (zum Zeitpunkt der Nekropsie) gewonnen. Der geometrische Mittelwert (GM) der Antikörpertiter wurde für jeden Test berechnet und die Ergebnisse zeigten, dass eine signifikante Reaktion auf alle drei Antigene in Tieren der Gruppe A 7 Tage nach der Impfung erhalten wurde und keine derartige Reaktion bei Tieren der Gruppe B 3 Tage nach der Impfung oder bei Tieren der Gruppe C 7 Tage nach der Verabreichung von Placebo beobachtet wurde.
Bei der Nekropsie wurden die Lungen entfernt und auf Läsionen, die für eine Pneumonie-Pasteurellose charakteristisch sind, bewertet. Die Lungen wurden durch Wiegen der betroffenen Bereiche und Angabe des Prozentwerts der beteiligten Lunge als Prozentsatz des Gesamtgewichts der Lungen zahlenmäßig bewertet. Ferner wurden die Lungen durch optische Inspektion einschließlich von Zeichnungen der betroffenen Bereiche zahlenmäßig bewertet. Tiere, die 7 Tage vor einer Infektion geimpft wurden, wiesen eine mittlere Lungenkonsolidierung von 12,7% auf, Tiere die 3 Tage vor einer Infektion geimpft wurden, wiesen eine mittlere Lungen konsolidierung von 36,1% auf, während Kontrolltiere eine mittlere Lungenkonsolidierung von 26,6% aufwiesen, wenn sie auf der Basis des tatsächlichen Gewichts von betroffenem Lungengewebe in Bezug auf das Gewicht der gesamten Lunge bewertet wurden. Eine optische zahlenmäßige Bewertung von betroffenem Lungengewebe ergab eine mittlere Lungenkonsolidierung von 8,6% für 7-Tage-Impflinge, 28,7% für 3-Tage-Impflinge und 17,8% für Placebokontrollen. Diese Ergebnisse zeigten eine Verringerung von 52,3% der Lungenläsionen in Gruppe A im Vergleich zu Gruppe C auf der Basis des Gewichts und eine Verringerung von 51,7%, wenn eine visuelle Betrachtung verwendet wurde. Eine statistische Analyse zeigte, dass der Unterschied der Lungenkonsolidierung zwischen Gruppe A und Gruppe B signifikant (p < 0,05) war, jedoch zwischen den Gruppen A und C nicht signifikant war. Keine Verringerung der Lungenläsion wurde beobachtet, wenn 3-Tage-Impflinge mit Placebokontrollen verglichen wurden.
Die Stellen der subkutanen Injektion wurden bei der Nekropsie sorgfältig geprüft. Etwa 50% der Tiere in allen drei Gruppen wiesen gewisse Anzeichen von Gewebereaktionen an der Injektionsstelle auf. Die Isolierung von Mikroorganismen von läsionstragenden Bereichen von Lungengewebe wurde versucht. P. haemolytica wurde von. Lungenläsionen von 5 von 10 Sieben-Tage-Impflingen, 8 von 10 Drei-Tage-Impflingen und 7 von 10 Placebokontrollen isoliert.
Diese Ergebnisse zeigten, dass dieses Produkt bei Verabreichung in einer einzigen Dosis eine Lungenschädigung verringern kann, wenn Tiere 7 Tage nach einer Impfung infiziert werden, jedoch nicht im Falle von 3 Tagen nach einer Impfung. Die Impfung von Rindern mit diesem Produkt 7 Tage vor einer Infektion erhöhte ihre Resistenz gegenüber einer Infektion.
Schlussfolgerung
Alle Untersuchungen bestätigten die Sicherheit des Impfstoffs. Keine ungünstigen Reaktionen wurden beobachtet. Sicherheit wurde auch bei der Verabreichung von drei unterschiedlichen Reihen des Impfstoffs an über 3000 Tiere unter Feldbedingungen bewiesen. Tests ergaben lokalisierte Reak tionen bei 3,5% der Impflinge, wobei viele derselben vorübergehend waren. Wenige andere Reaktionen wurden beobachtet.
Eine Antigenlöschungsuntersuchung wurde unternommen, um eine nicht-schützende Dosierungsmenge des Impfstoffs zu bestimmen. Die Untersuchung war erfolgreich, wobei sie eine feste Beziehung zwischen Schutz und Menge der Antigene im Impfstoff zeigte.
Die Analyse der in den Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse zeigte, dass dieser Impfstoff wirksam und sicher ist. Die Impfung von Rindern mit diesem Produkt (entweder auf intramuskulärem oder subkutanem Weg) stärkte deren Resistenz gegenüber Infektionen. Dies wurde durch eine signifikante Verringerung des Ausmaßes von Lungenläsionen, die bei Impflingen im Vergleich zu Kontrolltieren beobachtet wurde, reflektiert. Die experimentellen Infektionsmodelle, die bei diesen Untersuchungen, die zur Entwicklung und zum Testen dieses Impfstoffs führtne, waren streng genug, dass unter natürlichen Bedingungen die Wahrscheinlichkeit des Einwirkens einer Infektion in diesem Grad auf eine Tier weit entfernt ist. Daher kann mit Sicherheit gefolgert werden, dass dieser Impfstoff unter Feldbedingungen noch besser wirkt. Ferner sollte dieser Impfstoff als Komponente von einem oder mehreren mehrfach wirkenden Impfstoffen, die Viren- und Bakterienkomponenten enthalten, wie Impfstoffe für den Bovine Respiratory Disease Komplex, verwendet werden.

Claims

Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxid-Impfstoff gegen eine Infektion mit Pasteurella haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten, erhältlich durch Wiederherstellen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen und inaktivierten Zellen von P. haemolytica Typ A-1 umfasst, und wobei die Zusammensetzung in gefriergetrockneter Form vorhanden ist und vor der Verwendung mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung wiederhergestellt wird.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zellen von P. haemolytica vor der Inaktivierung mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml Überstand vorhanden sind.
Impfstoff nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Leukotoxoid, das kapselförmige Antigen, die löslichen Antigene und die inaktivierten Zellen von P. haemolytica von Stamm ATCC Nr. 55318 oder damit identischen Stämmen stammen.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der ferner eine therapeutisch wirksame Menge von einem oder mehreren weiteren Antigenen von Pathogenen von Rinderatemwegserkrankungen umfasst.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die gefriergetrocknete Zusammensetzung mit zwei Adjuvanzien wiederhergestellt wird.
Impfstoff nach Anspruch 5, wobei die Adjuvanzien Aluminiumhydroxid und eine Mineralöl/Lecithin-Emulsion sind.
Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffzusammensetzung gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6, die im wesentlichen aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Leukotoxoid, kapselförmigem Antigen, löslichen Antigenen, inaktivierten Zellen von P. haemolytica Typ A-1, Aluminiumhydroxidgel und einer Mineralöl/Lecithin-Emulsion besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Impfstoffzusammensetzung gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rinderarten gemäß Definition in Anspruch 7, das entweder die Stufen: (a) Kultivieren von Zellen von P. haemolytica Typ A-1 über einen derart ausreichenden Zeitraum, dass die Kultur von P. haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht; (b) Inaktivieren der Kultur von P. haemolytica; (c) Ernten des Kulturüberstands hiervon, der Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Zellen von P. haemolytica mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml umfasst; (d) Zugeben von einem pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel bzw. Ver dünnungsmitteln zu dem Kulturüberstand in Stufe (c); (e) Gefriertrocknen des Produkts von (d); und (f) Wiederherstellen des gefriergetrockneten Produkts von (e) mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung; oder die Stufen (a1) Kultivieren von Zellen von P. haemolytica Typ A-1 über einen derart ausreichenden Zeitraum, dass die Kultur von P. haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht; (b1) Ernten des Kulturüberstands hiervon, der Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und Zellen von P. haemolytica mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml umfasst; (c1) Zugeben von einem Inaktivierungsmittel zu dem Kulturüberstand in Stufe (b1); (d1) Zugeben von einem pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel bzw. Verdünnungsmitteln zu dem inaktivierten Kulturüberstand in Stufe (c1); (e1) Gefriertrocknen des Produkts von (d1); und (f1) Wiederherstellen des gefriergetrockneten Produkts von (e1) mit mindestens einem Adjuvans vor der Verwendung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei P. haemolytica Stamm ATCC Nr. 55318 oder damit identische Stämme ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der derart ausreichende Zeitraum, dass die Kultur von P. haemolytica die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht, etwa 2,5 bis 6 h beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Kultur von P. haemolytica mit Formalin inaktiviert wird oder das Inaktivierungsmittel Formalin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Überstand durch Zentrifugation geerntet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Zellen von P. haemolytica in einem proteinverstärkten Zellkulturmedium kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Zellkulturmedium RPMI-1640 und etwa 3% Rinderkalbserum, etwa 1% Tryptose und 0,1% Tween 80^®-Dispergiermittel umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung, die Leukotoxoid, kapselförmiges Antigen, lösliche Antigene und inaktivierte Zellen von Pasteurella haemolytica Typ A-1 umfasst, bei der Herstellung eines Einzeldosis-Bakterienimpfstoff-Toxoid-Impfstoffs gegen eine Infektion mit P. haemolytica Typ A-1 bei Rindern, und wobei die Zusammensetzung in gefriergetrockneter Form vorhanden ist und vor der Verwendung mit mindestens einem Adjuvans wiederhergestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Zellen von P. haemolytica vor der Inaktivierung mit einer Dichte im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10⁸ Zellen/ml Überstand vorhanden sind.
Verwendung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei die Verabreichung des Impfstoffs intramuskulär oder subkutan erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Impfstoff zwei Adjuvanzien umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Adjuvanzien Aluminiumhydroxidgel und eine Mineralöl/Lecithin-Emulsion sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die inaktivierten Zellen durch Inaktivieren einer Kultur von P. haemolytica in der späten logarithmischen Wachstumsphase mit Formalin hergestellt werden.
Biologisch reine Kultur von Pasteurella haemolytica mit der ATCC-Nr. 55318 oder damit identischen Stämmen.