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Die
Lyme-Krankheit wurde zuerst durch Steere et al. in 1977 beschrieben,
die über
eine Arthritis-Epidemie in Lyme, Old Lyme und East Haddam, Connecticut,
berichteten. 1982 entdeckte Dr. Willy Burgdorfer eine neue Spirochäte in dem
Mitteldarm von Ixodes dammini-Zecken (vgl. Burgdorfer W.A. et al.,
Science 216 (1982), 1317-1319). Später wurde gezeigt, dass diese
Spirochäte
eine Immunantwort in infizierten Kaninchen auslöst, welche Ähnlichkeit hatte mit der bei
Menschen, die an der Lyme-Krankheit leiden, und nun ist bekannt, dass
sie das äthiologische
Agens der Erkrankung ist. Die Spirochäte wurde später Borrelia burgdorferi bezeichnet.
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Obwohl
Ixodes-Zecken die am häufigsten
anzutreffenden Überträger von
Borrelia burgdorferi sind, sind die Spirochäten auch in Hirschfliegen,
Pferdefliegen und Moskitos nachgewiesen worden. Spirochäten dringen
in ein Wirtstier ein, wenn das Tier von dem Überträger gebissen wird. Die B. burgdorferi-Spirochäten besiedeln
verschiedene Gewebe des Wirtstieres, wo sie eine Langzeitinfektion
hervorrufen können.
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Vor
kurzem ist gezeigt worden, dass Borrelia burgdorferi einen einzigartigen
Typ einer extrachromosomalen DNA besitzt und zwar lineare Plasmide,
die eine Länge
im Bereich von 0,5 bis 50 kb aufweisen (Bergstrom S. et al., Scand.
J. Infect. Dis. – Anhang
77 (1991), 102-107). Diese Plasmide enthalten die Gene, welche die
zwei wichtigsten äußeren Oberflächenproteine
(Osp) die durch B. burgdorferi exprimiert werden, OspA und OspB,
codieren (Bergstrom et al., 1991). Es wird angenommen, dass diese
Proteine die Hauptantigene sind, welche an der Immunität gegen
eine B. burgdorferi-Infektion beteiligt sind. Schwan und Simpson
(Schwan T.G. und Simpson W.J., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang
77 (1991), 94-101) berichten über
eine Heterogenität
der OspA- und OspB-Proteine bei verschiedenen B. burgdorferi-Isolaten
sowie bei demselben Isolat, das bei unterschiedlichen Temperaturen
in vivo gezüchtet
wurde, und über
Studien zu verschiedenen Stadien während der Infektion von Mäusen.
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Das
erste Stadium der Lyme-Krankheit ist durch eine sich vergrößernde Hautläsion gekennzeichnet, welche
als Erythema chronicum migrans (Wanderröte) bezeichnet wird (Asbrink
E. und Hovmark A., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 4-15; Halperin
J.J., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang
77 (1991), 74-80). Die Individuen entwickeln auch häufig eine
Arthritis. Jedoch ist die Arthritis nur bei einem kleinen Prozentsatz
dieser Individuen chronisch (Steere A.C., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang
77 (1991), 51-54). Borrelia burgdorferi kann auch den Herzmuskel
infizieren. Die kardiale Beteiligung bei einer Lyme-Erkrankung ist
vorwiegend als vorübergehend
beschrieben worden. Allerdings ergaben Tierstudien, dass Skelett-
und Herzmuskeln regelmäßig betroffen
sind und dass sich die Spirochäten
anscheinend innerhalb der Muskelfasern ansiedeln. Diese Beobachtung
legt nahe, dass die Spirochäten
in den Wirten lange Zeit überleben
können
und auf diese Weise in der Lage sein können, chronische Herzkomplikationen
hervorzurufen (Stanek G. et al., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang
77 (1991), 85-87).
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In
einem hohen Prozentsatz der Fälle
infiziert B. burgdorferi auch das Nervensystem, woraus ein großer Bereich
von akuten, chronischen und progressiven Störungen des zentralen und peripheren
Nervensystems resultiert (Reik L. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539
(1991), 1-3). Veröffentlichte
Berichte haben gezeigt, dass europäische Populationen von der
Krankheitserfahrung des dramatischen klinischen Phänomens einer neurologischen
Störung
betroffen sind, während
nordamerikanische Patienten abgeschwächte Formen einer Beteiligung
des Nervensystems entwickeln (Halperin, 1991; Halperin J.J. et al.,
Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 24-34). Jedoch berichtet Halperin
(1991), dass es immer deutlicher wird, das im Hinblick auf die Beteiligung
des Nervensystems in beiden Populationen mindestens dieselbe Bandbreite
neurologischer Phänome auftritt.
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Die
Diagnose der Lyme-Krankheit ist auf eine Kombination der Erkennung
der vorhandenen klinischen Charakteristika und auch der Expositionswahrscheinlichkeit
in endemisch infizierten Gebieten angewiesen. Jedoch wird die Entwicklung
einer Arthritis häufig
auf andere Ursachen zurückgeführt und
nicht mit einer Spirochäteninfektion
in Beziehung gebracht. Die neurologischen Symptome, welche das Ergebnis
einer B. burgdorferi-Infektion sein können, können eine Vielzahl von anderen
neurologischen Zuständen
nachahmen (Reik et al., 1988). Zusätzlich zu diesen diagnostischen
Komplikationen ist es schwierig, die Spirochäten in den betroffenen Geweben
nachzuweisen.
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Eine
Borrelia-Infektion ist mit Antibiotika, z.B. Tetracyclin, Penicillin,
Amoxycilin, Doxycilin, Erythromycin und Phenoxymethylpenicillin,
behandelt worden (Neu H., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 314-316;
Skoldenberg B. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 317-323;
Weber K. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 325-345; Luft
B.J. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 352-361). Ceftriaxon
und chemisch verwandte Substanzen haben sich ebenfalls als Chemotherapeutika
nützlich
erwiesen (Neu, 1988). Jedoch ist die Etablierung von Protokollen
für eine
wirksame chemische Behandlung der Lyme-Krankheit durch den Mangel
an Daten, mit denen ein geeigneter Zeitraum für die Behandlung festgelegt
werden könnte,
erschwert worden. Zusätzlich fehlten
Studien zur Wirksamkeit von Arzneimitteln in menschlichen Patienten.
Das Therapiebild wird weiterhin durch die Notwendigkeit erschwert,
ausreichend hohe Gewebekonzentrationen von Antibiotika aufzubauen und
aufrechtzuerhalten, um eine chronische Borrelia-Infektion zu bekämpfen (Neu,
1988; Skoldenberg et al., 1988).
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In
Anbetracht dieser Schwierigkeiten bei dem Nachweis und der Behandlung
der Lyme-Krankheit sowie der Unmöglichkeit,
die Ausbreitung der Spirochäten-Überträgern zu kontrollieren, bestand
ein anerkannter Bedarf an einem Impfstoff, der in der Lage ist,
anfällige
Tiere und Menschen gegen eine Borrelia burgdorferi-Infektion zu immunisieren.
Impfstoffe sind in Hamstermodellen (Johnson R.C. et al., Ann. N.Y.
Acad. Sci. 539 (1988), 258-263) und Rattenmodellen (Barthold S.W.
et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 264-273) untersucht worden.
Ein Ganzzell-Borrelia burgdorferi-Bakterin zur Verwendung in Haustieren
ist entwickelt worden (US-Patent Nr. 4,721,617). Impfstoffe auf
der Basis des OspA- und/oder OspB-Proteins von Borrelia burgdorferi
sind ebenfalls entwickelt worden. Jedoch enthalten diese Ganzzell-
und Untereinheitenimpfstoffe lediglich ein B. burgdorferi-Isolat
oder sind nur von einem B. burgdorferi-Isolat abgeleitet.
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In
der Literatur gibt es auch Berichte, welche durch in-vitro-Studien
die Existenz von mehreren verschiedenen seroprotektiven Gruppen
bei nordamerikanischen und europäischen
Isolaten von B. burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii und
Borrelia afzelli nachgewiesen haben. Solche Berichte schließen jene
von Lovrich S.D. et al., Infection and Immunity 61 (10) (1993),
4367-4374, und Lovrich S.D. et al., The Journal of Infectious Diseases
170 (1994), 115-121, ein. Diese Ergebnisse sind von Manchen so interpretiert
worden, dass es nahe liegend ist, dass Kombinationen der verschiedenen
Isolate, deren Antigene oder deren immunogenen protektiven Proteine
erforderlich sind, um einen umfassenden Impfstoff bereitzustellen.
Bezugnehmend auf solche Berichte, die darin vorgestellten Ergebnisse
und andere solche Berichte bemerkten Fikrig E. et al. (J. Exp. Medicine
181 (1995), 215-221), dass die Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit
gegen die Lyme-Krankheit anhand der natürlichen Übertragungsweise erfolgen und
nicht basierend auf Klassifikationssystemen oder Tests, welche den Überträger, der
die Infektion überträgt, nicht
berücksichtigen,
vorausgesagt werden sollte, und erklären ihren Nachweis einer erfolgreichen
OspA- oder OspB-Immunisierung gegen eine Infektion mit heterologen
B. burgdorferi-Spezies gegenüber
solchen Berichten. Andere Literaturstellen, die mit Fikrig übereinstimmen,
schließen
zum Beispiel EP-A-0 465 204 ein, worin ein Impfstoff, enthaltend
eine bestimmte Menge der B. burgdorferi-Hauptantigene eines einzigen
Isolats, offenbart wird, der in der Lage ist, einen empfindlichen Säuger vor
einer Infektion durch verschiedene Stämme zu schützen. Vgl. auch Telford et
al., J. Exp. Med. 178 (2) (1993), 755-758, die einen Schutz gegen
antigenisch variable B. burgdorferi-Spezies, welcher unter Verwendung
eines aktiven Immunisierungsprotokolls mit rekombinanten Glutathiontransferase-Hüllmembran-Oberflächenprotein-Fusionsproteinen
A oder B (OspA oder OspB) und einer natürlichen Infektionsmethode übertragen
wird, offenbaren.
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Im
Gegensatz dazu enthält
das Bakterin dieser Erfindung mindestens zwei nicht-kreuzprotektive
B. burgdorferi-Isolate oder ist davon abgeleitet. Das Bakterin dieser
Erfindung überträgt daher
einen Immunschutz gegen zwei verschiedene Typen eines B. burgdorferi-Isolats,
während
die bereits beschriebenen Bakterine nur einen Schutz gegen einen
Typ eines Isolats vorsehen. Folglich ist das durch diese Erfindung
bereitgestellte Bakterin geeigneter, um Lebewesen (Tiere) gegen
die Lyme-Krankheit zu impfen.
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Diese
Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer
Menge, welche zur Verstärkung
der Immunogenität
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und
einen geeigneten Träger
umfasst. Die nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate können aus
den seroprotektiven Gruppen von Borrelia burgdorferi-Isolaten aus
Wisconsin, Chicago und Europa ausgewählt sein. Gegenwärtig werden
Isolate aus der Wisconsin- und Chicago-Gruppe bevorzugt. Jedoch
können
auch Isolate aus anderen seroprotektiven Gruppen verwendet werden.
Das Bakterin kann ferner ein drittes nicht-kreuzprotektives, inaktiviertes
Borrelia burgdorferi-Isolat umfassen.
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Diese
Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
Menge von mindestens einer antigenen Untereinheit, die von mindestens
einem der zwei nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate
abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der
Immunogenität
der einen oder mehreren antigenen Untereinheiten oder des Isolats
wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
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Diese
Erfindung stellt ferner ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit, die von einem
ersten Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet ist, eine wirksame
immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit, welche von einem
zweiten nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet
ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der
Immunogenität
der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
Das Bakterin kann weiterhin eine wirksame immunisierende Menge einer
antigenen Untereinheit von einem dritten nicht-kreuzprotektiven
Borrelia burgdorferi-Isolat umfassen.
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Diese
Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren antigenen
Untereinheiten der nicht-kreuzprotektiven Isolate, ein Adjuvans
in einer Menge, welche zur Verstärkung
der Immunogenität
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen
Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
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Diese
Erfindung stellt ferner die Verwendung eines Bakterins, das eine
wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer
Menge, welche zur Verstärkung
der Immunogenität
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und
einen geeigneten Träger
umfasst, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen
eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
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Diese
Erfindung stellt auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens einer antigenen Untereinheit,
die von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolaten
abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der
Immunogenität
der antigenen Untereinheit wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst,
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen
eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
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Die
Erfindung stellt auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren
antigenen Untereinheiten der nicht-kreuzprotektiven Isolate, ein
Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam
ist, und einen geeigneten Träger
umfasst, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren
gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
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Das
Tier kann ein Säuger
sein, einschließlich,
aber nicht darauf begrenzt, Menschen und Hunde. Diese Erfindung
umfasst ein Arzneimittel, welches dergestalt ist, dass an das Tier
eine zusätzliche
Dosis des Impfstoffes in einem geeigneten Zeitintervall nach der
Verabreichung der vorhergehenden Dosis verabreicht werden kann.
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1:
Wachstumskurve einer lebensfähigen
B. burgdorferi-Kultur. Die vertikale Achse gibt die Zahl der Zellen
(× 107) an, welche in einer Petroff-Hauser-Zählkammer bestimmt wurde.
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2:
Dextroseverbrauch und Lactatproduktion in einer B. burgdorferi-Kultur.
Ausgefüllte
Kreise markieren die Lactatproduktion und nicht ausgefüllte Kreise
markieren den Dextroseverbrauch in der Kultur. Die Werte sind in
g/l Kulturmedium angegeben.
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3:
Plethysmograph-Werte, welche die Quecksilberverdrängung durch
die Pfoten von Kontroll- und geimpften Hamstern zeigen. Die Hamster
wurden entweder mit normalem Hamsterserum (NHS) oder Serum von Hamstern,
welche selbst mit dem angegebenen B. burgdorferi-Isolat (297 oder
35211) geimpft worden waren, geimpft. Die vertikale Achse gibt die
Quecksilberverdrängung
in mm Hg an. Die horizontale Achse markiert die Anzahl der Tage
nach der Infektion, an denen die Quecksilberverdrängung gemessen
wurde. Nicht ausgefüllte
Kreise = Basislinienwerte, entsprechend unge impften und nicht herausgeforderten
(gechallenged) Hamstern; ausgefüllte
Kreise = Hamster geimpft mit Antiserum von Hamstern, die mit dem
lebenden B. burgdorferi-Isolat 297 geimpft und anschließend mit
dem Isolat 297 herausgefordert wurden; ausgefüllte Quadrate = Hamster, geimpft
mit Anti-297-Antiserum und herausgefordert mit dem Isolat 35211;
nicht ausgefüllte
Quadrate = Hamster, geimpft mit normalem Hamsterserum und exponiert
mit dem Isolat 35211; und ausgefüllte
Dreiecke = Hamster, geimpft mit normalem Hamsterserum und herausgefordert
mit dem Isolat 297.
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4:
Immunogenitätstest:
Borrelia-Antikörper
für die
Isolierung von S-1-10, gemessen durch einen Borrelia-Antikörper-Test
(Borreliacictal assay) nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin
und nach Herausforderung (Challenge) mit B. burgdorferi-infizierten
Zecken.
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5:
Immunogenitätstest:
Borrelia-Antikörper
für die
Isolierung von C-1-11, gemessen durch einen Borrelia-Antikörper-Test
nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach
Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
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6:
Immunogenitätstest:
Gegen das S-1-10-Antigen gerichtete Antikörper, gemessen durch einen ELISA
nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach
Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
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7:
Immunogenitätstest:
Gegen das C-1-11-Antigen gerichtete Antikörper, gemessen durch einen ELISA
nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach
Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
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8A und 8B:
Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung
(PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Zeckenexposition
(PC) und acht Wochen nach der Zeckenexposition (PsC), gegen die
Isolate S-1-10 (8A) und C-1-11 (8B).
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9A und 9B:
Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung
(PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Zeckenexposition
(PC) und acht Wochen nach der Zeckenexposition (PsC), gegen die
Isolate S-1-10 (9A) und C-1-11 (9B).
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10A und 10B:
Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV),
sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Herausforderung durch
Zecken (PC) und acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken
(PsC), gegen die Isolate S-1-10 (10A)
und C-1-11 (10B).
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11A und 11B:
Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV),
sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Herausforderung durch
Zecken (PC) und acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken
(PsC), gegen die Isolate S-1-10 (11A)
und C-1-11 (11B).
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12A und 12B:
Western-Immunblots von Nichtimpfserum, gesammelt sieben Monate nach der
zweiten Impfung vor der Herausforderung durch Zecken (PC), gegen
die Isolate S-1-10 (12A) und C-1-11 (12B).
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13A und 13B:
Western-Immunblots von Nichtimpfserum, gesammelt acht Wochen nach
der Herausforderung durch Zecken (PsC), gegen die Isolate S-1-10
(13A) und C-1-11 (13B).
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14: Kurzdarstellung des prozentualen Anteils der
Hunde, die nach der Herausforderung durch Zecken eine Lahmheit zeigten,
beobachtet über
sieben Monate.
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15A und 15B:
Western-Immunblots (Isolat C-1-11) des Serums von Hunden, welche
mit einem Volldosis-Bakterin (5 × 108 Zellen
je Isolat pro Dosis), geimpft wurden. Das Serum wurde vor der Impfung (PV),
vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und zwölf Wochen nach der Herausforderung
gesammelt.
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16A und 16B:
Western-Immunblots (Isolat S-1-10) des Serums von Hunden, die mit
einem Volldosis-Bakterin (5 × 108 Zellen je Isolat pro Dosis), geimpft wurden.
Das Serum wurde vor der Impfung (PV), vor der Herausforderung durch
Zecken (PC) und zwölf
Wochen nach der Herausforderung gesammelt.
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17A und 17B:
Western-Immunblots (Isolat C-1-11) des Serums von Hunden, die mit
einem Volldosis-Bakterin (5 × 107 Zellen je Isolat pro Dosis), geimpft wurden.
Das Serum wurde vor der Impfung (PV), vor der Herausforderung durch
Zecken (PC) und zwölf
Wochen nach der Herausforderung gesammelt.
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18A und 18B:
Western-Immunblots (Isolat C-1-11) von Serum, das von ungeimpften
Kontrollen zum Zeitpunkt der Herausforderung durch Zecken (18A) und zwölf
Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (18B) gesammelt wurde.
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19A und 19B:
Western-Immunblots (Isolat S-1-10) von Serum, das von ungeimpften
Kontrollen zum Zeitpunkt der Herausforderung durch Zecken (19A) und zwölf
Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (19B) gesammelt wurde.
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20: Kurzdarstellung des prozentualen Anteils der
Hunde, die nach der Zeckenexposition eine Lahmheit zeigten, beobachtet über zwölf Monate.
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Diese
Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer
Menge, welche zur Verstärkung
der Immunogenität
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und
einen geeigneten Träger
umfasst.
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Typischerweise
ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 1010 Organismen
je Isolat. Bevorzugt ist die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 109 Organismen
je Isolat. Mehr bevorzugt ist die wirksame immunisierende Menge
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa
1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 108 Organismen
je Isolat. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame
immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate
eine Menge von etwa 107 Organismen je Isolat.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame
immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate
etwa 5 × 107 Organismen je Isolat. In einer anderen
besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame
immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 108 Organismen je Isolat.
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Für die Zwecke
dieser Erfindung ist ein "inaktiviertes" Borrelia burgdorferi-Isolat ein Isolat,
welches fähig
ist, eine Immunantwort in einem Tier auszulösen, aber das nicht in der
Lage ist, das Tier zu infizieren. Die Borrelia burgdorferi-Isolate
können
durch einen Wirkstoff, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus binärem Ethylenimin,
Formalin, β-Propriolacton
oder Hitze, inaktiviert werden. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung werden die Borrelia burgdorferi-Isolate durch binäres Ethylenimin
inaktiviert.
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Die
mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate
können
aus den seroprotektiven Gruppen A, B oder C von Borrelia burgdorferi-Isolaten
ausgewählt
sein. So wie in dieser Erfindung verwendet, beschreibt der Begriff "seroprotektive Gruppe
A von B. burgdorferi-Isolaten" eine
seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche das Wisconsin-Isolat
S-1-10 und die Isolate 297 und B31 einschließt; "seroprotektive Gruppe B von B. burgdorferi-Isolaten" beschreibt eine
seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche das Chicago-Isolat
C-1-11 einschließt;
und "seroprotektive
Gruppe C von B. burgdorferi-Isolaten" beschreibt eine seroprotektive Gruppe
von B. burgdorferi-Isolaten, welche die europäischen Isolate einschließt. Beispiel
10 beschreibt in-vitro-Kreuzprotektionsstudien mit neun B. burgdorferi-Isolaten,
die zeigen, dass sechs der seroprotektiven Gruppe A angehören, eines
der seroprotektiven Gruppe B angehört und zwei der seroprotektiven
Gruppe C angehören.
Jedoch wird die Verwendung von nicht-kreuzprotektiven Isolaten aus
anderen seroprotektiven Gruppen in dem Bakterin dieser Erfindung
in Betracht gezogen. Die in Beispiel 12 vorgestellten Ergebnisse
(vgl. nachstehend) zeigen, dass es mindestens zwei seroprotektive
Gruppen von Borrelia burgdorferi neben den seroprotektiven Gruppen
A, B oder C gibt.
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Eine
Kreuzprotektivität
kann durch die Impfung eines Tieres, z.B. eines Hamsters, mit einem
lebenden B. burgdorferi-Isolat bestimmt werden. Das Antiserum eines
solchen Tieres wird dann zu Kulturen von B. burgdorferi-Isolaten
zugegeben. Die Antikörper
in Verbindung mit dem Komplement sollten den Zelltod des gleichen
Isolats, das für
die Impfung des Tieres verwendet wurde, in den Kulturen herbeiführen. Falls
die Antikörper
eine Antigendeterminante auf einem zweiten Isolat erkennen, induzieren
sie den Zelltod in einer Kultur dieses Isolats. Daher kann angenommen
werden, dass das erste und das zweite B. burgdorferi-Isolat kreuzprotektiv
sind. Eine Kreuzprotektivität
kann auch durch die Impfung eines Tieres mit einem B. burgdorferi-Isolat, die
Isolierung von Antiserum des Tieres und die Impfung eines anderen
Tieres der gleichen Spezies mit diesem Antiserum festgestellt werden.
Dieses Tier wird anschließend
entweder mit demselben oder mit einem zweiten B. burgdorferi-Isolat
herausgefordert. Die Antikörper
sollten eine passive Immunität
gegen eine Herausforderung mit dem gleichen Isolat auf das Empfängertier übertragen.
Falls die Antikörper
auch eine passive Immunität
gegen ein zweites Isolat übertragen,
sind die Isolate kreuzprotektiv.
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Kreuzprotektive
Isolate exprimieren äußere Oberflächenproteine
(Osp), die Antigendeterminanten gemeinsam haben, welche durch dieselben
Antikörper
erkannt werden. Kreuzprotektive Isolate gehören derselben seroprotektiven
Gruppe an. Demgemäß ist eine "seroprotektive Gruppe" eine Gruppe von
B. burgdorferi-Isolaten, welche die gleichen protektiven, äußeren Oberflächenproteine
gemeinsam haben. Antikörper,
welche diese Proteine erkennen, übertragen
eine passive Immunität
gegen eine Herausforderung durch ein beliebiges Isolat, welches
ein Mitglied der gleichen seroprotektiven Gruppe ist.
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Antikörper, die
gegen ein Mitglied eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten
gerichtet sind, übertragen
keine passive Immunität
gegen das andere Mitglied des Paares. Nicht-kreuzprotektive Isolate
gehören
daher verschiedenen seroprotektiven Gruppen an. Die Impfung mit
einem inaktivierten B. burgdorferi-Isolat übertragt keine passive Immunität auf ein
Tier gegen eine Herausforderung durch nicht-kreuzprotektive Isolate.
Das Bakterin dieser Erfindung, welches mindestens zwei nicht-kreuzprotektive
Isolate umfasst, ist dadurch wirksam, dass es die Bildung von Borrelia-Antikörpern gegen
die Mitglieder von zwei seroprotektiven Gruppen induziert. Daher
sieht das Bakterin ein breiteres Immunschutzspektrum vor als das,
welches mit gegenwärtig
erhältlichen
Impfstoffen, die mehrere nicht-kreuzprotektive B. burgdorferi-Isolate
verwenden, erhalten werden kann.
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In
einer Ausführungsform
dieser Erfindung sind die nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate aus
den seroprotektiven Gruppen A und B von Borrelia burgdorferi-Isolaten
ausgewählt.
Das Borrelia burgdorferi-Isolat aus der seroprotektiven Gruppe A
kann das Wisconsin-Isolat S-1-10 oder das Isolat 297 oder B31 sein.
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In
der gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung ist das Borrelia burgdorferi-Isolat aus der seroprotektiven
Gruppe A das Wisconsin-Isolat S-1-10. Vorzugsweise ist das B. burgdorferi-Isolat
aus der seroprotektiven Gruppe B das Chicago-Isolat C-1-11. Jedoch
kann diese Erfindung auch mit anderen inaktivierten B. burgdorferi-Isolaten,
welche in die seroprotektive Gruppe B eingruppiert werden, durchgeführt werden.
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Für die Zwecke
dieser Erfindung ist ein Adjuvans eine chemische Zusammensetzung,
welche in der Lage ist, die Immunogenität von Antigenen zu verstärken, wenn
das Adjuvans als Teil eines Bakterins verabreicht wird. Adjuvanzien,
welche in dem Bakterin dieser Erfindung nützlich sind, können aus
der Gruppe bestehend aus Aluminiumhydroxid, Carbopol, Lipopolysaccharid
(LSP) und Derivaten davon ausgewählt
sein. Der Begriff "Lipopolysaccharid", wie hierin verwendet,
verweist auf eine Gruppe von Polysacchariden, welche den Fachleuten
durch ihr Vorkommen in der Zellwand von Bakterien bekannt und als
Adjuvanzien nützlich
sind. Bestimmte Beispiele von Lipopolysacchariden und Derivaten
davon, welche eine Adjuvanswirkung zeigen, sind in Impfstoffen verwendet
worden. Die Verwendung von Lipopolysacchariden oder Derivaten davon
in Verbindung mit dem Bakterin dieser Erfindung wird in Betracht
gezogen. In der gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung ist das Adjuvans Aluminiumhydroxid. Jedoch kann
irgendein anderes Adjuvans, welches in der Lage ist, die Immunogenität von inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolaten zu verstärken, in dem Bakterin dieser
Erfindung verwendet werden.
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Wie
hierin verwendet, ist eine "wirksame
Menge" eines Adjuvans
irgendeine Menge des Adjuvans, welche zur Verstärkung der Immunogenität von Antigenen
in dem Bakterin wirksam ist. Typischerweise ist die wirksame Menge
des Adjuvans eine Menge von etwa 1,0 Volumen-% bis etwa 15 Volumen-%
je Dosis des Bakterins. Bevorzugt ist die wirksame Menge des Aluminiumhydroxid-Adjuvans
eine Menge von etwa 5 Volumen-% bis etwa 10 Volumen-%. Am meisten
bevorzugt beträgt
die wirksame Menge des Aluminiumhydroxid-Adjuvans 7,5 Volumen-%.
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"Träger", wie hierin verwendet,
bedeutet irgendeines der herkömmlichen
Verdünnungsmittel
für ein Bakterin,
welche den Fachleuten hinreichend bekannt sind. In der gegenwärtig bevorzugten
Ausführungsform dieser
Erfindung umfasst der Träger
einen wässrigen
Puffer, z.B. physiologische Kochsalzlösung, und Konservierungsmittel,
z.B. Nystatin und Gentamicin.
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Das
Bakterin dieser Erfindung kann ferner eine wirksame immunisierende
Menge eines dritten nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia
burgdorferi-Isolats umfassen.
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Diese
Erfindung stellt die Verwendung des Bakterins der vorliegenden Erfindung
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen
eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit, wobei eine Dosis
des Bakterins dieser Erfindung an das Tier zu verabreichen ist.
Den Fachleuten ist hinreichend bekannt, dass Borrelia burgdorferi
das verursachende Agens der Lyme-Krankheit
ist und dass eine Infektion das Ergebnis eines Bisses von warmblütigen Wirtstieren
durch Bakterien tragende Zecken ist. Es ist nachgewiesen worden,
dass Tiere als Antwort auf eine Impfung mit Borrelia burgdorferi
Antikörper
produzieren und dass daher eine Impfung entweder mit einem inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolat
oder einer Untereinheit davon ein möglicher Ansatz für den Schutz
vor der Lyme-Krankheit ist. Aufgrund der Schwierigkeit einer korrekten
Diagnose der Lyme-Krankheit,
der Unzulänglichkeit
von Behandlungsprotokollen und der Undurchführbarkeit einer Kontrolle der Überträger der
Krankheit, ist ein präventiver
Ansatz zur Kontrolle der Krankheit erforderlich. Die bisher verwendeten
B. burgdorferi-Impfstoffe enthalten nur ein Isolat der Bakterien.
Demgemäß sind solche
Impfstoffe am besten geeignet für
die Immunisierung gegen die Exposition von Isolaten, die ausschließlich derselben
seroprotektiven Gruppe wie das Impfstoff-Isolat angehören. Das
durch diese Erfindung bereitgestellte Bakterin kann eine Immunität gegen
Isolate aus mindestens zwei seroprotektiven Gruppen bereitstellen
und daher einen breiteren Schutz als die gegenwärtig erhältlichen Impfstoffe bereitstellen.
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Typischerweise
ist das Tier, an das der Impfstoff dieser Erfindung verabreicht
wird, ein Säuger.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Säuger
ein Mensch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung
ist der Säuger
ein Hund. Bei der Durchführung
dieser Erfindung ist ein Fachmann in der Lage, für jedes Tier, das geimpft werden
soll, das geeignete Alter zu bestimmen, in dem das Tier immunkompetent ist,
d.h. ein richtig funktionierendes Immunsystem besitzt. Eine Immunisierung
wäre daher
zu dem Zeitpunkt geeignet, wenn das Tier immunkompetent ist, und
vorzugsweise vor der Exposition mit Borrelia burgdorferi.
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Falls
das zu impfende Tier zum Beispiel ein Hund ist, ist der Hund zum
Zeitpunkt der ersten Verabreichung des Bakterins mindestens etwa
12 Wochen alt und vorzugsweise etwa 6 Wochen bis etwa 16 Wochen alt.
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Diese
Erfindung zieht auch in Betracht, dass das Bakterin der vorliegenden
Erfindung in einer zusätzlichen
Dosis des Impfstoffes in einem geeigneten Zeitintervall nach der
Verabreichung der vorhergehenden Dosis an das Tier zu verabreichen
ist. Diese Erfindung zieht folglich in Erwägung, dass mehrere Dosen des inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Bakterins an ein Tier verabreicht werden. Die
Verabreichung von mehr als einer Dosis eines Bakterins soll die
Immunantwort des geimpften Tieres auf bakterielle Antigene im Vergleich
zu derjenigen, welche durch die Verabreichung einer Einzeldosis
erzielt werden kann, verstärken.
Zwischen der Verabreichung jeder Dosis sollte ein geeignetes Zeitintervall
liegen, um zu ermöglichen,
dass das Immunsystem des Tieres auf die mehreren Dosen des Bakterins
eine stärkere
Antwort als auf eine Einzeldosis aufbaut. Ein "geeignetes" Zeitintervall zwischen der Verabreichung
von mehreren Dosen eines Bakterins an ein Tier ist daher ein Zeitintervall
zwischen der Verabreichung von Dosen eines Impfstoffes, welches
ausreichend ist, um zu bewirken, dass das Tier eine stärkere Immunantwort
aufbaut, als wenn eine Einzeldosis verabreicht wird. Typischerweise
beträgt
das geeignete Zeitintervall zwischen der Verabreichung von Dosen
des Bakterins dieser Erfindung etwa zwei Wochen bis etwa fünf Wochen
und vorzugsweise etwa drei Wochen. Diese Erfindung zieht ferner
die Verabreichung einer zusätzlichen
Dosis des Bakterins an das Tier ungefähr ein Jahr nach der ersten
Verabreichung und in etwa jährlichen
Intervallen danach in Betracht. Eine solche als "Booster"-Dosis bekannte Verabreichung ist auf
dem Fachgebiet der Impfung eine übliche
Vorgehensweise. Das inaktivierte Borrelia burgdorferi-Bakterin kann
durch irgendeinen der Wege, welche auf dem Fachgebiet für die Verabreichung
von Impfstoffen bekannt sind, verabreicht werden. Der gegenwärtig bevorzugte
Verabreichungsweg für das
Bakterin ist durch intramuskuläre
Injektion.
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Diese
Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge einer oder mehrerer antigener Untereinheiten,
welche von einem ersten Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind,
eine wirksame immunisierende Menge einer oder mehreren antigenen
Untereinheiten, welche von einem zweiten nicht-kreuzprotektiven
Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind, ein Adjuvans in einer
Menge, welche zur Verstärkung
der Immunogenität
der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
Auf dem Fachgebiet ist gut bekannt, dass die Antigendeterminanten
von Borrelia burgdorferi als "äußere Oberflächenproteine" (Osp) bezeichnet
werden und durch Plasmide, welche in den Bakterien enthalten sind,
codiert werden. Die gegenwärtig
bekannten Osp-Proteine von Borrelia burgdorferi sind die OspA, OspB-, OspC-,
OspD- und OspE-Proteine. Von diesen Proteinen sind die OspA- und
OspB-Proteine die am besten untersuchten und charakterisierten Proteine.
Das Bakterin dieser Erfindung schließt die Verwendung eines OspA-Proteins
oder einer Kombination des OspA-Proteins und des OspB-Proteins von
mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven B. burgdorferi-Isolaten ein.
Das Bakterin schließt
ferner die Verwendung anderer Osp-Proteine ein, entweder allein
oder in Kombination mit den OspA- und OspB-Proteinen, für welche
gezeigt wird, dass sie eine Borrelia-Antikörper-Antwort auslösen, welche
vergleichbar ist mit derjenigen, die für das OspA-Protein und die
OspA/OspB-Protein-Kombination bekannt ist. Für eine Besprechung der Herstellung
von Impfstoffen gegen die Lyme-Krankheit
unter Verwendung von antigenen Untereinheiten und Polypeptiden,
die von den äußeren Oberflächenproteinen
von B. burgdorferi abgeleitet sind, vgl. die Internationale PCT-Anmeldung
PCT/US94/08529, veröffentlicht
am 9. Februar 1995 als Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/04145,
wobei der Inhalt davon unter Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
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Wie
vorstehend besprochen, haben kreuzprotektive Isolate Antigendeterminanten
gemeinsam, die durch Antikörper
erkannt werden können
und woran Antikörper
binden. Folglich haben die Osp-Proteine von kreuzprotektiven Isolaten
Antigendeterminanten gemeinsam und werden durch dieselben Antikörper erkannt. Kreuzprotektive
Isolate gehören
wie erwähnt
derselben seroprotektiven Gruppe an. Die Impfung mit einem Mitglied
einer seroprotektiven Gruppe begründet eine Immunität gegen
eine Herausforderung durch andere Isolate, welche in dieselbe seroprotektiven
Gruppe eingruppiert werden. Antikörper, welche gegen ein Mitglied
eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten gerichtet sind, übertragen
keine passive Immunität
gegen das andere Mitglied des Paares. Nicht-kreuzprotektive Isolate
gehören
verschiedenen seroprotektiven Gruppen an. Die Impfung mit einem
Mitglied eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten überträgt keine
Immunität gegen
eine Herausforderung durch das andere Mitglied des Paares. Folglich
verleiht die Impfung mit einer wirksamen Menge eines OspA-Proteins
oder einer Kombination aus einem OspA-Protein und einem OspB-Protein
von einem Isolat eine passive Immunität gegen eine Herausforderung
durch dasselbe Isolat sowie andere kreuzprotektive Isolate.
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Typischerweise
ist die wirksame immunisierende Menge von jeder der antigenen Untereinheiten,
die von den nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolaten
abgeleitet sind, eine Menge von etwa 1 Mikrogramm bis etwa 1000
Mikrogramm.
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Das
Bakterin dieser Erfindung kann ferner eine wirksame immunisierende
Menge einer oder mehrerer antigener Untereinheiten, die von einem
dritten nicht-kreuzprotektiven
Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind, umfassen. Jedoch ist
das Bakterin nicht darauf begrenzt, dass es ein, zwei oder drei
nicht-kreuzprotektive Isolate enthält, sondern kann vier oder
mehr solcher Isolate enthalten.
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Diese
Erfindung sieht die Verwendung eines Bakterins, das drei oder mehr
nicht-kreuzprotektive B. burgdorferi-Isolate umfasst, für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine durch
B. burgdorferi verursachte Erkrankung vor.
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Diese
Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren
antigenen Untereinheiten von den nicht-kreuzprotektiven Isolaten,
ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam
ist, und einen geeigneten Träger
umfasst. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung dieses Bakterins für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine durch
B. burgdorferi verursachte Erkrankung, wobei eine Dosis eines solchen
Bakterins an das Tier zu verabreichen ist.
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Diese
Erfindung sieht ferner die Verwendung eines Bakterins, das eine
wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer
Menge, die zur Verstärkung
der Immunogenität
der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und
einen geeigneten Träger
umfasst, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen
eine Infektion durch Borrelia burgdorferi vor.
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In
einer Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen Verwendung ist die wirksame immunisierende
Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate
eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa
1010 Organismen je Isolat. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 109 Organismen
je Isolat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame immunisierende
Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate
eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa
108 Organismen je Isolat. In einer bevorzugten
Ausführungsform
beträgt
die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 107 Organismen
je Isolat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame
immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia
burgdorferi-Isolate etwa 5 × 107 Organismen je Isolat. In einer anderen
besonders bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 108 Organismen
je Isolat.
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Die
Erfindung sieht auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame
immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven,
inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren
antigenen Untereinheiten von den nicht-kreuzprotektiven Isolaten,
ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten
Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam
ist, und einen geeigneten Träger
umfasst, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren
gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi vor.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen Verwendung ist die wirksame immunisierende
Menge der antigenen Untereinheiten, die von jedem der nicht-kreuzprotektiven
Borrelia burgdorferi-Isolate abgeleitet ist, eine Menge von etwa
10 Mikrogramm bis etwa 10.000 Mikrogramm.
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Die
Erfindung wird im folgenden Abschnitt mit der Bezeichnung "experimentelle Einzelheiten" weiter veranschaulicht.
Der Abschnitt "experimentelle
Einzelheiten" und
die darin enthaltenen Beispiele werden zur Erleichterung des Verständnisses
der Erfindung angegeben. Dieser Abschnitt soll die Erfindung, so
wie sie in den folgenden Ansprüchen
dargelegt ist, in keiner Weise begrenzen oder als eine Begrenzung
davon interpretiert werden.
-
Beispiel 1
-
Herstellung
von Borrelia burgdorferi-Bakterin
-
Erforderliche Gerätschaften:
-
- Steril: 20 ml-Röhrchen,
250 ml-Flaschen und 10 l-Gefäße; 200
l-, 500 l- oder 3000 l-Fermenter;
serologische Pipetten; Magnete; Misch- und Lagertanks; und Zentrifuge.
- Nichtsteril: Magnetrührmotoren;
Pipettierhilfen; Schlauchpumpen; Schläuche und Schlauchklemmen; Petroff-Hauser-Zählkammer;
Dunkelfeldmikroskop; Overalls, Handschuhe, Kopfbedeckungen, Masken,
Schuhüberzüge und Gesichtsmasken;
Mikropipette und Mikropipettenspitzen; Kochsalzlösung-Blindproben.
- Verwendete Mikroorganismen: Zwei Isolate von Borrelia burgdorferi
wurden bei der Herstellung des Produkts verwendet, und zwar die
Borrelia burgdorferi-Isolate C-1-11 und S-1-10, welche von Dr. Steven
M. Callister, Gundersen Medical Foundation, La Crosse, WI, erhalten
wurden. Das Bakterin enthält
angepaßte
Zahlen jeder Borrelia-Isolat-Kultur,
um die Standardanforderungen für
eine Wirksamkeit zu erfüllen.
- Identität
jedes Mikroorganismus und Häufigkeit
der Identifizierungsverfahren: Die Identifizierung erfolgt auf der Grundlage
von morphologischen und serologischen Eigenschaften. Die serologische
Identifizierung der Hauptimpfkultur-Stammlösungen wird mit spezifischen
Antiseren unter Verwendung eines indirekten Fluoreszenzantikörpertests
durchgeführt.
- Virulenz, Reinheit, Aufrechterhaltung und Auswahl der Kulturen:
Die Virulenz der Kulturen ist kein notwendiges Kriterium für Antigenität. Die Reinheit
des Stammes wird durch eine genaue Untersuchung des Kulturwachstums
mit Hilfe eines Dunkelfeldmikroskops, einer Gramfärbung, einer
serologischen Identifizierung mit spezifischem Antiserum und einem
Test gemäß 9 C.F.R § 113.27
unter Verwendung von 0,5 ml- bis 1,0 ml-Proben bestimmt.
-
Die
Kulturen werden in Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium aufrechterhalten,
welches wie nachstehend beschrieben (vgl. Beispiel 5) hergestellt
wird. Subkulturen werden in BSK-Medium angelegt, wobei die Zahl
der Subkulturen auf 10 begrenzt ist.
-
Zusammensetzung von Impf-
und Produktionskulturen:
-
Die
Impf- und Produktionskulturen wurden in BSK-Medium angezogen. Die
Impfstammkulturen wurden in BSK-Medium vermehrt und nach Zugabe
von Glycerin (Endkonzentration 10-14%) eingefroren. Die eingefrorenen
Stammkulturen werden bei –70°C oder kälter aufbewahrt.
-
Beschaffenheit, Größe und Form
der für
die Anzucht der Kulturen verwendeten Behälter:
-
Die
eingefrorenen Stammkulturen werden in 20 ml-Röhrchen mit Schraubverschluß, enthaltend
10 ml Medium, vermehrt. Die 20 ml-Kulturröhrchen werden für das Beimpfen
von 250 ml-Flaschen oder -Kolben, enthaltend 200 ml Medium, verwendet.
Die 250 ml-Flaschen oder -Kolben werden für das Beimpfen von 10 l-Gefäßen, enthaltend
6 bis 8 Liter Medium, verwendet. Die 10 l-Gefäße können für das Beimpfen von 40 l-Gefäßen, enthaltend
25 bis 35 Liter Medium, eines 200 l-Fermenters, enthaltend 90 bis
175 Liter Medium, eines 500 l-Fermenters, enthaltend 175 bis 375
Liter Medium, oder eines 3000 l-Fermenters, enthaltend 800 bis 2500 Liter
Medium, verwendet werden. Der 200 l-Fermenter kann verwendet werden,
um einen 3000 l-Fermenter, enthaltend 300 bis 2300 Liter Medium,
zu beimpfen.
-
Lagerungsbedingungen für Impfkulturen:
-
Die
Stammkulturen werden in BSK-Medium als eingefrorene Kulturen bei –70°C oder kälter aufrechterhalten.
-
Verfahren zur Herstellung
von Suspensionen für
das Beimpfen oder die Impfung:
-
Vier
1 ml-Fläschchen
des gewünschten
B. burgdorferi-Stammes werden aufgetaut und anschließend mit
jeweils 9,0 ml Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium (vgl. nachstehend)
hinzugefügt.
Die Impf- und Stammkulturen werden vor der Überführung in das BSK-Medium für 10 bis
96 Stunden bei 32°C ± 1 °C vermehrt,
was anhand der Wachstumsrate beurteilt wird. Die Impfkulturen werden
vor der Überführung in
das Produktionsmedium routinemäßig mikroskopisch
auf ihre Reinheit untersucht. Das Zellwachstum in den Probenröhrchen wurde
mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer
nach 12 Stunden und danach jede Stunde bis zur Passage gemessen.
Die B. burgdorferi-Kulturen werden bei einer Konzentration von größer als
oder gleich 1 × 108 Zellen/ml passagiert. Wenn die Konzentration
der Zellen größer als
1 × 108 Zellen/ml wird, wird für jede Röhrchenkultur eine Gramfärbung durchgeführt, und
zwei annehmbare Kulturröhrchen
werden für
das Beimpfen von 250 ml-Impfmaterial gepoolt. Vier 250 ml-Kolben,
enthaltend 196,0 ml BSK-Medium, werden mit 4 ml des vorstehend beschriebenen
Impfmaterials beimpft und dann stationär während 48 bis 60 Stunden bei
32°C inkubiert.
Das Zellwachstum wird mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer
nach 24 Stunden und danach alle 6 Stunden bis zur Passage bestimmt.
Die Passage erfolgt bei Konzentrationen von größer als oder gleich 1 × 108 Zellen/ml. Wenn die Konzentration der Zellen
diesen Wert erreicht, wird für
jede Kolbenkultur eine Gramfärbung
durchgeführt,
und zwei annehmbare Kolben werden für das Beimpfen eines 10 l-Gefäßes gepoolt.
Jedes der drei 10 l-Gefäße, enthaltend
5880 ml BSK-Medium, wird mit 120 ml der vorstehend beschriebenen
Kultur beimpft. Die Kolben werden dann unter langsamen Rühren mit
einem Magnetrührstäbchen bei
32°C für 36 bis
48 Stunden inkubiert. Das Zellwachstum eines Gefäßes wird mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer nach
10 Stunden und danach alle 6 Stunden bis zur Passage, die bei einer
Konzentration von größer als
oder gleich 1 × 108 Zellen/ml erfolgt, bestimmt. Wenn die Konzentration
der Zellen in den Kulturen diesen Wert erreicht, wird für jede Gefäßkultur
eine Gramfärbung
durchgeführt,
und ein Gefäß mit 6
1 Inhalt wird verwendet, um einen 200 l-Fermenter, enthaltend 144
l BSK-Medium, zu beimpfen. Die Fermenter werden unter langsamen
Rühren
(55 UpM) bei 32°C
für etwa
96 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert bei 7,2 ± 0,2 kontrolliert wird. Nach
12, 24, 48 und 72 Stunden und danach alle 4 Stunden wird das Zellwachstum
mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer
bestimmt und anhand einer Grämfärbung überprüft. Die
Kultur wird inaktiviert, wenn sie die späte logarithmische Wachstumsphase
erreicht (etwa 5-7 × 108 Zellen/ml).
-
1 zeigt
eine Wachstumskurve für
eine Borrelia burgdorferi-Kultur. Wie aus der Figur erkennbar ist, begann
das exponentielle Wachstum der Kultur zwischen etwa 24 Stunden und
etwa 48 Stunden und hielt bis etwa 96 Stunden an, als sich das Wachstum
abschwächte.
-
2 zeigt
den Dextroseverbrauch und die Lactatproduktion einer Borrelia burgdorferi-Kultur.
Wie aus der Figur erkennbar ist, erhöht sich die Lactatproduktion
in der Kultur kontinuierlich. Dies zeigt die Wichtigkeit einer Kontrolle
des pH-Wertes in der Kultur. Ferner ist anhand der Figur erkennbar,
dass sich der Dextroseverbrauch mit der Zeit erhöht, was anzeigt, dass die Bakterien
die Dextrose als eine Energiequelle verwenden, welche daher ergänzt werden
muss, um die Lebensfähigkeit
oder das Wachstum der Kultur aufrechtzuerhalten.
-
Technik zur Beimpfung
von Impf- und Produktionsmedien:
-
Das
Impfmedium wird durch die direkte Übertragung der eingefrorenen
Stammkultur beimpft. Das Produktionsmedium wird durch die direkte Übertragung
der Impfkultur beimpft. Bei der Kulturbeimpfung werden weniger als
2% Impfmaterial verwendet.
-
Zeitraum, Bedingungen
und Temperaturgrad für
die Inkubation:
-
Nach
der Beimpfung werden die Gefäße bei 32°C ± 1 °C während 10
bis 96 Stunden inkubiert, und die Produktionsfermenter werden bei
32°C ± 1 °C während 24
bis 120 Stunden inkubiert. Gegebenenfalls wird sterile NaOH-Lösung zugegeben,
um den pH-Wert auf 7,2 ± 0,2
einzustellen.
-
Merkmal und Ausmaß des Wachstums:
-
Während der
Inkubation werden die beimpften Produktionskulturen täglich mit
Hilfe einer Petroff-Hauser-Quantifizierung mikroskopisch untersucht.
Am Ende des Inkubationszeitraums werden die Kulturen durch eine
Gramfärbung
und/oder Dunkelfelduntersuchung mikroskopisch auf eine Kontaminierung
untersucht.
-
Mindest- und Höchstzeiten
für die
Ernte:
-
Der
minimale Inkubationszeitraum bis zur Ernte beträgt 24 Stunden. Der maximale
Inkubationszeitraum bis zur Ernte beträgt 120 Stunden.
-
Erntetechnik:
-
Am
Ende des Inkubationszeitraums wird jede Produktionskultur durch
eine Gramfärbung
und/oder Dunkelfelduntersuchung mikroskopisch auf ihre Reinheit
untersucht, und Proben werden entnommen, um die Gesamtzellzahl zu
bestimmen. Die Kulturbehälter
können
bei 2°C
bis 7°C
gelagert werden.
-
Anforderungen für ein annehmbares
Erntematerial:
-
Ein
annehmbares Produktionswachstum umfasst Reinkulturen von Borrelia
burgdorferi, wie mittels Gramfärbung
und/oder Dunkelfeldmikroskopie nachgewiesen wird, sowie eine Borrelia-Zellzahl
von nicht weniger als 1 × 108 Organismen pro ml. Die Konzentration wird
mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer
(oder einem Äquivalent)
bestimmt.
-
Entsorgung von verworfenen
Materialien:
-
Alle
Materialien, die nicht bei der Herstellung des Bakterins verwendet
werden, müssen
gemäß dem Veterinary
Services Memorandum Nr. 800.56 entsorgt werden.
-
Beispiel 2
-
Herstellung des Produkts:
-
Inaktivierungsverfahren:
-
Das
Produktionswachstum wird mit binärem
Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Die Inaktivierung wird bei 32°C ± 2°C durchgeführt. Die
geeignete Menge an BEI wird in Form einer 0,344 M (7,05%) Lösung zubereitet. Eine
7,05%ige BEI-Lösung
wird durch Lösen
von 70,48 g 2-Bromethylaminhydrobromid (Molekulargewicht 204,89)
und 8,00 g NaOH (MW 40.00) in 1 Liter deionisiertem Wasser hergestellt.
Die Lösung
wird bei 37°C für 2 Stunden
inkubiert und dann in 30 ml pro Liter unter ständigem Rühren (langsamem Rühren) zu
der Kultur zugegeben. Die Inaktivierung wird für einen Zeitraum von nicht
weniger als 24 Stunden bei einem pH-Wert von 7,3 ± 0,2 unter
Rühren
(langsamen Rühren)
durchgeführt.
Nach Beendigung der Inaktivierung wird das BEI durch die Zugabe
von sterilem Natriumthiosulfat neutralisiert. Die geeignete Menge
der sterilen Natriumthiosulfatlösung
wird in Form einer 3,015 M (47,7%) Lösung zubereitet, indem 477,0
g Natriumthiosulfat in 1 Liter deionisiertem Wasser gelöst werden.
Diese Lösung
wird vor der Verwendung durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert und in 10,6 ml pro
Liter unter ständigem
Rühren
(langsamem Rühren)
zu der inaktivierten Kultur zugegeben. Die Neutralisierungsreaktion
läßt man für einen
Zeitraum von nicht weniger als 6 Stunden bei 32°C unter ständigem Rühren (langsamem Rühren) bei
einem pH-Wert von 7,3 ± 0,2
voranschreiten. Gentamicinsulfat und Nystatin werden in Endkonzentrationen
von 30,0 Mikrogramm/ml bzw. 30,0 Einheiten/ml zu der Kultur zugegeben.
Die Produktionsorganismen werden dann zur weiteren Verarbeitung
in sterilen Vorratsbehältern
vereinigt.
-
Inaktivierungstest:
-
Ein
Inaktivierungstest der Hauptmasse wird gemäß 9 C.F.R §113.100 durchgeführt. Der
inaktivierten Kultur wird eine Probe entnommen, und ein Röhrchen,
enthaltend 29 ml BSK-Medium, wird mit 1,0 ml der Probe beimpft.
Zur gleichen Zeit wird eine Probe desselben Organismus in einer
Konzentration von 10 Zellen/ml, wobei die Zellen bekanntermaßen lebensfähig sind,
als eine positive Wachstumskontrolle unter Verwendung einer Blindprobe
von 29,0 ml BSK-Medium in frischem BSK-Medium auf 1:30 verdünnt und
unter Verwendung von Blindproben von 9,0 ml BSK-Medium auf 10–1 bis
10–4 verdünnt. Die
Röhrchen
werden für
14 Tage bei 32°C ± 2°C inkubiert
und dann auf ein Wachstum untersucht. Ein zufriedenstellender Test
zeigt sich darin, dass es kein Anzeichen für ein Wachstum von Borrelia
in dem Röhrchen
gibt, das die inaktivierte Probe enthält. Die mit dem lebenden Organismus
beimpften Röhrchen
müssen
einen ID50-Wert zwischen ≤ 100 und ≥ 1, berechnet nach
der Reed-Muench-Methode, aufweisen.
-
Zusammensetzung, Anteile,
Konservierungsmittel und Adjuvanzien:
-
- 1. Aluminiumhydroxid-Adjuvans; Aluminiumhydroxid
[Al(OH)3] Rehydragel® HPA,
bezogen von Reheis Chemical Company (Berkeley Heights, New Jersey),
wird in einer Endkonzentration von nicht weniger als 1,5 mg (0,15%)
Aluminiumoxid (Al2O3)
je Dosis zu der Bakteriensuspension zugegeben.
- 2. Kochsalzlösung:
Sterile physiologische Kochsalzlösung
(0,85% NaCl – pH
7,2 ± 0,2)
kann als ein Verdünnungsmittel
zugegeben werden.
- 3. Konservierungsmittel: Gentamicinsulfat und Nystatin werden
in einer Endkonzentration von nicht mehr als 30,0 Mikrogramm/ml
bzw. 30,0 Einheiten/ml zu dem Produkt zugegeben.
- 4. pH: Der pH-Wert des fertigen Produkts wird mit sterilem NaOH
oder HCl auf 7,3 ± 0,1
eingestellt.
-
Verfahren und Ausmaß der Konzentration:
-
Das
Borrelia-Erntematerial wird durch Zentrifugation und Resuspension
in steriler Kochsalzlösung, enthaltend
Gentamicinsulfat und Nystatin in Endkonzentrationen von 30,0 Mikrogramm/ml
bzw. 30,0 Einheiten/ml, konzentriert. Das Borrelia-Erntematerial kann
bis auf ein 1/20 des ursprünglichen
Volumens eingeengt werden.
-
Verfahren zur Standardisierung
des Antigens:
-
Das
Bakterin wird mit Hilfe der Petroff-Hauser-Zellzahl, die nach der
Konzentration und Resuspension des Pelletmaterials bestimmt wurde,
zusammengestellt. Die Borrelia-Konzentration in jeder Kultur wird
wie vorstehend beschrieben bestimmt. Eine Mischung von Kulturen
mit hohen und niedrigen Konzentrationen kann bei der Einstellung
der Gesamtkonzentrationen verwendet werden.
-
Zusammenstellung einer
Serie:
-
- 1. Zusammenstellung von Einheiten zur Herstellung
einer Serie: Lagerbehälter
mit einem ausreichenden Volumen von einzelnen Pools eines jeden
Borrelia-Isolat werden aus der 4°C
bis 7°C
kalten Kühlvorrichtung entnommen.
Falls erforderlich, wird sterile physiologische Kochsalzlösung (0,85%
NaCl) als ein Verdünnungsmittel
zugegeben. Das Verdünnungsmittel
wird bei 121 °C ± 2°C 30 Minuten
autoklaviert oder, falls eine Probe in der Flüssigkeit einen Wert von ≥ 119°C mißt, nicht
weniger als 20 Minuten autoklaviert.
- 2. Beispiel für
eine Serienzusammenstellung Der pH-Wert
wird mit sterilem NaOH oder HCl auf 7,3 ± 0,1 eingestellt. Die durchschnittliche
Seriengröße beträgt 300 Liter.
Die maximale Seriengröße beträgt 900 Liter.
Die inaktivierten Borrelia-Suspensionen werden für die Zusammenstellung in einem
sterilen Edelstahltank vereinigt. Nach dem Mischen kann die gesamte
Serie in einem sterilen Edelstahlsammeltank gelagert oder auf kleinere
Behälter
aufgeteilt und bis zum Abfüllen
bei 2°C
bis 7°C
gelagert werden, oder das Produkt kann unmittelbar in Fläschchen
abgefüllt und
bei 2°C
bis 7°C
gelagert werden.
- 3. Füllvolumen
und Art des verwendeten Fläschchens:
Das Bakterin wird in 1,20 ml ± 0,05
ml je Dosis-Fläschchen
in Fläschchen
abgefüllt.
Die verwendeten Fläschchen
sind 2 ml-Glasfläschchen.
-
Verfahren und Technik
für das
Befüllen
und Versiegeln des fertigen Behälters
-
Sterile
Fläschchen
werden durch mechanische oder manuelle Sterilabfüllung der Charge unter ständigem Rühren befüllt. Die
befüllten
Fläschchen
werden mechanisch oder manuell mit sterilen Stopfen bedeckt und
mit Aluminiumverschlüssen
versiegelt.
-
Menge des antigenen Materials
je Dosis in dem fertigen Behälter
-
Jede
Dosis enthält
nicht weniger als die folgenden Organismen:
B. burgdorferi-Isolat
C-1-11 – 5 × 108 Organismen/ml.
B. burgdorferi-Isolat
S-1-10 – 5 × 108 Organismen/ml.
-
Beispiel 3
-
Testen des
Bakterins
-
Reinheit:
-
Jede
Serie oder Subserie wird gemäß 9 C.F.R. § 113.26
auf Bakterien und Pilze untersucht.
-
Sicherheit:
-
Der
Sicherheitstest wird mit der Hauptmasse oder den fertigen Behältern gemäß 9 C.F.R. §§ 113.38 und
113.40 durchgeführt,
wobei ein Sicherheitstest mit Hunden unter Verwendung einer 2-fachen
Dosis (2 cm3), verabreicht durch IM-Injektion, durchgeführt wird.
-
Wirksamkeit:
-
Der
Wirksamkeitstest wird mit der zusammengestellten Hauptmasse oder
den fertigen Behältern durchgeführt. Der
Wirksamkeitstest wird unter Verwendung eines Antigen-Abfang-ELISA
durchgeführt.
Zufriedenstellende Serien müssen
eine relative Wirksamkeit von ≥ 1,0,
bestimmt durch das U.S. Department of Agriculture, Veterinary Biologics
Program's Relative
Potency Calculations Software, Version 3.0, aufweisen.
-
Beispiel 4
-
Schritte nach
der Vorbereitung
-
Form und Größe der fertigen
Behälter,
worin das Produkt vertrieben wird:
-
Das
Bakterin wird in einem 2,0 ml-Fläschchen,
entsprechend einer Dosis (eine Dosis – 1,0 ml), vertrieben. Die
Kennzeichnung des fertigen Behälters
muß vollständig sein.
-
Gewinnung, Lagerung und
Submission von repräsentativen
Proben:
-
Repräsentative
Proben jeder Serie oder Subserie müssen für die APHISUSDA gemäß 9 C.F.R § 113.3 durch
einen autorisierten Stichprobenprüfer der Firma gewonnen werden.
-
Verfallsdatum des Produkts:
-
Das
für das
Produkt festgesetzte Verfallsdatum muß einen Zeitraum von 24 Monaten
beginnend nach dem zufriedenstellenden Wirksamkeitstest gemäß 9 C.F.R § 114.13
umfassen. Die Datierung wird gemäß 9 C.F.R § 114.13
bestätigt.
-
Verwendung, Dosierung
und Verabreichungsweg für
jede Tierspezies:
-
Das
Bakterin wird für
die Impfung von gesunden Hunden gegen eine durch B. burgdorferi
verursachte Krankheit empfohlen. Die Dosis beträgt jeweils 1,0 ml (1,0 cm3). Gesunde Hunde werden in einem Alter von 12
Wochen oder älter
mit zwei Dosen in einem Abstand von zwei bis drei Wochen geimpft.
Welpen, die jünger als
6 Wochen sind, sollten alle 2 bis 3 Wochen erneut geimpft werden,
bis sie mindestens 12 Wochen alt sind. Eine jährliche Wiederholungsimpfung
mit einer Dosis wird empfohlen. Der Verabreichungsweg ist durch
intramuskuläre
Injektion.
-
Beispiel 5
-
Herstellung des Barbour-Stoenner-Kelly
(BSK)-Mediums
-
Zusammensetzung:
-
Das
Medium wird für
die Vermehrung von Borrelia-Kulturen zur Verwendung in Bakterinen
verwendet. Alle Glaswaren werden nach der Reinigung mit einem Spülmittel
mit deionisiertem Wasser gründlich
gespült und
anschließend
autoklaviert.
-
Alle
Bestandteile werden in der angegebenen Reihenfolge unter ständigem,
langsamen Rühren
allmählich
zugegeben. Das Basalmedium wird wie folgt hergestellt:
Bestandteile: | Menge |
1)
Deionisiertes Wasser | 500,00
ml |
2)
HEPES | 4,60
g |
3)
Neopepton | 3,83
g |
4)
Natriumcitrat | 0,54
g |
5)
Glucose | 3,83
g |
6)
Natriumbicarbonat | 1,69
g |
7)
TC-Yeastolat | 1,92
g |
8)
Brenztraubensäure,
Natriumsalz | 0,61
g |
9)
N-Acetylglucosamin | 0,31
g |
-
Die
Lösung
wird langsam gerührt,
um alle Komponenten aufzulösen.
Anschließend
werden 76,70 ml 10× CMRL-1066
ohne Glutamin unter ständigem,
langsamen Rühren
zu dem Gemisch zugegeben.
-
Komplettmedium-Zusammenstellung:
-
Für 10,0 ml-Röhrchen-
oder 200,0 ml-Flaschenkulturen werden die folgenden Bestandteile
unter ständigem
Rühren
langsam zu dem Basalmedium zugegeben:
Bestandteile: | Menge/Liter |
1)
Steriles, hitzeinaktiviertes Kaninchenserum | 49,00
ml |
(Das
sterile Kaninchenserum wird für
30 Minuten bei 58,5 °C ± 0,5°C erhitzt) | |
2)
Rinderserumalbumin | 38,34
g |
3)
pH-Einstellung auf 7,3 ± 0,1
mit 2 N NaOH | |
-
Eine
ausreichende Menge (QS) an deionisiertem Wasser mit Raumtemperatur
wird auf 800 ml zugegeben. Das Gemisch wird unter Verwendung eines
0,2 μm-Filters,
der wenig Protein bindet, sterilisiert.
4)
Sterile Gelatine | 200,00
ml |
-
Die
sterile Gelatine wird durch Zugabe von 10,74 g Gelatine zu 200,0
ml deionisiertem Wasser hergestellt. Die Suspension wird für 30 Minuten
bei 121 °C ± 2°C autoklaviert
oder, falls eine Probe in der Flüssigkeit einen
Wert von ≥ 119°C mißt, für nicht
weniger als 20 Minuten autoklaviert. Die Lösung wird vor der Zugabe zu
dem Basalmedium auf mindestens 45°C ± 2°C abgekühlt.
-
Für 10 l-Gefäßkulturen,
100 l-Fermentationen oder andere werden die folgenden Bestandteile
unter ständigem
Rühren
langsam zu dem Basalmedium zugegeben:
Bestandteile: | Menge/Liter |
1)
Steriles, hitzeinaktiviertes Kaninchenserum | 49,00
ml |
(Das
sterile Kaninchenserum wird für
30 Minuten bei 58,5 °C ± 0,5°C erhitzt) | |
2)
Rinderserumalbumin | 38,34
g |
-
Der
pH-Wert wird mit 2 N NaOH auf 7,3 ± 0,1 eingestellt. Deionisiertes
Wasser wird QS auf 1 Liter zugegeben. Das Gemisch wird unter Verwendung
eines 0,2 μm-Filters,
der wenig Protein bindet, sterilisiert.
-
Bestandteilinformation:
-
- 1. Rinderserumalbumin (BSA): Das BSA-Pulver
wird von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Das in der Produktion
verwendete BSA-Pulver kann gemäß 9 C.F.R §§ 113.50
und 113.53 getestet und zur Verwendung zugelassen werden. Anstelle
eines solchen Tests kann das BSA-Pulver mit Gammastrahlen bei nicht
weniger als 2,7 Megarad bestrahlt werden.
- 2. Kaninchenserum: Das Kaninchenserum wird von einem kommerziellen
Lieferanten bezogen. Das in der Produktion verwendete Kaninchenserum
kann gemäß 9 C.F.R §§ 113.50
und 113.53 getestet und zur Verwendung zugelassen werden. Anstelle
eines solchen Tests gemäß 9 C.F.R §§ 113.50
und 113.53 kann das Kaninchenserum mit Gammastrahlen bei nicht weniger
als 2,7 Megarad bestrahlt werden.
-
Alle
chemische Komponenten sind von USP- oder äquivalenter Qualität.
-
Test:
-
Das
Medium wird als steril angesehen und nicht getestet.
-
Lagerung und Verwendung:
-
Das
sterile Medium wird bis zur Verwendung bei 4°C bis 30°C gelagert. Das Medium kann
unmittelbar nach der Herstellung oder für einen Zeitraum von nicht
mehr als 6 Monate verwendet werden. Das Medium wird für die Vermehrung
von Borrelia-Kulturen zur Verwendung bei der Bakterin-Herstellung
verwendet.
-
Beispiel 6
-
Hamsterimpfung-
Serologie- und Challengestudie
-
Hamster,
die mit dem Borrelia burgdorferi-Bakterin, welches mit binärem Ethylenimin
(BEI), Hitze oder Formalin inaktiviert wurde, geimpft worden waren,
wurden zwei oder drei Wochen, wie angegeben, nach der einen Impfung
zur Ader gelassen und herausgefordert. Die Impflinge wurden mit
einem Gemisch von drei Borrelia burgdorferi-Isolaten herausgefordert.
Ungeimpfte wurden als Kontrollen verwendet, welche nicht mit dem Borrelia
burgdorferi-Bakterin geimpft, aber mit dem einzelnen Isolat, angegeben
durch die Isolat-Bezeichnung, oder mit einem Gemisch von drei Isolaten,
angegeben als Tri, herausgefordert wurden. Tabelle
1 Challenge
zwei Wochen nach der Impfung
Challenge
drei Wochen nach der Impfung
- BA
- = Borrelia-Antikörper-Test
-
Die
in Tabelle 1 vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten
Unterschied (P = 0,05) bezüglich
der serologischen Antwort im Hinblick auf das Inaktivierungsverfahren
für die
B. burgdorferi-Zellen bei entweder 2 oder 3 Wochen nach der Impfung
gibt. Für
die serologischen Antworten wurde 2 oder 3 Wochen nach der Impfung
eine leichte Abnahme bzw. Erhöhung
beobachtet, jedoch verringerte sich der Schutz (im Hinblick auf
die Isolate C-1-11 und S-1-10) für
jede Impfgruppe drei Wochen nach der Impfung. Das P/Bi-Isolat ist nicht
virulent, und es wurde gezeigt, dass es Gewebe von Impflingen oder
Kontrollen infiziert.
-
Beispiel 7
-
ELISA-Studien zu ungeimpften
und intramuskulär
geimpften Hunden
-
Das
Bakterin wurde auf seine Fähigkeit
untersucht, eine Immunantwort in Hunden zu stimulieren. Die Hunde
wurden entweder mit dem hierin bereitgestellten Bakterin (V) geimpft
oder wurden nicht geimpft (NV), und deren Antikörpertiter gegen die Beschichtungsantigene
S-1-10 und C-1-11 wurden drei Wochen nach der ersten Impfung und
zwei Wochen nach einer folgenden zweiten Impfung, wie angegeben,
durch einen ELISA bestimmt.
-
-
Die
Daten zeigen, dass die Impfung mit dem Bakterin dieser Erfindung
die Produktion von Antikörpern gegen
sowohl das Wisconsin-Isolat S-1-10 als auch das Chicago-Isolat C-1-11
von B. burgdorferi zur Folge hat. Geimpfte Hunde wiesen einen höheren Serumantikörpertiter
gegen die Beschichtungsantigene S-1-10 und C-1-11 als Ungeimpfte
auf. Die Werte für
die Antikörperproduktion
erhöhten
sich nach der Verabreichung einer zweiten Dosis des Bakterins an
die Hunde.
-
Diese
Ergebnisse zeigen daher, dass das Bakterin dieser Erfindung in Tieren
die Produktion von Anti-Borrelia-Antikörpern, die gegen eine nachfolgende
Exposition durch die Bakterien nützlich
sind, stimulieren kann.
-
Beispiel 8
-
Borrelia-Antikörper-Test
unter Verwendung von Hundeserum
-
Hunde
wurden mit dem Borrelia burgdorferi-Bakterin geimpft. Das Serum
dieser Hunde wurde isoliert und mit einer Kultur des vermehrten
B. burgdorferi-Isolats
S-1-10 gemischt. Die prozentuale Abtötung der Borrelia-Bakterien
in Kulturen, die in Anwesenheit und in Abwesenheit dieses Hunde-Immunserums
vermehrt wurden, ist in Tabelle 4 (vgl. nachstehend) angegeben. Tabelle
3 Borrelia-Antikörper-Test – Hundeserum
- Ungeimpft: Serum von ungeimpften Hunden;
IM-Impfung: intramuskulär
geimpfte Hunde; subk. geimpft: subkutan geimpfte Hunde; vor Impfung:
Serum von Hunden vor der Impfung.
-
Wie
aus Tabelle 3 erkennbar ist, war das Serum, das aus Hunden vor der
Impfung mit dem Bakterin (vor Impfung) und aus nicht geimpften Tieren
(nicht geimpft) isoliert wurde, nicht in der Lage, einen Zelltod
in einer wachsenden Borrelia-Kultur
zu initiieren. Im Gegensatz dazu war das Immunserum von Hunden befähigt, einen
Zelltod zu initiieren. Serum, das aus Hunden isoliert wurde, die
mit dem Bakterin intramuskulär
geimpft wurden (IM-Impfung), war in der Lage, einen ähnlichen
prozentualen Zelltod hervorzurufen wie das Serum, das aus subkutan
geimpften (subk. geimpft) Hunden isoliert wurde. Serum, das aus
Hunden isoliert wurde, denen eine zweite Dosis des Bakterins verabreicht
wurde, rief eine höhere
Zelltodrate hervor als das Serum von Hunden, die nur einmal geimpft
wurden.
-
Beispiel 9
-
Borrelia burgdorferi-Isolat
297
-
Das
Serum von Hunden vor und nach der Impfung mit dem Borrelia burgdorferi-Isolat
N-40 wurde durch den Borrelia-Antikörper-Test auf einen Borrelia-Antikörper gegen
Zellen des Isolats 297 getestet. Tabelle
4 Serumverdünnung
- NC:
- Nicht gezählt.
-
Die
in Tabelle 4 vorgestellten Daten zeigen, dass Hunde, die mit dem
B. burgdorferi-Isolat N-40 geimpft wurden, einen Borrelia-Antikörper gegen
ein anderes Isolat (d.h. 297), aber aus derselben seroprotektiven Gruppe
wie N-40, produzieren, welcher in ungeimpften, B. burgdorferi-freien
Hunden nicht vorhanden ist.
-
Borrelia burgdorferi-Isolat
N-40
-
Das
Serum von Hunden vor und nach der Impfung mit dem Borrelia burgdorferi-Isolat
N-40 wurde durch den Borrelia-Antikörper-Test auf einen Borrelia-Antikörper gegen
Zellen des Isolats N-40 getestet.
-
Tabelle
5 Serumverdünnung
-
Die
in Tabelle 5 vorgestellten Daten zeigen, dass Hunde, die mit dem
B. burgdorferi-Isolat N-40 geimpft wurden, einen Borrelia-Antikörper gegen
das geimpfte Isolat produzieren, welcher in ungeimpften, B. burgdorferi-freien
Hunden nicht vorhanden ist.
-
Beispiel 10
-
In-vitro-Kreuzprotektionsstudien
-
Tabelle
7 (vgl. nachstehend) zeigt die natürlichen Wirte der verschiedenen
Borrelia burgdorferi-Isolate, welche in den in-vitro-Kreuzprotektionsstudien
verwendet werden, die Quelle der Isolate in den Wirtstieren und die
geographischen Regionen, in denen die Stämme isoliert wurden. Tabelle
7 Borrelia
burgdoreri-Isolate
- CSF:
- Liquor cerebrospinalis
-
Hamster
wurden mit einer lebenden Form eines der in der ersten senkrechten
Spalte von Tabelle 8 angegebenen Isolate geimpft. Das Antiserum
dieser Hamster wurde isoliert und zu Kulturen der B. burgdorferi-Isolate,
die in der waagrechten Zeile von Tabelle 8 angegeben sind, zugegeben.
Das Ausmaß,
in dem der Antikörper
die Bakterien in der Kultur erkennt, und daher der Umfang, in dem
ein Zelltod hervorgerufen wird, wurde wie folgt gemessen. Das Serum
von Hamstern, die mit einzelnen lebenden Borrelia burgdorferi-Isolaten infiziert
wurden, wurde isoliert, in BSK-Medium verdünnt und hitzeinaktiviert, und
100 μl davon
wurden zu jedem Reaktionsröhrchen
zugegeben. 10 μl
Komplement wurden ebenfalls zugegeben. Die Kulturdichte wurde dann
auf eine Konzentration von 10
5 Zellen/ml
eingestellt, und anschließend
wurden 100 μl
der Kultur zu jedem Reaktionsröhrchen
zugegeben. Die erhaltenen Antikörper/B.
burgdorferi-Reaktionsröhrchen
wurden bei 32°C für 2 Stunden
inkubiert, und anschließend
wurden 800 μl
frisches BSK-Medium zugegeben. Die Reaktionsröhrchen wurden dann bei 32°C für 4 Tage
inkubiert. Im Anschluß daran
wurde die Lebensfähigkeit
als Prozentsatz der intakten Zellen, bestimmt mit Hilfe eines Coulter-Zählgerätes, abgeschätzt. Die
Ergebnisse der in-vitro-Kreuzprotektionsstudien sind nachstehend
in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle
8 In-vitro-Kreuzprotektionsstudien
- BSK. Barbour-Stoenner-Kelly-Medium; NHS:
normales Hamsterserum, d.h. Serum, das keine Anti-Borrelia-Antikörper enthält.
-
Die
Lebensfähigkeitswerte
in Tabelle 8 sind als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit
in einer Kultur im Vergleich zu einer Lebensfähigkeit von 100% der "BSK"-Kontrollen angegeben. BSK-Kontrollkulturen
sind Kulturen, welche mit Barbour-Stoenner-Kelly-Medium anstelle des Antiserums
von Hamstern, die mit einem B. burgdorferi-Isolat geimpft wurden,
in Kontakt gebracht werden. Daher sollten diese Kulturen keinen
Zelltod infolge von Antikörperreaktionen
erleiden. Demgemäß wird der
Lebensfähigkeit
dieser Kulturen ein Wert von 100% im Vergleich zu Kulturen, zu welchen
Antiserum zugegeben worden ist, zugeordnet. Eine geringe Lebensfähigkeit
einer Kultur im Vergleich zu den Kontrollwerten zeigt, dass ein
Zelltod in der Kultur hervorgerufen wurde, der auf Antikörperreaktionen
mit Zelloberflächendeterminanten
zurückzuführen ist.
-
Die
Daten in Tabelle 8 zeigen, dass Kulturen eines Isolats, die mit
dem Antiserum eines Hamsters, welcher mit diesem Isolat geimpft
wurde, in Kontakt gebracht wurden, eine geringe Lebensfähigkeit
zeigen; d.h. die Antikörper,
welche gegen das eingeimpfte Isolat gebildet werden, erkennen das
Isolat in der Kultur und bewirken zusammen mit dem Komplement den
Zelltod. Zum Beispiel zeigte eine Kultur von B. burgdorferi 297, die
mit BSK-Medium oder NHS, d.h. einem Serum, das keine Anti-Borrelia-Antikörper enthält, in Kontakt
gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit
von 100%. Jedoch zeigte eine 297-Kultur, welche mit dem Antiserum
eines Hamsters, der mit 297 geimpft worden war, in Kontakt gebracht
wurde, eine Lebensfähigkeit
von 0,6%. Ferner zeigte eine Kultur des Chicago-Isolats von B. burgdorferi,
die mit NHS in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit
von 111 %, während
eine Kultur des Chicago-Isolats, die mit Anti-Chicago-Antiserum
in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit von 0,8%.
-
Die
Daten in Tabelle 8 zeigen auch, dass Antiserum von Hamstern, welche
mit einem Isolat geimpft wurden, den Zelltod in Kulturen von einigen
der anderen Isolate induzierte. Wie vorstehend besprochen, wird der
Lebensfähigkeit
von Kulturen, die mit BSK-Medium in Kontakt gebracht werden, ein
Wert von 100% zugeordnet. Die Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit
von Kulturen, die mit normalem Hamsterserum (NHS) in Kontakt gebracht
werden, wie erwartet ebenfalls etwa 100% beträgt. Jedoch zeigten alle Kulturen
der ersten sechs aufgeführten
B. burgdorferi-Isolate,
d.h. 297, B31, S-1-10, 35211, MMTI und IPT, wenn sie mit Antiserum von
Hamstern, die mit irgendeinem dieser sechs Isolate geimpft wurden,
in Kontakt ge bracht wurden, Lebensfähigkeitswerte, welche wesentlich
niedriger waren als die Kontrollen. Die Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit
der Kultur gering war, wenn ein Antiserum gegen ein Isolat zu Kulturen
desselben Isolats zugegeben wurde. Die Lebensfähigkeit der Kultur war gering,
wenn die Kulturen mit Antiseren, die gegen andere Isolate gerichtet
sind, in Kontakt gebracht wurden. Zum Beispiel wurde Anti-297-Antiserum zu
Kulturen von 297, B31, S-1-10, 35211, MMTI und IPT zugegeben. Die
Lebensfähigkeit
der Kultur betrug 0,6%, 0,9%, 1,0%, 1,0%, 2,5% bzw. 0,3%, was zeigt,
dass die Antikörper
die Determinanten auf diesen Isolaten erkannt haben und damit reagierten.
-
Die
Daten in Tabelle 8 zeigen daher, dass die Isolate 297, B31, S-1-10,
35211, MMTI und IPT kreuzprotektiv sind. Das heißt, wie vorstehend besprochen,
dass Antikörper
gegen ein Isolat die Oberflächendeterminanten
auf anderen Isolaten erkennen und damit reagieren. Diese Isolate
sind daher Mitglieder derselben seroprotektiven Gruppe. Diese Gruppe
ist als die seroprotektive Gruppe A von Borrelia burgdorferi-Isolaten
bekannt.
-
Das
Antiserum von Hamstern, die mit dem Chicago-, PBi- und G25-Isolat
geimpft wurden, induzierte in Kulturen dieser Isolate keinen Zelltod,
und gehören
daher einer oder mehreren anderen seroprotektiven Gruppen an. Das
Anti-Chicago-Antiserum
induzierte keine wesentliche Zelltodrate in Kulturen von irgendeinem der
anderen getesteten Isolate. Demgemäß ist der Chicago-Stamm (auch
bezeichnet als C-1-11) der einzige getestete Stamm, welcher der
seroprotektiven Gruppe B angehört.
-
Das
Anti-PBi-Antiserum induzierte einen Zelltod in Kulturen von PBi
als auch G25, wie auch das Anti-G25-Antiserum. Daher sind PBi und
G25 kreuzprotektive Isolate, welche in dieselbe seroprotektive Gruppe, die "europäischen Gruppe" von Borrelia burgdorferi-Isolaten,
eingruppiert werden.
-
Folglich
zeigen die in Tabelle 8 vorgestellten Ergebnisse der Kreuzprotektionsstudien,
dass Borrelia burgdorferi-Isolate in mindestens drei verschiedene
seroprotektive Gruppen eingeteilt werden können.
-
Beispiel 11
-
Hamsterimpfung-
Serologie- und Challenge-Studie
-
Hamster
wurden mit lebenden Borrelia burgdorferi-Bakterien des Isolats 297
geimpft. Das Serum von diesen Hamstern oder von normalen Hamstern,
d.h. ungeimpften Hamstern, oder normales Hamsterserum (NHS), wurde
dann an andere Hamster verabreicht. Diese Hamster wurden dann mit
entweder dem Stamm 297 oder 35211 (Swiss) herausgefordert, wie in 3 gezeigt
ist. Das Antiserum wurde an aufeinander folgenden Tagen nach der
Infektion, wie angegeben, auf seine Fähigkeit untersucht, eine passive
Immunität
auf Empfängerhamster
gegen eine B. burgdorferi-Infektion zu übertragen.
-
3 zeigt
die Ergebnisse der Serologie- und Challenge-Studie. Der Schutz gegen
eine B. burgdorferi-Infektion wurde anhand der Plethysmograph-Werte
von herausgeforderten Tieren im Vergleich zu den Basislinienwerten
für die
Kontrolle, d.h. ungeimpften Tieren, beurteilt. Der Plethysmograph
mißt die
Menge an Quecksilber, welche durch die Pfoten eines Hamsters verdrängt wird.
Wie vorstehend besprochen, ist eines der Symptome, welche die Folge
einer B. burgdorferi-Infektion sind, eine Arthritis und eine Schwellung.
Demgemäß sollten
Borrelia-infizierte Hamster geschwollene Pfoten haben, welche größere Mengen
an Quecksilber verdrängen
als die Pfoten von normalen Hamstern. Hamster, die vor einer B.
burgdorferi-Infektion geschützt sind,
sollten keine geschwollene Pfoten haben. Daher zeigt eine Zunahme
der Größe der Pfoten
eines infizierten Hamsters, d.h. eine Zunahme der verdrängten Menge
an Quecksilber, dass der Hamster durch das verabreichte Antiserum
nicht vor einer Herausforderung mit B. burgdorferi geschützt war.
-
Die
in 3 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass normales
Hamsterserum (NHS) wie erwartet Hamster nicht vor einer Infektion
durch das B. burgdorferi-Isolat 297 schützt (der Plethysmograph-Wert
des NHS-geimpften/297-herausgeforderten
Hamsters erhöhte
sich acht Tage nach der Herausforderung auf einen Höchstwert
von etwa 1,0 mm Hg im Vergleich zu dem Basislinienwert von etwa
0,35). Normales Hamsterserum schützte
Hamster auch nicht vor einer Infektion durch das B. burgdorferi-Isolat
35211 (der Plethysmograph-Wert des NHS-geimpften/35211- herausgeforderten Hamsters
erhöhte
sich neun Tage nach der Herausforderung auf einen Höchstwert
von etwa 0,85 mm Hg im Vergleich zu dem Basislinienwert).
-
Im
Gegensatz dazu zeigt 3, dass das Anti-297-Antiserum
die Hamster gegen eine folgende Herausforderung mit dem Isolat 35211
schützte.
Die Plethysmograph-Werte des 297-geimpften/35211- herausgeforderten
Hamsters waren 2 bis 14 Tage nach der Herausforderung mit dem Basislinienwert
in etwa vergleichbar. Diese Ergebnisse bestätigen die In-vitro-Studien,
welche zeigten, dass Borrelia burgdorferi-Isolate kreuzprotektiv
sein können,
d.h., dass die Antikörper
gegen ein Isolat eine passive Immunität gegen ein anderes Isolat übertragen
können.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Isolate 297 und 35211 kreuzprotektiv
sind und daher derselben seroprotektiven Gruppe angehören.
-
Beispiel 12
-
Zusammenfassung der Borrelia
burgdorferi-Isolate
-
43
Einzelisolate von Borrelia burgdorferi aus den Vereinigten Staaten
und Europa wurden untersucht. Exponentiell wachsende Kulturen der
einzelnen Isolate wurden mit dem Antiserum gegen das Borrelia burgdorferi-Isolat
297 aus der seroprotektiven Gruppe A, das Isolat PBi aus der seroprotektiven
Gruppe C und das Isolat C-1-11 aus der seroprotektiven Gruppe C
inkubiert. Tabelle
9
- S: Empfindlich gegen eine Abtötung; R:
Resistent gegen eine Abtötung;
P: Teilweise Abtötung.
-
Eine
Empfindlichkeit (S) gegen eine Abtötung, die durch das Anti-297-Antiserum,
aber nicht durch das Anti-PBi- oder Anti-Chicago-Antiserum hervorgerufen
wurde, zeigt, dass ein Borrelia burgdorferi-Isolat derselben seroprotektiven
Gruppe, d.h. der seroprotektiven Gruppe A, wie das Isolat 297 angehört. Eine
Resistenz (R) gegen eine Abtötung,
welche durch das Anti-297-Antiserum induziert wird, zeigt, dass
ein Isolat in eine andere seroprotektive Gruppe eingruppiert werden
sollte. Tabelle 9 zeigt, dass 15 der 16 Isolate, welche in die seroprotektive
Gruppe A eingruppiert werden, in den Vereinigten Staaten isoliert
wurden. Tabelle 9 zeigt auch, dass 13 der 13 Isolate, welche lediglich
gegen eine Abtötung
durch das Anti-PBi-Antiserum
empfindlich sind und daher der seroprotektiven Gruppe C angehören, in
Europa isoliert wurden. Tabelle 9 zeigt ferner, dass 6 der 43 Isolate
gegen eine Abtötung
durch das Anti-297-, Anti-PBi- und Anti-Chicago-Antiserum resistent
waren, d.h., dass die Antikörper
nicht die durch diese Stämme
exprimierten Zelloberflächendeterminanten
erkannten. Demgemäß waren
diese 6 Isolate nicht mit irgendeinem der anderen getesteten Isolate
kreuzprotektiv. Die Daten zeigen daher, dass es mindestens eine
weitere seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten neben
den seroprotektiven Gruppen A, B oder C gibt.
-
Beispiel 13
-
Natürliche Herausforderung
durch Zecken unter Verwendung einer bivalenten Impfstoffzusammensetzung
-
Einführung
-
Die
Lyme-Krankheit, welche durch den Spirochäten Borrelia burgdorferi (Bb)
verursacht und durch Ixodes-Zecken übertragen wird, ist eine multisystemische
Erkrankung, welche die Haut, das Nervensystem, das Herz und die
Gelenke von ungeschützten
Menschen und Hunden befallen kann. (Anderson J.F. et al., J. Clin. Microbiol.
26 (1988), 2209-2212; Appel et al., J. Inf. Dis. 167 (1993), 651-664;
Lane R.S. et al., J. Clin. Microbiol. 27 (1989), 2344-2349; LeFebvre
R.B. et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990), 700-707; Levy S.A. et
al., Canine Practice 17 (1992), 5-14; Nelson J.A. et al., J. Clin.
Microbiol. 29 (1991), 1732-1734; Piesman J. et al., Am. J. Trop.
Med. Hyg. 42 (1990), 352-357; Steere A.C. et al., N. Engl. J. Med.
308 (1983), 733-740; Steere A.C. et al., Ann. Intern. Med. 86 (1977),
685-698). Obwohl eine Antibiotika-Therapie erfolgreich sein kann,
muss sie in einem frühen
Stadium der Krankheit verabreicht werden. Antibiotika, die in späteren Stadien
der Krankheit verabreicht werden, können im Hinblick auf eine vollständige Eliminierung
des Organismus aus dem Wirt unwirksam sein. Hamster oder Mäuse, die
mit experimentellen Bakterinen, enthaltend inaktivierte ganze Zellen oder
Untereinheiten-Antigene, geimpft werden, entwickeln eine Immunantwort,
die gegen entweder künstliche oder
natürliche
Infektionswege schützt
(Fikrig E. et al., Science 250 (1990), 553-556; Fikrig E. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5418-5421; Johnson R.C. et al.,
Immun. 54 (1986), 897-898; Johnson R.C. et al., Zbl. Bakt. Hyg.
A. 263 (1986), 45-48;
Kochi S.K. et al., Infect. and Immun. 56 (1988), 314-321; Schmitz
J.L. et al., Infect. and Immun. 59 (1991), 3815-3818). Vor kurzem
ist gezeigt worden, dass ein kommerziell erhältlicher Impfstoff gegen eine
Exposition im Labor und im Feld wirksam ist (Hsien-Jue C., Chavez
L.G. Jr., Blumer B.M., Sebring R.W., Wasmoen T.L. und Acree W.M.,
JAVMA 201 (1992), 403-411). Obwohl Impfstoffe einen Schutz vorsehen,
ist es wichtig, dass vor einer Infektion eine Immunität (ein Borrelia-Antikörper) vorhanden
ist, da infizierte Tiere ungeachtet des Vorhandenseins eines zirkulierenden
Borrelia-Antikörpers
infiziert bleiben können (Callister
S.M. et al., J. Clin. Microbiol. 29 (1991), 1773-1776; Johnson R.C.
et al., Immun. 54 (1986), 897-898; Johnson
R.C. et al., Zbl. Bakt. Hyg. A. 263 (1986), 45-48; Kochi S.K. et
al., Infect. and Immun. 56 (1988), 314-321; Schmitz J.L. et al.,
Infect. and Immun. 59 (1991), 3815-3818).
-
In
Tabelle 10 sind verschiedene seroprotektive Gruppen von Bb aufgeführt, welche
durch Studien zu einem passiven Schutz in Hamstern und einen in-vitro-Test
(Borrelia-Antikörper-Test),
welcher basierend auf einer Antikörperantwort nach einer Infektion
zwischen seroprotektiven Gruppen unterscheiden kann (Lovrich S.D.
et al. (1993), Infect. and Immun. [in Druck]), charakterisiert worden
sind. Ein Antikörper,
der gegen ein Isolat aus einer seroprotektiven Gruppe gebildet wird,
kann keinen Schutz bei Hunden oder anderen Spezies gegen eine Exposition
mit einem Isolat einer anderen seroprotektiven Gruppe vorsehen.
Daher ist es erforderlich, Isolate einzubeziehen, die verschiedene
seroprotektive Gruppen repräsentieren,
um einen Impfstoff mit einem breiten Wirksamkeitsspektrum sicherzustellen.
-
Ixodes
scapularis-Zecken, die mit Bb infiziert sind, können Mäuse oder Hunde infizieren,
wenn sie auf die Tiere gesetzt und man sie saugen lässt (Appel, Max
J.G. et al., J. Inf. Dis. 167 (1993), 651-664; Fikrig E. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5418-5421; Rowhrig J.T. et al.,
Journ. Immunol. 149 (1992), 3648-3653). Die Immunantwort von Hunden
auf Bb durch eine Spritzenimpfung unterscheidet sich von der Zeckenübertragung
(Rowhrig J.T. et al., Journ. Immunol. 149 (1992), 3648-3653). Aus diesem
Grund haben die Erfinder die Immunogenität eines bivalenten Impfstoffes
im Vergleich zu einer natürlichen
Herausforderung durch Zecken untersucht.
-
I. Materialien
und Methoden
-
A. Tiere
-
In
einem Zecken Challenge-modell-Test wurden vier (4) B. burgdorferi
(Bb)-freie Beagle,
welche älter als
21 Wochen sind, von Solvay Animal Health, Inc., Charles City, IA,
verwendet. In dem Immunogenitätstest wurden
dreißig
(30) (Bb)-freie
Beagle in einem Alter von 5 bis 16 Wochen von Harlan Sprague Dawley,
Indianapolis, Indiana, verwendet (19 Impflinge und 9 Ungeimpfte).
Durch serologische Tests und eine Blutkultur in Barbour-Stoenner-Kelly
(BSK)-Medium wurde gezeigt, dass die Hunde frei von Bb waren.
-
B. Bakterin-Herstellung
-
Das
Bakterin wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Das Bakterin
wurde mit zwei Isolaten, C-1-11 und S-1-10,, deren verwendete Hauptkultur
achtmal passagiert wurde (Passagenanzahl X + 8), hergestellt.
-
C. Impfung
-
Gemäß der Gebrauchsanweisung
wurden 19 Hunde geimpft:
- 1. Der Impfstoff wurde
auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen.
- 2. Das Fläschchen
wurde vorsichtig geschüttelt,
bevor der Inhalt aseptisch entnommen wurde.
- 3. Eine Dosis (1,0 ml) wurde intramuskulär in den hinteren Oberschenkel
verabreicht. Die erste Dosis wurde in einem Alter von 5 bis 16 Wochen
verabreicht. Die zweite Dosis wurde 3 Wochen nach der ersten Impfung verabreicht.
-
Die
Hunde wurden visuell auf anormale Reaktionen auf die Impfung untersucht.
-
D. Exposition
-
Männliche
und weibliche Ixodes scapularis-Zecken wurden in zwei endemischen
Gebieten der Lyme-Krankheit in Wisconsin (ländliche Gebiete nahe Hixton
und Ettrick, WI) gesammelt. Der Mitteldarm von 50 weiblichen und
48 männlichen
I. scapularis-Zecken aus Hixton bzw. Ettrick, WI, wurde mittels
eines Fluoreszenzantikörpertests
(FA), welcher für
Bb spezifisch ist, untersucht. Die Zecken aus diesen Sammlungen
wurden zusammengefaßt
und für
sowohl den Challenge-Modell-Test als auch den Immunogenitätstest verwendet.
- 1. B. burgdorferi-Nachweis durch Immunfluoreszenz
unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers.
- a. Probenherstellung:
i. Zecke – Der Kopf wurde mit Hilfe
eines Skalpells entfernt. Der Mitteldarm wurde aus der Zecke herausgedrückt und
unter Verwendung eines Applikatorstiftes auf einem Objektträger ausgestrichen,
und der Ausstrich wurde gründlich
getrocknet.
ii. Kultur – Die
gezüchteten
Spirochäten
wurden durch Zentrifugation (13.000 × g, Raumtemperatur) konzentriert
und in 0,01 M PBS, pH 7,2, gewaschen. 15 μl der gewaschenen Suspension
wurden auf einen Objektträger
aufgebracht und gründlich
getrocknet.
- b. Die getrockneten Objektträger
wurden für
10 Minuten in Aceton fixiert und trocknen gelassen.
- c. Der monoclonale Maus-Antikörper H5332 (zunächst erhalten
von Alan Barbour, University of Texas, San Antonio) wurde unter
Verwendung von PBS auf 1:40 verdünnt
und auf den Objektträger
aufgebracht. Die Objektträger
wurden für
30 Minuten bei 37°C
in einer feuchten Kammer inkubiert.
- d. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit einem PBS-Strahl gespült und für 5 bis
10 Minuten in einem flachen Gefäß in PBS
eingetaucht.
- e. Die Objektträger
wurden dann mit einem IgG-FITC-markierten Anti-Maus-Konjugat, verdünnt 1:400
mit PBS, umgesetzt. Die Objektträger
wurden für
30 Minuten bei 37°C
in einer feuchten Kammer inkubiert.
- f. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit einem PBS-Strahl gespült und für 5 bis
10 Minuten in einem flachen Gefäß in PBS
eingetaucht, und anschließend
wurden die Objektträger
mit Löschpapier
getrocknet.
- g. Die Objektträger
wurden mit gepuffertem Glycerin und einem Deckglas bedeckt und mittels
Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
-
E. Challenge-Methoden
-
1. Challenge-Modell-Test
-
Um
die Art und Weise der Anheftung und der Infektion zu untersuchen,
wurden 4 weibliche und 1 oder 2 männliche Zecken auf einen rasierten
Bereich auf jeder Seite des Brustkorbes von jeweils 4 Hunden aufgebracht.
Die Weibchen wurden zum Saugen auf die Hunde gesetzt, wobei die
Männchen
anwesend waren, um die Beendigung des Saugvorganges durch die Weibchen
zu beschleunigen (Appel, Max J.G. et al., J. Inf. Dis. 167 (1993),
651-664). Die Zecken ließ man
eine Woche saugen und wurden falls möglich abgesammelt und auf die
Anwesenheit von Bb untersucht. Hautbiopsien wurden von der linken
Seite der Anheftungsstelle eine Woche nach der Anheftung und von
der rechten Seite zwei Wochen nach der Anheftung entnommen.
-
1. Immunogenitätstest
-
Vier
weibliche Zecken und eine männliche
Zecke wurden eine Woche nach der zweiten Impfung auf einen rasierten
Bereich auf der rechten Seite jedes Impflings und Nichtimpflings
aufgebracht. Man ließ Zecken wurden
für 9 Tage
saugen, sie wurden falls möglich
abgesammelt und auf die Anwesenheit von Bb untersucht. Hautbiopsien
wurden 14 bis 15 Tage nach der Zeckenanheftung von der Zeckenanheftungsstelle
und von einer Stelle, die etwa 15 cm von der Anheftungsstelle entfernt
ist, entnommen.
-
F. Hautbiopsien
-
Die
Stellen für
die Hautbiopsie wurden rasiert, mit SolvahexTM-Desinfektionsmittel
gewaschen und mit sterilem Wasser gründlich gespült, um restliches Desinfektionsmittel
zu entfernen. Die Hautbiopsien wurden mit Hilfe von ellipsenförmigen Schnitten
durch die dermalen und subkutanen Hautschichten entnommen. Eine Hautbiopsie
wurden in Schnitte aufgeteilt, die jeweils in 9,0 ml frisches BSK- Medium eingebracht
wurden. Die Proben wurden homogenisiert. und 1,0 ml des Homogenats
wurde in frisches BSK-Medium, enthaltend Agarose, ohne oder mit
Rifampin (40 μg/ml)
eingebracht. Die Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wurden
regelmäßig auf
das Vorhandensein von Spirochäten
untersucht. Für
Spirochäten-positive
Kulturen wurde durch einen FA bestätigt, dass sie Bb enthalten.
Nach 6-wöchiger
Inkubation wurden negative Kulturen in frisches BSK-Medium überführt, indem
1,0 ml der negativen Kultur in 9,0 ml frisches BSK-Medium, enthaltend
Agarose und Rifampin (40 μg/ml), überimpft
wurde. Diese Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wie
vorstehend beschrieben untersucht.
-
G. Blut (Challenge-Modell-Test
und Immunogenitätstest)
-
Das
Blut wurde in Natriumcitrat-Röhrchen
zum Zeitpunkt der Zeckenanheftung und wöchentlich nach der Zeckenanheftung
entnommen. Für
jede Probe wurden 3,0 ml Blut eines jeden Hundes in 27 ml frisches BSK-Medium
eingebracht. Die Blutkulturen wurden unter Verwendung von 9,0 ml-BSK-Blindproben
weiter auf 1:100 und 1:1000 verdünnt.
Die Kulturen wurden bei 32°C
für mindestens
3 Wochen inkubiert und wie vorstehend beschrieben untersucht. Für Spirochäten-positive
Kulturen wurden durch einen FA bestätigt, dass sie Bb enthalten.
-
H. Serologie
-
- 1. Challenge-Modell-Test: Zum Zeitpunkt der
Zeckenanheftung und wöchentlich
nach der Zeckenanheftung wurde Blut entnommen. Mit dem Serum der
gesammelten Blutproben wurden Borrelia-Antikörper-Tests und ELISA-Tests
durchgeführt.
- 2. Immunogenitätstest:
Zum Zeitpunkt der ersten und der zweiten Impfung, der Zeckenanheftung
und wöchentlich
nach der Zeckenanheftung wurde Blut entnommen. Das Serum wurde abgetrennt,
und mit den in den Wochen 0, 4, 9 und 10 gesammelten Proben wurden
Bb-Tests durchgeführt.
Die ELISA-Tests wurden mit den in den Wochen 0, 3, 4, 5, 6, 8, 9
und 10 gesammelten Proben durchgeführt.
-
I. Borrelia-Antikörper-Testmethode
-
- a) Eine 72 Stunden-Kultur von entweder dem
B. burgdorferi (Bb)-Isolat C-1-11 oder S-1-10 wurde mit Hilfe einer
Petroff-Hauser-Zählkammer
quantifiziert und mit frischem BSK-Medium auf 1 × 105 Zellen/ml
verdünnt.
- b) Das zu testende Serum wurde in frischem BSK-Medium 1:20 verdünnt, durch
einen 0,2 μm-Filter
gefiltert und bei 56°C
für 45
Minuten hitzeinaktiviert.
- c) Zur Durchführung
des Tests wurden 100 μl
der verdünnten
Kultur und 100 μl
des verdünnten,
gefilterten und hitzeinaktivierten Serums in ein 1,5 ml-Röhrchen mit
Schraubverschluß eingebracht.
Zu diesen Röhrchen
wurden fünfzehn
(15 μl)
Meerscheinchenkomplement zugegeben. Die Inhalte wurden gemischt
und bei 32°C
für 2 Stunden
inkubiert.
- d) Nach dem Inkubationszeitraum von 2 Stunden wurden 800 μl frisches
BSK-Medium zu dem
Röhrchen zugegeben.
Das Röhrchen
wurde bei 32°C
für weitere
5 bis 7 Tage inkubiert.
- e) Nach der Inkubation für
5 bis 7 Tage wurde das Wachstum von Bb dadurch nachgewiesen, dass
eine Probe von 300 μl
bis 600 μl
aus dem Reaktionsröhrchen
entnommen wurde, und die Probe in ein Fläschchen, enthaltend 10,0 ml
einer 2,0%igen Kochsalzlösung,
eingebracht wurde. Die Bb-Bakterien in der verdünnten Probe wurden unter Verwendung
einer Coulter-Zählvorrichtung
(Modell ZBi) gezählt.
Die Abtötung in
Prozent wurde durch die folgende Gleichung bestimmt:
-
-
J. ELISA-Verfahren
-
1. Herstellung eines Ganzzellantigens:
-
- a) Das Borrelia burgdorferi-Isolat C-1-11 oder
S-1-10 wurde bis zum Erreichen der späten logarithmischen Phase (etwa
2 × 108 Zellen/ml) in Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium
gezüchtet
und mit binärem
Ethylenimin inaktiviert.
- b) Die Zellen wurden dreimal in steriler Kochsalzlösung (0,85%
NaCl, pH 7,1 ± 0,2)
gewaschen.
- c) Mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits wurde das Gesamtprotein
bestimmt.
-
2. Testprotokoll:
-
- a) Immulon-3-Platten wurden mit dem Ganzzellantigen
von entweder C-1-11 oder S-1-10 (0,3 μg Ganzzellantigen in 100 μl Carbonat-Beschichtungspuffer
pro Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden bei 4°C für 15 bis
17 Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert.
- b) Die Inhalte jeder Platte (Ganzzellantigenlösung) wurden
entfernt, und eine 5%-ige
(Gew./Vol.) Trockenmilchlösung
wurde zu jeder Vertiefung zugegeben (400 μl pro Vertiefung). Die Platten
wurden bei 37°C
für 60
Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert.
- c) Die Inhalte jeder Platte (5%ige Trockenmilchlösung) wurden
entfernt, und die Platten wurden für 30 Minuten trocknen gelassen
(zu diesem Zeitpunkt wurden die Platten bei 4°C gelagert oder sofort verwendet).
- d) Serumproben wurden in 0,01 M PBS, pH 7,2, 0,05% Tween-20
auf 1:200 verdünnt
und in doppelter Ausfertigung durch Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums
zu jeder der zwei Vertiefungen getestet. Positive und negative Kontrollserumproben
wurden ebenfalls auf jeder Platte in doppelter Ausfertigung getestet.
Die Platten wurden bei 37°C
für 60
Minuten inkubiert.
- e) Die Inhalte jeder Platte (Serumprobenverdünnungen) wurden entfernt, und
die Platten wurden dreimal mit einer 0,9% NaCl/0,05% Tween-20-Lösung gewaschen.
- f) Ein Peroxidase-markiertes Ziege-anti-Hund-IgG (schwere und
leichte Ketten)-Konjugat,
verdünnt
1:1500 in 0,01 M PBS, pH 7,2, 0,05% Tween-20, wurde zu jeder Vertiefung
zugegeben (50 μl
pro Vertiefung). Die Platten wurden bei 37°C für 60 Minuten in einer feuchten
Kammer inkubiert.
- g) Die Inhalte jeder Platte (Konjugatlösung) wurden entfernt, und
die Platten wurden wie vorstehend in Schritt 6 beschrieben gewaschen.
- h) Das Substrat O-Phenylendiamin (30,0 mg) wurde in einer Lösung von
0,051 M dibasischem Natriumphosphat, 0,0224 M Citronensäure und
0,012% Wasserstoffperoxid (74,83 ml) gelöst und zu jeder Vertiefung
zugegeben (100 μl
pro Vertiefung). Man ließ Substrat
wurde für
8 bis 10 Minuten umsetzen.
- i) Die Substratreaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure je Vertiefung
gestoppt. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 490 nm
abgelesen. Die Mittelwerte der optischen Dichte der Testvertiefungen
wurden gegen die Mittelwerte der optischen Dichte der positiven
Kontrolle normalisiert (d.h. der Mittelwert der optischen Dichte
der Testvertiefungen einer getesteten Serumprobe wurde durch den
Mittelwert der optischen Dichte der positiven Kontrolle dividiert).
-
K. Klinische Symptome
-
Nach
der Herausforderung wurden alle Hunde auf klinische Symptome wie
Fieber, Lethargie, Lahmheit und Appetitlosigkeit untersucht.
-
L. Statistische Analyse
-
Die
Ergebnisse der Hautbiopsie-Kultur wurden durch den Fischer-Exakt-Test verglichen.
-
II. Ergebnisse
-
A. Impfung
-
Es
wurden keine anomalen Reaktionen auf die Impfung beobachtet.
-
B. Zecken
-
Die
FA-getestete Probe männlicher
Zecken, welche in Hixton und Ettrick gesammelt wurde, war zu 52%
bzw. 54% infiziert.
-
C. Challenge-Modell-Test
-
Die
Zecken hefteten sich innerhalb von 1 bis 2 Stunden an. Nach 2 Tagen
waren die Zecken vollgesogen. Drei Tage später hatten die meisten Hunde
die anheftenden Zecken abgelöst,
jedoch wurden drei vollgesogene Zecken von einem der vier Hunde
(#450) abgesammelt. Aus dem Blut, das aus dem Hämocoel von einer der drei Zecken
entnommen wurde, wurden Bb-Bakterien vermehrt, und der Mitteldarm
dieser Zecke war anhand eines FA für Bb positiv. Die eine Woche
nach der Anheftung von der Anheftungsstelle dieses Hundes entnommenen
Hautbiopsien waren nicht Bb-positiv. In der Tat wurden eine Woche
nach der Zeckenanheftung aus den Hautbiopsien von nur einem Hund
Spirochäten
isoliert (Tabelle 11a). Im Gegensatz dazu wurden zwei Wochen nach
der Anheftung aus den Hautbiopsien, die von der gegenüberliegenden
Seite bei allen vier Hunden entnommen wurden, Spirochäten isoliert
(Tabelle 11 b). Die Hunde wurden 2 und 9 Wochen nach der Zeckenanheftung
positiv auf Spirochäten
getestet (Tabelle 11 b). Ein Borrelia-Antikörper war nachweisbar, wobei sich
der Titer davon 10 und 11 Wochen nach der Zeckenanheftung erhöhte (Tabelle
12a). Nach der Zeckenanheftung waren Antikörper gegen sowohl C-1-11- als
auch S-1-10-Antigene nachweisbar, wie durch einen ELISA gezeigt
wurde (Tabelle 12b).
-
Tabelle 11a
-
- Expositionsmodell-Test: B. burgdorferi, vermehrt aus Hautbiopsieproben,
die eine und zwei Wochen nach der Zeckenanheftung entnommen wurden.
-
-
- a Proben positiv je getesteter Anzahl.
- b Kontaminiert
-
Tabelle 11b
-
- Challenge-Modell-Test: B. burgdorferi, vermehrt aus Blut,
das den Hunden nach der Zeckenanheftung entnommen wurde.
-
-
- + (Wachstum)
- – (Kein
Wachstum)
-
Tabelle 12a
-
- Challenge-Modell-Test: Borrelia-Antikörper-Testwerte (Mittelwert ± SD, Abtötung in
Prozent für
vier Hunden) gegen C-1-11 und S-1-10 nach der Zeckenanheftung.
-
-
- a Der BA-Test für die Wochen 12 bis 16 ist
in Vorbereitung.
- b Die Standardabweichungen waren aufgrund
von negativen BA-Antworten in einigen Hunden hoch.
-
Tabelle 12b
-
- Challenge-Modell-Test: Nachgewiesener Antikörper gegen
S-1-10- und C-1-11-Antigene, gemessen durch einen ELISA, nach der
Zeckenanheftung.
-
-
- a Die Standardabweichungen waren
hoch wegen eines Hundes, welcher durchgängig schwache ELISA-Antworten
auf sowohl das C-1-11- als auch das S-1-10-Antigen zeigte.
-
D. Immunogenitätstest
-
Eine
bis vier Zecken wurden von allen Hunden, mit Ausnahme von sechs
Impflingen (die Bandagen lösten
sich ab oder wurden durch die Hunde in den späten Phasen des Vollsaugens
entfernt, und Zecken, die sich angeheftet hatten und saugten, waren
verloren gegangen) abgesammelt. Einige der gewonnenen Zecken waren
geschädigt
oder tot. Bb-positive Zecken wurden von 3 der 19 Impflinge und von
3 der 9 Kontrollen gewonnen (Tabelle 13). Das Vorkommen der Bb-positiven
Zecken korrelierte nicht notwendigerweise mit der beobachteten Infektion.
-
Die
Hautbiopsien von 4 der 9 (44%) ungeimpften Hunde waren positiv (Tabelle
4). Alle Hautbiopsien, welche von geimpften Hunden entnommen wurden,
waren Bb-negativ. Dies entspricht einer signifikanten (P = 0,0016,
Fischer-Exakt-Test)
Verringerung der Infektion in der Impfgruppe. Alle Kulturen mit
einem Spirochätenwachstum
wurden durch einen FA als Bb-positiv identifiziert. Alle Blindpassagen-Kulturen
blieben negativ. Keine der Hautbiopsien, welche in einer Entfernung
von etwa 15 cm von dem Zeckenanheftungsbereich in entweder der Kontroll- oder der Impfgruppe
entnommen wurden, war Bb-positiv (Tabelle 13).
-
Tabelle 13
-
- Immunogenitätstest:
B. burgdorferi, identifiziert durch einen FA in Zecken, welche von
Hunden gewonnen wurden, und vermehrt aus Hautbiopsien, welche von
der Zeckenanheftungsstelle und einer anderen entfernten Stelle etwa
zwei Wochen nach der Zeckenanheftung entnommen wurden.
-
-
- a NT (Nicht getestet. Zecken geschädigt oder
keine lebensfähigen
Zecken gewonnen).
-
Tabelle
14 zeigt die Ergebnisse der Blutkulturen. Einer der 9 Ungeimpften
wies ungefähr
eine Woche nach Anheftung der Zecken (d.h. während des Saugens) positive
Blutkulturen bei Verdünnungen
von 1:10 und 1:100 auf. Die Blutkulturen waren ansonsten negativ,
bis auf Woche 6 nach der Zeckenanheftung. Zu diesem Zeitpunkt wiesen
9 von 19 Impflingen und 6 von 9 Kontrollen positive Blutkulturen
bei Verdünnungen
von 1:100 und 1:1000, aber nicht bei der ersten Verdünnung von
1:10 auf (nachgewiesen durch ein Wachstum und einen FA). Da dies
ein fragliches Ergebnis war, wurden die Blutproben noch einmal kultiviert,
wobei das Blut und die 1:10-Verdünnung durch
einen FA untersucht wurden. Es wurde kein Spirochätenwachstum
in dem erneut kultivierten Blut nachgewiesen, und in dem Blut oder
der 1:10-Verdünnung
wurden durch den FA keine Spirochäten nachgewiesen.
-
Tabelle 14
-
- Immunogenitätstest:
B. burgdorferi, vermehrt aus Blut, das Hunden vor und nach der Zeckenanheftung
entnommen wurde.
-
-
-
- a Blut entnommen zum Zeitpunkt des
Aufbringens der Zecken auf die Hunde.
- + (Wachstum)
- – (Kein
Wachstum)
-
Die 4 und 5 veranschaulichen
die Borrelia-Antikörper-Antworten
auf die Isolate S-1-10 und C-1-11 nach der Impfung und der Zeckenanheftung.
Die Serumproben von Impflingen zeigten eine Woche nach der zweiten
Impfung eine starke Antikörperantwort
auf sowohl S-1-10 als auch C-1-11. Fünf Wochen nach der Zeckenanheftung
wurde in der ungeimpften Gruppe eine leichte Verstärkung der
Borrelia-Antikörper-Antworten
auf sowohl S-1-10 als auch C-1-11 beobachtet. Jedoch wurde 6 Wochen
nach der Zeckenanheftung eine stärkere
Borrelia-Antikörper-Antwort,
welche nur gegen S-1-10 gerichtet war, in der ungeimpften Gruppe
beobachtet.
-
Die
durch einen ELISA getesteten Serumproben zeigten eine Woche nach
der zweiten Impfung ebenfalls eine starke Antikörperantwort auf sowohl die
S-1-10- als auch
die C-1-11-Antigene (3 und 4). Anschließend schwächte sich
die Antikörperantwort
langsam ab. Ungeimpfte zeigten in der Woche 8, 9 und 10 (4, 5 und
6 Wochen nach der Zeckenanheftung 6 und 7)
verstärkte
Antikörperantworten.
-
Bei
keinem der Hund wurden entweder unmittelbar oder während den
Beobachtungszeiträumen
nach den Impfungen und der Zeckenanheftung unerwünschte Nebenwirkungen beobachtet.
-
Bis
heute hat keiner der Hunde klinische Symptome im Zusammenhang mit
einer Lyme-Erkrankung gezeigt.
-
III. Diskussion
-
Alle
Hunde der Challenge-Modell-Studie wurden infiziert, wie mittels
Hauptbiopsie-Kulturen (4 von 4 Hunden waren positiv), Blutkulturen
(4 von 4 Hunden waren positiv) und Serologie (alle Hunde, bis auf
Hund Nr. 450, zeigten eine Serokonversion, wie durch einen BA oder
ELISA bestätigt
wurde) nachgewiesen wurde. Die Hunde werden gegenwärtig auf
klinische Symptome überwacht.
Die Zecken, welche zur Infektion dieser Hunde verwendet wurden,
wurden auch zur Infektion der Hunde in dem Immunogenitätstest verwendet.
-
Die
Zecken infizierten 4 der 9 Ungeimpften und keinen der 19 Impflinge.
Dies entspricht einer signifikanten (P = 0,0016, Fischer-Exakt-Test)
Verringerung der Infektion und korreliert mit dem Vorhandensein
eines Borrelia-Antikörpers.
Es wurde eine signifikante (P = 0,0422, Fischer-Exakt-Test) Verringerung
der Infektion in der Impfgruppe beobachtet, wenn die Infektion von
Hautbiopsien und eine Spirochätensepsis
insgesamt beurteilt wurden.
-
Die
Impflinge in dem Immunogenitätstest
zeigten zum Zeitpunkt der Zeckenanheftung eine starke Borrelia-Antikörper-Antwort
auf beide Impfstoff-Isolate. Nach der Zeckenanheftung schwächten sich
die Antikörperantworten
in der Impfgruppe für
beide Isolate ab, wie durch einen BA gemessen wurde. Im Gegensatz
dazu erhöhte
sich die Borrelia-Antikörper-Antwort
auf S-1-10 in der ungeimpften Gruppe. Diese Erhöhung spiegelt die in dieser
Gruppe beobachteten Infektionen wieder. Durch einen ELISA wurde
in der ungeimpften Gruppe eine Erhöhung auf sowohl die S-1-10-
als auch die C-1-11-Antigene gemessen. Diese Beobachtungen stützen die
vorher angeführten
(Lovrich S.D. et al., Infect. and Immun. [in Druck]), dass der Borrelia-Antikörper-Test zwischen
Isolaten aus verschiedenen seroprotektiven Gruppen unterscheidet,
während
ELISA-Tests keine solche Unterscheidung ermöglichen. Die Daten zeigen,
dass die Borrelia-Bakterien, welche durch die Zecken übertragen
werden, wahrscheinlich in dieselbe seroprotektive Gruppe wie S-1-10
eingruppiert werden können. Jedoch
erhöhten
sich die mittleren BA-Antworten auf beide Isolate in dem Challenge-Modell-Test
nach der Zeckenanheftung erhöht.
Es ist möglich,
dass der Pool von Zecken mit entweder Isolaten einer Gruppe, beider Gruppen
oder möglicherweise
anderer seroprotektiver Gruppen infiziert war.
-
Bakterien,
welche in proteinreichen Medien gezüchtet werden und in Multikomponenten-Bakterine
eingebracht werden, haben das Potenzial, unerwünschte Nebenwirkungen (Ödeme, Schwellungen,
Wundsein, Lethargie, Überempfindlichkeit),
hervorzurufen, welche aus der Wechselwirkung zwischen Tier, Impfstoff
und Umgebung resultieren. In dieser Studie wurden keine anomalen
Reaktionen in irgendeinem der Impflinge nach jeder Impfung mit einem
Bakterin, das zwei Isolate von Bb enthält, beobachtet.
-
IV. Schlußfolgerung
-
Die
in diesen Studien verwendeten Zecken waren in der Lage, Hunde mit
B. burgdorferi zu infizieren.
-
Der
Impfstoff, welcher hohe Borrelia-Antikörper-Titer hervorrief, war
gegen eine natürliche
Herausforderung durch Zecken wirksam und war sicher.
-
Beispiel 14
-
Immunogenitätstest und
Studie zur Dauer der Immunität
-
I. Materialien und Methoden
-
A. Tiere
-
In
der Studie wurden Beagle aus der Kolonie, welche von der Solvay
Animal Health, Inc., Charles City, IA, unterhalten wird, verwendet.
Die Hunde waren zum Zeitpunkt der Impfung 12 bis 24 Wochen alt (Tabelle 15)
und waren für
B. burgdorferi seronegativ (< 1:20),
wie durch einen Ganzzell-ELISA getestet wurde.
-
Tabelle
15: In der Studie verwendete Hunde
-
B. Bakterin-Herstellung
-
Das
Bakterin wurde, wie vorstehend beschrieben, aus den B. burgdorferi-Serotypen C-1-11
und S-1-10 nach der achten Passage der Hauptimpfkultur hergestellt.
Das Bakterin wurde dergestalt formuliert, dass es 5 × 108 Zellen je Serotyp pro 1 ml-Dosis zusammen
mit Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA, Reheis Chemical Co., Berkeley
Hts., New Jersey) in 1,5 mg Aluminiumoxid pro 1 ml-Dosis als Adjuvans
enthält.
Der Impfstoff wurde bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
-
C. Impfung
-
Zwanzig
Hunde wurden intramuskulär
in den hinteren Oberschenkel mit zwei 1,0 ml-Dosen in einem Abstand
von drei Wochen geimpft. Die erste Dosis wurde in einem Alter von
12 bis 24 Wochen verabreicht. Die zweite Dosis wurde drei Wochen
nach der ersten Dosis verabreicht. Die Hunde wurden auf anomale
Reaktionen überwacht,
die Temperaturen wurden protokolliert, und die Injektionsstellen
wurden während
einer Woche nach jeder Impfung täglich
untersucht. Eine Gruppe von 15 ungeimpften Hunden diente als Kontrolle.
-
D. Serologie
-
Blut
wurde vor und nach der Impfung und in Intervallen nach der Herausforderung
entnommen. Das Serum wurde durch einen Borrelia-Antikörper-Test, einen Ganzzell-ELISA
und einen OspA-ELISA sowie ein Western-Immunblot-Verfahren auf einen Antikörper gegen
B. burgdorferi getestet.
-
E. Ganzzell-ELISA
-
Die
Antikörperantwort
auf Oberflächenantigene
von B. burgdorferi wurde durch eine Modifikation eines Ganzzell-ELISA,
welcher durch das Regional Animal Health Laboratory, Baron, WI,
verwendet wird, bestimmt. Kulturen in der späten log-Phase von sowohl C-1-11 als auch S-1-10
wurden mit binärem
Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Nach Neutralisation des BEI's mit Natriumthiosulfat
wurden die Zellen durch Zentrifugation dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen.
Der Proteingesamtgehalt der inaktiven Organismen wurde durch einen
Bicinchoninsäure
(BCA)-Proteintest
(Pierce Co., Rockford, IL) bestimmt. Vertiefungen von Immunol-3-Platten
(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 0,3 μg Ganzzellantigen
in 100 μl
Puffer, enthaltend Natriumcarbonat, beschichtet. Die Platten wurden
in einer feuchten Kammer bei 4°C
für 15
bis 17 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Inhalte
der Platte verworfen, und die Vertiefungen wurden mit PBS, enthaltend
5% Magermilchpulver (NFDM), gefüllt
und in einer feuchten Kammer für
60 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden entleert, und 50 μl Testserum,
verdünnt
in PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-TW), wurde zu den Ver tiefungen
in doppelter Ausfertigung zugegeben und in einer feuchten Kammer
für 60
Minuten bei 37°C
inkubiert. Positives und negatives Hunde-Kontrollserum war auf jeder
Platte eingeschlossen. Die Platten wurden dreimal mit Kochsalzlösung, enthaltend
0,05% Tween-20, gewaschen, und 50 μl-Aliquots eines Peroxidase-markierten
Ziege-anti-Hund-IgG's
(Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), verdünnt 1:1500 in PBS-TW, wurden
pro Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer
für 60
Minuten bei 37°C
inkubiert und dreimal mit PBS-TW gewaschen. Das Substrat wurde durch
Lösen von
30,0 mg O-Phenylendiamin in einer Lösung aus 0,051 M dibasischem
Natriumphosphat, 0,024 M Citronensäure und 0,012% Wasserstoffperoxid
hergestellt, und 100 μl-Aliquots
wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure pro
Vertiefung gestoppt, und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde
bei 490 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde
als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte
von 30% der höchsten
optischen Dichte ergab, definiert.
-
E. OspA-ELISA
-
Die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit
50 ng rekombinantem OspA beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Vertiefungen wurden mit 5% NFDM in PBS für 30 Minuten bei 37°C nachbeschichtet.
Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl von Hundeserum-Zweifachverdünnungen
wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C für eine Stunde
inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl Ziege-anti-Hund-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Nach
der Inkubation für
eine Stunde bei 37°C
wurde der gebundene Antikörper
durch die Zugabe von ABTS-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg,
MD) nachgewiesen. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei
405 nm in einem ELISA-Lesegerät
bestimmt. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die
eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab,
definiert.
-
F. Western-Immunblot-Verfahren
-
Kulturen
von B. burgdorferi in der mittleren bis späten log-Phase wurden durch
Zentrifugation bei 15.000 × g,
4°C, 30
Minuten, geerntet und durch Zentrifugation dreimal mit steriler
Kochsalzlösung
gewaschen. Eine Suspension von etwa 1 × 108 Zellen
wurde in Elektrophorese-Probenpuffer für 9 Minuten denaturiert und auf
einem 10% SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen (Laemmli
E.K., Nature 227 (1970), 680-685). Die Proteine wurden durch eine
Modifikation des durch Towbin (Towbin H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
76 (1979), 4350-4354) beschriebenen Verfahrens durch Elektroblotting
auf eine ImmobilonTM-PVDF-Membran (Millipore
Corp., Bedford, MA) übertragen.
Die PVDF-Membran wurde für
90 Minuten bei 22°C
in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2 (TBS) mit 5% NFDM inkubiert.
Streifen davon wurden mit Hundeserum oder einem monoclonalen Antikörper gegen
OspA, verdünnt
1:75 in dem Blockierungspuffer, für 60 Minuten bei 22°C inkubiert.
Die Streifen wurden anschließend
zweimal in TBS, enthaltend 0,2% Triton X-100, und einmal in TBS gewaschen.
Der gebundene Antikörper
wurde durch die Zugabe von Meerrettichperoxidase-markiertem Anti-Hund-
oder Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Proteinbanden
wurden mit einem TMB-Membran-Peroxidasesubstrat-System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.,
Gaithersburg, MD) sichtbar gemacht.
-
G. Nachweis des Borrelia-Antikörpers mittels
Durchflußcytometrie
-
Der
Borrelia-Antikörper-Test
wurde unter Verwendung einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren
(Lim L.C. et al. (1993), Clin. Diag. Lab. Immunol. (in Druck); Sachsenmeirer
K.F. et al., J. Clin. Microbiol. 30 (1992), 1457-1461) durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden
72-Stunden-Kulturen der B. burgdorferi-Isolate C-1-11 und S-1-110
in der mittleren log-Phase in modifiziertem Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium
in einer Petroff-Hauser-Zählkammer
quantifiziert und bis zum Erhalt von 1 × 106 Zellen/ml BSK-Medium
verdünnt.
100 μl-Aliquots
eines verdünnten,
hitzeinaktivierten Serums wurden mit 100 μl jeder B. burgdorferi-Suspension gemischt,
und 10 μl
Meerschweinchenserum-Komplement (210 CH50-Einheiten; GIBCO
Laboratories, Grand Island, NY) wurden zugegeben. Die Suspension
wurde vorsichtig gemischt und bei 32°C für 16 bis 24 Stunden inkubiert.
Nach Inkubation der Reaktionsröhrchen
wurden 100 μl
des Reaktionsgemisches mit phos phatgepufferter Kochsalzlösung (PBS),
enthaltend 5,4 × 10–9 M
Acridinorange, verdünnt. Der
Nachweis einer Borrelia-Antikörper-Aktivität erfolgte
unter Verwendung einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren
(Callister S.M. et al., J. Infec. Dis. 167 (1992), 158-164). Eine
Abtötung
durch Borrelia-Antikörper
bewirkt die Bildung von Bläschen
in den Zellwänden
von B. burgdorferi, wodurch höhere
Konzentrationen an Acridinorange auf und innerhalb dieser geschädigten Zellwände adsorbiert
werden. Folglich fluoreszieren abgetötete B. burgdorferi-Organismen
mit einer sehr viel höheren
Intensität
als normale lebende Spirochäten.
Eine Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
von ≥ 16%
im Vergleich zu Organismen, welche normalem Hundeserum ausgesetzt
werden, wurde als ein positiver Nachweis für eine Borrelia-Antikörper-Aktivität angesehen.
Der Endpunkttiter wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, bei
welcher eine Erhöhung von ≥ 16% der Fluoreszenzintensität beobachtet
wurde, ausgedrückt.
Hunde mit einem Titer von < 1:20
wurden als negativ erachtet.
-
H. Herausforderung von
Hunden durch B. burgdorferi-infizierten Zecken
-
Insgesamt
wurden 631 männliche
und 732 weibliche I. scapularis-Zecken in einem endemischem Gebiet
der Lyme-Krankheit nahe Ettrick, Wisconsin, gesammelt. Zur Ermittlung
der gesamten B. burgdorferi-Infektionsrate der Zecken wurde der
Mitteldarm von 50 männlichen
I. scapularis-Zecken durch einen Fluoreszenzantikörpertest
(FA) unter Verwendung des monoclonalen OspA-Antikörpers, welcher
von Dr. A.G. Barbour erhalten wurde, untersucht. Sieben Monate nach
der zweiten Impfung wurden die Hunde mit 10 weiblichen und 6 männlichen
Zecken herausgefordert. Weibliche Zecken sind die einzigen erwachsenen
Zecken, welche die Krankheit übertragen.
Männliche
Zecken sind erforderlich, damit die weiblichen Zecken richtig saugen.
Für jeden
Hund wurden 5 weibliche und 3 männliche
Zecken zufällig
aus dem Pool von Zecken ausgewählt
und in zwei kleine Petrischalen gesetzt, die auf einer rasierten
Fläche
auf dem linken anterior-dorsalen Bereich der Brust jedes Hundes
befestigt wurden. Die Zecken ließ man während einer Woche saugen. Während dieser
Zeit wurden die Zecken in Intervallen von zwei Tagen untersucht.
Eine Woche nach der Anheftung wurden die Zecken gewonnen, und der
Mitteldarm davon wurde durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper auf
die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht.
-
I. Untersuchung
der Hunde auf klinische Symptome der Lyme-Krankheit
-
Die
Hunde wurden nach der Herausforderung täglich auf klinische Symptome
in Zusammenhang mit einer Lyme-Erkrankung untersucht. Das als primärer Indikator
für eine
klinische Lyme-Erkrankung verwendete Symptom war eine Lahmheit.
Lahmheit wurde als das Widerstreben einer Gewichtsbelastung eines
betroffenen Beines, mit oder ohne einer Schwellung und einer Temperatur
an dem betroffenen Gelenk, die Steifheit der Beine und die Wanderung
der Lahmheit von Gelenk zu Gelenk oder von Gliedmaß zu Gliedmaß definiert. Die
Hunde wurden auch auf eine Lethargie und Fieber untersucht.
-
J. Isolierung von B. burgdorferi
aus Hunden nach der Herausforderung
-
Es
wurden Versuche unternommen, B. burgdorferi aus der Haut, dem Blut,
den Gelenken und den Organen der Hunde zu isolieren. Hautbiopsien
wurden von betäubten
Hunden 18 bis 19 Tage nach der Zeckenanheftung und zum Zeitpunkt
der Obduktion entnommen. Die Hautbiopsien wurden von der Zeckenanheftungsstelle
entnommen, und bei einigen Hunden wurden Hautbiopsien von Stellen
in Entfernung von der Zeckenbißstelle
entnommen. Die entfernten Stellen befanden sich ventral zu der Zeckenbißstelle,
posterior zu der Zeckenbißstelle
und auf der rechten Seite des anterior-dorsalen Bereiches der Brust
auf der gegenüberliegenden
Seite des Hundes. Die Stellen der Hautbiopsie wurden rasiert, mit
SolvahexTM-Desinfektionsmittel gewaschen
und mit sterilem Wasser gründlich
gespült,
um das restliche Desinfektionsmittel zu entfernen. Ein ellipsenförmiger Schnitt
wurde durch die dermalen und subkutanen Hautschichten vorgenommen.
Etwa 1 g Haut wurde in 9 ml BSK-Medium, enthaltend 0,15% Agarose
und 40 μg
Rifampin/ml, eingebracht. Die Biopsieprobe wurde homogenisiert,
und zwei weitere Zehnfachverdünnungen
des Homogenats wurden in 9 ml-Blindproben des BSK-Mediums hergestellt.
Die Kulturen wurden bei 32°C
für 6 Wochen
inkubiert und wurden mikroskopisch in wöchentlichen Intervallen auf
das Wachstum von Spirochäten
untersucht. Kulturen, die ein Wachstum von Spirochäten zeigten,
wurden durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper als
B. burgdorferi bestätigt.
Nach 6-wöchiger
Inkubation wurden negative Kulturen durch Überimpfen von 1 ml der negativen
Kultur auf 9 ml frisches BSK-Medium in frischem BSK-Medium subkultiviert.
Diese Kulturen wurden bei 32°C
für weitere
6 Wochen inkubiert und untersucht, wie vorstehend beschrieben wurde.
Kulturen, die im Hinblick auf das Wachstum von Spirochäten negativ
waren, wurden verworfen.
-
Das
Herz, die Milz, die Nieren und die Blase wurden als Ganzes in 50
ml BSK, enthaltend Agarose und Rifampin, unter Verwendung einer
Stomacher-Vorrichtung (Seward Medical, London, England) getrennt homogenisiert.
Eine 50 ml-Probe
wurde abgefüllt
und 10–1 und
10–2 in
BSK-Medium verdünnt.
Die 50 ml-Probe und die Verdünnungen
wurden für
6 Wochen bei 32°C
inkubiert, untersucht und als B. burgdorferi bestätigt, wie
beschrieben wurde.
-
Eine
2-3 ml-Probe Liquor cerebrospinalis wurde zu 9 ml BSK-Medium zugegeben,
und eine weitere 1:10-Verdünnung
wurde in demselben Medium hergestellt, inkubiert und untersucht,
wie beschrieben wurde.
-
Aus
dem Ellbogen, Vorderfußwurzelgelenk,
Knie und Fußwurzelgelenk
wurde Gelenkgewebe entnommen. Das Gewebe jedes Gelenks wurde zu
9 ml BSK-Medium,
enthaltend Agarose und Rifampin, zugegeben. Eine weitere 1:10-Verdünnung wurde
in demselben Medium hergestellt, und die Kulturen wurden inkubiert
und untersucht, wie beschrieben wurde.
-
K. Blutkulturen
-
Mit
Heparin versetzte Blutproben zur Isolierung von B. burgdorferi wurden
zum Zeitpunkt der Herausforderung, in wöchentlichen Intervallen nach
der Herausforderung und bei der Obduktion gesammelt. Das Blut jedes
Hundes wurde 10–1, 10–2 und
10–3 in
BSK-Medium verdünnt.
Die Kulturen wurden bei 32°C
für 6 Wochen inkubiert
und wöchentlich
auf das Wachstum von B. burgdorferi untersucht, wie beschrieben
wurde.
-
L. Statistische Analyse
-
Statistische
Unterschiede wurden durch die Pearson-Chi-Quadrat-Analyse verglichen.
-
I. Ergebnisse
-
A. Impfung
-
Die
Hunde wurden mit zwei Dosen des Impfstoffes in einem Abstand von
drei Wochen geimpft. Nach der ersten Impfung zeigten 14 von 20 Hunden
ein leichtes Fieber von 1,5°F
oberhalb der Basistemperaturen (Tabelle 16). Die Temperaturen hielten
bei der Mehrzahl dieser Hunde lediglich für 3 Tage an. Leicht erhöhte Temperaturen
wurden für
die Hunde 566 und 568 während
7 Tagen nach der Impfung protokolliert. Eine geschwollene Impfstelle
wurde bei Hund 560 beobachtet, welche während 4 Tagen anhielt und dann
verschwand. Nach der zweiten Impfung zeigten 13 von 20 Hunden ein
leichtes Fieber von 1,5°F
oberhalb der Basislinie, welches während 3 oder 4 Tagen anhielt
(Tabelle 17). Hund 615 zeigte eine erhöhte Temperatur, welche während 8
Tagen anhielt. Die Hunde zeigten keine anderen Reaktionen nach der
Impfung, und es wurden keine schweren Überempfindlichkeits- oder anaphylaktische
Reaktionen beobachtet.
-
-
-
B. Antikörperantwort
auf B. burgdorferi-Ganzzellantigene
-
Ein
ELISA unter Verwendung von ganzen Zellen von B. burgdorferi wurde
zum Nachweis der serologischen Antwort von geimpften und herausgeforderten
Hunden auf Oberflächenantigene
von B. burgdorferi verwendet. Vor der Impfung waren alle Hunde seronegativ.
Drei Wochen nach der zweiten Impfung wurde ein geometrischer mittlerer
Titer (GMT) von 1236 gegen den Stamm S-1-10 und von 816 gegen den
Stamm C-1-11 erhalten (Tabelle 18). Sechs Monate später, zum
Zeitpunkt der Exposition, hatten sich die Antikörpertiter in den Impflingen
auf 343 und 234 für
S-1-10 bzw. C-1-11 verringert. Die Antikörpertiter gegen beide Stämme blieben in
den Impflingen nach der Herausforderung mit infizierten Zecken im
Wesentlichen unverändert.
Ungeimpfte Kontrollhunde waren während
des Zeitraums vor der Herauforderung seronegativ. Nach der Exposition
waren alle Kontrollhunde für
sowohl S-1-10 als auch C-1-11 seropositiv. Der GMT in den Kontrollhunden
betrug 1167 und 1404 für
S-1-10 bzw. C-1-11 und war um das 4- bis 5-fache höher als
die Titer in den geimpften Hunden nach der Exposition. Jedoch waren
die Antikörpertiter
gegen beide Stämme
in Hund Nr. 669 um das 8- bis 16-fache niedriger als der GMT der
Kontrollhunde.
-
-
-
C. Western-Immunblot-Verfahren
-
Das
Serum von geimpften und ungeimpften Kontrollhunden wurde vor und
nach der Herausforderung untersucht, um die Reaktivität des Antikörpers mit
spezifischen Antigenen von B. burgdorferi zu bestimmen. Alle Hunde
waren vor der Impfung seronegativ. Sieben Monate nach der zweiten
Impfung enthielt das Serum von geimpften Hunden einen Antikörper, der
vorwiegend mit dem OspA-Protein (31 Kilodalton) und einem Protein
von 34 Kilodalton, welches dem beschriebenen Molekulargewicht für OspB entspricht,
reagierte (1 bis 4). Der
Antikörper
reagierte ungefähr
in demselben Ausmaß mit
diesen Proteinen von S-1-10 und C-1-11. Jedoch deuteten Unterschiede bezüglich des
Färbungsmusters
und der relativen Beweglichkeit der Proteine auf andere Unterschiede
bei den Proteinen zwischen den zwei Stämmen hin. In dem Serum einiger
Impflinge wurden Antikörper
gegen andere Proteine von B. burgdorferi wie ein Flagellin-Protein
(41 Kilodalton) und Proteine mit einem höheren Molekulargewicht nachgewiesen.
Nach der Herausforderung durch Zecken wurde eine leichte Veränderung
in dem Immunblot-Profil der geimpften Hunde beobachtet. Der Antikörper von
geimpften Hunden reagierte vorwiegend mit den OspA- und OspB-Proteinen.
Das Antikörper-Immunblot-Profil von
ungeimpften Kontrollhunden nach der Zeckenexposition unterschied
sich von dem Immunblot-Profil
der geimpften Hunde. Die ungeimpften Kontrollen waren vor der Herausforderung
seronegativ (5). Nach der Herausforderung
produzierten die Ungeimpften einen Antikörper gegen des Flagellin-Protein
von 41 Kilodalton und ein Protein von 39 Kilodalton sowie gegen
Proteine mit einem höheren
Molekulargewicht von B. burgdorferi (6). In
dem Serum von Kontrollhunden wurden nach der Herausforderung durch
Zecken nur wenige oder keine Antikörper gegen OspA und OspB nachgewiesen.
Studien haben gezeigt, dass ungeimpfte Tiere sehr wenige Antikörper gegen
OspA und OspB nach einer Exposition mit B. burgdorferi-infizierten
Zecken produzieren (Appel et al. (1993); Burgdorfer et al. (1982);
Roelerig et al. (1992); Schaible U.E. et al., Immunol. Let. 36 (1993),
219-226).
-
D. OspA-ELISA
-
In
einem ELISA wurde ein rekombinantes OspA verwendet, um die Antikörperantwort
auf ein wichtiges protektives Antigen in Hunden nach einer Impfung
mit dem Bakterin zu bestimmen. Geimpfte Hunde entwickelten OspA-Antikörpertiter,
welche nach der zweiten Impfung im Bereich von 320 bis 2560 liegen
(Tabelle 19).
-
Der
OspA-GMT betrug 640 nach der Impfung und 279 vor der Herausforderung.
Der Antikörper
gegen OspA wurde in ungeimpften Kontrollhunden acht Wochen nach
der Herausforderung durch Zecken nicht nachgewiesen. Tabelle
19: ELISA-Antikörperantwort
auf OspA
- a Antikörper gegen
ein rekombinantes OspA-Protein, gebunden an die Vertiefungen einer
Platte.
- b Drei Wochen nach der zweiten Impfung.
- c Negativ – korreliert mit einem Titer
von < 1:20.
- d Geometrischer mittlerer Titer.
-
E. Borrelia-Antikörper-Antwort
-
Die
funktionelle Aktivität
des Antikörpers,
welcher gegen B. burgdorferi als Ergebnis einer Impfung mit dem
Bakterin hervorgerufen wurde, wurde in dem Borrelia-Antikörper-Test
gemessen. Der Borrelia-Antikörper wurde
durch die Hemmung des Wachstums von B. burgdorferi als Ergebnis
der Antikörper-vermittelten
Lyse des Organismus nachgewiesen. Geimpfte Hunde entwickelten hohe
Titer des Borrelia-Antikörpers
gegen sowohl S-1-10 als auch C-1-11 (Tabelle 20). Der GMT des Borrelia-Antikörpers betrug
520 gegen den Stamm S-1-10 und 1076 gegen den Stamm C-1-11. Ähnlich wie
bei der Ganzzell- und OspA-Antikörperantwort
verringerten sich die Borrelia-Antikörper-Titer von der zweiten
Impfung bis zum Zeitpunkt der Herausforderung. Zum Zeitpunkt der
Exposition, sieben Monate nach der zweiten Impfung, wurden Borrelia-Antikörper-Titer
von 113 und 279 für
S-1-10 bzw. C-1-11 in den Impflingen nachgewiesen. Geimpfte Hunde
erzeugten auch einen Borrelia-Antikörper gegen einen anderen Stamm
von B. burgdorferi aus derselben seropositiven Gruppe wie S-1-10
(Tabelle 21). Der Borrelia-Antikörper
wurde in keinem der ungeimpften Kontrollhunde vor oder nach der Herausforderung
nachgewiesen (Daten nicht vorgestellt). Das Fehlen des Borrelia-Antikörpers in
den Kontrollhunden nach der Herausforderung ist vergleichbar mit
den Ergebnissen, welche zeigten, dass der OspA-Antikörper in
Kontrollhunden nach der Herausforderung durch den OspA-ELISA und
das Immunblot-Verfahren nicht nachgewiesen wurde.
-
-
-
Tabelle
21: Borrelia-Antikörper-Antwort
auf homologe und heterologe Isolate von B. burgdorferi
-
- a Menschliches Liquor cerebrospinalis-Isolat
aus Connecticut.
- b Geometrischer mittlerer Titer.
- c Negativ – korreliert mit einem Titer
von < 1:20 für die Isolate
C-1-11 und S-1-10 sowie < 1:16
für das
Isolat 297.
- d Nicht durchgeführt.
-
F. Herausforderung von
Hunden mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
-
Insgesamt
wurden 1363 I. scapularis-Zecken (732 Weibchen und 631 Männchen)
in dem Gebiet in der Nähe
von Ettrick, WI, gesammelt. Die Infektionsrate der Zecken mit B.
burgdorferi betrug 44%, wie durch eine FA-Analyse des Mitteldarms
von männlichen
Zecken bestimmt wurde. Diese Infektionsrate ist vergleichbar mit der
Infektionsrate von 47%, welche durch Lacombe und Mitarbeiter beschrieben
wurde (Lacombe E. et al., J. Infect. Dis. 167 (1993), 1236-1238).
Berechnungen wurden durchgeführt,
um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass mindestens eine infizierte
Zecke auf jeden Hund zum Zeitpunkt der Herausforderung aufgebracht wurde.
Die Ergebnisse zeigten, das eine Wahrscheinlichkeit von 99,4% bestand,
dass alle der 35 herausgeforderten Hunde mindestens eine infizierte
Zecke erhielten (Tabelle 22). Zum Zeitpunkt der herausgeforderten wurden
10 weiblichen und 6 männliche
Zecken auf jeden Hund aufgebracht, die man während einer Woche saugen ließ. Im Allgemeinen
hefteten sich die Zecken innerhalb von 24 Stunden an, und die meisten
Zecken saugten sich bis zum vollständigen oder nahezu vollständigen Anschwellen
während
des einwöchigen
Zeitraums der Herausforderung voll. Zecken, welche von dem Hund
abgefallen waren, wurden in der Schale zurückgehalten. Am Ende des einwöchigen Zeckenanheftungszeitraums
wurde die gewonnenen Zecken durch einen FA auf die Anwesenheit von
B. burgdorferi untersucht. Die Zecken wurden von 18 der 20 Impflinge
gewonnen, und mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke wurde
von 8 der 18 Hunde gewonnen (44%). Die Zecken wurden von 14 der
15 ungeimpften Hunde gewonnen, wobei 12 von 14 (86%) positiv auf
B. burgdorferi getestet wurden. Fikrig (15) hat auch berichtet,
dass weniger infizierte Zecken von geimpften Tieren als von ungeimpften
Tieren gewonnen werden (Fikrig E. et al., P.N.A.S. 89 (1992), 5418-5421).
-
G. Gewinnung von B. burgdorferi
aus Hautbiopsieproben
-
Die
Isolierung von B. burgdorferi aus der Haut von Tieren ist als Indikator
für eine
B. burgdorferi-Infektion verwendet worden. Daher wurden Hautbiopsien
von betäubten
Tieren 18 Tage nach der Herausforderung durch die Zecken entnommen,
um eine Infektion mit B. burgdorferi-infizierten Zecken nachzuweisen.
B. burgdorferi wurde aus der Haut von einem der 20 (5%) geimpften
Hunde im Vergleich zu 14 der 15 (93%) ungeimpften Kontrollen isoliert
(Tabelle 23).
-
-
-
In
Tabelle 22 wurde die theoretische Anzahl der infizierten Zecken,
welche auf die Hunde aufgebracht wurden, auf die gegenwärtige Infektionsrate
bezogen. Zum Beispiel waren 322/732 oder 44% der Zecken theoretisch
infiziert. Folglich wird der Wert für 40% der 10 gesammelten Zecken
auf 5 infizierte Zecken aufgerundet, um ein Szenarium für den schlimmsten
Fall anzunehmen, dass die Wahrscheinlichkeit einer unzureichenden
Anzahl an infizierten Zellen für
die letztendlich wenigen Hunde in der Studie besteht. Diese Zahl
wurde verwendet, um neue Infektionsraten der Population für den nächsten Hund
abzuschätzen.
-
Bei
der Berechnung der Wahrscheinlichkeit von mindestens einer infizierten
Zecke wurden 10 Wahrscheinlichkeitswerte (1 Zecke, 2 Zecken, 3 Zecken,
4 Zecken...& 10
Zecken), basierend auf der gegenwärtige Population von infizierten
Zecken und der Zecken insgesamt und der verbliebenen Zecken insgesamt,
addiert. Mathematisch wurde eine hypergeometrische Verteilung verwendet,
um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass eine infizierte Zecke
in einer Probe von 10 Zecken aus einer Population von 732 Zecken
mit 322 infizierten Zecken vorhanden ist. Um mindestens eine infizierte
Zecke zu erhalten, wurden die Wahrscheinlichkeiten von 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9 & 10
Zecken berechnet und addiert. Tabelle
23: Charakterisierung einer Infektion in Impflingen und Ungeimpften
nach der Exposition mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
- a Hautbiopsien,
entnommen von den Zeckenbißstellen
zwei Wochen nach der Zeckenanheftung.
-
H. Entwicklung einer Lahmheit
in Hunden nach einer Herausforderung
-
Das
primäre
klinische Symptom der Lyme-Krankheit in Hunden ist eine Lahmheit.
Der Schutz von Hunden gegen die Lyme-Krankheit wurde durch eine
wesentliche Verringerung der Anzahl an lahmenden Hunden zwischen
Impflingen und Kontrollen beurteilt. Die Hunde sind nun für einen
Zeitraum von 7 Monaten nach der Herausforderung durch Zecken täglich auf
eine Lahmheit untersucht worden. Die Anzahl der Hunde, die eine Lahmheit
und begleitende klinische Symptome gezeigt haben, ist in Tabelle
23 angegeben. Eine Lahmheit wurde bei zwei geimpften Hunden beobachtet.
Bei dem einen Impfling war ein Bein betroffen, und bei dem anderen
Impfling waren zwei Beine betroffen. Zehn ungeimpfte Kontrollen
zeigten eine Lahmheit in Verbindung mit Lethargie und/oder Fieber
bei 9 der 10 Hunden. Bei dem einen Kontrollhund waren drei Beine
betroffen. Die Lahmheit schien bei ungeimpften Hunden insofern schwerer
zu sein, als die Hunde unwillig waren, das betroffene Bein zu belasten.
Bei der Mehrzahl der ungeimpften Hunde waren die betroffenen Gelenke
geschwollen und fühlten
sich warm an.
-
Die
temporäre
Beobachtung einer Lahmheit bei Hunden nach der Herausforderung ist
in Tabelle 24 dargestellt. Die Lahmheit wurde ungefähr zwei
Monate nach der Herausforderung durch Zecken zum ersten Mal bei
den Hunden beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt zeigten ein Impfling
und zwei Kontrollhunde eine Lahmheit. Anfang September, vier Monate
nach der Exposition, ist bei einem weiteren geimpften Hund und bei
vier weiteren Kontrollhunden eine Lahmheit beobachtet worden. Da
nicht bekannt war, ob irgendwelche weiteren Hunde eine Lahmheit
entwickeln würden,
wurde die Entscheidung getroffen, bei fünf Impflingen und fünf Ungeimpften
eine Obduktion durchzuführen,
um festzustellen, ob B. burgdorferi aus den Hunden isoliert werden konnte.
Die Gewinnung des Spirochäten
aus den nicht lahmenden Hunden würde
auf ein Überleben
des Organismus in den Hunden hinweisen, wobei aber keine klinische
Symptome vorhanden sind. Zwei der fünf Hunde in jeder Gruppe hatten
eine Lahmheit gezeigt, und drei Hunde in jeder Gruppe waren normal
geblieben. Da drei Hunde aus jeder Testgruppen-Population entfernt
worden waren, wurde die Anzahl der Hunde in der Gruppe der Impflinge
und in der ungeimpften Kontrollgruppe auf 17 bzw. 12 verringert.
Sieben Monate nach der Zeckenexposition wurde eine Lahmheit bei
insgesamt 2 der 17 (12%) Impflinge und 10 der 12 (83%) ungeimpften
Kontrollen beobachtet. Dies entspricht einem berechneten Schutzindexwert
von 85,6% und stellt eine wesentliche Verringerung (p 0,01) der
klinischen Erkrankung zwischen Impflingen und Kontrollen dar. Eine
Zusammenstellung des Prozentsatzes der Hunde, welche eine Lahmheit
nach der Exposition zeigten, ist in 14 dargestellt.
-
Es
wurden Versuche unternommen, die lahmenden Hunde innerhalb von drei
bis vier Tagen während der
Episode der Lahmheit zu obduzieren, um B. burgdorferi aus der Haut,
den Gelenken und den Organen der Hunde zu isolieren (Tabelle 25).
B. burgdorferi wurde nicht aus der Haut, den Gelenken oder den Organen
von einem der beiden lahmenden geimpften Hunde isoliert, aber wurde
aus der Haut und dem Gelenk des nicht lahmenden Impflings, dessen
Hautbiopsie zuerst positiv war, isoliert. Im Gegensatz dazu wurde
B. burgdorferi aus Hautbiopsieproben isoliert, welche bei der Obduktion
von entweder der Zeckenbißstelle
oder von Stellen entfernt von der Zeckenbißstelle von allen ungeimpften
Kontrollhunden, welche lahmten, entnommen wurden. Der Spirochät wurde
auch aus entweder den Gelenken oder den Organen von allen lahmenden
ungeimpften Kontrollhunden isoliert. Der ungeimpfte Kontrollhund,
dessen Hautbiopsie anfangs negativ war, blieb zum Zeitpunkt der
Obduktion hinsichtlich der Hautbiopsie negativ, und B. burgdorferi
wurde nicht aus den Gelenken oder den Organen des Hundes isoliert.
![Figure 00880001](https://patentimages.storage.googleapis.com/3c/12/9c/e3b444c28b42b0/00880001.png)
Tabelle
25: Gewinnung von B. burgdorferi aus lahmenden Hunden
- a Hautbiopsien
entnommen von den Zeckenbißstellen
zwei Wochen nach der Zeckenanheftung.
- b Blase/Herz/Niere/Milz.
- c B. burgdorferi wurde auch aus der
Liquor cerebrospinalis isoliert.
- d Biopsie entnommen von der Zeckenbißstelle/Biopsie
entnommen von einer Stelle entfernt von der Zeckenbißstelle.
-
III. Diskussion
-
Es
ist gezeigt worden, dass die humorale Immunantwort eine entscheidende
Rolle bei dem Schutz von Tieren gegen die Lyme-Krankheit spielt
(Barthold S.W. et al., Infect. Immunol. 61 (1993), 4696-4702; Callister et
al. (1991); Callister et al. (1992); Johnson et al. (1986); Johnson
et al. (1986); Johnson et al. (1988); Kochi et al. (1988); Schaible
U.E. et al., P.N.A.S. 87 (1990), 3768-3722; Schmitz et al. (1991)).
In dieser Studie wurden mehrere serologische Tests verwendet, um
die Antikörperantwort
in Hunden, die mit dem Bakterin geimpft wurden, zu charakterisieren.
Der Ganzzell-ELISA wurde verwendet, um die Antikörperantwort auf Oberflächenantigene
von B. burgdorferi nachzuweisen. Die Entwicklung von Antikörpertitern,
welche über
einen Zeitraum von sieben Monaten nach der Impfung fortbestanden,
liefert einen Beweis für
die Antigenität
des Bakterins. Die Spezifität
der Antikörperantwort
wurde durch das Western-Immunblot-Verfahren gezeigt. Zum Zeitpunkt
der Herausforderung, sieben Monate nach der Impfung, reagierte der
Antikörper
im Serum von geimpften Hunden vorwiegend mit OspA- und OspB-Oberflächenproteinen.
Andere Forscher haben ebenfalls gezeigt, dass die überwiegende
Antikörperantwort
auf in vitro gezüchtete
B. burgdorferi-Bakterien gegen die äußeren Oberflächenproteine
gerichtet ist (Appel et al. (1993); Gern L. et al., J. Infect. Dis.
167 (1993), 971-975; Roerhign et al. (1992)). Der OspA-ELISA zeigte
ferner das Vorhandensein eines hohen Antikörpertiters im Serum von geimpften
Hunden und bestätigte
die Fähigkeit
des Bakterins, eine Antikörperantwort
auf ein protektives Antigen des Spirochäten hervorzurufen.
-
Der
Borrelia-Antikörper-Test
wurde verwendet, um die funktionelle Aktivität des Antikörpers gegen B. burgdorferi
im Serum von geimpften Hunden nachzuweisen. Die Antikörper-vermittelte
Lyse von Borrelia resultiert aus der Kombination eines spezifischen
Immunantikörpers
mit Komplementkomponenten und der Bildung des Membranangriffskomplexes.
Der wachstumshemmende Effekt der Antikörper-vermittelten Lyse von B. burgdorferi
kann als analog zu einem virusneutralisierenden Antikörper verstanden
werden. Studien haben gezeigt, dass der Schutz von Labortieren vor
der Lyme-Krankheit mit den Borrelia-Antikörper-Titern korreliert (Jobe
D.A. et al. (1994), J. Clin. Microbiol. (in Druck); Lourich S.D.
et al., Infect. Immunol. 59 (1991), 2522-2528). Daher kann das Vorhandensein
eines Borrelia-Antikörpers
in geimpften Hunden als ein Beweis für die Immunogenität des Bakterins
verwendet werden. Hohe Borrelia-Antikörper-Spiegel waren in allen
geimpften Hunden vorhanden und waren noch zum Zeitpunkt der Herausforderung,
sieben Monate nach der Impfung, nachweisbar. Der Antikörper in
den Impflingen zeigte auch gegenüber
dem heterologen B. burgdorferi-Stamm eine borreliazidale Aktivität. Die Ergebnisse
zeigen, dass der Antikörper
von ungeimpften Kontrollhunden nach der Herausforderung nicht mit
OspA reagierte und keine borreliazidale Aktivität zeigte, was darauf hindeutet,
dass ein großer
Teil der borreliazidalen Aktivität
auf den Antikörper,
der mit OspA und anderen protektiven Oberflächenproteinen reagiert, zurückzuführen ist.
Callister und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die borreliazidale
Aktivität
des Antikörpers
gegen B. burgdorferi in menschlichem Serum durch ein rekombinantes
OspA-Protein adsorbiert werden kann (Callister S.M. et al. (1992)).
So entwickelten Hunde, welche mit dem Bakterin geimpft wurden, eine
protektive Antikörperantwort
auf verschiedene Stämme,
welche sich von den Impfstämmen
unterscheiden.
-
In
dieser Studie wurde ein natürliches
Herausforderungsmodell von Zecken, welches mit demjenigen vergleichbar
war, das durch Appel und Kollegen (Appel et al. (1993)) beschrieben
wurde, verwendet, um eine Lyme-Erkrankung in Hunden hervorzurufen.
Das verwendete Modell repräsentierte
den natürlichen
Expositionsweg, die Dosierung und die Virulenz der unter natürlichen
Feldbedingungen auftretenden B. burgdorferi-Bakterien.
-
Die
in dieser Studie verwendeten Zecken wurden in einem endemischen
Gebiet der Lyme-Krankheit gesammelt, wobei eine Infektionsrate mit
B. burgdorferi von 44% ermittelt wurde. Diese Infektionsrate ist
vergleichbar mit derjenigen, welche durch Lacombe (Lacombe et al.
(1993)) beschrieben wird, aber ist niedriger als jene, welche durch
Appel (Appel et al. (1993)) beschrieben wird. Shih und Spielman
haben gezeigt, dass infizierte Zecken B. burgdorferi auf Mäuse übertragen,
nachdem sie nur 2 Tage gesaugt haben (Shih C. et al., J. Clin. Microbiol.
31 (1993), 2878-2881). Daher scheint der in dieser Studie verwendete
Zeitraum von einer Woche, während
dem die Zecken saugen, mehr als ausreichend. In der Tat wurde die
Wirksamkeit der Herausforderung auf zwei Wegen nachgewiesen. Der
Ganzzell-ELISA wies eine serologische Antwort auf B. burgdorferi
in 14 von 15 ungeimpften Kontrollhunden nach der Herausforderung
nach. Die Ergebnisse korrelierten mit den Hautbiopsie-Ergebnissen insofern,
als es sich bei dem einen Hund, welcher eine geringe oder keine serologische
Antwort zeigte, um denselben Hund handelte, dessen Hautbiopsie nach
der Herausforderung negativ war und dessen Hautbiopsie bei der Obduktion
negativ war. Es ist interessant zu erwähnen, dass weniger B. burgdorferi-infizierte Zecken
von geimpften Hunden als von ungeimpften Kontrollhunden gewonnen
wurden. Diese Ergebnisse sind ähnlich
mit denen von Fikrig und Kollegen (Fikrig et al., P.N.A.S. (1992)).
Diese Autoren postulieren, dass die verringerte Zahl von B. burgdorferi
in Zecken von geimpften Hunden auf die antikörperverstärkte Eliminierung des Spirochäten zurückzuführen war.
-
Eine
Lahmheit ist die primäre
Manifestation der Lyme-Borreliose beim Hund und wurde in dieser
Studie als das Hauptkriterium für
eine klinische Erkrankung verwendet. Nach der Herausforderung variierte
die temporäre
Entwicklung einer Lahmheit bei Hunden während des Zeitraums von sieben
Monaten nach der Herausforderung. Eine Lahmheit wurde bei zwei ungeimpften
Kontrollhunden einen Monat nach der Herausforderung beobachtet.
Jedoch trat die Mehrzahl der Episoden einer Lahmheit erst vier bis
fünf Monate
nach der Herausforderung auf. Appel berichtete auch, dass eine Lahmheit
bei Hunden nicht früher
als zwei bis fünf
Monate nach der Herausforderung auftrat (Appel et al. (1993)). Zehn
von zwölf
ungeimpften Kontrollhunden, deren Hautbiopsie nach der Herausforderung
positiv war, wurden lahm, und B. burgdorferi wurde aus der Haut und
den Gelenken oder anderen Organen bei allen diesen Hunden reisoliert.
Die Entdeckung, dass B. burgdorferi in der Haut und an Stellen,
welche sich weit entfernt von der Zeckenbißstelle befinden, dieser Hunde bis
zu sieben Monate nach der Herausforderung noch verbleiben, weist
auf die evolutionäre
Entwicklung des Parasiten hin, um die Übertragung von Wirt zu Wirt
sicherzustellen. B. burgdorferi wurde aus den beiden geimpften Hunden,
die lahm wurden, nicht reisoliert. Die Lahmheit dieser beiden Hunde
kann nicht auf der Basis der humoralen Antwort erklärt werden.
Eine andere mögliche
Erklärung
schließt
die genetische Prädisposition der
Hunde, die Dosierung der Spirochäten
und die Effizienz der Übertragung
durch die Zecken ein. Obwohl B. burgdorferi in den letzten Jahren
umfassend untersucht worden ist, sind die pathogenen Mechanismen
der Organismen nicht hinreichend charakterisiert. Die Fähigkeit
anderer Borrelia-Spezies,
sich an immunologisch privilegierten Stellen des Wirtes zu maskieren
und die Abwehrmechanismen zu umgehen, ist hinreichend bekannt (Geogitis
K. et al., J. Infect. Dis. 166 (1992), 440-444; Levy et al. (1992);
Ramachandra R.N. et al., J. Med. Entomol. 29 (1992), 818-826), und
dies ist für
B. burgdorferi postuliert worden.
-
Die
Wirksamkeit des Bakterins wurde durch eine wesentliche Verringerung
der Lahmheit zwischen geimpften und ungeimpften Hunden, welche von
B. burgdorferi-infizierten Zecken herausgefordert wurden, beurteilt.
Aus der Lahmheits-Gesamthäufigkeit
von 2 der 17 (12%) Impflinge im Vergleich zu 10 der 12 (83%) ungeimpften
Kontrollen ergibt sich rechnerisch ein Wert für den Schutzindex von 86%.
Dies entspricht einer signifikanten (p ≤ 0,01) Verringerung der Entwicklung
einer klinischen Lyme-Erkrankung zwischen Impflingen und Kontrollen.
-
In
dieser Studie wurde die Sicherheit des Bakterins demonstriert. Die
Wirksamkeit und die Dauer der Immunität wurde durch die Fähigkeit
des Impfstoffes gezeigt, die Entwicklung einer klinischen Erkrankung
in geimpften Hunden im Vergleich zu den Kontrollen sieben Monate
nach der Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken zu verringern.
-
Bei
dem Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 13 und Beispiel 14 wird
angenommen, dass Beispiel 14 die besseren Ergebnisse liefert, da
in Beispiel 14 mehr Zecken und gesündere Zecken und bessere Hautbiopsien
verwendet werden. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass Kontrollhunde
klinische Anzeichen der Lyme-Krankheit
zeigen, und daher wird eine Verringerung der klinischen Anzeichen
in Impflingen im Vergleich zu den Kontrollen unter Verwendung des
Bakterins dieser Erfindung nachgewiesen.
-
Beispiel 15
-
Studie zu einer reduzierten
Dosis
-
I. Materialien und Methoden
-
A. Hunde
-
In
der Studie wurden Beagle aus der Kolonie der Solvay Animal Health,
Inc., Charles City, IA, verwendet. Das mittlere Alter der Hunde
zum Zeitpunkt der Impfung betrug 13 Wochen (Tabelle 26). Alle Hunde
waren für
B. burgdorferi seronegativ (Titer < 20),
wie durch einen Ganzzell-ELISA getestet wurde.
-
Tabelle
26: Geschlecht und Alter der in dieser Studie verwendeten Hunde
-
B. Bakterin-Herstellung
-
In
der Studie wurden zwei Bakterine verwendet. Das Volldosis-Bakterin
wurde, wie vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, aus
den Serotypen S-1-10 und C-1-11 von B. burgdorferi nach der achten
Passage aus der Hauptimpfkultur hergestellt. Dieses Bakterin wurde
dergestalt formuliert, um 5 × 108 Zellen je Serotyp pro 1 ml-Dosis zusammen
mit 7,5% (Gew./Vol.) Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA, Reheis Chemical Co.,
Berkeley Hts., New Jersey) zu enthalten. Die reduzierte Dosis von
Bakterin wurde durch Verdünnen
des Volldosis-Bakterins auf 1:10 in einem hilfreichen Verdünnungsmittel,
bestehend aus Kochsalzlösung,
mit 7,5% (Gew./Vol.) Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA), sowie Gentamicin
und Nystatin als Konservierungsmittel, hergestellt. Beide Bakterine
wurden bis zur Verwendung bei 4°C
gelagert.
-
C. Impfung
-
Zehn
Hunde wurden intramuskulär
in den hinteren Oberschenkel mit zwei 1,0 ml-Dosen jedes Bakterins
in einem Abstand von drei Wochen geimpft. Nach jeder Impfung wurden
die Hunde auf anomale Reaktionen untersucht, die Temperaturen wurden
protokolliert, und die Injektionsstellen wurden während fünf Tagen täglich abgetastet.
Eine Gruppe von 14 ungeimpften Hunden diente als Kontrolle.
-
D. Serologie
-
Blut
wurde vor und nach der Impfung und in Intervallen nach der Herausforderung
gesammelt. Das Serum wurde durch einen Ganzzell-ELISA, einen OspA-ELISA,
einen Borrelia-Antikörper-Test
und ein Western-Immunblot-Verfahren auf einen Antikörper gegen
B. burgdorferi getestet.
-
1. Ganzzell-ELISA
-
Die
Antikörperantwort
in Hunden auf Oberflächenantigene
von B. burgdorferi wurde durch eine Modifikation eines Ganzzell-ELISA,
der durch das Regional Animal Health Laboratory, Baron, WI, verwendet
wird, bestimmt. Kulturen von B. burgdorferi C-1-11 und S-1-10 in
der späten
log-Phase wurden mit binärem
Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Die Vertiefungen von Immulon-3-Platten
(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 0,3 μg Ganzzellantigen
von S-1-10 oder C-1-11 in einem Natriumcarbonat enthaltenden Beschichtungspuffer
beschichtet. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer bei 4°C für 15 bis
17 Stunden inkubiert. Die Inhalte der Vertiefungen wurden verworfen,
und freie reaktive Stellen wurden durch die Zugabe von phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS), enthaltend 5% Magermilchpulver (PBS-NFDM), blockiert und
in einer feuchten Kammer für
60 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden entleert, und 50 μl Testserum, verdünnt in PBS,
enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-TW), wurden zu Vertiefungen in doppelter
Ausfertigung zugegeben und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Positives und negatives Hunde-Kontrollserum wurde auf
jeder Platte eingeschlossen. Die Platten wurden dreimal mit Kochsalzlösung, enthaltend
0,05% Tween-20, gewaschen, und 50 μl-Aliquots eines Peroxidase-markierten
Ziege-anti-Hund-IgG's (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD), verdünnt
1:1500 in PBS-TW, wurden pro Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden
in einer feuchten Kammer für
60 Minuten bei 37°C
inkubiert und dreimal mit PBS-TW gewaschen. Das Substrat durch Lösen von
30,0 mg O-Phenylendiamin in einer Lösung aus 0,051 M dibasischem
Natriumphosphat, 0,024 M Citronensäure und 0,012% Wasserstoffperoxid
hergestellt, und 100 μl-Aliquots
wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure pro
Vertiefung gestoppt, und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde
bei 490 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde
als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte
von 30% der höchsten
optischen Dichte ergab, definiert.
-
2. OspA-ELISA
-
Die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit
75 ng eines rekombinanten OspA von S-1-10 oder C-1-11 beschichtet
und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 5% NFDM in PBS für 60 Minuten
bei 37°C
nachbeschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-TW gewaschen,
und 50 μl
von Hundeserum-Zweifachverdünnungen
wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde
wurden die Vertiefungen mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl Ziege-anti-Hund-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Der
gebundene Antikörper
wurde durch die Zugabe von ABTS-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die optische Dichte jeder
Vertiefung wurde bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt.
Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die
eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab,
definiert.
-
3. Western-Immunblot-Verfahren
-
Kulturen
von B. burgdorferi S-1-10 und C-1-11 in der mittleren bis späten log-Phase
wurden durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4°C für 30 Minuten geerntet. Die
Bakterien wurden durch Zentrifugation dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen.
Suspensionen von etwa 1 × 108 Zellen wurde in Elektrophorese-Probenpuffer für 9 Minuten
gekocht und auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese
unterzogen (Laemmli, 1970). Die aufgetrennten Proteine wurden durch
eine Modifikation des durch Towbin (Towbin et al., 1979) beschriebenen
Verfahrens mittels Elektroblotting auf eine ImmobilonTM-PVDF-Membran übertragen.
Die PVDF-Membran wurde für
90 Minuten bei 22°C
in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2 (TBS) mit 5% NFDM inkubiert.
Streifen davon wurden mit Hundeserum oder einem monoclonalen Antikörper gegen
OspA, 1:75 verdünnt
in dem Blockierungspuffer, für
60 Minuten bei 22°C
inkubiert. Die Streifen wurden dann zweimal in TBS, enthaltend 0,2%
Triton X-100, und einmal in TBS gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde
durch die Zugabe von Ziege-anti-Hund-IgG • HRP oder Ziege-anti-Maus-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Proteinbanden wurden mit einem
TMB-Membran-Peroxidasesubstrat-System (Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) sichtbar gemacht.
-
F. Nachweis eines Borrelia-Antikörpers durch
Durchflußcytometrie
-
Der
Borrelia-Antikörper-Test
wurde mittels einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren
(6, 7) durchgeführt.
Kurz zusammengefasst wurden 72-Stunden-Kulturen
des B. burgdorferi-Isolats C-1-11 und S-1-10 in der mittleren log-Phase in modifiziertem
Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium in einer Petroff-Hauser-Zählkammer
quantifiziert und auf 1 × 106 Zellen/ml BSK-Medium verdünnt. 100 μl-Aliquots
eines verdünnten,
hitzeinaktivierten Serums wurden mit 100 μl jeder B. burgdorferi-Suspension
gemischt, und 10 μl
Meerschweinchenserum-Komplement (210 CH50-Einheiten;
GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) wurden zugegeben. Die Suspension
wurde vorsichtig gemischt und bei 32°C für 16 bis 24 Stunden inkubiert.
Nach Inkubation der Reaktionsröhrchen
wurden 100 μl
des Reaktionsgemisches mit PBS, enthaltend 5,4 × 10–9 M
Acridinorange, verdünnt.
Der Nachweis einer borreliazidalen Aktivität erfolgte mittels einer Modifikation
der bereits beschriebenen Verfahren (Callister et al. (1994)). Eine
Abtötung
durch Borrelia-Antikörper bewirkt
die Bildung von Bläschen
in den Zellwänden
von B. burgdorferi, wodurch höhere
Konzentrationen an Acridinorange auf und innerhalb dieser geschädigten Zellwände adsorbiert
werden. Folglich fluoreszieren abgetötete B. burgdorferi-Organismen
mit einer sehr viel höheren
Intensität
als normale lebende Spirochäten.
Eine Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
von ≥ 16%
im Vergleich zu Organismen, die normalem Hundeserum ausgesetzt werden, wurde
als positiver Beweis für
eine borreliazidale Aktivität
angesehen. Der Endpunkttiter wurde als reziproker Wert der letzten
Verdünnung,
bei der eine Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
von ≥ 16%
beobachtet wurde, ausgedrückt.
Hunde mit einem Titer von < 20
wurden als seronegativ definiert.
-
G. Herausforderung
-
Insgesamt
wurden 300 männliche
und 360 weibliche I. scapularis-Zecken in einem endemischem Gebiet
der Lyme-Krankheit nahe Ettrick, Wisconsin, gesammelt. Zur Ermittlung
der gesamten B. burgdorferi-Infektionsrate der Zecken wurde der
Mitteldarm von 49 männlichen
I. scapularis-Zecken durch einen Fluoreszenzantikörpertest
(FA) unter Verwendung des monoclonalen OspA-Antikörpers, welcher
von Dr. A.G. Barbour erhalten wurde, untersucht. Vier Wochen nach
der zweiten Impfung wurde jeder Hund mit 10 weiblichen und 6 männlichen
Zecken herausgefordert. Weibliche Zecken sind die einzigen erwachsenen
Zecken, welche die Krankheit übertragen.
Männliche
Zecken sind erforderlich, damit die weiblichen Zecken richtig saugen.
Fünf weibliche
und drei männliche
Zecken wurden zufällig
aus dem Pool von Zecken ausgewählt
und in zwei kleine Petrischalen gesetzt, die auf einer rasierten
Fläche
auf dem linken anterior-dorsalen Bereich der Brust jedes Hundes
befestigt wurden. Die Zecken ließ man während einer Woche saugen und
sie wurden in Intervallen von zwei Tagen untersucht. Eine Woche
nach der Anheftung wurden die Zecken gewonnen, und der Mitteldarm
wurde durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper auf
die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht.
-
H. Untersuchung auf klinische
Anzeichen
-
Die
Hunde wurden nach der Herausforderung täglich auf klinische Anzeichen
in Verbindung mit der Lyme-Krankheit untersucht. Die als Indikatoren
für eine
klinische Lyme-Erkrankung verwendeten klinischen Anzeichen waren
Lahmheit, Lethargie und Fieber. Eine Lahmheit wurde als das Widerstreben
einer Gewichtsbelastung eines betroffenen Beines, mit oder ohne
einer Schwellung und einer Temperatur des betroffenen Gelenks, Steifheit
der Beine und die Wanderung der Lahmheit von Gelenk zu Gelenk oder
von Gliedmaß zu
Gliedmaß definiert.
-
I. Isolierung von B. burgdorferi
-
Für die Isolierung
von B. burgdorferi wurden Proben der Haut, der Gelenke und der Organe
der Hunde gesammelt. Hautbiopsien wurden von der Zeckenanheftungsstelle
und von Stellen entfernt von der Zeckenbißstelle von betäubten Hunden
21 Tage nach der Zeckenanheftung und zum Zeitpunkt der Obduktion
entnommen. Die entfernten Stellen befanden sich ventral zu der Zeckenbißstelle,
posterior zu der Zeckenbißstelle
und auf der rechten Seite des anterior-dorsalen Bereiches der Brust
auf der gegenüberliegenden
Seite des Hundes. Die Haut wurde rasiert, mit Solvahex-Desinfektionsmittel
gewaschen und mit sterilem Wasser gründlich gespült, um das restliche Desinfektionsmittel
zu entfernen. Ein ellipsenförmiger
Schnitt wurde durch die dermalen und subkutanen Hautschichten vorgenommen.
Etwa 1 g Haut wurde in 9 ml BSK-Medium, enthaltend 0,15% Agarose
und 40 μg
Rifampin/ml, eingebracht. Die Biopsieprobe wurde homogenisiert,
und zwei weitere Zehnfachverdünnungen
des Homogenats wurden in 9 ml-Blindproben des BSK-Mediums hergestellt.
Die Kulturen wurden bei 32°C
für 6 Wochen
inkubiert und drei und sechs Wochen nach der Beimpfung mikroskopisch auf
das Wachstum von Spirochäten
untersucht. Kulturen, die ein Wachstum von Spirochäten zeigen,
wurden durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper als
B. burgdorferi identifiziert. Kulturen, die nach 6-wöchiger Inkubation
hinsichtlich des Wachstums von Spirochäten negativ waren, wurden verworfen. Zum
Zeitpunkt der Obduktion wurden das Herz, die Milz, die Nieren und
die Blase entnommen und in 50 ml BSK-Medium, enthaltend Agarose
und Rifampin, unter Verwendung einer Stomacher-Vorrichtung (Seward Medical,
London, England) homogenisiert. Eine 50 ml-Probe wurde abgefüllt, und
Zehnfachverdünnungen
davon wurden in BSK-Medium hergestellt. Die Kulturen wurden für 6 Wochen
bei 32°C
inkubiert, untersucht und durch einen FA als B. burgdorferi identifiziert.
Eine 2-3 ml-Probe von Liquor cerebrospinalis wurde zu 9 ml BSK-Medium
zugegeben, und eine weitere 1:10-Verdünnung wurde in demselben Medium
hergestellt, inkubiert und untersucht, wie beschrieben wurde. Aus
dem Ellbogen, Vorderfußwurzelgelenk,
Knie und Fußwurzelgelenk
wurde Gelenkgewebe entnommen. Das Gewebe jedes Gelenks wurde zu
9 ml BSK-Medium, enthaltend Agarose und Rifampin, zugegeben. Eine
weitere 1:10-Verdünnung
wurde in demselben Medium hergestellt, und die Kulturen wurden inkubiert
und untersucht, wie beschrieben wurde.
-
II. Ergebnisse
-
A. Impfung
-
Die
Hunde wurden mit zwei Dosen von Bakterin in einem Abstand von drei
Wochen geimpft. Es wurden keine lokalen oder systemischen Reaktionen
bei irgendeinem der Hunde beobachtet. Die Temperaturen der Hunde
in beiden Impfgruppen blieben nach der ersten bzw. der zweiten Dosis
von Bakterin normal (Tabelle 27 bzw. 28).
-
Tabelle
27: Temperaturen der Hunde nach der ersten Impfung
-
Tabelle
28: Temperaturen der Hunde nach der zweiten Impfung
-
B. Antikörperantwort
auf B. burgdorferi-Ganzzellantigene
-
Ein
ELISA der B. burgdorferi-Zellen benutzt wurde zum Nachweis der serologischen
Antwort von geimpften und herausgeforderten Hunden auf Oberflächenantigene
von B. burgdorferi verwendet. Vor der Impfung waren alle Hunde seronegativ.
Vier Wochen nach der zweiten Impfung wiesen Hunde, welche mit dem Volldosis-Bakterin
geimpft wurden, einen Antikörper-GMT
von 788 gegen C-1-11 und einen GMT von 520 gegen S-1-10 auf (Tabelle
29). Hunde, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden,
wiesen einen etwas niedrigeren GMT von 485 gegen C-1-11 und einen
identischen GMT von 520 gegen S-1-10 auf. Nach der Herausforderung
erhöhten
sich die Antikörpertiter
gegen C-1-11 und S-1-10
in beiden Bakterin-Gruppen auf nahezu den gleichen Wert. Zwölf Wochen
nach der Herausforderung war der Ganzzell-Antikörper-GMT von ungeimpften Kontrollhunden
höher als
der Ganzzell-GMT von geimpften Hunden. Der GMT bei ungeimpften Kontrollen
betrug 1502 und 2301 gegen C-1-11 bzw. S-1-10. Ein ungeimpfter Kontrollhund
blieb zwölf
Wochen nach der Exposition seronegativ.
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C. Western-Immunblot-Verfahren
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Serum
von geimpften und ungeimpften Kontrollhunden wurde vor und nach
der Impfung und der Herausforderung untersucht, um die Reaktivität des Antikörpers mit
spezifischen Antigenen von B. burgdorferi zu bestimmen. Alle Hunde
waren vor der Impfung seronegativ. Die Antikörperantworten gegen B. burgdorferi C-1-11
bzw. S-1-10 in Hunden, welche mit dem Volldosis-Bakterin geimpft
wurden, sind in den 1 und 2 dargestellt.
Die Antikörperantwort
war vorwiegend gegen die OspA- und
OspB-Proteine von C-1-11 und S-1-10 gerichtet. Hunde, die mit dem
Volldosis-Bakterin
geimpft wurden, reagierten mit den OspA- und OspB-Proteinen von
C-1-11 und S-1-10, welche ein Molekulargewicht von 31 bzw. 34 Kilodalton
aufweisen, in nahezu demselben Ausmaß. Unterschiede in den Färbungsmustern
der OspA-Proteine
von C-1-11 und S-1-10 weisen auf den deutlichen antigenen Unterschied
zwischen den beiden Isolaten hin. Bei einigen Hunden wurde eine
geringe Reaktivität
gegenüber
anderen Proteinen des Spirochäten
beobachtet. Hunde, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft
wurden, entwickelten ebenfalls Antikörper gegen die OspA- und OspB-Proteine
von C-1-11 und S-1-10 (3 und 4). Die
Färbungsintensität des Antikörperprofils
bei Hunden, welche mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft
wurden, zeigte, dass das Ausmaß der
OspA-Antwort identisch war mit derjenigen, welche bei Hunden beobachtet
wurde, die das Volldosis-Bakterin erhielten. Zwölf Wochen nach der Herausforderung
war das Antikörperprofil
bei Hunden aus der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe mit
der reduzierten Dosis von Bakterin im Wesentlichen unverändert. Die
Reaktivität
gegenüber OspA
und OspB blieb die bedeutendste Antikörperantwort, welche nachgewiesen
wurde. Jedoch wurde, wenn überhaupt,
eine geringe Antikörperantwort
auf andere Proteine von Borrelia nach der Herausforderung beobachtet.
Nach der Herausforderung wurde bei einigen Impflingen eine Verringerung
der Färbungsintensität gegenüber OspA
und OspB beobachtet, welche aber bei Hunden aus beiden Bakterin-Gruppen
auftrat. Obwohl bei einigen Hunden eine unspezifische Färbung beobachtet
wurde, waren alle ungeimpften Kontrollhunde für B. burgdorferi seronegativ
und waren alle geimpften Kontrollhunde vor der Impfung für B. burgdorferi
seronegativ. Bei keinem der ungeimpften Kontrollhunde wurde eine
Reaktivität
gegenüber
OspA und OspB nachgewiesen (5 und 6).
Das Antikörperprofil
bei Kontrollhunden nach der Herausforderung unterschied sich drastisch
von dem Antikörperprofil,
das bei geimpften Hunden nach der Herausforderung beobachtet wurde. Ungeimpfte
Kontrollhunde entwickelten, wenn überhaupt, eine geringe Antwort
auf OspA- und OspB-Proteine nach der Herausforderung, aber entwickelten
Antikörper
gegen eine Vielzahl von anderen Antigenen von B. burgdorferi.
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D. OspA-ELISA
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Ein
ELISA welcher rekombinante OspA nützt wurde verwendet, um die
Antikörperantwort
auf ein wichtiges protektives Antigen in Hunden, welche mit dem
Volldosis-Bakterin und der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft
wurden, zu bestimmen. Es wurde kein signifikanter Unterschied hinsichtlich
des OspA-Antikörper-GMT gegen
das B. burgdorferi-Isolat C-1-11 oder S-1-10 zwischen Hunden beobachtet,
welche das Volldosis-Bakterin oder die reduzierte Dosis von Bakterin
erhielten. Hunde, die mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, entwickelten
einen OspA-Antikörper-GMT
von 452 für
C-1-11, verglichen mit einem GMT von 368 gegen C-1-11 bei Hunden,
welche die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten (Tabelle 30).
Der OspA-Antikörper-GMT in
der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe mit der reduzierten
Dosis von Bakterin gegen S-1-10 betrug 299 bzw. 394. Die Beobachtung,
dass Antikörper
gegen OspA von C-1-11 und S-1-10 bei keinem der ungeimpften Kontrollhunde
nach der Herausforderung durch Zecken durch einen ELISA nachgewiesen
wurden, korreliert mit dem fehlenden Nachweis des OspA-Antikörpers durch
das Immunblot-Verfahren.
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E. Borrelia-Antikörper-Antwort
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Die
funktionelle Aktivität
des Antikörpers,
welcher gegen B. burgdorferi als Ergebnis einer Impfung mit dem
Bakterin hervorgerufen wurde, wurde in dem Borrelia-Antikörper-Test
gemessen. Der Borrelia-Antikörper wurde
durch die Hemmung des Wachstums von B. burgdorferi als Ergebnis
einer Antikörper-vermittelten
Lyse des Organismus nachgewiesen. Hunde, die mit entweder dem Volldosis-Bakterin oder der
reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, entwickelten hohe
Titer des Borrelia-Antikörpers
gegen sowohl S-1-10 als auch C-1-11 (Tabelle 31). Der Borrelia-Antikörper-GMT
bei Hunden, die das Volldosis-Bakterin erhielten, betrug 970 gegen
C-1-11, verglichen mit einem GMT von 640 gegen C-1-11 bei Hunden,
welche die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten. Für den Borrelia-Antikörper-GMT
gegen S-1-10 war in beiden Bakterin-Gruppen 597.
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F. Herausforderung von
Hunden mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
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Insgesamt
wurden 660 I. scapularis-Zecken (360 Weibchen und 300 Männchen)
für die
Herausforderung der Hunde verwendet. Die Infektionsrate mit B. burgdorferi
in den Zecken betrug 45%, wie durch eine FA-Analyse des Mitteldarms
von männlichen
Zecken bestimmt wurde. Diese Infektionsrate ist vergleichbar mit der
Infektionsrate von 44%, welche in dem obigen Beispiel 14 angegeben
wurde, und ist wiederum vergleichbar mit der Infektionsrate von
47%, welche von Lacombe und Mitarbeiter (Lacombe et al. (1993))
beschrieben wurde. Im Allgemeinen hefteten sich die Zecken innerhalb
von 24 Stunden an, und die meisten Zecken saugten bis zur vollständigen oder
nahezu vollständigen
Sättigung
während
des einwöchigen
Herausforderungszeitraums voll. Zecken, die von dem Hund abgefallen
waren, wurden in der Schale zurückgehalten.
Am Ende der einwöchigen
Zeckenanheftungsperiode wurden die gewonnenen Zecken durch einen
FA auf die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht. Zecken wurden
von 10 der 10 Volldosis-Impflinge
gewonnen, wobei mindestens eine B. burgdorferi-infizierten Zecke
von 3 der 10 Impflinge (30%) gewonnen wurde. In der Gruppe mit der
reduzierten Dosis wurden Zecken von 10 der 10 Impflinge gewonnen,
wobei 40% mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke aufwiesen.
Zecken wurden von 14 der 14 ungeimpften Hunden gewonnen, wobei 12 von
14 (86%) mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke aufwiesen.
Die Beobachtung, dass weniger infizierte Zecken von geimpften Tieren
als von ungeimpften Tieren gewonnen wurden, wurde zuvor in dem Immunogenicity
Test and Duration of Immunity Study Research Report, 28. Dezember
1993, beschrieben, und ist in Fikrig et al. (1992) veröffentlicht
worden.
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G. Isolierung von B. burgdorferi
aus Hautbiopsieproben
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Es
ist gezeigt worden, dass die Haut von Hunden eine gute Quelle für die Gewinnung
von B. burgdorferi nach einer Exposition mit infizierten Zecken
ist (Immunogenicity Test and Duration of Immunity Study Research
Report, 28. Dezember 1993). Folglich kann die Isolierung von B.
burgdorferi aus den Hautbiopsien von Hunden als ein Nachweis für eine B.
burgdorferi-Infektion und als ein Indikator für die Eliminierung des Spirochäten aus
dem Hund verwendet werden. Die Hunde wurden 21 Tage nach der Herausforderung
durch Zecken betäubt,
wobei von allen geimpften und ungeimpften Hunden Hautbiopsien entnommen
wurden. B. burgdorferi wurde aus keiner der Hautbiopsien irgendeines
der 10 Hunde in der Volldosis-Bakterin-Gruppe isoliert. In der Gruppe mit der
reduzierten Dosis wurde B. burgdorferi aus 1 von 10 Hunden isoliert
(Tabelle 32). Im Gegensatz dazu waren die Hautbiopsien von 12 der
14 (86%) ungeimpften Kontrollhunde 21 Tage nach der Herausforderung
für B.
burgdorferi positiv. Interessanterweise war der eine ungeimpfte
Kontrollhund, welcher nach der Herausforderung im Ganzzell-ELISA
seronegativ war, einer der beiden Kontrollhunde, deren Hautbiopsie
negativ war.
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H. Entwicklung von klinischen
Anzeichen bei Hunden nach einer Herausforderung
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Lahmheit,
Lethargie und Fieber waren die klinischen Anzeichen einer Lyme-Erkrankung bei Hunden, die
verwendet wurden, um den Grad des Schutzes zu beurteilen, welcher
durch die Bakterine gewährleistet wird.
Acht Monate nach der Herausforderung durch Zecken wies ein Hund
(10%) in der Volldosis-Bakterin-Gruppe
Lahmheit auf, und zwei Hunde (20%) in der Gruppe mit der reduzierten
Dosis von Bakterin wiesen Lahmheit auf (Tabelle 32). Ähnlich wie
in der Studie zur Immunogenität/Dauer
zeigten Hunde, die entweder das Volldosis-Bakterin oder die reduzierte
Dosis von Bakterin erhielten, vier Monate nach der Herausforderung keine
Lahmheit. Eine Lahmheit ist für
8 von 14 Hunden (57%) in der ungeimpften Kontrollgruppe berichtet
worden. Daraus ergibt sich ein Schutzindex von 83% für die Volldosis-Bakterin-Gruppe
und ein Schutzindex von 65% für
die Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin. Eine Lahmheit
wurde bei einem Bein bei den Impflingen und den ungeimpften Kontrollen
beobachtet. Wie in der Studie zur Immunogenität/Dauer gezeigt, trat die Entwicklung
einer Lahmheit bei Hunden in dem natürlichen Zecken-Herausforderungsmodell über einen längeren Zeitraum
auf. Die temporäre
Beobachtung einer Lahmheit für
Hunde in der Studie mit einer reduzierten Dosis ist in 7 dargestellt.
Im Vergleich zu der Studie zur Immunogenität/Dauer trat die Entwicklung
einer Lahmheit bei ungeimpften Kontrollhunden in der Studie zu einer
reduzierten Dosis über
einen etwas längeren
Zeitraum auf. Die Hunde wurden auf andere klinische Symptome einer
Lyme-Erkrankung einschließlich Fieber
und Lethargie überwacht.
Der eine lahmende Hund in der Volldosis-Bakterin-Gruppe zeigte kein
Fieber von ≥ 103,5°F, noch zeigte
der Hund irgendeine Lethargie. Einer der beiden lahmenden Hunde
in der Gruppe mit der reduzierten Dosis hatte für einen Tag Fieber von 103,7°F. Alle ungeimpften
Kontrollhunde wiesen Temperaturen von ≥ 103,5°F zum Zeitpunkt der Beobachtung
einer Lahmheit auf. Bei keinem der lahmenden Hunde wurde eine Lethargie
beobachtet.
-
I. Isolierung von B. burgdorferi
aus lahmenden Hunden
-
Die
Hunde wurden innerhalb von 3 bis 4 Tagen während der Episode einer Lahmheit
obduziert, und Proben der Haut, Gelenke und Organe wurden zur Isolierung
von B. burgdorferi kultiviert. B. burgdorferi wurde nicht aus den
lahmenden Impflingen in der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe
mit der reduzierten Dosis von Bakterin isoliert (Tabelle 32). Im
Gegensatz dazu wurde B. burgdorferi aus der Haut und den Gelenken von
allen lahmenden ungeimpften Kontrollen und aus der Milz eines lahmenden
Kontrollhundes isoliert. Bei allen Kontrollhunden wurde der Spirochät aus Hautbiopsieproben
gewonnen, welche an Stellen entfernt von dem Zeckenbiß entnommen
wurden. Die Ergebnisse, welche die Gewinnung von B. burgdorferi
aus lahmenden ungeimpften Kontrollhunden, aber nicht aus lahmenden
Impflingen zeigen, wurden in der der Studie zur Immunogenität/Dauer
beschrieben.
-
III. Diskussion
-
Das
in der Studie verwendete Volldosis-Bakterin enthielt 5 × 108 Zellen jedes B. burgdorferi-Isolats aus zwei
verschiedenen seroprotektiven Gruppen. Die Ergebnisse zeigten, dass
geimpfte Hunde einen Borrelia-Antikörper bilden, welcher gegen
die wichtigsten protektiven Antigene von B. burgdorferi gerichtet
war. Ein Zecken-Herausforderungs-modell wurde entwickelt und dazu
verwendet, die Fähigkeit
des Bakterins zu beurteilen, Hunde gegen eine klinische Lyme-Erkrankung
zu schützen.
Sieben Monate nach der zweiten Impfung wurden die Hunde mit B. burgdorferi-infizierten
Zecken herausgefordert und für
weitere sieben Monate überwacht.
Das Bakterin schützte
die Hunde gegen klinische Symptome einer Lyme-Erkrankung, welche Lahmheit, Fieber
und Lethargie einschlossen. Die Beobachtung, dass B. burgdorferi
nicht aus lahmenden Impflingen, aber aus allen lahmenden Kontrollhunden
isoliert wurde, weist auf eine vermehrte Eliminierung des Spirochäten in den
geimpften Hunden hin. Die Daten der Studie wurden durch die APHIS
als Beweis für
die Immunogenität
und die Dauer der Immunität
des Bakterins anerkannt.
-
Das
Zecken-Herausforderungs-modell wurde zu einem relativ späten Stadium
in der Entwicklung des vorstehend beschriebenen Bakterins in den
Bakterin-Wirksamkeitstest
einbezogen. Daher sind keine Studien zu minimalen Immunisierungsdosen
durchgeführt
worden. Dieses Beispiel veranschaulicht die Impfung von Hunden mit
einem Bakterin, worin die Anzahl jedes Isolat von B. burgdorferi
um das 10-fache verringert war. Als ein Vergleich zu der Gruppe
mit der reduzierten Dosis von Bakterin wurden weitere Hunde mit
dem Bakterin geimpft, welches die ursprüngliche Volldosis von Bakterin
enthält.
Da die Dauer der Immunität
vorher demonstriert wurde, wurden die Hunde in der Studie zu der
reduzierten Antigendosis vier Wochen nach der zweiten Impfung herausgefordert.
Das Zecken- Herausforderungs-modell
wurde in der Studie zu der reduzierten Antigendosis erneut verwendet,
da das Expositionsmodell der maßgeblichste
Test für
eine Impfstoffwirksamkeit ist.
-
Als
ein erster Schritt bei der Bestimmung, ob die Verringerung der Zellzahlen
von B. burgdorferi die Wirksamkeit des Bakterins beeinflußte, wurde
die humorale Immunantwort von Hunden beurteilt, wobei die Ganzzell-Borrelia-
und OspA-Antikörper-Titer
von Hunden in der Gruppe mit der reduzierten Dosis gemessen wurden.
Im Allgemeinen waren die Antikörpertiter
bei Hunden, die mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, etwas
höher als
der Titer bei Hunden, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin
geimpft wurden. Jedoch unterschieden sich Antikörpertiter zwischen den Bakterin-Gruppen
um nicht mehr als das 2-fache und waren nicht signifikant verschieden.
Die Antikörpertiter
in der Studie zu der reduzierten Dosis waren vergleichbar mit den
Titern, welche in der Studie zur Immunogenität/Dauer beschrieben wurden
(Tabelle 33). Die Tatsache, dass die Bakterine, die in der Studie
zu der reduzierten Dosis verwendet wurden, ein zusätzliches
Jahr bei 4°C gelagert
wurden, ist ein Beweis für
die Stabilität
des Bakterins. Bedeutsamer ist, dass die Ergebnisse die Reproduzierbarkeit
der Versuchsbedingungen und die Gleichheit des Bakterins in der
reduzierten Dosis und in der Volldosis im Hinblick auf das Hervorrufen
einer ähnlichen
humoralen Immunantwort auf B. burgdorferi demonstrierten.
-
-
Die
Isolierung von B. burgdorferi aus Gewebeproben von Hunden ist als
ein Indikator für
eine Infektion mit dem Spirochäten
verwendet worden. Beispiel 14, worin das Volldosis-Bakterin verwendet
wurde, zeigt, dass nach einer Exposition mit B. burgdorferi-infizierten
Zecken, der Spirochät
eher bei den weniger geimpften Hunden gewonnen wurde als bei den
ungeimpften Kontrollhunden aus der Haut gewonnen wurde. Dieses Beispiel
zeigt auch, dass B. burgdorferi nach der Herausforderung durch Zecken
bei weniger Impflingen als Kontrollhunden aus Hautbiopsien gewonnen
wurde. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe mit
der reduzierten Dosis von Bakterin und der Volldosis-Bakterin-Gruppe im Hinblick
auf die Gewinnung von B. burgdorferi aus Hautbiopsien nach der Herausforderung
beobachtet. Der Unterschied zwischen Impflingen und Kontrollhunden
bei der Isolierung von B. burgdorferi aus Gewebeproben wurde auch
zum Zeitpunkt der Obduktion der lahmenden Hunde beobachtet. B. burgdorferi
wurde aus keinem Gewebe des einen lahmenden Hundes in der Volldosis-Bakterin-Gruppe oder aus einem
der beiden Hunde in der Gruppe mit der reduzierten Dosis gewonnenen.
Diese Ergebnisse sind identisch mit den Ergebnissen aus der Studie
zur Immunogenität/Dauer.
Im Gegensatz dazu wurde B. burgdorferi aus allen lahmenden ungeimpften
Kontrollhunden in sowohl der Studie zur Immunogenität/Dauer
als auch in der Studie zu der reduzierten Dosis isoliert. Obwohl
die Mechanismen nicht aufgeklärt
worden sind, zeigten diese Beobachtungen, dass das Volldosis-Bakterin
und die reduzierte Dosis von Bakterin hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
die Spirochätenbelastung
bei den Hunden zum Zeitpunkt der Infektion zu verringern und/oder
eine Immunantwort hervorzurufen, welche eine vermehrte Eliminierung
des Spirochäten
zur Folge hatte, vergleichbar waren.
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Die
primären
klinischen Anzeichen einer Lyme-Erkrankung beim Hund sind Lahmheit
und in einem geringeren Maße
Fieber und Lethargie. Die Studie zur Immunogenität/Dauer, welche mit dem Volldosis-Bakterin in
Beispiel 14 durchgeführt
wurde, zeigte, dass eine Lahmheit und andere klinische Symptome
bei 12% der Impflinge, verglichen mit 83% der ungeimpften Kontrollen,
beobachtet wurden. In der Studie zu der reduzierten Dosis wurden ähnliche
Ergebnisse beobachtet, wobei eine Lahmheit von 10% für die Volldosis-Gruppe
und von 20% für
die Gruppe mit der reduzierten Dosis berichtet wurde. In beiden
Studien trat die Lahmheit bei ungeimpften Kontrollhunden beginnend
zwei Monate nach der Herausforderung und dann in periodisch wiederkehrenden
Zeiträumen
auf. Am Ende der Studie zur Immunogenität/Dauer, acht Monate nach der
Herausforderung, wurde bei etwa 80% der ungeimpften Kontrollhunde
eine Lahmheit beobachtet. In der Studie zu der reduzierten Dosis
ist acht Monate nach der Herausforderung durch Zecken bei etwa 60%
der ungeimpften Kontrollen eine Lahmheit beobachtet worden. Die
chronische Natur der Krankheit und das verzögerte Auftreten von klinischen
Symptomen ist unter Verwendung eines Herausforderungsmodells, das
der natürlichen Feldherausforderung
sehr nahe kommt, nicht unerwartet. Bei Appel et al. (1993) wird
berichtet, dass die Manifestation einer klinischen Lyme-Erkrankung
einschließlich
einer Lahmheit erst fünf
Monate nach der Herausforderung der Hunde mit infizierten Zecken
beobachtet wurde. Der Grund für
den längeren
Zeitraum bei der Entwicklung einer klinischen Erkrankung in der
Studie zu der reduzierten Dosis ist nicht bekannt. In der Studie zu
der reduzierten Dosis waren die Parameter der Herausforderung durch
Zecken, wie die Anzahl der infizierten Zecken pro Hund und die Infektionsraten
der Zecken, vergleichbar mit den Parametern, welche in der Studie
zur Immunogenität/Dauer,
Beispiel 14, verwendet wurden. Obwohl das Zecken-Herausforderungs-modell den natürlichen
Expositionsweg, die Dosierung und die Virulenz von B. burgdorferi,
welche der Hund ausgesetzt ist, wiedergibt, sind es diese Parameter,
welche das Ergebnis der Herausforderung ganz direkt beeinflussen.
-
Die
in diesem Beispiel vorgestellten Daten zeigen, dass ein Bakterin,
das in einer reduzierten Antigendosismenge zubereitet ist, im Hinblick
auf das Hervorrufen einer protektiven Antikörperantwort auf B. burgdorferi
und im Hinblick auf die Verringerung der Infektion mit dem Spirochäten nach
der Herausforderung durch Zecken genauso wirksam wie das Volldosis-Bakterin
ist. Sowohl das Volldosis-Bakterin als auch die reduzierte Dosis
von Bakterin schützten
die Hunde vor den klinischen Symptomen einer Lyme-Erkrankung.
-
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