DE69535059T2 - Borrelia burgdorferi bacterin - Google Patents

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Description

  • Die Lyme-Krankheit wurde zuerst durch Steere et al. in 1977 beschrieben, die über eine Arthritis-Epidemie in Lyme, Old Lyme und East Haddam, Connecticut, berichteten. 1982 entdeckte Dr. Willy Burgdorfer eine neue Spirochäte in dem Mitteldarm von Ixodes dammini-Zecken (vgl. Burgdorfer W.A. et al., Science 216 (1982), 1317-1319). Später wurde gezeigt, dass diese Spirochäte eine Immunantwort in infizierten Kaninchen auslöst, welche Ähnlichkeit hatte mit der bei Menschen, die an der Lyme-Krankheit leiden, und nun ist bekannt, dass sie das äthiologische Agens der Erkrankung ist. Die Spirochäte wurde später Borrelia burgdorferi bezeichnet.
  • Obwohl Ixodes-Zecken die am häufigsten anzutreffenden Überträger von Borrelia burgdorferi sind, sind die Spirochäten auch in Hirschfliegen, Pferdefliegen und Moskitos nachgewiesen worden. Spirochäten dringen in ein Wirtstier ein, wenn das Tier von dem Überträger gebissen wird. Die B. burgdorferi-Spirochäten besiedeln verschiedene Gewebe des Wirtstieres, wo sie eine Langzeitinfektion hervorrufen können.
  • Vor kurzem ist gezeigt worden, dass Borrelia burgdorferi einen einzigartigen Typ einer extrachromosomalen DNA besitzt und zwar lineare Plasmide, die eine Länge im Bereich von 0,5 bis 50 kb aufweisen (Bergstrom S. et al., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang 77 (1991), 102-107). Diese Plasmide enthalten die Gene, welche die zwei wichtigsten äußeren Oberflächenproteine (Osp) die durch B. burgdorferi exprimiert werden, OspA und OspB, codieren (Bergstrom et al., 1991). Es wird angenommen, dass diese Proteine die Hauptantigene sind, welche an der Immunität gegen eine B. burgdorferi-Infektion beteiligt sind. Schwan und Simpson (Schwan T.G. und Simpson W.J., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang 77 (1991), 94-101) berichten über eine Heterogenität der OspA- und OspB-Proteine bei verschiedenen B. burgdorferi-Isolaten sowie bei demselben Isolat, das bei unterschiedlichen Temperaturen in vivo gezüchtet wurde, und über Studien zu verschiedenen Stadien während der Infektion von Mäusen.
  • Das erste Stadium der Lyme-Krankheit ist durch eine sich vergrößernde Hautläsion gekennzeichnet, welche als Erythema chronicum migrans (Wanderröte) bezeichnet wird (Asbrink E. und Hovmark A., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 4-15; Halperin J.J., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang 77 (1991), 74-80). Die Individuen entwickeln auch häufig eine Arthritis. Jedoch ist die Arthritis nur bei einem kleinen Prozentsatz dieser Individuen chronisch (Steere A.C., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang 77 (1991), 51-54). Borrelia burgdorferi kann auch den Herzmuskel infizieren. Die kardiale Beteiligung bei einer Lyme-Erkrankung ist vorwiegend als vorübergehend beschrieben worden. Allerdings ergaben Tierstudien, dass Skelett- und Herzmuskeln regelmäßig betroffen sind und dass sich die Spirochäten anscheinend innerhalb der Muskelfasern ansiedeln. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Spirochäten in den Wirten lange Zeit überleben können und auf diese Weise in der Lage sein können, chronische Herzkomplikationen hervorzurufen (Stanek G. et al., Scand. J. Infect. Dis. – Anhang 77 (1991), 85-87).
  • In einem hohen Prozentsatz der Fälle infiziert B. burgdorferi auch das Nervensystem, woraus ein großer Bereich von akuten, chronischen und progressiven Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems resultiert (Reik L. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1991), 1-3). Veröffentlichte Berichte haben gezeigt, dass europäische Populationen von der Krankheitserfahrung des dramatischen klinischen Phänomens einer neurologischen Störung betroffen sind, während nordamerikanische Patienten abgeschwächte Formen einer Beteiligung des Nervensystems entwickeln (Halperin, 1991; Halperin J.J. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 24-34). Jedoch berichtet Halperin (1991), dass es immer deutlicher wird, das im Hinblick auf die Beteiligung des Nervensystems in beiden Populationen mindestens dieselbe Bandbreite neurologischer Phänome auftritt.
  • Die Diagnose der Lyme-Krankheit ist auf eine Kombination der Erkennung der vorhandenen klinischen Charakteristika und auch der Expositionswahrscheinlichkeit in endemisch infizierten Gebieten angewiesen. Jedoch wird die Entwicklung einer Arthritis häufig auf andere Ursachen zurückgeführt und nicht mit einer Spirochäteninfektion in Beziehung gebracht. Die neurologischen Symptome, welche das Ergebnis einer B. burgdorferi-Infektion sein können, können eine Vielzahl von anderen neurologischen Zuständen nachahmen (Reik et al., 1988). Zusätzlich zu diesen diagnostischen Komplikationen ist es schwierig, die Spirochäten in den betroffenen Geweben nachzuweisen.
  • Eine Borrelia-Infektion ist mit Antibiotika, z.B. Tetracyclin, Penicillin, Amoxycilin, Doxycilin, Erythromycin und Phenoxymethylpenicillin, behandelt worden (Neu H., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 314-316; Skoldenberg B. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 317-323; Weber K. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 325-345; Luft B.J. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 352-361). Ceftriaxon und chemisch verwandte Substanzen haben sich ebenfalls als Chemotherapeutika nützlich erwiesen (Neu, 1988). Jedoch ist die Etablierung von Protokollen für eine wirksame chemische Behandlung der Lyme-Krankheit durch den Mangel an Daten, mit denen ein geeigneter Zeitraum für die Behandlung festgelegt werden könnte, erschwert worden. Zusätzlich fehlten Studien zur Wirksamkeit von Arzneimitteln in menschlichen Patienten. Das Therapiebild wird weiterhin durch die Notwendigkeit erschwert, ausreichend hohe Gewebekonzentrationen von Antibiotika aufzubauen und aufrechtzuerhalten, um eine chronische Borrelia-Infektion zu bekämpfen (Neu, 1988; Skoldenberg et al., 1988).
  • In Anbetracht dieser Schwierigkeiten bei dem Nachweis und der Behandlung der Lyme-Krankheit sowie der Unmöglichkeit, die Ausbreitung der Spirochäten-Überträgern zu kontrollieren, bestand ein anerkannter Bedarf an einem Impfstoff, der in der Lage ist, anfällige Tiere und Menschen gegen eine Borrelia burgdorferi-Infektion zu immunisieren. Impfstoffe sind in Hamstermodellen (Johnson R.C. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 258-263) und Rattenmodellen (Barthold S.W. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 539 (1988), 264-273) untersucht worden. Ein Ganzzell-Borrelia burgdorferi-Bakterin zur Verwendung in Haustieren ist entwickelt worden (US-Patent Nr. 4,721,617). Impfstoffe auf der Basis des OspA- und/oder OspB-Proteins von Borrelia burgdorferi sind ebenfalls entwickelt worden. Jedoch enthalten diese Ganzzell- und Untereinheitenimpfstoffe lediglich ein B. burgdorferi-Isolat oder sind nur von einem B. burgdorferi-Isolat abgeleitet.
  • In der Literatur gibt es auch Berichte, welche durch in-vitro-Studien die Existenz von mehreren verschiedenen seroprotektiven Gruppen bei nordamerikanischen und europäischen Isolaten von B. burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii und Borrelia afzelli nachgewiesen haben. Solche Berichte schließen jene von Lovrich S.D. et al., Infection and Immunity 61 (10) (1993), 4367-4374, und Lovrich S.D. et al., The Journal of Infectious Diseases 170 (1994), 115-121, ein. Diese Ergebnisse sind von Manchen so interpretiert worden, dass es nahe liegend ist, dass Kombinationen der verschiedenen Isolate, deren Antigene oder deren immunogenen protektiven Proteine erforderlich sind, um einen umfassenden Impfstoff bereitzustellen. Bezugnehmend auf solche Berichte, die darin vorgestellten Ergebnisse und andere solche Berichte bemerkten Fikrig E. et al. (J. Exp. Medicine 181 (1995), 215-221), dass die Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit gegen die Lyme-Krankheit anhand der natürlichen Übertragungsweise erfolgen und nicht basierend auf Klassifikationssystemen oder Tests, welche den Überträger, der die Infektion überträgt, nicht berücksichtigen, vorausgesagt werden sollte, und erklären ihren Nachweis einer erfolgreichen OspA- oder OspB-Immunisierung gegen eine Infektion mit heterologen B. burgdorferi-Spezies gegenüber solchen Berichten. Andere Literaturstellen, die mit Fikrig übereinstimmen, schließen zum Beispiel EP-A-0 465 204 ein, worin ein Impfstoff, enthaltend eine bestimmte Menge der B. burgdorferi-Hauptantigene eines einzigen Isolats, offenbart wird, der in der Lage ist, einen empfindlichen Säuger vor einer Infektion durch verschiedene Stämme zu schützen. Vgl. auch Telford et al., J. Exp. Med. 178 (2) (1993), 755-758, die einen Schutz gegen antigenisch variable B. burgdorferi-Spezies, welcher unter Verwendung eines aktiven Immunisierungsprotokolls mit rekombinanten Glutathiontransferase-Hüllmembran-Oberflächenprotein-Fusionsproteinen A oder B (OspA oder OspB) und einer natürlichen Infektionsmethode übertragen wird, offenbaren.
  • Im Gegensatz dazu enthält das Bakterin dieser Erfindung mindestens zwei nicht-kreuzprotektive B. burgdorferi-Isolate oder ist davon abgeleitet. Das Bakterin dieser Erfindung überträgt daher einen Immunschutz gegen zwei verschiedene Typen eines B. burgdorferi-Isolats, während die bereits beschriebenen Bakterine nur einen Schutz gegen einen Typ eines Isolats vorsehen. Folglich ist das durch diese Erfindung bereitgestellte Bakterin geeigneter, um Lebewesen (Tiere) gegen die Lyme-Krankheit zu impfen.
  • Diese Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst. Die nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate können aus den seroprotektiven Gruppen von Borrelia burgdorferi-Isolaten aus Wisconsin, Chicago und Europa ausgewählt sein. Gegenwärtig werden Isolate aus der Wisconsin- und Chicago-Gruppe bevorzugt. Jedoch können auch Isolate aus anderen seroprotektiven Gruppen verwendet werden. Das Bakterin kann ferner ein drittes nicht-kreuzprotektives, inaktiviertes Borrelia burgdorferi-Isolat umfassen.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame Menge von mindestens einer antigenen Untereinheit, die von mindestens einem der zwei nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der einen oder mehreren antigenen Untereinheiten oder des Isolats wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  • Diese Erfindung stellt ferner ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit, die von einem ersten Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet ist, eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit, welche von einem zweiten nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst. Das Bakterin kann weiterhin eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit von einem dritten nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat umfassen.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren antigenen Untereinheiten der nicht-kreuzprotektiven Isolate, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  • Diese Erfindung stellt ferner die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
  • Diese Erfindung stellt auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame immunisierende Menge von mindestens einer antigenen Untereinheit, die von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolaten abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der antigenen Untereinheit wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren antigenen Untereinheiten der nicht-kreuzprotektiven Isolate, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit.
  • Das Tier kann ein Säuger sein, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Menschen und Hunde. Diese Erfindung umfasst ein Arzneimittel, welches dergestalt ist, dass an das Tier eine zusätzliche Dosis des Impfstoffes in einem geeigneten Zeitintervall nach der Verabreichung der vorhergehenden Dosis verabreicht werden kann.
  • 1: Wachstumskurve einer lebensfähigen B. burgdorferi-Kultur. Die vertikale Achse gibt die Zahl der Zellen (× 107) an, welche in einer Petroff-Hauser-Zählkammer bestimmt wurde.
  • 2: Dextroseverbrauch und Lactatproduktion in einer B. burgdorferi-Kultur. Ausgefüllte Kreise markieren die Lactatproduktion und nicht ausgefüllte Kreise markieren den Dextroseverbrauch in der Kultur. Die Werte sind in g/l Kulturmedium angegeben.
  • 3: Plethysmograph-Werte, welche die Quecksilberverdrängung durch die Pfoten von Kontroll- und geimpften Hamstern zeigen. Die Hamster wurden entweder mit normalem Hamsterserum (NHS) oder Serum von Hamstern, welche selbst mit dem angegebenen B. burgdorferi-Isolat (297 oder 35211) geimpft worden waren, geimpft. Die vertikale Achse gibt die Quecksilberverdrängung in mm Hg an. Die horizontale Achse markiert die Anzahl der Tage nach der Infektion, an denen die Quecksilberverdrängung gemessen wurde. Nicht ausgefüllte Kreise = Basislinienwerte, entsprechend unge impften und nicht herausgeforderten (gechallenged) Hamstern; ausgefüllte Kreise = Hamster geimpft mit Antiserum von Hamstern, die mit dem lebenden B. burgdorferi-Isolat 297 geimpft und anschließend mit dem Isolat 297 herausgefordert wurden; ausgefüllte Quadrate = Hamster, geimpft mit Anti-297-Antiserum und herausgefordert mit dem Isolat 35211; nicht ausgefüllte Quadrate = Hamster, geimpft mit normalem Hamsterserum und exponiert mit dem Isolat 35211; und ausgefüllte Dreiecke = Hamster, geimpft mit normalem Hamsterserum und herausgefordert mit dem Isolat 297.
  • 4: Immunogenitätstest: Borrelia-Antikörper für die Isolierung von S-1-10, gemessen durch einen Borrelia-Antikörper-Test (Borreliacictal assay) nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach Herausforderung (Challenge) mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
  • 5: Immunogenitätstest: Borrelia-Antikörper für die Isolierung von C-1-11, gemessen durch einen Borrelia-Antikörper-Test nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
  • 6: Immunogenitätstest: Gegen das S-1-10-Antigen gerichtete Antikörper, gemessen durch einen ELISA nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
  • 7: Immunogenitätstest: Gegen das C-1-11-Antigen gerichtete Antikörper, gemessen durch einen ELISA nach Impfung mit einem bivalenten B. burgdorferi-Bakterin und nach Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken.
  • 8A und 8B: Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Zeckenexposition (PC) und acht Wochen nach der Zeckenexposition (PsC), gegen die Isolate S-1-10 (8A) und C-1-11 (8B).
  • 9A und 9B: Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Zeckenexposition (PC) und acht Wochen nach der Zeckenexposition (PsC), gegen die Isolate S-1-10 (9A) und C-1-11 (9B).
  • 10A und 10B: Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (PsC), gegen die Isolate S-1-10 (10A) und C-1-11 (10B).
  • 11A und 11B: Western-Immunblots von Impfserum, gesammelt nach der ersten Impfung (PV), sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (PsC), gegen die Isolate S-1-10 (11A) und C-1-11 (11B).
  • 12A und 12B: Western-Immunblots von Nichtimpfserum, gesammelt sieben Monate nach der zweiten Impfung vor der Herausforderung durch Zecken (PC), gegen die Isolate S-1-10 (12A) und C-1-11 (12B).
  • 13A und 13B: Western-Immunblots von Nichtimpfserum, gesammelt acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (PsC), gegen die Isolate S-1-10 (13A) und C-1-11 (13B).
  • 14: Kurzdarstellung des prozentualen Anteils der Hunde, die nach der Herausforderung durch Zecken eine Lahmheit zeigten, beobachtet über sieben Monate.
  • 15A und 15B: Western-Immunblots (Isolat C-1-11) des Serums von Hunden, welche mit einem Volldosis-Bakterin (5 × 108 Zellen je Isolat pro Dosis), geimpft wurden. Das Serum wurde vor der Impfung (PV), vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und zwölf Wochen nach der Herausforderung gesammelt.
  • 16A und 16B: Western-Immunblots (Isolat S-1-10) des Serums von Hunden, die mit einem Volldosis-Bakterin (5 × 108 Zellen je Isolat pro Dosis), geimpft wurden. Das Serum wurde vor der Impfung (PV), vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und zwölf Wochen nach der Herausforderung gesammelt.
  • 17A und 17B: Western-Immunblots (Isolat C-1-11) des Serums von Hunden, die mit einem Volldosis-Bakterin (5 × 107 Zellen je Isolat pro Dosis), geimpft wurden. Das Serum wurde vor der Impfung (PV), vor der Herausforderung durch Zecken (PC) und zwölf Wochen nach der Herausforderung gesammelt.
  • 18A und 18B: Western-Immunblots (Isolat C-1-11) von Serum, das von ungeimpften Kontrollen zum Zeitpunkt der Herausforderung durch Zecken (18A) und zwölf Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (18B) gesammelt wurde.
  • 19A und 19B: Western-Immunblots (Isolat S-1-10) von Serum, das von ungeimpften Kontrollen zum Zeitpunkt der Herausforderung durch Zecken (19A) und zwölf Wochen nach der Herausforderung durch Zecken (19B) gesammelt wurde.
  • 20: Kurzdarstellung des prozentualen Anteils der Hunde, die nach der Zeckenexposition eine Lahmheit zeigten, beobachtet über zwölf Monate.
  • Diese Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  • Typischerweise ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 1010 Organismen je Isolat. Bevorzugt ist die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 109 Organismen je Isolat. Mehr bevorzugt ist die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 1 × 104 Organismen bis etwa 1 × 108 Organismen je Isolat. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 107 Organismen je Isolat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 107 Organismen je Isolat. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame immunisierende Menge der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 108 Organismen je Isolat.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung ist ein "inaktiviertes" Borrelia burgdorferi-Isolat ein Isolat, welches fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier auszulösen, aber das nicht in der Lage ist, das Tier zu infizieren. Die Borrelia burgdorferi-Isolate können durch einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus binärem Ethylenimin, Formalin, β-Propriolacton oder Hitze, inaktiviert werden. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden die Borrelia burgdorferi-Isolate durch binäres Ethylenimin inaktiviert.
  • Die mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate können aus den seroprotektiven Gruppen A, B oder C von Borrelia burgdorferi-Isolaten ausgewählt sein. So wie in dieser Erfindung verwendet, beschreibt der Begriff "seroprotektive Gruppe A von B. burgdorferi-Isolaten" eine seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche das Wisconsin-Isolat S-1-10 und die Isolate 297 und B31 einschließt; "seroprotektive Gruppe B von B. burgdorferi-Isolaten" beschreibt eine seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche das Chicago-Isolat C-1-11 einschließt; und "seroprotektive Gruppe C von B. burgdorferi-Isolaten" beschreibt eine seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche die europäischen Isolate einschließt. Beispiel 10 beschreibt in-vitro-Kreuzprotektionsstudien mit neun B. burgdorferi-Isolaten, die zeigen, dass sechs der seroprotektiven Gruppe A angehören, eines der seroprotektiven Gruppe B angehört und zwei der seroprotektiven Gruppe C angehören. Jedoch wird die Verwendung von nicht-kreuzprotektiven Isolaten aus anderen seroprotektiven Gruppen in dem Bakterin dieser Erfindung in Betracht gezogen. Die in Beispiel 12 vorgestellten Ergebnisse (vgl. nachstehend) zeigen, dass es mindestens zwei seroprotektive Gruppen von Borrelia burgdorferi neben den seroprotektiven Gruppen A, B oder C gibt.
  • Eine Kreuzprotektivität kann durch die Impfung eines Tieres, z.B. eines Hamsters, mit einem lebenden B. burgdorferi-Isolat bestimmt werden. Das Antiserum eines solchen Tieres wird dann zu Kulturen von B. burgdorferi-Isolaten zugegeben. Die Antikörper in Verbindung mit dem Komplement sollten den Zelltod des gleichen Isolats, das für die Impfung des Tieres verwendet wurde, in den Kulturen herbeiführen. Falls die Antikörper eine Antigendeterminante auf einem zweiten Isolat erkennen, induzieren sie den Zelltod in einer Kultur dieses Isolats. Daher kann angenommen werden, dass das erste und das zweite B. burgdorferi-Isolat kreuzprotektiv sind. Eine Kreuzprotektivität kann auch durch die Impfung eines Tieres mit einem B. burgdorferi-Isolat, die Isolierung von Antiserum des Tieres und die Impfung eines anderen Tieres der gleichen Spezies mit diesem Antiserum festgestellt werden. Dieses Tier wird anschließend entweder mit demselben oder mit einem zweiten B. burgdorferi-Isolat herausgefordert. Die Antikörper sollten eine passive Immunität gegen eine Herausforderung mit dem gleichen Isolat auf das Empfängertier übertragen. Falls die Antikörper auch eine passive Immunität gegen ein zweites Isolat übertragen, sind die Isolate kreuzprotektiv.
  • Kreuzprotektive Isolate exprimieren äußere Oberflächenproteine (Osp), die Antigendeterminanten gemeinsam haben, welche durch dieselben Antikörper erkannt werden. Kreuzprotektive Isolate gehören derselben seroprotektiven Gruppe an. Demgemäß ist eine "seroprotektive Gruppe" eine Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten, welche die gleichen protektiven, äußeren Oberflächenproteine gemeinsam haben. Antikörper, welche diese Proteine erkennen, übertragen eine passive Immunität gegen eine Herausforderung durch ein beliebiges Isolat, welches ein Mitglied der gleichen seroprotektiven Gruppe ist.
  • Antikörper, die gegen ein Mitglied eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten gerichtet sind, übertragen keine passive Immunität gegen das andere Mitglied des Paares. Nicht-kreuzprotektive Isolate gehören daher verschiedenen seroprotektiven Gruppen an. Die Impfung mit einem inaktivierten B. burgdorferi-Isolat übertragt keine passive Immunität auf ein Tier gegen eine Herausforderung durch nicht-kreuzprotektive Isolate. Das Bakterin dieser Erfindung, welches mindestens zwei nicht-kreuzprotektive Isolate umfasst, ist dadurch wirksam, dass es die Bildung von Borrelia-Antikörpern gegen die Mitglieder von zwei seroprotektiven Gruppen induziert. Daher sieht das Bakterin ein breiteres Immunschutzspektrum vor als das, welches mit gegenwärtig erhältlichen Impfstoffen, die mehrere nicht-kreuzprotektive B. burgdorferi-Isolate verwenden, erhalten werden kann.
  • In einer Ausführungsform dieser Erfindung sind die nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate aus den seroprotektiven Gruppen A und B von Borrelia burgdorferi-Isolaten ausgewählt. Das Borrelia burgdorferi-Isolat aus der seroprotektiven Gruppe A kann das Wisconsin-Isolat S-1-10 oder das Isolat 297 oder B31 sein.
  • In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Borrelia burgdorferi-Isolat aus der seroprotektiven Gruppe A das Wisconsin-Isolat S-1-10. Vorzugsweise ist das B. burgdorferi-Isolat aus der seroprotektiven Gruppe B das Chicago-Isolat C-1-11. Jedoch kann diese Erfindung auch mit anderen inaktivierten B. burgdorferi-Isolaten, welche in die seroprotektive Gruppe B eingruppiert werden, durchgeführt werden.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung ist ein Adjuvans eine chemische Zusammensetzung, welche in der Lage ist, die Immunogenität von Antigenen zu verstärken, wenn das Adjuvans als Teil eines Bakterins verabreicht wird. Adjuvanzien, welche in dem Bakterin dieser Erfindung nützlich sind, können aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumhydroxid, Carbopol, Lipopolysaccharid (LSP) und Derivaten davon ausgewählt sein. Der Begriff "Lipopolysaccharid", wie hierin verwendet, verweist auf eine Gruppe von Polysacchariden, welche den Fachleuten durch ihr Vorkommen in der Zellwand von Bakterien bekannt und als Adjuvanzien nützlich sind. Bestimmte Beispiele von Lipopolysacchariden und Derivaten davon, welche eine Adjuvanswirkung zeigen, sind in Impfstoffen verwendet worden. Die Verwendung von Lipopolysacchariden oder Derivaten davon in Verbindung mit dem Bakterin dieser Erfindung wird in Betracht gezogen. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Adjuvans Aluminiumhydroxid. Jedoch kann irgendein anderes Adjuvans, welches in der Lage ist, die Immunogenität von inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten zu verstärken, in dem Bakterin dieser Erfindung verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, ist eine "wirksame Menge" eines Adjuvans irgendeine Menge des Adjuvans, welche zur Verstärkung der Immunogenität von Antigenen in dem Bakterin wirksam ist. Typischerweise ist die wirksame Menge des Adjuvans eine Menge von etwa 1,0 Volumen-% bis etwa 15 Volumen-% je Dosis des Bakterins. Bevorzugt ist die wirksame Menge des Aluminiumhydroxid-Adjuvans eine Menge von etwa 5 Volumen-% bis etwa 10 Volumen-%. Am meisten bevorzugt beträgt die wirksame Menge des Aluminiumhydroxid-Adjuvans 7,5 Volumen-%.
  • "Träger", wie hierin verwendet, bedeutet irgendeines der herkömmlichen Verdünnungsmittel für ein Bakterin, welche den Fachleuten hinreichend bekannt sind. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst der Träger einen wässrigen Puffer, z.B. physiologische Kochsalzlösung, und Konservierungsmittel, z.B. Nystatin und Gentamicin.
  • Das Bakterin dieser Erfindung kann ferner eine wirksame immunisierende Menge eines dritten nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolats umfassen.
  • Diese Erfindung stellt die Verwendung des Bakterins der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi bereit, wobei eine Dosis des Bakterins dieser Erfindung an das Tier zu verabreichen ist. Den Fachleuten ist hinreichend bekannt, dass Borrelia burgdorferi das verursachende Agens der Lyme-Krankheit ist und dass eine Infektion das Ergebnis eines Bisses von warmblütigen Wirtstieren durch Bakterien tragende Zecken ist. Es ist nachgewiesen worden, dass Tiere als Antwort auf eine Impfung mit Borrelia burgdorferi Antikörper produzieren und dass daher eine Impfung entweder mit einem inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolat oder einer Untereinheit davon ein möglicher Ansatz für den Schutz vor der Lyme-Krankheit ist. Aufgrund der Schwierigkeit einer korrekten Diagnose der Lyme-Krankheit, der Unzulänglichkeit von Behandlungsprotokollen und der Undurchführbarkeit einer Kontrolle der Überträger der Krankheit, ist ein präventiver Ansatz zur Kontrolle der Krankheit erforderlich. Die bisher verwendeten B. burgdorferi-Impfstoffe enthalten nur ein Isolat der Bakterien. Demgemäß sind solche Impfstoffe am besten geeignet für die Immunisierung gegen die Exposition von Isolaten, die ausschließlich derselben seroprotektiven Gruppe wie das Impfstoff-Isolat angehören. Das durch diese Erfindung bereitgestellte Bakterin kann eine Immunität gegen Isolate aus mindestens zwei seroprotektiven Gruppen bereitstellen und daher einen breiteren Schutz als die gegenwärtig erhältlichen Impfstoffe bereitstellen.
  • Typischerweise ist das Tier, an das der Impfstoff dieser Erfindung verabreicht wird, ein Säuger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Säuger ein Mensch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist der Säuger ein Hund. Bei der Durchführung dieser Erfindung ist ein Fachmann in der Lage, für jedes Tier, das geimpft werden soll, das geeignete Alter zu bestimmen, in dem das Tier immunkompetent ist, d.h. ein richtig funktionierendes Immunsystem besitzt. Eine Immunisierung wäre daher zu dem Zeitpunkt geeignet, wenn das Tier immunkompetent ist, und vorzugsweise vor der Exposition mit Borrelia burgdorferi.
  • Falls das zu impfende Tier zum Beispiel ein Hund ist, ist der Hund zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung des Bakterins mindestens etwa 12 Wochen alt und vorzugsweise etwa 6 Wochen bis etwa 16 Wochen alt.
  • Diese Erfindung zieht auch in Betracht, dass das Bakterin der vorliegenden Erfindung in einer zusätzlichen Dosis des Impfstoffes in einem geeigneten Zeitintervall nach der Verabreichung der vorhergehenden Dosis an das Tier zu verabreichen ist. Diese Erfindung zieht folglich in Erwägung, dass mehrere Dosen des inaktivierten Borrelia burgdorferi-Bakterins an ein Tier verabreicht werden. Die Verabreichung von mehr als einer Dosis eines Bakterins soll die Immunantwort des geimpften Tieres auf bakterielle Antigene im Vergleich zu derjenigen, welche durch die Verabreichung einer Einzeldosis erzielt werden kann, verstärken. Zwischen der Verabreichung jeder Dosis sollte ein geeignetes Zeitintervall liegen, um zu ermöglichen, dass das Immunsystem des Tieres auf die mehreren Dosen des Bakterins eine stärkere Antwort als auf eine Einzeldosis aufbaut. Ein "geeignetes" Zeitintervall zwischen der Verabreichung von mehreren Dosen eines Bakterins an ein Tier ist daher ein Zeitintervall zwischen der Verabreichung von Dosen eines Impfstoffes, welches ausreichend ist, um zu bewirken, dass das Tier eine stärkere Immunantwort aufbaut, als wenn eine Einzeldosis verabreicht wird. Typischerweise beträgt das geeignete Zeitintervall zwischen der Verabreichung von Dosen des Bakterins dieser Erfindung etwa zwei Wochen bis etwa fünf Wochen und vorzugsweise etwa drei Wochen. Diese Erfindung zieht ferner die Verabreichung einer zusätzlichen Dosis des Bakterins an das Tier ungefähr ein Jahr nach der ersten Verabreichung und in etwa jährlichen Intervallen danach in Betracht. Eine solche als "Booster"-Dosis bekannte Verabreichung ist auf dem Fachgebiet der Impfung eine übliche Vorgehensweise. Das inaktivierte Borrelia burgdorferi-Bakterin kann durch irgendeinen der Wege, welche auf dem Fachgebiet für die Verabreichung von Impfstoffen bekannt sind, verabreicht werden. Der gegenwärtig bevorzugte Verabreichungsweg für das Bakterin ist durch intramuskuläre Injektion.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge einer oder mehrerer antigener Untereinheiten, welche von einem ersten Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind, eine wirksame immunisierende Menge einer oder mehreren antigenen Untereinheiten, welche von einem zweiten nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind, ein Adjuvans in einer Menge, welche zur Verstärkung der Immunogenität der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst. Auf dem Fachgebiet ist gut bekannt, dass die Antigendeterminanten von Borrelia burgdorferi als "äußere Oberflächenproteine" (Osp) bezeichnet werden und durch Plasmide, welche in den Bakterien enthalten sind, codiert werden. Die gegenwärtig bekannten Osp-Proteine von Borrelia burgdorferi sind die OspA, OspB-, OspC-, OspD- und OspE-Proteine. Von diesen Proteinen sind die OspA- und OspB-Proteine die am besten untersuchten und charakterisierten Proteine. Das Bakterin dieser Erfindung schließt die Verwendung eines OspA-Proteins oder einer Kombination des OspA-Proteins und des OspB-Proteins von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven B. burgdorferi-Isolaten ein. Das Bakterin schließt ferner die Verwendung anderer Osp-Proteine ein, entweder allein oder in Kombination mit den OspA- und OspB-Proteinen, für welche gezeigt wird, dass sie eine Borrelia-Antikörper-Antwort auslösen, welche vergleichbar ist mit derjenigen, die für das OspA-Protein und die OspA/OspB-Protein-Kombination bekannt ist. Für eine Besprechung der Herstellung von Impfstoffen gegen die Lyme-Krankheit unter Verwendung von antigenen Untereinheiten und Polypeptiden, die von den äußeren Oberflächenproteinen von B. burgdorferi abgeleitet sind, vgl. die Internationale PCT-Anmeldung PCT/US94/08529, veröffentlicht am 9. Februar 1995 als Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/04145, wobei der Inhalt davon unter Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
  • Wie vorstehend besprochen, haben kreuzprotektive Isolate Antigendeterminanten gemeinsam, die durch Antikörper erkannt werden können und woran Antikörper binden. Folglich haben die Osp-Proteine von kreuzprotektiven Isolaten Antigendeterminanten gemeinsam und werden durch dieselben Antikörper erkannt. Kreuzprotektive Isolate gehören wie erwähnt derselben seroprotektiven Gruppe an. Die Impfung mit einem Mitglied einer seroprotektiven Gruppe begründet eine Immunität gegen eine Herausforderung durch andere Isolate, welche in dieselbe seroprotektiven Gruppe eingruppiert werden. Antikörper, welche gegen ein Mitglied eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten gerichtet sind, übertragen keine passive Immunität gegen das andere Mitglied des Paares. Nicht-kreuzprotektive Isolate gehören verschiedenen seroprotektiven Gruppen an. Die Impfung mit einem Mitglied eines Paares von nicht-kreuzprotektiven Isolaten überträgt keine Immunität gegen eine Herausforderung durch das andere Mitglied des Paares. Folglich verleiht die Impfung mit einer wirksamen Menge eines OspA-Proteins oder einer Kombination aus einem OspA-Protein und einem OspB-Protein von einem Isolat eine passive Immunität gegen eine Herausforderung durch dasselbe Isolat sowie andere kreuzprotektive Isolate.
  • Typischerweise ist die wirksame immunisierende Menge von jeder der antigenen Untereinheiten, die von den nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolaten abgeleitet sind, eine Menge von etwa 1 Mikrogramm bis etwa 1000 Mikrogramm.
  • Das Bakterin dieser Erfindung kann ferner eine wirksame immunisierende Menge einer oder mehrerer antigener Untereinheiten, die von einem dritten nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet sind, umfassen. Jedoch ist das Bakterin nicht darauf begrenzt, dass es ein, zwei oder drei nicht-kreuzprotektive Isolate enthält, sondern kann vier oder mehr solcher Isolate enthalten.
  • Diese Erfindung sieht die Verwendung eines Bakterins, das drei oder mehr nicht-kreuzprotektive B. burgdorferi-Isolate umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine durch B. burgdorferi verursachte Erkrankung vor.
  • Diese Erfindung stellt ein Bakterin bereit, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren antigenen Untereinheiten von den nicht-kreuzprotektiven Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung dieses Bakterins für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine durch B. burgdorferi verursachte Erkrankung, wobei eine Dosis eines solchen Bakterins an das Tier zu verabreichen ist.
  • Diese Erfindung sieht ferner die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi vor.
  • In einer Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verwendung ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 1010 Organismen je Isolat. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 109 Organismen je Isolat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 108 Organismen je Isolat. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 107 Organismen je Isolat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 107 Organismen je Isolat. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate etwa 5 × 108 Organismen je Isolat.
  • Die Erfindung sieht auch die Verwendung eines Bakterins, das eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und einer oder mehreren antigenen Untereinheiten von den nicht-kreuzprotektiven Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Tieren gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi vor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verwendung ist die wirksame immunisierende Menge der antigenen Untereinheiten, die von jedem der nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate abgeleitet ist, eine Menge von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 10.000 Mikrogramm.
  • Die Erfindung wird im folgenden Abschnitt mit der Bezeichnung "experimentelle Einzelheiten" weiter veranschaulicht. Der Abschnitt "experimentelle Einzelheiten" und die darin enthaltenen Beispiele werden zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung angegeben. Dieser Abschnitt soll die Erfindung, so wie sie in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist, in keiner Weise begrenzen oder als eine Begrenzung davon interpretiert werden.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Borrelia burgdorferi-Bakterin
  • Erforderliche Gerätschaften:
    • Steril: 20 ml-Röhrchen, 250 ml-Flaschen und 10 l-Gefäße; 200 l-, 500 l- oder 3000 l-Fermenter; serologische Pipetten; Magnete; Misch- und Lagertanks; und Zentrifuge.
    • Nichtsteril: Magnetrührmotoren; Pipettierhilfen; Schlauchpumpen; Schläuche und Schlauchklemmen; Petroff-Hauser-Zählkammer; Dunkelfeldmikroskop; Overalls, Handschuhe, Kopfbedeckungen, Masken, Schuhüberzüge und Gesichtsmasken; Mikropipette und Mikropipettenspitzen; Kochsalzlösung-Blindproben.
    • Verwendete Mikroorganismen: Zwei Isolate von Borrelia burgdorferi wurden bei der Herstellung des Produkts verwendet, und zwar die Borrelia burgdorferi-Isolate C-1-11 und S-1-10, welche von Dr. Steven M. Callister, Gundersen Medical Foundation, La Crosse, WI, erhalten wurden. Das Bakterin enthält angepaßte Zahlen jeder Borrelia-Isolat-Kultur, um die Standardanforderungen für eine Wirksamkeit zu erfüllen.
    • Identität jedes Mikroorganismus und Häufigkeit der Identifizierungsverfahren: Die Identifizierung erfolgt auf der Grundlage von morphologischen und serologischen Eigenschaften. Die serologische Identifizierung der Hauptimpfkultur-Stammlösungen wird mit spezifischen Antiseren unter Verwendung eines indirekten Fluoreszenzantikörpertests durchgeführt.
    • Virulenz, Reinheit, Aufrechterhaltung und Auswahl der Kulturen: Die Virulenz der Kulturen ist kein notwendiges Kriterium für Antigenität. Die Reinheit des Stammes wird durch eine genaue Untersuchung des Kulturwachstums mit Hilfe eines Dunkelfeldmikroskops, einer Gramfärbung, einer serologischen Identifizierung mit spezifischem Antiserum und einem Test gemäß 9 C.F.R § 113.27 unter Verwendung von 0,5 ml- bis 1,0 ml-Proben bestimmt.
  • Die Kulturen werden in Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium aufrechterhalten, welches wie nachstehend beschrieben (vgl. Beispiel 5) hergestellt wird. Subkulturen werden in BSK-Medium angelegt, wobei die Zahl der Subkulturen auf 10 begrenzt ist.
  • Zusammensetzung von Impf- und Produktionskulturen:
  • Die Impf- und Produktionskulturen wurden in BSK-Medium angezogen. Die Impfstammkulturen wurden in BSK-Medium vermehrt und nach Zugabe von Glycerin (Endkonzentration 10-14%) eingefroren. Die eingefrorenen Stammkulturen werden bei –70°C oder kälter aufbewahrt.
  • Beschaffenheit, Größe und Form der für die Anzucht der Kulturen verwendeten Behälter:
  • Die eingefrorenen Stammkulturen werden in 20 ml-Röhrchen mit Schraubverschluß, enthaltend 10 ml Medium, vermehrt. Die 20 ml-Kulturröhrchen werden für das Beimpfen von 250 ml-Flaschen oder -Kolben, enthaltend 200 ml Medium, verwendet. Die 250 ml-Flaschen oder -Kolben werden für das Beimpfen von 10 l-Gefäßen, enthaltend 6 bis 8 Liter Medium, verwendet. Die 10 l-Gefäße können für das Beimpfen von 40 l-Gefäßen, enthaltend 25 bis 35 Liter Medium, eines 200 l-Fermenters, enthaltend 90 bis 175 Liter Medium, eines 500 l-Fermenters, enthaltend 175 bis 375 Liter Medium, oder eines 3000 l-Fermenters, enthaltend 800 bis 2500 Liter Medium, verwendet werden. Der 200 l-Fermenter kann verwendet werden, um einen 3000 l-Fermenter, enthaltend 300 bis 2300 Liter Medium, zu beimpfen.
  • Lagerungsbedingungen für Impfkulturen:
  • Die Stammkulturen werden in BSK-Medium als eingefrorene Kulturen bei –70°C oder kälter aufrechterhalten.
  • Verfahren zur Herstellung von Suspensionen für das Beimpfen oder die Impfung:
  • Vier 1 ml-Fläschchen des gewünschten B. burgdorferi-Stammes werden aufgetaut und anschließend mit jeweils 9,0 ml Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium (vgl. nachstehend) hinzugefügt. Die Impf- und Stammkulturen werden vor der Überführung in das BSK-Medium für 10 bis 96 Stunden bei 32°C ± 1 °C vermehrt, was anhand der Wachstumsrate beurteilt wird. Die Impfkulturen werden vor der Überführung in das Produktionsmedium routinemäßig mikroskopisch auf ihre Reinheit untersucht. Das Zellwachstum in den Probenröhrchen wurde mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer nach 12 Stunden und danach jede Stunde bis zur Passage gemessen. Die B. burgdorferi-Kulturen werden bei einer Konzentration von größer als oder gleich 1 × 108 Zellen/ml passagiert. Wenn die Konzentration der Zellen größer als 1 × 108 Zellen/ml wird, wird für jede Röhrchenkultur eine Gramfärbung durchgeführt, und zwei annehmbare Kulturröhrchen werden für das Beimpfen von 250 ml-Impfmaterial gepoolt. Vier 250 ml-Kolben, enthaltend 196,0 ml BSK-Medium, werden mit 4 ml des vorstehend beschriebenen Impfmaterials beimpft und dann stationär während 48 bis 60 Stunden bei 32°C inkubiert. Das Zellwachstum wird mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer nach 24 Stunden und danach alle 6 Stunden bis zur Passage bestimmt. Die Passage erfolgt bei Konzentrationen von größer als oder gleich 1 × 108 Zellen/ml. Wenn die Konzentration der Zellen diesen Wert erreicht, wird für jede Kolbenkultur eine Gramfärbung durchgeführt, und zwei annehmbare Kolben werden für das Beimpfen eines 10 l-Gefäßes gepoolt. Jedes der drei 10 l-Gefäße, enthaltend 5880 ml BSK-Medium, wird mit 120 ml der vorstehend beschriebenen Kultur beimpft. Die Kolben werden dann unter langsamen Rühren mit einem Magnetrührstäbchen bei 32°C für 36 bis 48 Stunden inkubiert. Das Zellwachstum eines Gefäßes wird mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer nach 10 Stunden und danach alle 6 Stunden bis zur Passage, die bei einer Konzentration von größer als oder gleich 1 × 108 Zellen/ml erfolgt, bestimmt. Wenn die Konzentration der Zellen in den Kulturen diesen Wert erreicht, wird für jede Gefäßkultur eine Gramfärbung durchgeführt, und ein Gefäß mit 6 1 Inhalt wird verwendet, um einen 200 l-Fermenter, enthaltend 144 l BSK-Medium, zu beimpfen. Die Fermenter werden unter langsamen Rühren (55 UpM) bei 32°C für etwa 96 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert bei 7,2 ± 0,2 kontrolliert wird. Nach 12, 24, 48 und 72 Stunden und danach alle 4 Stunden wird das Zellwachstum mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer bestimmt und anhand einer Grämfärbung überprüft. Die Kultur wird inaktiviert, wenn sie die späte logarithmische Wachstumsphase erreicht (etwa 5-7 × 108 Zellen/ml).
  • 1 zeigt eine Wachstumskurve für eine Borrelia burgdorferi-Kultur. Wie aus der Figur erkennbar ist, begann das exponentielle Wachstum der Kultur zwischen etwa 24 Stunden und etwa 48 Stunden und hielt bis etwa 96 Stunden an, als sich das Wachstum abschwächte.
  • 2 zeigt den Dextroseverbrauch und die Lactatproduktion einer Borrelia burgdorferi-Kultur. Wie aus der Figur erkennbar ist, erhöht sich die Lactatproduktion in der Kultur kontinuierlich. Dies zeigt die Wichtigkeit einer Kontrolle des pH-Wertes in der Kultur. Ferner ist anhand der Figur erkennbar, dass sich der Dextroseverbrauch mit der Zeit erhöht, was anzeigt, dass die Bakterien die Dextrose als eine Energiequelle verwenden, welche daher ergänzt werden muss, um die Lebensfähigkeit oder das Wachstum der Kultur aufrechtzuerhalten.
  • Technik zur Beimpfung von Impf- und Produktionsmedien:
  • Das Impfmedium wird durch die direkte Übertragung der eingefrorenen Stammkultur beimpft. Das Produktionsmedium wird durch die direkte Übertragung der Impfkultur beimpft. Bei der Kulturbeimpfung werden weniger als 2% Impfmaterial verwendet.
  • Zeitraum, Bedingungen und Temperaturgrad für die Inkubation:
  • Nach der Beimpfung werden die Gefäße bei 32°C ± 1 °C während 10 bis 96 Stunden inkubiert, und die Produktionsfermenter werden bei 32°C ± 1 °C während 24 bis 120 Stunden inkubiert. Gegebenenfalls wird sterile NaOH-Lösung zugegeben, um den pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 einzustellen.
  • Merkmal und Ausmaß des Wachstums:
  • Während der Inkubation werden die beimpften Produktionskulturen täglich mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Quantifizierung mikroskopisch untersucht. Am Ende des Inkubationszeitraums werden die Kulturen durch eine Gramfärbung und/oder Dunkelfelduntersuchung mikroskopisch auf eine Kontaminierung untersucht.
  • Mindest- und Höchstzeiten für die Ernte:
  • Der minimale Inkubationszeitraum bis zur Ernte beträgt 24 Stunden. Der maximale Inkubationszeitraum bis zur Ernte beträgt 120 Stunden.
  • Erntetechnik:
  • Am Ende des Inkubationszeitraums wird jede Produktionskultur durch eine Gramfärbung und/oder Dunkelfelduntersuchung mikroskopisch auf ihre Reinheit untersucht, und Proben werden entnommen, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen. Die Kulturbehälter können bei 2°C bis 7°C gelagert werden.
  • Anforderungen für ein annehmbares Erntematerial:
  • Ein annehmbares Produktionswachstum umfasst Reinkulturen von Borrelia burgdorferi, wie mittels Gramfärbung und/oder Dunkelfeldmikroskopie nachgewiesen wird, sowie eine Borrelia-Zellzahl von nicht weniger als 1 × 108 Organismen pro ml. Die Konzentration wird mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer (oder einem Äquivalent) bestimmt.
  • Entsorgung von verworfenen Materialien:
  • Alle Materialien, die nicht bei der Herstellung des Bakterins verwendet werden, müssen gemäß dem Veterinary Services Memorandum Nr. 800.56 entsorgt werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung des Produkts:
  • Inaktivierungsverfahren:
  • Das Produktionswachstum wird mit binärem Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Die Inaktivierung wird bei 32°C ± 2°C durchgeführt. Die geeignete Menge an BEI wird in Form einer 0,344 M (7,05%) Lösung zubereitet. Eine 7,05%ige BEI-Lösung wird durch Lösen von 70,48 g 2-Bromethylaminhydrobromid (Molekulargewicht 204,89) und 8,00 g NaOH (MW 40.00) in 1 Liter deionisiertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und dann in 30 ml pro Liter unter ständigem Rühren (langsamem Rühren) zu der Kultur zugegeben. Die Inaktivierung wird für einen Zeitraum von nicht weniger als 24 Stunden bei einem pH-Wert von 7,3 ± 0,2 unter Rühren (langsamen Rühren) durchgeführt. Nach Beendigung der Inaktivierung wird das BEI durch die Zugabe von sterilem Natriumthiosulfat neutralisiert. Die geeignete Menge der sterilen Natriumthiosulfatlösung wird in Form einer 3,015 M (47,7%) Lösung zubereitet, indem 477,0 g Natriumthiosulfat in 1 Liter deionisiertem Wasser gelöst werden. Diese Lösung wird vor der Verwendung durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert und in 10,6 ml pro Liter unter ständigem Rühren (langsamem Rühren) zu der inaktivierten Kultur zugegeben. Die Neutralisierungsreaktion läßt man für einen Zeitraum von nicht weniger als 6 Stunden bei 32°C unter ständigem Rühren (langsamem Rühren) bei einem pH-Wert von 7,3 ± 0,2 voranschreiten. Gentamicinsulfat und Nystatin werden in Endkonzentrationen von 30,0 Mikrogramm/ml bzw. 30,0 Einheiten/ml zu der Kultur zugegeben. Die Produktionsorganismen werden dann zur weiteren Verarbeitung in sterilen Vorratsbehältern vereinigt.
  • Inaktivierungstest:
  • Ein Inaktivierungstest der Hauptmasse wird gemäß 9 C.F.R §113.100 durchgeführt. Der inaktivierten Kultur wird eine Probe entnommen, und ein Röhrchen, enthaltend 29 ml BSK-Medium, wird mit 1,0 ml der Probe beimpft. Zur gleichen Zeit wird eine Probe desselben Organismus in einer Konzentration von 10 Zellen/ml, wobei die Zellen bekanntermaßen lebensfähig sind, als eine positive Wachstumskontrolle unter Verwendung einer Blindprobe von 29,0 ml BSK-Medium in frischem BSK-Medium auf 1:30 verdünnt und unter Verwendung von Blindproben von 9,0 ml BSK-Medium auf 10–1 bis 10–4 verdünnt. Die Röhrchen werden für 14 Tage bei 32°C ± 2°C inkubiert und dann auf ein Wachstum untersucht. Ein zufriedenstellender Test zeigt sich darin, dass es kein Anzeichen für ein Wachstum von Borrelia in dem Röhrchen gibt, das die inaktivierte Probe enthält. Die mit dem lebenden Organismus beimpften Röhrchen müssen einen ID50-Wert zwischen ≤ 100 und ≥ 1, berechnet nach der Reed-Muench-Methode, aufweisen.
  • Zusammensetzung, Anteile, Konservierungsmittel und Adjuvanzien:
    • 1. Aluminiumhydroxid-Adjuvans; Aluminiumhydroxid [Al(OH)3] Rehydragel® HPA, bezogen von Reheis Chemical Company (Berkeley Heights, New Jersey), wird in einer Endkonzentration von nicht weniger als 1,5 mg (0,15%) Aluminiumoxid (Al2O3) je Dosis zu der Bakteriensuspension zugegeben.
    • 2. Kochsalzlösung: Sterile physiologische Kochsalzlösung (0,85% NaCl – pH 7,2 ± 0,2) kann als ein Verdünnungsmittel zugegeben werden.
    • 3. Konservierungsmittel: Gentamicinsulfat und Nystatin werden in einer Endkonzentration von nicht mehr als 30,0 Mikrogramm/ml bzw. 30,0 Einheiten/ml zu dem Produkt zugegeben.
    • 4. pH: Der pH-Wert des fertigen Produkts wird mit sterilem NaOH oder HCl auf 7,3 ± 0,1 eingestellt.
  • Verfahren und Ausmaß der Konzentration:
  • Das Borrelia-Erntematerial wird durch Zentrifugation und Resuspension in steriler Kochsalzlösung, enthaltend Gentamicinsulfat und Nystatin in Endkonzentrationen von 30,0 Mikrogramm/ml bzw. 30,0 Einheiten/ml, konzentriert. Das Borrelia-Erntematerial kann bis auf ein 1/20 des ursprünglichen Volumens eingeengt werden.
  • Verfahren zur Standardisierung des Antigens:
  • Das Bakterin wird mit Hilfe der Petroff-Hauser-Zellzahl, die nach der Konzentration und Resuspension des Pelletmaterials bestimmt wurde, zusammengestellt. Die Borrelia-Konzentration in jeder Kultur wird wie vorstehend beschrieben bestimmt. Eine Mischung von Kulturen mit hohen und niedrigen Konzentrationen kann bei der Einstellung der Gesamtkonzentrationen verwendet werden.
  • Zusammenstellung einer Serie:
    • 1. Zusammenstellung von Einheiten zur Herstellung einer Serie: Lagerbehälter mit einem ausreichenden Volumen von einzelnen Pools eines jeden Borrelia-Isolat werden aus der 4°C bis 7°C kalten Kühlvorrichtung entnommen. Falls erforderlich, wird sterile physiologische Kochsalzlösung (0,85% NaCl) als ein Verdünnungsmittel zugegeben. Das Verdünnungsmittel wird bei 121 °C ± 2°C 30 Minuten autoklaviert oder, falls eine Probe in der Flüssigkeit einen Wert von ≥ 119°C mißt, nicht weniger als 20 Minuten autoklaviert.
    • 2. Beispiel für eine Serienzusammenstellung
      Figure 00250001
      Der pH-Wert wird mit sterilem NaOH oder HCl auf 7,3 ± 0,1 eingestellt. Die durchschnittliche Seriengröße beträgt 300 Liter. Die maximale Seriengröße beträgt 900 Liter. Die inaktivierten Borrelia-Suspensionen werden für die Zusammenstellung in einem sterilen Edelstahltank vereinigt. Nach dem Mischen kann die gesamte Serie in einem sterilen Edelstahlsammeltank gelagert oder auf kleinere Behälter aufgeteilt und bis zum Abfüllen bei 2°C bis 7°C gelagert werden, oder das Produkt kann unmittelbar in Fläschchen abgefüllt und bei 2°C bis 7°C gelagert werden.
    • 3. Füllvolumen und Art des verwendeten Fläschchens: Das Bakterin wird in 1,20 ml ± 0,05 ml je Dosis-Fläschchen in Fläschchen abgefüllt. Die verwendeten Fläschchen sind 2 ml-Glasfläschchen.
  • Verfahren und Technik für das Befüllen und Versiegeln des fertigen Behälters
  • Sterile Fläschchen werden durch mechanische oder manuelle Sterilabfüllung der Charge unter ständigem Rühren befüllt. Die befüllten Fläschchen werden mechanisch oder manuell mit sterilen Stopfen bedeckt und mit Aluminiumverschlüssen versiegelt.
  • Menge des antigenen Materials je Dosis in dem fertigen Behälter
  • Jede Dosis enthält nicht weniger als die folgenden Organismen:
    B. burgdorferi-Isolat C-1-11 – 5 × 108 Organismen/ml.
    B. burgdorferi-Isolat S-1-10 – 5 × 108 Organismen/ml.
  • Beispiel 3
  • Testen des Bakterins
  • Reinheit:
  • Jede Serie oder Subserie wird gemäß 9 C.F.R. § 113.26 auf Bakterien und Pilze untersucht.
  • Sicherheit:
  • Der Sicherheitstest wird mit der Hauptmasse oder den fertigen Behältern gemäß 9 C.F.R. §§ 113.38 und 113.40 durchgeführt, wobei ein Sicherheitstest mit Hunden unter Verwendung einer 2-fachen Dosis (2 cm3), verabreicht durch IM-Injektion, durchgeführt wird.
  • Wirksamkeit:
  • Der Wirksamkeitstest wird mit der zusammengestellten Hauptmasse oder den fertigen Behältern durchgeführt. Der Wirksamkeitstest wird unter Verwendung eines Antigen-Abfang-ELISA durchgeführt. Zufriedenstellende Serien müssen eine relative Wirksamkeit von ≥ 1,0, bestimmt durch das U.S. Department of Agriculture, Veterinary Biologics Program's Relative Potency Calculations Software, Version 3.0, aufweisen.
  • Beispiel 4
  • Schritte nach der Vorbereitung
  • Form und Größe der fertigen Behälter, worin das Produkt vertrieben wird:
  • Das Bakterin wird in einem 2,0 ml-Fläschchen, entsprechend einer Dosis (eine Dosis – 1,0 ml), vertrieben. Die Kennzeichnung des fertigen Behälters muß vollständig sein.
  • Gewinnung, Lagerung und Submission von repräsentativen Proben:
  • Repräsentative Proben jeder Serie oder Subserie müssen für die APHISUSDA gemäß 9 C.F.R § 113.3 durch einen autorisierten Stichprobenprüfer der Firma gewonnen werden.
  • Verfallsdatum des Produkts:
  • Das für das Produkt festgesetzte Verfallsdatum muß einen Zeitraum von 24 Monaten beginnend nach dem zufriedenstellenden Wirksamkeitstest gemäß 9 C.F.R § 114.13 umfassen. Die Datierung wird gemäß 9 C.F.R § 114.13 bestätigt.
  • Verwendung, Dosierung und Verabreichungsweg für jede Tierspezies:
  • Das Bakterin wird für die Impfung von gesunden Hunden gegen eine durch B. burgdorferi verursachte Krankheit empfohlen. Die Dosis beträgt jeweils 1,0 ml (1,0 cm3). Gesunde Hunde werden in einem Alter von 12 Wochen oder älter mit zwei Dosen in einem Abstand von zwei bis drei Wochen geimpft. Welpen, die jünger als 6 Wochen sind, sollten alle 2 bis 3 Wochen erneut geimpft werden, bis sie mindestens 12 Wochen alt sind. Eine jährliche Wiederholungsimpfung mit einer Dosis wird empfohlen. Der Verabreichungsweg ist durch intramuskuläre Injektion.
  • Beispiel 5
  • Herstellung des Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Mediums
  • Zusammensetzung:
  • Das Medium wird für die Vermehrung von Borrelia-Kulturen zur Verwendung in Bakterinen verwendet. Alle Glaswaren werden nach der Reinigung mit einem Spülmittel mit deionisiertem Wasser gründlich gespült und anschließend autoklaviert.
  • Alle Bestandteile werden in der angegebenen Reihenfolge unter ständigem, langsamen Rühren allmählich zugegeben. Das Basalmedium wird wie folgt hergestellt:
    Bestandteile: Menge
    1) Deionisiertes Wasser 500,00 ml
    2) HEPES 4,60 g
    3) Neopepton 3,83 g
    4) Natriumcitrat 0,54 g
    5) Glucose 3,83 g
    6) Natriumbicarbonat 1,69 g
    7) TC-Yeastolat 1,92 g
    8) Brenztraubensäure, Natriumsalz 0,61 g
    9) N-Acetylglucosamin 0,31 g
  • Die Lösung wird langsam gerührt, um alle Komponenten aufzulösen. Anschließend werden 76,70 ml 10× CMRL-1066 ohne Glutamin unter ständigem, langsamen Rühren zu dem Gemisch zugegeben.
  • Komplettmedium-Zusammenstellung:
  • Für 10,0 ml-Röhrchen- oder 200,0 ml-Flaschenkulturen werden die folgenden Bestandteile unter ständigem Rühren langsam zu dem Basalmedium zugegeben:
    Bestandteile: Menge/Liter
    1) Steriles, hitzeinaktiviertes Kaninchenserum 49,00 ml
    (Das sterile Kaninchenserum wird für 30 Minuten bei 58,5 °C ± 0,5°C erhitzt)
    2) Rinderserumalbumin 38,34 g
    3) pH-Einstellung auf 7,3 ± 0,1 mit 2 N NaOH
  • Eine ausreichende Menge (QS) an deionisiertem Wasser mit Raumtemperatur wird auf 800 ml zugegeben. Das Gemisch wird unter Verwendung eines 0,2 μm-Filters, der wenig Protein bindet, sterilisiert.
    4) Sterile Gelatine 200,00 ml
  • Die sterile Gelatine wird durch Zugabe von 10,74 g Gelatine zu 200,0 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Die Suspension wird für 30 Minuten bei 121 °C ± 2°C autoklaviert oder, falls eine Probe in der Flüssigkeit einen Wert von ≥ 119°C mißt, für nicht weniger als 20 Minuten autoklaviert. Die Lösung wird vor der Zugabe zu dem Basalmedium auf mindestens 45°C ± 2°C abgekühlt.
  • Für 10 l-Gefäßkulturen, 100 l-Fermentationen oder andere werden die folgenden Bestandteile unter ständigem Rühren langsam zu dem Basalmedium zugegeben:
    Bestandteile: Menge/Liter
    1) Steriles, hitzeinaktiviertes Kaninchenserum 49,00 ml
    (Das sterile Kaninchenserum wird für 30 Minuten bei 58,5 °C ± 0,5°C erhitzt)
    2) Rinderserumalbumin 38,34 g
  • Der pH-Wert wird mit 2 N NaOH auf 7,3 ± 0,1 eingestellt. Deionisiertes Wasser wird QS auf 1 Liter zugegeben. Das Gemisch wird unter Verwendung eines 0,2 μm-Filters, der wenig Protein bindet, sterilisiert.
  • Bestandteilinformation:
    • 1. Rinderserumalbumin (BSA): Das BSA-Pulver wird von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Das in der Produktion verwendete BSA-Pulver kann gemäß 9 C.F.R §§ 113.50 und 113.53 getestet und zur Verwendung zugelassen werden. Anstelle eines solchen Tests kann das BSA-Pulver mit Gammastrahlen bei nicht weniger als 2,7 Megarad bestrahlt werden.
    • 2. Kaninchenserum: Das Kaninchenserum wird von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Das in der Produktion verwendete Kaninchenserum kann gemäß 9 C.F.R §§ 113.50 und 113.53 getestet und zur Verwendung zugelassen werden. Anstelle eines solchen Tests gemäß 9 C.F.R §§ 113.50 und 113.53 kann das Kaninchenserum mit Gammastrahlen bei nicht weniger als 2,7 Megarad bestrahlt werden.
  • Alle chemische Komponenten sind von USP- oder äquivalenter Qualität.
  • Test:
  • Das Medium wird als steril angesehen und nicht getestet.
  • Lagerung und Verwendung:
  • Das sterile Medium wird bis zur Verwendung bei 4°C bis 30°C gelagert. Das Medium kann unmittelbar nach der Herstellung oder für einen Zeitraum von nicht mehr als 6 Monate verwendet werden. Das Medium wird für die Vermehrung von Borrelia-Kulturen zur Verwendung bei der Bakterin-Herstellung verwendet.
  • Beispiel 6
  • Hamsterimpfung- Serologie- und Challengestudie
  • Hamster, die mit dem Borrelia burgdorferi-Bakterin, welches mit binärem Ethylenimin (BEI), Hitze oder Formalin inaktiviert wurde, geimpft worden waren, wurden zwei oder drei Wochen, wie angegeben, nach der einen Impfung zur Ader gelassen und herausgefordert. Die Impflinge wurden mit einem Gemisch von drei Borrelia burgdorferi-Isolaten herausgefordert. Ungeimpfte wurden als Kontrollen verwendet, welche nicht mit dem Borrelia burgdorferi-Bakterin geimpft, aber mit dem einzelnen Isolat, angegeben durch die Isolat-Bezeichnung, oder mit einem Gemisch von drei Isolaten, angegeben als Tri, herausgefordert wurden. Tabelle 1 Challenge zwei Wochen nach der Impfung
    Figure 00310001
    Challenge drei Wochen nach der Impfung
    Figure 00310002
    • BA
    = Borrelia-Antikörper-Test
  • Die in Tabelle 1 vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied (P = 0,05) bezüglich der serologischen Antwort im Hinblick auf das Inaktivierungsverfahren für die B. burgdorferi-Zellen bei entweder 2 oder 3 Wochen nach der Impfung gibt. Für die serologischen Antworten wurde 2 oder 3 Wochen nach der Impfung eine leichte Abnahme bzw. Erhöhung beobachtet, jedoch verringerte sich der Schutz (im Hinblick auf die Isolate C-1-11 und S-1-10) für jede Impfgruppe drei Wochen nach der Impfung. Das P/Bi-Isolat ist nicht virulent, und es wurde gezeigt, dass es Gewebe von Impflingen oder Kontrollen infiziert.
  • Beispiel 7
  • ELISA-Studien zu ungeimpften und intramuskulär geimpften Hunden
  • Das Bakterin wurde auf seine Fähigkeit untersucht, eine Immunantwort in Hunden zu stimulieren. Die Hunde wurden entweder mit dem hierin bereitgestellten Bakterin (V) geimpft oder wurden nicht geimpft (NV), und deren Antikörpertiter gegen die Beschichtungsantigene S-1-10 und C-1-11 wurden drei Wochen nach der ersten Impfung und zwei Wochen nach einer folgenden zweiten Impfung, wie angegeben, durch einen ELISA bestimmt.
  • Tabelle 2
    Figure 00320001
  • Die Daten zeigen, dass die Impfung mit dem Bakterin dieser Erfindung die Produktion von Antikörpern gegen sowohl das Wisconsin-Isolat S-1-10 als auch das Chicago-Isolat C-1-11 von B. burgdorferi zur Folge hat. Geimpfte Hunde wiesen einen höheren Serumantikörpertiter gegen die Beschichtungsantigene S-1-10 und C-1-11 als Ungeimpfte auf. Die Werte für die Antikörperproduktion erhöhten sich nach der Verabreichung einer zweiten Dosis des Bakterins an die Hunde.
  • Diese Ergebnisse zeigen daher, dass das Bakterin dieser Erfindung in Tieren die Produktion von Anti-Borrelia-Antikörpern, die gegen eine nachfolgende Exposition durch die Bakterien nützlich sind, stimulieren kann.
  • Beispiel 8
  • Borrelia-Antikörper-Test unter Verwendung von Hundeserum
  • Hunde wurden mit dem Borrelia burgdorferi-Bakterin geimpft. Das Serum dieser Hunde wurde isoliert und mit einer Kultur des vermehrten B. burgdorferi-Isolats S-1-10 gemischt. Die prozentuale Abtötung der Borrelia-Bakterien in Kulturen, die in Anwesenheit und in Abwesenheit dieses Hunde-Immunserums vermehrt wurden, ist in Tabelle 4 (vgl. nachstehend) angegeben. Tabelle 3 Borrelia-Antikörper-Test – Hundeserum
    Figure 00330001
    • Ungeimpft: Serum von ungeimpften Hunden; IM-Impfung: intramuskulär geimpfte Hunde; subk. geimpft: subkutan geimpfte Hunde; vor Impfung: Serum von Hunden vor der Impfung.
  • Wie aus Tabelle 3 erkennbar ist, war das Serum, das aus Hunden vor der Impfung mit dem Bakterin (vor Impfung) und aus nicht geimpften Tieren (nicht geimpft) isoliert wurde, nicht in der Lage, einen Zelltod in einer wachsenden Borrelia-Kultur zu initiieren. Im Gegensatz dazu war das Immunserum von Hunden befähigt, einen Zelltod zu initiieren. Serum, das aus Hunden isoliert wurde, die mit dem Bakterin intramuskulär geimpft wurden (IM-Impfung), war in der Lage, einen ähnlichen prozentualen Zelltod hervorzurufen wie das Serum, das aus subkutan geimpften (subk. geimpft) Hunden isoliert wurde. Serum, das aus Hunden isoliert wurde, denen eine zweite Dosis des Bakterins verabreicht wurde, rief eine höhere Zelltodrate hervor als das Serum von Hunden, die nur einmal geimpft wurden.
  • Beispiel 9
  • Borrelia burgdorferi-Isolat 297
  • Das Serum von Hunden vor und nach der Impfung mit dem Borrelia burgdorferi-Isolat N-40 wurde durch den Borrelia-Antikörper-Test auf einen Borrelia-Antikörper gegen Zellen des Isolats 297 getestet. Tabelle 4 Serumverdünnung
    Figure 00340001
    • NC:
    Nicht gezählt.
  • Die in Tabelle 4 vorgestellten Daten zeigen, dass Hunde, die mit dem B. burgdorferi-Isolat N-40 geimpft wurden, einen Borrelia-Antikörper gegen ein anderes Isolat (d.h. 297), aber aus derselben seroprotektiven Gruppe wie N-40, produzieren, welcher in ungeimpften, B. burgdorferi-freien Hunden nicht vorhanden ist.
  • Borrelia burgdorferi-Isolat N-40
  • Das Serum von Hunden vor und nach der Impfung mit dem Borrelia burgdorferi-Isolat N-40 wurde durch den Borrelia-Antikörper-Test auf einen Borrelia-Antikörper gegen Zellen des Isolats N-40 getestet.
  • Tabelle 5 Serumverdünnung
    Figure 00350001
  • Die in Tabelle 5 vorgestellten Daten zeigen, dass Hunde, die mit dem B. burgdorferi-Isolat N-40 geimpft wurden, einen Borrelia-Antikörper gegen das geimpfte Isolat produzieren, welcher in ungeimpften, B. burgdorferi-freien Hunden nicht vorhanden ist.
  • Beispiel 10
  • In-vitro-Kreuzprotektionsstudien
  • Tabelle 7 (vgl. nachstehend) zeigt die natürlichen Wirte der verschiedenen Borrelia burgdorferi-Isolate, welche in den in-vitro-Kreuzprotektionsstudien verwendet werden, die Quelle der Isolate in den Wirtstieren und die geographischen Regionen, in denen die Stämme isoliert wurden. Tabelle 7 Borrelia burgdoreri-Isolate
    Figure 00360001
    • CSF:
    Liquor cerebrospinalis
  • Hamster wurden mit einer lebenden Form eines der in der ersten senkrechten Spalte von Tabelle 8 angegebenen Isolate geimpft. Das Antiserum dieser Hamster wurde isoliert und zu Kulturen der B. burgdorferi-Isolate, die in der waagrechten Zeile von Tabelle 8 angegeben sind, zugegeben. Das Ausmaß, in dem der Antikörper die Bakterien in der Kultur erkennt, und daher der Umfang, in dem ein Zelltod hervorgerufen wird, wurde wie folgt gemessen. Das Serum von Hamstern, die mit einzelnen lebenden Borrelia burgdorferi-Isolaten infiziert wurden, wurde isoliert, in BSK-Medium verdünnt und hitzeinaktiviert, und 100 μl davon wurden zu jedem Reaktionsröhrchen zugegeben. 10 μl Komplement wurden ebenfalls zugegeben. Die Kulturdichte wurde dann auf eine Konzentration von 105 Zellen/ml eingestellt, und anschließend wurden 100 μl der Kultur zu jedem Reaktionsröhrchen zugegeben. Die erhaltenen Antikörper/B. burgdorferi-Reaktionsröhrchen wurden bei 32°C für 2 Stunden inkubiert, und anschließend wurden 800 μl frisches BSK-Medium zugegeben. Die Reaktionsröhrchen wurden dann bei 32°C für 4 Tage inkubiert. Im Anschluß daran wurde die Lebensfähigkeit als Prozentsatz der intakten Zellen, bestimmt mit Hilfe eines Coulter-Zählgerätes, abgeschätzt. Die Ergebnisse der in-vitro-Kreuzprotektionsstudien sind nachstehend in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 In-vitro-Kreuzprotektionsstudien
    Figure 00370001
    • BSK. Barbour-Stoenner-Kelly-Medium; NHS: normales Hamsterserum, d.h. Serum, das keine Anti-Borrelia-Antikörper enthält.
  • Die Lebensfähigkeitswerte in Tabelle 8 sind als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit in einer Kultur im Vergleich zu einer Lebensfähigkeit von 100% der "BSK"-Kontrollen angegeben. BSK-Kontrollkulturen sind Kulturen, welche mit Barbour-Stoenner-Kelly-Medium anstelle des Antiserums von Hamstern, die mit einem B. burgdorferi-Isolat geimpft wurden, in Kontakt gebracht werden. Daher sollten diese Kulturen keinen Zelltod infolge von Antikörperreaktionen erleiden. Demgemäß wird der Lebensfähigkeit dieser Kulturen ein Wert von 100% im Vergleich zu Kulturen, zu welchen Antiserum zugegeben worden ist, zugeordnet. Eine geringe Lebensfähigkeit einer Kultur im Vergleich zu den Kontrollwerten zeigt, dass ein Zelltod in der Kultur hervorgerufen wurde, der auf Antikörperreaktionen mit Zelloberflächendeterminanten zurückzuführen ist.
  • Die Daten in Tabelle 8 zeigen, dass Kulturen eines Isolats, die mit dem Antiserum eines Hamsters, welcher mit diesem Isolat geimpft wurde, in Kontakt gebracht wurden, eine geringe Lebensfähigkeit zeigen; d.h. die Antikörper, welche gegen das eingeimpfte Isolat gebildet werden, erkennen das Isolat in der Kultur und bewirken zusammen mit dem Komplement den Zelltod. Zum Beispiel zeigte eine Kultur von B. burgdorferi 297, die mit BSK-Medium oder NHS, d.h. einem Serum, das keine Anti-Borrelia-Antikörper enthält, in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit von 100%. Jedoch zeigte eine 297-Kultur, welche mit dem Antiserum eines Hamsters, der mit 297 geimpft worden war, in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit von 0,6%. Ferner zeigte eine Kultur des Chicago-Isolats von B. burgdorferi, die mit NHS in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit von 111 %, während eine Kultur des Chicago-Isolats, die mit Anti-Chicago-Antiserum in Kontakt gebracht wurde, eine Lebensfähigkeit von 0,8%.
  • Die Daten in Tabelle 8 zeigen auch, dass Antiserum von Hamstern, welche mit einem Isolat geimpft wurden, den Zelltod in Kulturen von einigen der anderen Isolate induzierte. Wie vorstehend besprochen, wird der Lebensfähigkeit von Kulturen, die mit BSK-Medium in Kontakt gebracht werden, ein Wert von 100% zugeordnet. Die Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit von Kulturen, die mit normalem Hamsterserum (NHS) in Kontakt gebracht werden, wie erwartet ebenfalls etwa 100% beträgt. Jedoch zeigten alle Kulturen der ersten sechs aufgeführten B. burgdorferi-Isolate, d.h. 297, B31, S-1-10, 35211, MMTI und IPT, wenn sie mit Antiserum von Hamstern, die mit irgendeinem dieser sechs Isolate geimpft wurden, in Kontakt ge bracht wurden, Lebensfähigkeitswerte, welche wesentlich niedriger waren als die Kontrollen. Die Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit der Kultur gering war, wenn ein Antiserum gegen ein Isolat zu Kulturen desselben Isolats zugegeben wurde. Die Lebensfähigkeit der Kultur war gering, wenn die Kulturen mit Antiseren, die gegen andere Isolate gerichtet sind, in Kontakt gebracht wurden. Zum Beispiel wurde Anti-297-Antiserum zu Kulturen von 297, B31, S-1-10, 35211, MMTI und IPT zugegeben. Die Lebensfähigkeit der Kultur betrug 0,6%, 0,9%, 1,0%, 1,0%, 2,5% bzw. 0,3%, was zeigt, dass die Antikörper die Determinanten auf diesen Isolaten erkannt haben und damit reagierten.
  • Die Daten in Tabelle 8 zeigen daher, dass die Isolate 297, B31, S-1-10, 35211, MMTI und IPT kreuzprotektiv sind. Das heißt, wie vorstehend besprochen, dass Antikörper gegen ein Isolat die Oberflächendeterminanten auf anderen Isolaten erkennen und damit reagieren. Diese Isolate sind daher Mitglieder derselben seroprotektiven Gruppe. Diese Gruppe ist als die seroprotektive Gruppe A von Borrelia burgdorferi-Isolaten bekannt.
  • Das Antiserum von Hamstern, die mit dem Chicago-, PBi- und G25-Isolat geimpft wurden, induzierte in Kulturen dieser Isolate keinen Zelltod, und gehören daher einer oder mehreren anderen seroprotektiven Gruppen an. Das Anti-Chicago-Antiserum induzierte keine wesentliche Zelltodrate in Kulturen von irgendeinem der anderen getesteten Isolate. Demgemäß ist der Chicago-Stamm (auch bezeichnet als C-1-11) der einzige getestete Stamm, welcher der seroprotektiven Gruppe B angehört.
  • Das Anti-PBi-Antiserum induzierte einen Zelltod in Kulturen von PBi als auch G25, wie auch das Anti-G25-Antiserum. Daher sind PBi und G25 kreuzprotektive Isolate, welche in dieselbe seroprotektive Gruppe, die "europäischen Gruppe" von Borrelia burgdorferi-Isolaten, eingruppiert werden.
  • Folglich zeigen die in Tabelle 8 vorgestellten Ergebnisse der Kreuzprotektionsstudien, dass Borrelia burgdorferi-Isolate in mindestens drei verschiedene seroprotektive Gruppen eingeteilt werden können.
  • Beispiel 11
  • Hamsterimpfung- Serologie- und Challenge-Studie
  • Hamster wurden mit lebenden Borrelia burgdorferi-Bakterien des Isolats 297 geimpft. Das Serum von diesen Hamstern oder von normalen Hamstern, d.h. ungeimpften Hamstern, oder normales Hamsterserum (NHS), wurde dann an andere Hamster verabreicht. Diese Hamster wurden dann mit entweder dem Stamm 297 oder 35211 (Swiss) herausgefordert, wie in 3 gezeigt ist. Das Antiserum wurde an aufeinander folgenden Tagen nach der Infektion, wie angegeben, auf seine Fähigkeit untersucht, eine passive Immunität auf Empfängerhamster gegen eine B. burgdorferi-Infektion zu übertragen.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Serologie- und Challenge-Studie. Der Schutz gegen eine B. burgdorferi-Infektion wurde anhand der Plethysmograph-Werte von herausgeforderten Tieren im Vergleich zu den Basislinienwerten für die Kontrolle, d.h. ungeimpften Tieren, beurteilt. Der Plethysmograph mißt die Menge an Quecksilber, welche durch die Pfoten eines Hamsters verdrängt wird. Wie vorstehend besprochen, ist eines der Symptome, welche die Folge einer B. burgdorferi-Infektion sind, eine Arthritis und eine Schwellung. Demgemäß sollten Borrelia-infizierte Hamster geschwollene Pfoten haben, welche größere Mengen an Quecksilber verdrängen als die Pfoten von normalen Hamstern. Hamster, die vor einer B. burgdorferi-Infektion geschützt sind, sollten keine geschwollene Pfoten haben. Daher zeigt eine Zunahme der Größe der Pfoten eines infizierten Hamsters, d.h. eine Zunahme der verdrängten Menge an Quecksilber, dass der Hamster durch das verabreichte Antiserum nicht vor einer Herausforderung mit B. burgdorferi geschützt war.
  • Die in 3 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass normales Hamsterserum (NHS) wie erwartet Hamster nicht vor einer Infektion durch das B. burgdorferi-Isolat 297 schützt (der Plethysmograph-Wert des NHS-geimpften/297-herausgeforderten Hamsters erhöhte sich acht Tage nach der Herausforderung auf einen Höchstwert von etwa 1,0 mm Hg im Vergleich zu dem Basislinienwert von etwa 0,35). Normales Hamsterserum schützte Hamster auch nicht vor einer Infektion durch das B. burgdorferi-Isolat 35211 (der Plethysmograph-Wert des NHS-geimpften/35211- herausgeforderten Hamsters erhöhte sich neun Tage nach der Herausforderung auf einen Höchstwert von etwa 0,85 mm Hg im Vergleich zu dem Basislinienwert).
  • Im Gegensatz dazu zeigt 3, dass das Anti-297-Antiserum die Hamster gegen eine folgende Herausforderung mit dem Isolat 35211 schützte. Die Plethysmograph-Werte des 297-geimpften/35211- herausgeforderten Hamsters waren 2 bis 14 Tage nach der Herausforderung mit dem Basislinienwert in etwa vergleichbar. Diese Ergebnisse bestätigen die In-vitro-Studien, welche zeigten, dass Borrelia burgdorferi-Isolate kreuzprotektiv sein können, d.h., dass die Antikörper gegen ein Isolat eine passive Immunität gegen ein anderes Isolat übertragen können. Die Ergebnisse zeigen, dass die Isolate 297 und 35211 kreuzprotektiv sind und daher derselben seroprotektiven Gruppe angehören.
  • Beispiel 12
  • Zusammenfassung der Borrelia burgdorferi-Isolate
  • 43 Einzelisolate von Borrelia burgdorferi aus den Vereinigten Staaten und Europa wurden untersucht. Exponentiell wachsende Kulturen der einzelnen Isolate wurden mit dem Antiserum gegen das Borrelia burgdorferi-Isolat 297 aus der seroprotektiven Gruppe A, das Isolat PBi aus der seroprotektiven Gruppe C und das Isolat C-1-11 aus der seroprotektiven Gruppe C inkubiert. Tabelle 9
    Figure 00410001
    • S: Empfindlich gegen eine Abtötung; R: Resistent gegen eine Abtötung; P: Teilweise Abtötung.
  • Eine Empfindlichkeit (S) gegen eine Abtötung, die durch das Anti-297-Antiserum, aber nicht durch das Anti-PBi- oder Anti-Chicago-Antiserum hervorgerufen wurde, zeigt, dass ein Borrelia burgdorferi-Isolat derselben seroprotektiven Gruppe, d.h. der seroprotektiven Gruppe A, wie das Isolat 297 angehört. Eine Resistenz (R) gegen eine Abtötung, welche durch das Anti-297-Antiserum induziert wird, zeigt, dass ein Isolat in eine andere seroprotektive Gruppe eingruppiert werden sollte. Tabelle 9 zeigt, dass 15 der 16 Isolate, welche in die seroprotektive Gruppe A eingruppiert werden, in den Vereinigten Staaten isoliert wurden. Tabelle 9 zeigt auch, dass 13 der 13 Isolate, welche lediglich gegen eine Abtötung durch das Anti-PBi-Antiserum empfindlich sind und daher der seroprotektiven Gruppe C angehören, in Europa isoliert wurden. Tabelle 9 zeigt ferner, dass 6 der 43 Isolate gegen eine Abtötung durch das Anti-297-, Anti-PBi- und Anti-Chicago-Antiserum resistent waren, d.h., dass die Antikörper nicht die durch diese Stämme exprimierten Zelloberflächendeterminanten erkannten. Demgemäß waren diese 6 Isolate nicht mit irgendeinem der anderen getesteten Isolate kreuzprotektiv. Die Daten zeigen daher, dass es mindestens eine weitere seroprotektive Gruppe von B. burgdorferi-Isolaten neben den seroprotektiven Gruppen A, B oder C gibt.
  • Beispiel 13
  • Natürliche Herausforderung durch Zecken unter Verwendung einer bivalenten Impfstoffzusammensetzung
  • Einführung
  • Die Lyme-Krankheit, welche durch den Spirochäten Borrelia burgdorferi (Bb) verursacht und durch Ixodes-Zecken übertragen wird, ist eine multisystemische Erkrankung, welche die Haut, das Nervensystem, das Herz und die Gelenke von ungeschützten Menschen und Hunden befallen kann. (Anderson J.F. et al., J. Clin. Microbiol. 26 (1988), 2209-2212; Appel et al., J. Inf. Dis. 167 (1993), 651-664; Lane R.S. et al., J. Clin. Microbiol. 27 (1989), 2344-2349; LeFebvre R.B. et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990), 700-707; Levy S.A. et al., Canine Practice 17 (1992), 5-14; Nelson J.A. et al., J. Clin. Microbiol. 29 (1991), 1732-1734; Piesman J. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 42 (1990), 352-357; Steere A.C. et al., N. Engl. J. Med. 308 (1983), 733-740; Steere A.C. et al., Ann. Intern. Med. 86 (1977), 685-698). Obwohl eine Antibiotika-Therapie erfolgreich sein kann, muss sie in einem frühen Stadium der Krankheit verabreicht werden. Antibiotika, die in späteren Stadien der Krankheit verabreicht werden, können im Hinblick auf eine vollständige Eliminierung des Organismus aus dem Wirt unwirksam sein. Hamster oder Mäuse, die mit experimentellen Bakterinen, enthaltend inaktivierte ganze Zellen oder Untereinheiten-Antigene, geimpft werden, entwickeln eine Immunantwort, die gegen entweder künstliche oder natürliche Infektionswege schützt (Fikrig E. et al., Science 250 (1990), 553-556; Fikrig E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5418-5421; Johnson R.C. et al., Immun. 54 (1986), 897-898; Johnson R.C. et al., Zbl. Bakt. Hyg. A. 263 (1986), 45-48; Kochi S.K. et al., Infect. and Immun. 56 (1988), 314-321; Schmitz J.L. et al., Infect. and Immun. 59 (1991), 3815-3818). Vor kurzem ist gezeigt worden, dass ein kommerziell erhältlicher Impfstoff gegen eine Exposition im Labor und im Feld wirksam ist (Hsien-Jue C., Chavez L.G. Jr., Blumer B.M., Sebring R.W., Wasmoen T.L. und Acree W.M., JAVMA 201 (1992), 403-411). Obwohl Impfstoffe einen Schutz vorsehen, ist es wichtig, dass vor einer Infektion eine Immunität (ein Borrelia-Antikörper) vorhanden ist, da infizierte Tiere ungeachtet des Vorhandenseins eines zirkulierenden Borrelia-Antikörpers infiziert bleiben können (Callister S.M. et al., J. Clin. Microbiol. 29 (1991), 1773-1776; Johnson R.C. et al., Immun. 54 (1986), 897-898; Johnson R.C. et al., Zbl. Bakt. Hyg. A. 263 (1986), 45-48; Kochi S.K. et al., Infect. and Immun. 56 (1988), 314-321; Schmitz J.L. et al., Infect. and Immun. 59 (1991), 3815-3818).
  • In Tabelle 10 sind verschiedene seroprotektive Gruppen von Bb aufgeführt, welche durch Studien zu einem passiven Schutz in Hamstern und einen in-vitro-Test (Borrelia-Antikörper-Test), welcher basierend auf einer Antikörperantwort nach einer Infektion zwischen seroprotektiven Gruppen unterscheiden kann (Lovrich S.D. et al. (1993), Infect. and Immun. [in Druck]), charakterisiert worden sind. Ein Antikörper, der gegen ein Isolat aus einer seroprotektiven Gruppe gebildet wird, kann keinen Schutz bei Hunden oder anderen Spezies gegen eine Exposition mit einem Isolat einer anderen seroprotektiven Gruppe vorsehen. Daher ist es erforderlich, Isolate einzubeziehen, die verschiedene seroprotektive Gruppen repräsentieren, um einen Impfstoff mit einem breiten Wirksamkeitsspektrum sicherzustellen.
  • Ixodes scapularis-Zecken, die mit Bb infiziert sind, können Mäuse oder Hunde infizieren, wenn sie auf die Tiere gesetzt und man sie saugen lässt (Appel, Max J.G. et al., J. Inf. Dis. 167 (1993), 651-664; Fikrig E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5418-5421; Rowhrig J.T. et al., Journ. Immunol. 149 (1992), 3648-3653). Die Immunantwort von Hunden auf Bb durch eine Spritzenimpfung unterscheidet sich von der Zeckenübertragung (Rowhrig J.T. et al., Journ. Immunol. 149 (1992), 3648-3653). Aus diesem Grund haben die Erfinder die Immunogenität eines bivalenten Impfstoffes im Vergleich zu einer natürlichen Herausforderung durch Zecken untersucht.
  • I. Materialien und Methoden
  • A. Tiere
  • In einem Zecken Challenge-modell-Test wurden vier (4) B. burgdorferi (Bb)-freie Beagle, welche älter als 21 Wochen sind, von Solvay Animal Health, Inc., Charles City, IA, verwendet. In dem Immunogenitätstest wurden dreißig (30) (Bb)-freie Beagle in einem Alter von 5 bis 16 Wochen von Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana, verwendet (19 Impflinge und 9 Ungeimpfte). Durch serologische Tests und eine Blutkultur in Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium wurde gezeigt, dass die Hunde frei von Bb waren.
  • B. Bakterin-Herstellung
  • Das Bakterin wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Das Bakterin wurde mit zwei Isolaten, C-1-11 und S-1-10,, deren verwendete Hauptkultur achtmal passagiert wurde (Passagenanzahl X + 8), hergestellt.
  • C. Impfung
  • Gemäß der Gebrauchsanweisung wurden 19 Hunde geimpft:
    • 1. Der Impfstoff wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen.
    • 2. Das Fläschchen wurde vorsichtig geschüttelt, bevor der Inhalt aseptisch entnommen wurde.
    • 3. Eine Dosis (1,0 ml) wurde intramuskulär in den hinteren Oberschenkel verabreicht. Die erste Dosis wurde in einem Alter von 5 bis 16 Wochen verabreicht. Die zweite Dosis wurde 3 Wochen nach der ersten Impfung verabreicht.
  • Die Hunde wurden visuell auf anormale Reaktionen auf die Impfung untersucht.
  • D. Exposition
  • Männliche und weibliche Ixodes scapularis-Zecken wurden in zwei endemischen Gebieten der Lyme-Krankheit in Wisconsin (ländliche Gebiete nahe Hixton und Ettrick, WI) gesammelt. Der Mitteldarm von 50 weiblichen und 48 männlichen I. scapularis-Zecken aus Hixton bzw. Ettrick, WI, wurde mittels eines Fluoreszenzantikörpertests (FA), welcher für Bb spezifisch ist, untersucht. Die Zecken aus diesen Sammlungen wurden zusammengefaßt und für sowohl den Challenge-Modell-Test als auch den Immunogenitätstest verwendet.
    • 1. B. burgdorferi-Nachweis durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers.
    • a. Probenherstellung: i. Zecke – Der Kopf wurde mit Hilfe eines Skalpells entfernt. Der Mitteldarm wurde aus der Zecke herausgedrückt und unter Verwendung eines Applikatorstiftes auf einem Objektträger ausgestrichen, und der Ausstrich wurde gründlich getrocknet. ii. Kultur – Die gezüchteten Spirochäten wurden durch Zentrifugation (13.000 × g, Raumtemperatur) konzentriert und in 0,01 M PBS, pH 7,2, gewaschen. 15 μl der gewaschenen Suspension wurden auf einen Objektträger aufgebracht und gründlich getrocknet.
    • b. Die getrockneten Objektträger wurden für 10 Minuten in Aceton fixiert und trocknen gelassen.
    • c. Der monoclonale Maus-Antikörper H5332 (zunächst erhalten von Alan Barbour, University of Texas, San Antonio) wurde unter Verwendung von PBS auf 1:40 verdünnt und auf den Objektträger aufgebracht. Die Objektträger wurden für 30 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
    • d. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit einem PBS-Strahl gespült und für 5 bis 10 Minuten in einem flachen Gefäß in PBS eingetaucht.
    • e. Die Objektträger wurden dann mit einem IgG-FITC-markierten Anti-Maus-Konjugat, verdünnt 1:400 mit PBS, umgesetzt. Die Objektträger wurden für 30 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
    • f. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit einem PBS-Strahl gespült und für 5 bis 10 Minuten in einem flachen Gefäß in PBS eingetaucht, und anschließend wurden die Objektträger mit Löschpapier getrocknet.
    • g. Die Objektträger wurden mit gepuffertem Glycerin und einem Deckglas bedeckt und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
  • E. Challenge-Methoden
  • 1. Challenge-Modell-Test
  • Um die Art und Weise der Anheftung und der Infektion zu untersuchen, wurden 4 weibliche und 1 oder 2 männliche Zecken auf einen rasierten Bereich auf jeder Seite des Brustkorbes von jeweils 4 Hunden aufgebracht. Die Weibchen wurden zum Saugen auf die Hunde gesetzt, wobei die Männchen anwesend waren, um die Beendigung des Saugvorganges durch die Weibchen zu beschleunigen (Appel, Max J.G. et al., J. Inf. Dis. 167 (1993), 651-664). Die Zecken ließ man eine Woche saugen und wurden falls möglich abgesammelt und auf die Anwesenheit von Bb untersucht. Hautbiopsien wurden von der linken Seite der Anheftungsstelle eine Woche nach der Anheftung und von der rechten Seite zwei Wochen nach der Anheftung entnommen.
  • 1. Immunogenitätstest
  • Vier weibliche Zecken und eine männliche Zecke wurden eine Woche nach der zweiten Impfung auf einen rasierten Bereich auf der rechten Seite jedes Impflings und Nichtimpflings aufgebracht. Man ließ Zecken wurden für 9 Tage saugen, sie wurden falls möglich abgesammelt und auf die Anwesenheit von Bb untersucht. Hautbiopsien wurden 14 bis 15 Tage nach der Zeckenanheftung von der Zeckenanheftungsstelle und von einer Stelle, die etwa 15 cm von der Anheftungsstelle entfernt ist, entnommen.
  • F. Hautbiopsien
  • Die Stellen für die Hautbiopsie wurden rasiert, mit SolvahexTM-Desinfektionsmittel gewaschen und mit sterilem Wasser gründlich gespült, um restliches Desinfektionsmittel zu entfernen. Die Hautbiopsien wurden mit Hilfe von ellipsenförmigen Schnitten durch die dermalen und subkutanen Hautschichten entnommen. Eine Hautbiopsie wurden in Schnitte aufgeteilt, die jeweils in 9,0 ml frisches BSK- Medium eingebracht wurden. Die Proben wurden homogenisiert. und 1,0 ml des Homogenats wurde in frisches BSK-Medium, enthaltend Agarose, ohne oder mit Rifampin (40 μg/ml) eingebracht. Die Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wurden regelmäßig auf das Vorhandensein von Spirochäten untersucht. Für Spirochäten-positive Kulturen wurde durch einen FA bestätigt, dass sie Bb enthalten. Nach 6-wöchiger Inkubation wurden negative Kulturen in frisches BSK-Medium überführt, indem 1,0 ml der negativen Kultur in 9,0 ml frisches BSK-Medium, enthaltend Agarose und Rifampin (40 μg/ml), überimpft wurde. Diese Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wie vorstehend beschrieben untersucht.
  • G. Blut (Challenge-Modell-Test und Immunogenitätstest)
  • Das Blut wurde in Natriumcitrat-Röhrchen zum Zeitpunkt der Zeckenanheftung und wöchentlich nach der Zeckenanheftung entnommen. Für jede Probe wurden 3,0 ml Blut eines jeden Hundes in 27 ml frisches BSK-Medium eingebracht. Die Blutkulturen wurden unter Verwendung von 9,0 ml-BSK-Blindproben weiter auf 1:100 und 1:1000 verdünnt. Die Kulturen wurden bei 32°C für mindestens 3 Wochen inkubiert und wie vorstehend beschrieben untersucht. Für Spirochäten-positive Kulturen wurden durch einen FA bestätigt, dass sie Bb enthalten.
  • H. Serologie
    • 1. Challenge-Modell-Test: Zum Zeitpunkt der Zeckenanheftung und wöchentlich nach der Zeckenanheftung wurde Blut entnommen. Mit dem Serum der gesammelten Blutproben wurden Borrelia-Antikörper-Tests und ELISA-Tests durchgeführt.
    • 2. Immunogenitätstest: Zum Zeitpunkt der ersten und der zweiten Impfung, der Zeckenanheftung und wöchentlich nach der Zeckenanheftung wurde Blut entnommen. Das Serum wurde abgetrennt, und mit den in den Wochen 0, 4, 9 und 10 gesammelten Proben wurden Bb-Tests durchgeführt. Die ELISA-Tests wurden mit den in den Wochen 0, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 10 gesammelten Proben durchgeführt.
  • I. Borrelia-Antikörper-Testmethode
    • a) Eine 72 Stunden-Kultur von entweder dem B. burgdorferi (Bb)-Isolat C-1-11 oder S-1-10 wurde mit Hilfe einer Petroff-Hauser-Zählkammer quantifiziert und mit frischem BSK-Medium auf 1 × 105 Zellen/ml verdünnt.
    • b) Das zu testende Serum wurde in frischem BSK-Medium 1:20 verdünnt, durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert und bei 56°C für 45 Minuten hitzeinaktiviert.
    • c) Zur Durchführung des Tests wurden 100 μl der verdünnten Kultur und 100 μl des verdünnten, gefilterten und hitzeinaktivierten Serums in ein 1,5 ml-Röhrchen mit Schraubverschluß eingebracht. Zu diesen Röhrchen wurden fünfzehn (15 μl) Meerscheinchenkomplement zugegeben. Die Inhalte wurden gemischt und bei 32°C für 2 Stunden inkubiert.
    • d) Nach dem Inkubationszeitraum von 2 Stunden wurden 800 μl frisches BSK-Medium zu dem Röhrchen zugegeben. Das Röhrchen wurde bei 32°C für weitere 5 bis 7 Tage inkubiert.
    • e) Nach der Inkubation für 5 bis 7 Tage wurde das Wachstum von Bb dadurch nachgewiesen, dass eine Probe von 300 μl bis 600 μl aus dem Reaktionsröhrchen entnommen wurde, und die Probe in ein Fläschchen, enthaltend 10,0 ml einer 2,0%igen Kochsalzlösung, eingebracht wurde. Die Bb-Bakterien in der verdünnten Probe wurden unter Verwendung einer Coulter-Zählvorrichtung (Modell ZBi) gezählt. Die Abtötung in Prozent wurde durch die folgende Gleichung bestimmt:
  • Figure 00480001
  • J. ELISA-Verfahren
  • 1. Herstellung eines Ganzzellantigens:
    • a) Das Borrelia burgdorferi-Isolat C-1-11 oder S-1-10 wurde bis zum Erreichen der späten logarithmischen Phase (etwa 2 × 108 Zellen/ml) in Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium gezüchtet und mit binärem Ethylenimin inaktiviert.
    • b) Die Zellen wurden dreimal in steriler Kochsalzlösung (0,85% NaCl, pH 7,1 ± 0,2) gewaschen.
    • c) Mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits wurde das Gesamtprotein bestimmt.
  • 2. Testprotokoll:
    • a) Immulon-3-Platten wurden mit dem Ganzzellantigen von entweder C-1-11 oder S-1-10 (0,3 μg Ganzzellantigen in 100 μl Carbonat-Beschichtungspuffer pro Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden bei 4°C für 15 bis 17 Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert.
    • b) Die Inhalte jeder Platte (Ganzzellantigenlösung) wurden entfernt, und eine 5%-ige (Gew./Vol.) Trockenmilchlösung wurde zu jeder Vertiefung zugegeben (400 μl pro Vertiefung). Die Platten wurden bei 37°C für 60 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert.
    • c) Die Inhalte jeder Platte (5%ige Trockenmilchlösung) wurden entfernt, und die Platten wurden für 30 Minuten trocknen gelassen (zu diesem Zeitpunkt wurden die Platten bei 4°C gelagert oder sofort verwendet).
    • d) Serumproben wurden in 0,01 M PBS, pH 7,2, 0,05% Tween-20 auf 1:200 verdünnt und in doppelter Ausfertigung durch Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums zu jeder der zwei Vertiefungen getestet. Positive und negative Kontrollserumproben wurden ebenfalls auf jeder Platte in doppelter Ausfertigung getestet. Die Platten wurden bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
    • e) Die Inhalte jeder Platte (Serumprobenverdünnungen) wurden entfernt, und die Platten wurden dreimal mit einer 0,9% NaCl/0,05% Tween-20-Lösung gewaschen.
    • f) Ein Peroxidase-markiertes Ziege-anti-Hund-IgG (schwere und leichte Ketten)-Konjugat, verdünnt 1:1500 in 0,01 M PBS, pH 7,2, 0,05% Tween-20, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben (50 μl pro Vertiefung). Die Platten wurden bei 37°C für 60 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert.
    • g) Die Inhalte jeder Platte (Konjugatlösung) wurden entfernt, und die Platten wurden wie vorstehend in Schritt 6 beschrieben gewaschen.
    • h) Das Substrat O-Phenylendiamin (30,0 mg) wurde in einer Lösung von 0,051 M dibasischem Natriumphosphat, 0,0224 M Citronensäure und 0,012% Wasserstoffperoxid (74,83 ml) gelöst und zu jeder Vertiefung zugegeben (100 μl pro Vertiefung). Man ließ Substrat wurde für 8 bis 10 Minuten umsetzen.
    • i) Die Substratreaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure je Vertiefung gestoppt. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 490 nm abgelesen. Die Mittelwerte der optischen Dichte der Testvertiefungen wurden gegen die Mittelwerte der optischen Dichte der positiven Kontrolle normalisiert (d.h. der Mittelwert der optischen Dichte der Testvertiefungen einer getesteten Serumprobe wurde durch den Mittelwert der optischen Dichte der positiven Kontrolle dividiert).
  • K. Klinische Symptome
  • Nach der Herausforderung wurden alle Hunde auf klinische Symptome wie Fieber, Lethargie, Lahmheit und Appetitlosigkeit untersucht.
  • L. Statistische Analyse
  • Die Ergebnisse der Hautbiopsie-Kultur wurden durch den Fischer-Exakt-Test verglichen.
  • II. Ergebnisse
  • A. Impfung
  • Es wurden keine anomalen Reaktionen auf die Impfung beobachtet.
  • B. Zecken
  • Die FA-getestete Probe männlicher Zecken, welche in Hixton und Ettrick gesammelt wurde, war zu 52% bzw. 54% infiziert.
  • C. Challenge-Modell-Test
  • Die Zecken hefteten sich innerhalb von 1 bis 2 Stunden an. Nach 2 Tagen waren die Zecken vollgesogen. Drei Tage später hatten die meisten Hunde die anheftenden Zecken abgelöst, jedoch wurden drei vollgesogene Zecken von einem der vier Hunde (#450) abgesammelt. Aus dem Blut, das aus dem Hämocoel von einer der drei Zecken entnommen wurde, wurden Bb-Bakterien vermehrt, und der Mitteldarm dieser Zecke war anhand eines FA für Bb positiv. Die eine Woche nach der Anheftung von der Anheftungsstelle dieses Hundes entnommenen Hautbiopsien waren nicht Bb-positiv. In der Tat wurden eine Woche nach der Zeckenanheftung aus den Hautbiopsien von nur einem Hund Spirochäten isoliert (Tabelle 11a). Im Gegensatz dazu wurden zwei Wochen nach der Anheftung aus den Hautbiopsien, die von der gegenüberliegenden Seite bei allen vier Hunden entnommen wurden, Spirochäten isoliert (Tabelle 11 b). Die Hunde wurden 2 und 9 Wochen nach der Zeckenanheftung positiv auf Spirochäten getestet (Tabelle 11 b). Ein Borrelia-Antikörper war nachweisbar, wobei sich der Titer davon 10 und 11 Wochen nach der Zeckenanheftung erhöhte (Tabelle 12a). Nach der Zeckenanheftung waren Antikörper gegen sowohl C-1-11- als auch S-1-10-Antigene nachweisbar, wie durch einen ELISA gezeigt wurde (Tabelle 12b).
  • Tabelle 11a
    • Expositionsmodell-Test: B. burgdorferi, vermehrt aus Hautbiopsieproben, die eine und zwei Wochen nach der Zeckenanheftung entnommen wurden.
  • Hautbiopsiekulturen
    Figure 00510001
    • a Proben positiv je getesteter Anzahl.
    • b Kontaminiert
  • Tabelle 11b
    • Challenge-Modell-Test: B. burgdorferi, vermehrt aus Blut, das den Hunden nach der Zeckenanheftung entnommen wurde.
  • Blutkulturen
    Figure 00510002
    • + (Wachstum)
    • – (Kein Wachstum)
  • Tabelle 12a
    • Challenge-Modell-Test: Borrelia-Antikörper-Testwerte (Mittelwert ± SD, Abtötung in Prozent für vier Hunden) gegen C-1-11 und S-1-10 nach der Zeckenanheftung.
  • Borrelia-Antikörper-Test
    Figure 00520001
    • a Der BA-Test für die Wochen 12 bis 16 ist in Vorbereitung.
    • b Die Standardabweichungen waren aufgrund von negativen BA-Antworten in einigen Hunden hoch.
  • Tabelle 12b
    • Challenge-Modell-Test: Nachgewiesener Antikörper gegen S-1-10- und C-1-11-Antigene, gemessen durch einen ELISA, nach der Zeckenanheftung.
  • ELISA
    Figure 00530001
    • a Die Standardabweichungen waren hoch wegen eines Hundes, welcher durchgängig schwache ELISA-Antworten auf sowohl das C-1-11- als auch das S-1-10-Antigen zeigte.
  • D. Immunogenitätstest
  • Eine bis vier Zecken wurden von allen Hunden, mit Ausnahme von sechs Impflingen (die Bandagen lösten sich ab oder wurden durch die Hunde in den späten Phasen des Vollsaugens entfernt, und Zecken, die sich angeheftet hatten und saugten, waren verloren gegangen) abgesammelt. Einige der gewonnenen Zecken waren geschädigt oder tot. Bb-positive Zecken wurden von 3 der 19 Impflinge und von 3 der 9 Kontrollen gewonnen (Tabelle 13). Das Vorkommen der Bb-positiven Zecken korrelierte nicht notwendigerweise mit der beobachteten Infektion.
  • Die Hautbiopsien von 4 der 9 (44%) ungeimpften Hunde waren positiv (Tabelle 4). Alle Hautbiopsien, welche von geimpften Hunden entnommen wurden, waren Bb-negativ. Dies entspricht einer signifikanten (P = 0,0016, Fischer-Exakt-Test) Verringerung der Infektion in der Impfgruppe. Alle Kulturen mit einem Spirochätenwachstum wurden durch einen FA als Bb-positiv identifiziert. Alle Blindpassagen-Kulturen blieben negativ. Keine der Hautbiopsien, welche in einer Entfernung von etwa 15 cm von dem Zeckenanheftungsbereich in entweder der Kontroll- oder der Impfgruppe entnommen wurden, war Bb-positiv (Tabelle 13).
  • Tabelle 13
    • Immunogenitätstest: B. burgdorferi, identifiziert durch einen FA in Zecken, welche von Hunden gewonnen wurden, und vermehrt aus Hautbiopsien, welche von der Zeckenanheftungsstelle und einer anderen entfernten Stelle etwa zwei Wochen nach der Zeckenanheftung entnommen wurden.
  • Figure 00540001
    • a NT (Nicht getestet. Zecken geschädigt oder keine lebensfähigen Zecken gewonnen).
  • Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse der Blutkulturen. Einer der 9 Ungeimpften wies ungefähr eine Woche nach Anheftung der Zecken (d.h. während des Saugens) positive Blutkulturen bei Verdünnungen von 1:10 und 1:100 auf. Die Blutkulturen waren ansonsten negativ, bis auf Woche 6 nach der Zeckenanheftung. Zu diesem Zeitpunkt wiesen 9 von 19 Impflingen und 6 von 9 Kontrollen positive Blutkulturen bei Verdünnungen von 1:100 und 1:1000, aber nicht bei der ersten Verdünnung von 1:10 auf (nachgewiesen durch ein Wachstum und einen FA). Da dies ein fragliches Ergebnis war, wurden die Blutproben noch einmal kultiviert, wobei das Blut und die 1:10-Verdünnung durch einen FA untersucht wurden. Es wurde kein Spirochätenwachstum in dem erneut kultivierten Blut nachgewiesen, und in dem Blut oder der 1:10-Verdünnung wurden durch den FA keine Spirochäten nachgewiesen.
  • Tabelle 14
    • Immunogenitätstest: B. burgdorferi, vermehrt aus Blut, das Hunden vor und nach der Zeckenanheftung entnommen wurde.
  • Blutkulturen
    Figure 00550001
  • Figure 00560001
    • a Blut entnommen zum Zeitpunkt des Aufbringens der Zecken auf die Hunde.
    • + (Wachstum)
    • – (Kein Wachstum)
  • Die 4 und 5 veranschaulichen die Borrelia-Antikörper-Antworten auf die Isolate S-1-10 und C-1-11 nach der Impfung und der Zeckenanheftung. Die Serumproben von Impflingen zeigten eine Woche nach der zweiten Impfung eine starke Antikörperantwort auf sowohl S-1-10 als auch C-1-11. Fünf Wochen nach der Zeckenanheftung wurde in der ungeimpften Gruppe eine leichte Verstärkung der Borrelia-Antikörper-Antworten auf sowohl S-1-10 als auch C-1-11 beobachtet. Jedoch wurde 6 Wochen nach der Zeckenanheftung eine stärkere Borrelia-Antikörper-Antwort, welche nur gegen S-1-10 gerichtet war, in der ungeimpften Gruppe beobachtet.
  • Die durch einen ELISA getesteten Serumproben zeigten eine Woche nach der zweiten Impfung ebenfalls eine starke Antikörperantwort auf sowohl die S-1-10- als auch die C-1-11-Antigene (3 und 4). Anschließend schwächte sich die Antikörperantwort langsam ab. Ungeimpfte zeigten in der Woche 8, 9 und 10 (4, 5 und 6 Wochen nach der Zeckenanheftung 6 und 7) verstärkte Antikörperantworten.
  • Bei keinem der Hund wurden entweder unmittelbar oder während den Beobachtungszeiträumen nach den Impfungen und der Zeckenanheftung unerwünschte Nebenwirkungen beobachtet.
  • Bis heute hat keiner der Hunde klinische Symptome im Zusammenhang mit einer Lyme-Erkrankung gezeigt.
  • III. Diskussion
  • Alle Hunde der Challenge-Modell-Studie wurden infiziert, wie mittels Hauptbiopsie-Kulturen (4 von 4 Hunden waren positiv), Blutkulturen (4 von 4 Hunden waren positiv) und Serologie (alle Hunde, bis auf Hund Nr. 450, zeigten eine Serokonversion, wie durch einen BA oder ELISA bestätigt wurde) nachgewiesen wurde. Die Hunde werden gegenwärtig auf klinische Symptome überwacht. Die Zecken, welche zur Infektion dieser Hunde verwendet wurden, wurden auch zur Infektion der Hunde in dem Immunogenitätstest verwendet.
  • Die Zecken infizierten 4 der 9 Ungeimpften und keinen der 19 Impflinge. Dies entspricht einer signifikanten (P = 0,0016, Fischer-Exakt-Test) Verringerung der Infektion und korreliert mit dem Vorhandensein eines Borrelia-Antikörpers. Es wurde eine signifikante (P = 0,0422, Fischer-Exakt-Test) Verringerung der Infektion in der Impfgruppe beobachtet, wenn die Infektion von Hautbiopsien und eine Spirochätensepsis insgesamt beurteilt wurden.
  • Die Impflinge in dem Immunogenitätstest zeigten zum Zeitpunkt der Zeckenanheftung eine starke Borrelia-Antikörper-Antwort auf beide Impfstoff-Isolate. Nach der Zeckenanheftung schwächten sich die Antikörperantworten in der Impfgruppe für beide Isolate ab, wie durch einen BA gemessen wurde. Im Gegensatz dazu erhöhte sich die Borrelia-Antikörper-Antwort auf S-1-10 in der ungeimpften Gruppe. Diese Erhöhung spiegelt die in dieser Gruppe beobachteten Infektionen wieder. Durch einen ELISA wurde in der ungeimpften Gruppe eine Erhöhung auf sowohl die S-1-10- als auch die C-1-11-Antigene gemessen. Diese Beobachtungen stützen die vorher angeführten (Lovrich S.D. et al., Infect. and Immun. [in Druck]), dass der Borrelia-Antikörper-Test zwischen Isolaten aus verschiedenen seroprotektiven Gruppen unterscheidet, während ELISA-Tests keine solche Unterscheidung ermöglichen. Die Daten zeigen, dass die Borrelia-Bakterien, welche durch die Zecken übertragen werden, wahrscheinlich in dieselbe seroprotektive Gruppe wie S-1-10 eingruppiert werden können. Jedoch erhöhten sich die mittleren BA-Antworten auf beide Isolate in dem Challenge-Modell-Test nach der Zeckenanheftung erhöht. Es ist möglich, dass der Pool von Zecken mit entweder Isolaten einer Gruppe, beider Gruppen oder möglicherweise anderer seroprotektiver Gruppen infiziert war.
  • Bakterien, welche in proteinreichen Medien gezüchtet werden und in Multikomponenten-Bakterine eingebracht werden, haben das Potenzial, unerwünschte Nebenwirkungen (Ödeme, Schwellungen, Wundsein, Lethargie, Überempfindlichkeit), hervorzurufen, welche aus der Wechselwirkung zwischen Tier, Impfstoff und Umgebung resultieren. In dieser Studie wurden keine anomalen Reaktionen in irgendeinem der Impflinge nach jeder Impfung mit einem Bakterin, das zwei Isolate von Bb enthält, beobachtet.
  • IV. Schlußfolgerung
  • Die in diesen Studien verwendeten Zecken waren in der Lage, Hunde mit B. burgdorferi zu infizieren.
  • Der Impfstoff, welcher hohe Borrelia-Antikörper-Titer hervorrief, war gegen eine natürliche Herausforderung durch Zecken wirksam und war sicher.
  • Beispiel 14
  • Immunogenitätstest und Studie zur Dauer der Immunität
  • I. Materialien und Methoden
  • A. Tiere
  • In der Studie wurden Beagle aus der Kolonie, welche von der Solvay Animal Health, Inc., Charles City, IA, unterhalten wird, verwendet. Die Hunde waren zum Zeitpunkt der Impfung 12 bis 24 Wochen alt (Tabelle 15) und waren für B. burgdorferi seronegativ (< 1:20), wie durch einen Ganzzell-ELISA getestet wurde.
  • Tabelle 15: In der Studie verwendete Hunde
    Figure 00590001
  • B. Bakterin-Herstellung
  • Das Bakterin wurde, wie vorstehend beschrieben, aus den B. burgdorferi-Serotypen C-1-11 und S-1-10 nach der achten Passage der Hauptimpfkultur hergestellt. Das Bakterin wurde dergestalt formuliert, dass es 5 × 108 Zellen je Serotyp pro 1 ml-Dosis zusammen mit Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA, Reheis Chemical Co., Berkeley Hts., New Jersey) in 1,5 mg Aluminiumoxid pro 1 ml-Dosis als Adjuvans enthält. Der Impfstoff wurde bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
  • C. Impfung
  • Zwanzig Hunde wurden intramuskulär in den hinteren Oberschenkel mit zwei 1,0 ml-Dosen in einem Abstand von drei Wochen geimpft. Die erste Dosis wurde in einem Alter von 12 bis 24 Wochen verabreicht. Die zweite Dosis wurde drei Wochen nach der ersten Dosis verabreicht. Die Hunde wurden auf anomale Reaktionen überwacht, die Temperaturen wurden protokolliert, und die Injektionsstellen wurden während einer Woche nach jeder Impfung täglich untersucht. Eine Gruppe von 15 ungeimpften Hunden diente als Kontrolle.
  • D. Serologie
  • Blut wurde vor und nach der Impfung und in Intervallen nach der Herausforderung entnommen. Das Serum wurde durch einen Borrelia-Antikörper-Test, einen Ganzzell-ELISA und einen OspA-ELISA sowie ein Western-Immunblot-Verfahren auf einen Antikörper gegen B. burgdorferi getestet.
  • E. Ganzzell-ELISA
  • Die Antikörperantwort auf Oberflächenantigene von B. burgdorferi wurde durch eine Modifikation eines Ganzzell-ELISA, welcher durch das Regional Animal Health Laboratory, Baron, WI, verwendet wird, bestimmt. Kulturen in der späten log-Phase von sowohl C-1-11 als auch S-1-10 wurden mit binärem Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Nach Neutralisation des BEI's mit Natriumthiosulfat wurden die Zellen durch Zentrifugation dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen. Der Proteingesamtgehalt der inaktiven Organismen wurde durch einen Bicinchoninsäure (BCA)-Proteintest (Pierce Co., Rockford, IL) bestimmt. Vertiefungen von Immunol-3-Platten (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 0,3 μg Ganzzellantigen in 100 μl Puffer, enthaltend Natriumcarbonat, beschichtet. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer bei 4°C für 15 bis 17 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Inhalte der Platte verworfen, und die Vertiefungen wurden mit PBS, enthaltend 5% Magermilchpulver (NFDM), gefüllt und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden entleert, und 50 μl Testserum, verdünnt in PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-TW), wurde zu den Ver tiefungen in doppelter Ausfertigung zugegeben und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Positives und negatives Hunde-Kontrollserum war auf jeder Platte eingeschlossen. Die Platten wurden dreimal mit Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen, und 50 μl-Aliquots eines Peroxidase-markierten Ziege-anti-Hund-IgG's (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), verdünnt 1:1500 in PBS-TW, wurden pro Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert und dreimal mit PBS-TW gewaschen. Das Substrat wurde durch Lösen von 30,0 mg O-Phenylendiamin in einer Lösung aus 0,051 M dibasischem Natriumphosphat, 0,024 M Citronensäure und 0,012% Wasserstoffperoxid hergestellt, und 100 μl-Aliquots wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure pro Vertiefung gestoppt, und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 490 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab, definiert.
  • E. OspA-ELISA
  • Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit 50 ng rekombinantem OspA beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 5% NFDM in PBS für 30 Minuten bei 37°C nachbeschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl von Hundeserum-Zweifachverdünnungen wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl Ziege-anti-Hund-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Nach der Inkubation für eine Stunde bei 37°C wurde der gebundene Antikörper durch die Zugabe von ABTS-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab, definiert.
  • F. Western-Immunblot-Verfahren
  • Kulturen von B. burgdorferi in der mittleren bis späten log-Phase wurden durch Zentrifugation bei 15.000 × g, 4°C, 30 Minuten, geerntet und durch Zentrifugation dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen. Eine Suspension von etwa 1 × 108 Zellen wurde in Elektrophorese-Probenpuffer für 9 Minuten denaturiert und auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen (Laemmli E.K., Nature 227 (1970), 680-685). Die Proteine wurden durch eine Modifikation des durch Towbin (Towbin H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979), 4350-4354) beschriebenen Verfahrens durch Elektroblotting auf eine ImmobilonTM-PVDF-Membran (Millipore Corp., Bedford, MA) übertragen. Die PVDF-Membran wurde für 90 Minuten bei 22°C in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2 (TBS) mit 5% NFDM inkubiert. Streifen davon wurden mit Hundeserum oder einem monoclonalen Antikörper gegen OspA, verdünnt 1:75 in dem Blockierungspuffer, für 60 Minuten bei 22°C inkubiert. Die Streifen wurden anschließend zweimal in TBS, enthaltend 0,2% Triton X-100, und einmal in TBS gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde durch die Zugabe von Meerrettichperoxidase-markiertem Anti-Hund- oder Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Proteinbanden wurden mit einem TMB-Membran-Peroxidasesubstrat-System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) sichtbar gemacht.
  • G. Nachweis des Borrelia-Antikörpers mittels Durchflußcytometrie
  • Der Borrelia-Antikörper-Test wurde unter Verwendung einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren (Lim L.C. et al. (1993), Clin. Diag. Lab. Immunol. (in Druck); Sachsenmeirer K.F. et al., J. Clin. Microbiol. 30 (1992), 1457-1461) durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden 72-Stunden-Kulturen der B. burgdorferi-Isolate C-1-11 und S-1-110 in der mittleren log-Phase in modifiziertem Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium in einer Petroff-Hauser-Zählkammer quantifiziert und bis zum Erhalt von 1 × 106 Zellen/ml BSK-Medium verdünnt. 100 μl-Aliquots eines verdünnten, hitzeinaktivierten Serums wurden mit 100 μl jeder B. burgdorferi-Suspension gemischt, und 10 μl Meerschweinchenserum-Komplement (210 CH50-Einheiten; GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) wurden zugegeben. Die Suspension wurde vorsichtig gemischt und bei 32°C für 16 bis 24 Stunden inkubiert. Nach Inkubation der Reaktionsröhrchen wurden 100 μl des Reaktionsgemisches mit phos phatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 5,4 × 10–9 M Acridinorange, verdünnt. Der Nachweis einer Borrelia-Antikörper-Aktivität erfolgte unter Verwendung einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren (Callister S.M. et al., J. Infec. Dis. 167 (1992), 158-164). Eine Abtötung durch Borrelia-Antikörper bewirkt die Bildung von Bläschen in den Zellwänden von B. burgdorferi, wodurch höhere Konzentrationen an Acridinorange auf und innerhalb dieser geschädigten Zellwände adsorbiert werden. Folglich fluoreszieren abgetötete B. burgdorferi-Organismen mit einer sehr viel höheren Intensität als normale lebende Spirochäten. Eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität von ≥ 16% im Vergleich zu Organismen, welche normalem Hundeserum ausgesetzt werden, wurde als ein positiver Nachweis für eine Borrelia-Antikörper-Aktivität angesehen. Der Endpunkttiter wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, bei welcher eine Erhöhung von ≥ 16% der Fluoreszenzintensität beobachtet wurde, ausgedrückt. Hunde mit einem Titer von < 1:20 wurden als negativ erachtet.
  • H. Herausforderung von Hunden durch B. burgdorferi-infizierten Zecken
  • Insgesamt wurden 631 männliche und 732 weibliche I. scapularis-Zecken in einem endemischem Gebiet der Lyme-Krankheit nahe Ettrick, Wisconsin, gesammelt. Zur Ermittlung der gesamten B. burgdorferi-Infektionsrate der Zecken wurde der Mitteldarm von 50 männlichen I. scapularis-Zecken durch einen Fluoreszenzantikörpertest (FA) unter Verwendung des monoclonalen OspA-Antikörpers, welcher von Dr. A.G. Barbour erhalten wurde, untersucht. Sieben Monate nach der zweiten Impfung wurden die Hunde mit 10 weiblichen und 6 männlichen Zecken herausgefordert. Weibliche Zecken sind die einzigen erwachsenen Zecken, welche die Krankheit übertragen. Männliche Zecken sind erforderlich, damit die weiblichen Zecken richtig saugen. Für jeden Hund wurden 5 weibliche und 3 männliche Zecken zufällig aus dem Pool von Zecken ausgewählt und in zwei kleine Petrischalen gesetzt, die auf einer rasierten Fläche auf dem linken anterior-dorsalen Bereich der Brust jedes Hundes befestigt wurden. Die Zecken ließ man während einer Woche saugen. Während dieser Zeit wurden die Zecken in Intervallen von zwei Tagen untersucht. Eine Woche nach der Anheftung wurden die Zecken gewonnen, und der Mitteldarm davon wurde durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper auf die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht.
  • I. Untersuchung der Hunde auf klinische Symptome der Lyme-Krankheit
  • Die Hunde wurden nach der Herausforderung täglich auf klinische Symptome in Zusammenhang mit einer Lyme-Erkrankung untersucht. Das als primärer Indikator für eine klinische Lyme-Erkrankung verwendete Symptom war eine Lahmheit. Lahmheit wurde als das Widerstreben einer Gewichtsbelastung eines betroffenen Beines, mit oder ohne einer Schwellung und einer Temperatur an dem betroffenen Gelenk, die Steifheit der Beine und die Wanderung der Lahmheit von Gelenk zu Gelenk oder von Gliedmaß zu Gliedmaß definiert. Die Hunde wurden auch auf eine Lethargie und Fieber untersucht.
  • J. Isolierung von B. burgdorferi aus Hunden nach der Herausforderung
  • Es wurden Versuche unternommen, B. burgdorferi aus der Haut, dem Blut, den Gelenken und den Organen der Hunde zu isolieren. Hautbiopsien wurden von betäubten Hunden 18 bis 19 Tage nach der Zeckenanheftung und zum Zeitpunkt der Obduktion entnommen. Die Hautbiopsien wurden von der Zeckenanheftungsstelle entnommen, und bei einigen Hunden wurden Hautbiopsien von Stellen in Entfernung von der Zeckenbißstelle entnommen. Die entfernten Stellen befanden sich ventral zu der Zeckenbißstelle, posterior zu der Zeckenbißstelle und auf der rechten Seite des anterior-dorsalen Bereiches der Brust auf der gegenüberliegenden Seite des Hundes. Die Stellen der Hautbiopsie wurden rasiert, mit SolvahexTM-Desinfektionsmittel gewaschen und mit sterilem Wasser gründlich gespült, um das restliche Desinfektionsmittel zu entfernen. Ein ellipsenförmiger Schnitt wurde durch die dermalen und subkutanen Hautschichten vorgenommen. Etwa 1 g Haut wurde in 9 ml BSK-Medium, enthaltend 0,15% Agarose und 40 μg Rifampin/ml, eingebracht. Die Biopsieprobe wurde homogenisiert, und zwei weitere Zehnfachverdünnungen des Homogenats wurden in 9 ml-Blindproben des BSK-Mediums hergestellt. Die Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wurden mikroskopisch in wöchentlichen Intervallen auf das Wachstum von Spirochäten untersucht. Kulturen, die ein Wachstum von Spirochäten zeigten, wurden durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper als B. burgdorferi bestätigt. Nach 6-wöchiger Inkubation wurden negative Kulturen durch Überimpfen von 1 ml der negativen Kultur auf 9 ml frisches BSK-Medium in frischem BSK-Medium subkultiviert. Diese Kulturen wurden bei 32°C für weitere 6 Wochen inkubiert und untersucht, wie vorstehend beschrieben wurde. Kulturen, die im Hinblick auf das Wachstum von Spirochäten negativ waren, wurden verworfen.
  • Das Herz, die Milz, die Nieren und die Blase wurden als Ganzes in 50 ml BSK, enthaltend Agarose und Rifampin, unter Verwendung einer Stomacher-Vorrichtung (Seward Medical, London, England) getrennt homogenisiert. Eine 50 ml-Probe wurde abgefüllt und 10–1 und 10–2 in BSK-Medium verdünnt. Die 50 ml-Probe und die Verdünnungen wurden für 6 Wochen bei 32°C inkubiert, untersucht und als B. burgdorferi bestätigt, wie beschrieben wurde.
  • Eine 2-3 ml-Probe Liquor cerebrospinalis wurde zu 9 ml BSK-Medium zugegeben, und eine weitere 1:10-Verdünnung wurde in demselben Medium hergestellt, inkubiert und untersucht, wie beschrieben wurde.
  • Aus dem Ellbogen, Vorderfußwurzelgelenk, Knie und Fußwurzelgelenk wurde Gelenkgewebe entnommen. Das Gewebe jedes Gelenks wurde zu 9 ml BSK-Medium, enthaltend Agarose und Rifampin, zugegeben. Eine weitere 1:10-Verdünnung wurde in demselben Medium hergestellt, und die Kulturen wurden inkubiert und untersucht, wie beschrieben wurde.
  • K. Blutkulturen
  • Mit Heparin versetzte Blutproben zur Isolierung von B. burgdorferi wurden zum Zeitpunkt der Herausforderung, in wöchentlichen Intervallen nach der Herausforderung und bei der Obduktion gesammelt. Das Blut jedes Hundes wurde 10–1, 10–2 und 10–3 in BSK-Medium verdünnt. Die Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und wöchentlich auf das Wachstum von B. burgdorferi untersucht, wie beschrieben wurde.
  • L. Statistische Analyse
  • Statistische Unterschiede wurden durch die Pearson-Chi-Quadrat-Analyse verglichen.
  • I. Ergebnisse
  • A. Impfung
  • Die Hunde wurden mit zwei Dosen des Impfstoffes in einem Abstand von drei Wochen geimpft. Nach der ersten Impfung zeigten 14 von 20 Hunden ein leichtes Fieber von 1,5°F oberhalb der Basistemperaturen (Tabelle 16). Die Temperaturen hielten bei der Mehrzahl dieser Hunde lediglich für 3 Tage an. Leicht erhöhte Temperaturen wurden für die Hunde 566 und 568 während 7 Tagen nach der Impfung protokolliert. Eine geschwollene Impfstelle wurde bei Hund 560 beobachtet, welche während 4 Tagen anhielt und dann verschwand. Nach der zweiten Impfung zeigten 13 von 20 Hunden ein leichtes Fieber von 1,5°F oberhalb der Basislinie, welches während 3 oder 4 Tagen anhielt (Tabelle 17). Hund 615 zeigte eine erhöhte Temperatur, welche während 8 Tagen anhielt. Die Hunde zeigten keine anderen Reaktionen nach der Impfung, und es wurden keine schweren Überempfindlichkeits- oder anaphylaktische Reaktionen beobachtet.
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • B. Antikörperantwort auf B. burgdorferi-Ganzzellantigene
  • Ein ELISA unter Verwendung von ganzen Zellen von B. burgdorferi wurde zum Nachweis der serologischen Antwort von geimpften und herausgeforderten Hunden auf Oberflächenantigene von B. burgdorferi verwendet. Vor der Impfung waren alle Hunde seronegativ. Drei Wochen nach der zweiten Impfung wurde ein geometrischer mittlerer Titer (GMT) von 1236 gegen den Stamm S-1-10 und von 816 gegen den Stamm C-1-11 erhalten (Tabelle 18). Sechs Monate später, zum Zeitpunkt der Exposition, hatten sich die Antikörpertiter in den Impflingen auf 343 und 234 für S-1-10 bzw. C-1-11 verringert. Die Antikörpertiter gegen beide Stämme blieben in den Impflingen nach der Herausforderung mit infizierten Zecken im Wesentlichen unverändert. Ungeimpfte Kontrollhunde waren während des Zeitraums vor der Herauforderung seronegativ. Nach der Exposition waren alle Kontrollhunde für sowohl S-1-10 als auch C-1-11 seropositiv. Der GMT in den Kontrollhunden betrug 1167 und 1404 für S-1-10 bzw. C-1-11 und war um das 4- bis 5-fache höher als die Titer in den geimpften Hunden nach der Exposition. Jedoch waren die Antikörpertiter gegen beide Stämme in Hund Nr. 669 um das 8- bis 16-fache niedriger als der GMT der Kontrollhunde.
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • C. Western-Immunblot-Verfahren
  • Das Serum von geimpften und ungeimpften Kontrollhunden wurde vor und nach der Herausforderung untersucht, um die Reaktivität des Antikörpers mit spezifischen Antigenen von B. burgdorferi zu bestimmen. Alle Hunde waren vor der Impfung seronegativ. Sieben Monate nach der zweiten Impfung enthielt das Serum von geimpften Hunden einen Antikörper, der vorwiegend mit dem OspA-Protein (31 Kilodalton) und einem Protein von 34 Kilodalton, welches dem beschriebenen Molekulargewicht für OspB entspricht, reagierte (1 bis 4). Der Antikörper reagierte ungefähr in demselben Ausmaß mit diesen Proteinen von S-1-10 und C-1-11. Jedoch deuteten Unterschiede bezüglich des Färbungsmusters und der relativen Beweglichkeit der Proteine auf andere Unterschiede bei den Proteinen zwischen den zwei Stämmen hin. In dem Serum einiger Impflinge wurden Antikörper gegen andere Proteine von B. burgdorferi wie ein Flagellin-Protein (41 Kilodalton) und Proteine mit einem höheren Molekulargewicht nachgewiesen. Nach der Herausforderung durch Zecken wurde eine leichte Veränderung in dem Immunblot-Profil der geimpften Hunde beobachtet. Der Antikörper von geimpften Hunden reagierte vorwiegend mit den OspA- und OspB-Proteinen. Das Antikörper-Immunblot-Profil von ungeimpften Kontrollhunden nach der Zeckenexposition unterschied sich von dem Immunblot-Profil der geimpften Hunde. Die ungeimpften Kontrollen waren vor der Herausforderung seronegativ (5). Nach der Herausforderung produzierten die Ungeimpften einen Antikörper gegen des Flagellin-Protein von 41 Kilodalton und ein Protein von 39 Kilodalton sowie gegen Proteine mit einem höheren Molekulargewicht von B. burgdorferi (6). In dem Serum von Kontrollhunden wurden nach der Herausforderung durch Zecken nur wenige oder keine Antikörper gegen OspA und OspB nachgewiesen. Studien haben gezeigt, dass ungeimpfte Tiere sehr wenige Antikörper gegen OspA und OspB nach einer Exposition mit B. burgdorferi-infizierten Zecken produzieren (Appel et al. (1993); Burgdorfer et al. (1982); Roelerig et al. (1992); Schaible U.E. et al., Immunol. Let. 36 (1993), 219-226).
  • D. OspA-ELISA
  • In einem ELISA wurde ein rekombinantes OspA verwendet, um die Antikörperantwort auf ein wichtiges protektives Antigen in Hunden nach einer Impfung mit dem Bakterin zu bestimmen. Geimpfte Hunde entwickelten OspA-Antikörpertiter, welche nach der zweiten Impfung im Bereich von 320 bis 2560 liegen (Tabelle 19).
  • Der OspA-GMT betrug 640 nach der Impfung und 279 vor der Herausforderung. Der Antikörper gegen OspA wurde in ungeimpften Kontrollhunden acht Wochen nach der Herausforderung durch Zecken nicht nachgewiesen. Tabelle 19: ELISA-Antikörperantwort auf OspA
    Figure 00740001
    • a Antikörper gegen ein rekombinantes OspA-Protein, gebunden an die Vertiefungen einer Platte.
    • b Drei Wochen nach der zweiten Impfung.
    • c Negativ – korreliert mit einem Titer von < 1:20.
    • d Geometrischer mittlerer Titer.
  • E. Borrelia-Antikörper-Antwort
  • Die funktionelle Aktivität des Antikörpers, welcher gegen B. burgdorferi als Ergebnis einer Impfung mit dem Bakterin hervorgerufen wurde, wurde in dem Borrelia-Antikörper-Test gemessen. Der Borrelia-Antikörper wurde durch die Hemmung des Wachstums von B. burgdorferi als Ergebnis der Antikörper-vermittelten Lyse des Organismus nachgewiesen. Geimpfte Hunde entwickelten hohe Titer des Borrelia-Antikörpers gegen sowohl S-1-10 als auch C-1-11 (Tabelle 20). Der GMT des Borrelia-Antikörpers betrug 520 gegen den Stamm S-1-10 und 1076 gegen den Stamm C-1-11. Ähnlich wie bei der Ganzzell- und OspA-Antikörperantwort verringerten sich die Borrelia-Antikörper-Titer von der zweiten Impfung bis zum Zeitpunkt der Herausforderung. Zum Zeitpunkt der Exposition, sieben Monate nach der zweiten Impfung, wurden Borrelia-Antikörper-Titer von 113 und 279 für S-1-10 bzw. C-1-11 in den Impflingen nachgewiesen. Geimpfte Hunde erzeugten auch einen Borrelia-Antikörper gegen einen anderen Stamm von B. burgdorferi aus derselben seropositiven Gruppe wie S-1-10 (Tabelle 21). Der Borrelia-Antikörper wurde in keinem der ungeimpften Kontrollhunde vor oder nach der Herausforderung nachgewiesen (Daten nicht vorgestellt). Das Fehlen des Borrelia-Antikörpers in den Kontrollhunden nach der Herausforderung ist vergleichbar mit den Ergebnissen, welche zeigten, dass der OspA-Antikörper in Kontrollhunden nach der Herausforderung durch den OspA-ELISA und das Immunblot-Verfahren nicht nachgewiesen wurde.
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Tabelle 21: Borrelia-Antikörper-Antwort auf homologe und heterologe Isolate von B. burgdorferi
    Figure 00790001
    • a Menschliches Liquor cerebrospinalis-Isolat aus Connecticut.
    • b Geometrischer mittlerer Titer.
    • c Negativ – korreliert mit einem Titer von < 1:20 für die Isolate C-1-11 und S-1-10 sowie < 1:16 für das Isolat 297.
    • d Nicht durchgeführt.
  • F. Herausforderung von Hunden mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
  • Insgesamt wurden 1363 I. scapularis-Zecken (732 Weibchen und 631 Männchen) in dem Gebiet in der Nähe von Ettrick, WI, gesammelt. Die Infektionsrate der Zecken mit B. burgdorferi betrug 44%, wie durch eine FA-Analyse des Mitteldarms von männlichen Zecken bestimmt wurde. Diese Infektionsrate ist vergleichbar mit der Infektionsrate von 47%, welche durch Lacombe und Mitarbeiter beschrieben wurde (Lacombe E. et al., J. Infect. Dis. 167 (1993), 1236-1238). Berechnungen wurden durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass mindestens eine infizierte Zecke auf jeden Hund zum Zeitpunkt der Herausforderung aufgebracht wurde. Die Ergebnisse zeigten, das eine Wahrscheinlichkeit von 99,4% bestand, dass alle der 35 herausgeforderten Hunde mindestens eine infizierte Zecke erhielten (Tabelle 22). Zum Zeitpunkt der herausgeforderten wurden 10 weiblichen und 6 männliche Zecken auf jeden Hund aufgebracht, die man während einer Woche saugen ließ. Im Allgemeinen hefteten sich die Zecken innerhalb von 24 Stunden an, und die meisten Zecken saugten sich bis zum vollständigen oder nahezu vollständigen Anschwellen während des einwöchigen Zeitraums der Herausforderung voll. Zecken, welche von dem Hund abgefallen waren, wurden in der Schale zurückgehalten. Am Ende des einwöchigen Zeckenanheftungszeitraums wurde die gewonnenen Zecken durch einen FA auf die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht. Die Zecken wurden von 18 der 20 Impflinge gewonnen, und mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke wurde von 8 der 18 Hunde gewonnen (44%). Die Zecken wurden von 14 der 15 ungeimpften Hunde gewonnen, wobei 12 von 14 (86%) positiv auf B. burgdorferi getestet wurden. Fikrig (15) hat auch berichtet, dass weniger infizierte Zecken von geimpften Tieren als von ungeimpften Tieren gewonnen werden (Fikrig E. et al., P.N.A.S. 89 (1992), 5418-5421).
  • G. Gewinnung von B. burgdorferi aus Hautbiopsieproben
  • Die Isolierung von B. burgdorferi aus der Haut von Tieren ist als Indikator für eine B. burgdorferi-Infektion verwendet worden. Daher wurden Hautbiopsien von betäubten Tieren 18 Tage nach der Herausforderung durch die Zecken entnommen, um eine Infektion mit B. burgdorferi-infizierten Zecken nachzuweisen. B. burgdorferi wurde aus der Haut von einem der 20 (5%) geimpften Hunde im Vergleich zu 14 der 15 (93%) ungeimpften Kontrollen isoliert (Tabelle 23).
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • In Tabelle 22 wurde die theoretische Anzahl der infizierten Zecken, welche auf die Hunde aufgebracht wurden, auf die gegenwärtige Infektionsrate bezogen. Zum Beispiel waren 322/732 oder 44% der Zecken theoretisch infiziert. Folglich wird der Wert für 40% der 10 gesammelten Zecken auf 5 infizierte Zecken aufgerundet, um ein Szenarium für den schlimmsten Fall anzunehmen, dass die Wahrscheinlichkeit einer unzureichenden Anzahl an infizierten Zellen für die letztendlich wenigen Hunde in der Studie besteht. Diese Zahl wurde verwendet, um neue Infektionsraten der Population für den nächsten Hund abzuschätzen.
  • Bei der Berechnung der Wahrscheinlichkeit von mindestens einer infizierten Zecke wurden 10 Wahrscheinlichkeitswerte (1 Zecke, 2 Zecken, 3 Zecken, 4 Zecken...& 10 Zecken), basierend auf der gegenwärtige Population von infizierten Zecken und der Zecken insgesamt und der verbliebenen Zecken insgesamt, addiert. Mathematisch wurde eine hypergeometrische Verteilung verwendet, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass eine infizierte Zecke in einer Probe von 10 Zecken aus einer Population von 732 Zecken mit 322 infizierten Zecken vorhanden ist. Um mindestens eine infizierte Zecke zu erhalten, wurden die Wahrscheinlichkeiten von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 & 10 Zecken berechnet und addiert. Tabelle 23: Charakterisierung einer Infektion in Impflingen und Ungeimpften nach der Exposition mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
    Figure 00850001
    • a Hautbiopsien, entnommen von den Zeckenbißstellen zwei Wochen nach der Zeckenanheftung.
  • H. Entwicklung einer Lahmheit in Hunden nach einer Herausforderung
  • Das primäre klinische Symptom der Lyme-Krankheit in Hunden ist eine Lahmheit. Der Schutz von Hunden gegen die Lyme-Krankheit wurde durch eine wesentliche Verringerung der Anzahl an lahmenden Hunden zwischen Impflingen und Kontrollen beurteilt. Die Hunde sind nun für einen Zeitraum von 7 Monaten nach der Herausforderung durch Zecken täglich auf eine Lahmheit untersucht worden. Die Anzahl der Hunde, die eine Lahmheit und begleitende klinische Symptome gezeigt haben, ist in Tabelle 23 angegeben. Eine Lahmheit wurde bei zwei geimpften Hunden beobachtet. Bei dem einen Impfling war ein Bein betroffen, und bei dem anderen Impfling waren zwei Beine betroffen. Zehn ungeimpfte Kontrollen zeigten eine Lahmheit in Verbindung mit Lethargie und/oder Fieber bei 9 der 10 Hunden. Bei dem einen Kontrollhund waren drei Beine betroffen. Die Lahmheit schien bei ungeimpften Hunden insofern schwerer zu sein, als die Hunde unwillig waren, das betroffene Bein zu belasten. Bei der Mehrzahl der ungeimpften Hunde waren die betroffenen Gelenke geschwollen und fühlten sich warm an.
  • Die temporäre Beobachtung einer Lahmheit bei Hunden nach der Herausforderung ist in Tabelle 24 dargestellt. Die Lahmheit wurde ungefähr zwei Monate nach der Herausforderung durch Zecken zum ersten Mal bei den Hunden beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt zeigten ein Impfling und zwei Kontrollhunde eine Lahmheit. Anfang September, vier Monate nach der Exposition, ist bei einem weiteren geimpften Hund und bei vier weiteren Kontrollhunden eine Lahmheit beobachtet worden. Da nicht bekannt war, ob irgendwelche weiteren Hunde eine Lahmheit entwickeln würden, wurde die Entscheidung getroffen, bei fünf Impflingen und fünf Ungeimpften eine Obduktion durchzuführen, um festzustellen, ob B. burgdorferi aus den Hunden isoliert werden konnte. Die Gewinnung des Spirochäten aus den nicht lahmenden Hunden würde auf ein Überleben des Organismus in den Hunden hinweisen, wobei aber keine klinische Symptome vorhanden sind. Zwei der fünf Hunde in jeder Gruppe hatten eine Lahmheit gezeigt, und drei Hunde in jeder Gruppe waren normal geblieben. Da drei Hunde aus jeder Testgruppen-Population entfernt worden waren, wurde die Anzahl der Hunde in der Gruppe der Impflinge und in der ungeimpften Kontrollgruppe auf 17 bzw. 12 verringert. Sieben Monate nach der Zeckenexposition wurde eine Lahmheit bei insgesamt 2 der 17 (12%) Impflinge und 10 der 12 (83%) ungeimpften Kontrollen beobachtet. Dies entspricht einem berechneten Schutzindexwert von 85,6% und stellt eine wesentliche Verringerung (p 0,01) der klinischen Erkrankung zwischen Impflingen und Kontrollen dar. Eine Zusammenstellung des Prozentsatzes der Hunde, welche eine Lahmheit nach der Exposition zeigten, ist in 14 dargestellt.
  • Es wurden Versuche unternommen, die lahmenden Hunde innerhalb von drei bis vier Tagen während der Episode der Lahmheit zu obduzieren, um B. burgdorferi aus der Haut, den Gelenken und den Organen der Hunde zu isolieren (Tabelle 25). B. burgdorferi wurde nicht aus der Haut, den Gelenken oder den Organen von einem der beiden lahmenden geimpften Hunde isoliert, aber wurde aus der Haut und dem Gelenk des nicht lahmenden Impflings, dessen Hautbiopsie zuerst positiv war, isoliert. Im Gegensatz dazu wurde B. burgdorferi aus Hautbiopsieproben isoliert, welche bei der Obduktion von entweder der Zeckenbißstelle oder von Stellen entfernt von der Zeckenbißstelle von allen ungeimpften Kontrollhunden, welche lahmten, entnommen wurden. Der Spirochät wurde auch aus entweder den Gelenken oder den Organen von allen lahmenden ungeimpften Kontrollhunden isoliert. Der ungeimpfte Kontrollhund, dessen Hautbiopsie anfangs negativ war, blieb zum Zeitpunkt der Obduktion hinsichtlich der Hautbiopsie negativ, und B. burgdorferi wurde nicht aus den Gelenken oder den Organen des Hundes isoliert.
    Figure 00880001
    Tabelle 25: Gewinnung von B. burgdorferi aus lahmenden Hunden
    Figure 00890001
    • a Hautbiopsien entnommen von den Zeckenbißstellen zwei Wochen nach der Zeckenanheftung.
    • b Blase/Herz/Niere/Milz.
    • c B. burgdorferi wurde auch aus der Liquor cerebrospinalis isoliert.
    • d Biopsie entnommen von der Zeckenbißstelle/Biopsie entnommen von einer Stelle entfernt von der Zeckenbißstelle.
  • III. Diskussion
  • Es ist gezeigt worden, dass die humorale Immunantwort eine entscheidende Rolle bei dem Schutz von Tieren gegen die Lyme-Krankheit spielt (Barthold S.W. et al., Infect. Immunol. 61 (1993), 4696-4702; Callister et al. (1991); Callister et al. (1992); Johnson et al. (1986); Johnson et al. (1986); Johnson et al. (1988); Kochi et al. (1988); Schaible U.E. et al., P.N.A.S. 87 (1990), 3768-3722; Schmitz et al. (1991)). In dieser Studie wurden mehrere serologische Tests verwendet, um die Antikörperantwort in Hunden, die mit dem Bakterin geimpft wurden, zu charakterisieren. Der Ganzzell-ELISA wurde verwendet, um die Antikörperantwort auf Oberflächenantigene von B. burgdorferi nachzuweisen. Die Entwicklung von Antikörpertitern, welche über einen Zeitraum von sieben Monaten nach der Impfung fortbestanden, liefert einen Beweis für die Antigenität des Bakterins. Die Spezifität der Antikörperantwort wurde durch das Western-Immunblot-Verfahren gezeigt. Zum Zeitpunkt der Herausforderung, sieben Monate nach der Impfung, reagierte der Antikörper im Serum von geimpften Hunden vorwiegend mit OspA- und OspB-Oberflächenproteinen. Andere Forscher haben ebenfalls gezeigt, dass die überwiegende Antikörperantwort auf in vitro gezüchtete B. burgdorferi-Bakterien gegen die äußeren Oberflächenproteine gerichtet ist (Appel et al. (1993); Gern L. et al., J. Infect. Dis. 167 (1993), 971-975; Roerhign et al. (1992)). Der OspA-ELISA zeigte ferner das Vorhandensein eines hohen Antikörpertiters im Serum von geimpften Hunden und bestätigte die Fähigkeit des Bakterins, eine Antikörperantwort auf ein protektives Antigen des Spirochäten hervorzurufen.
  • Der Borrelia-Antikörper-Test wurde verwendet, um die funktionelle Aktivität des Antikörpers gegen B. burgdorferi im Serum von geimpften Hunden nachzuweisen. Die Antikörper-vermittelte Lyse von Borrelia resultiert aus der Kombination eines spezifischen Immunantikörpers mit Komplementkomponenten und der Bildung des Membranangriffskomplexes. Der wachstumshemmende Effekt der Antikörper-vermittelten Lyse von B. burgdorferi kann als analog zu einem virusneutralisierenden Antikörper verstanden werden. Studien haben gezeigt, dass der Schutz von Labortieren vor der Lyme-Krankheit mit den Borrelia-Antikörper-Titern korreliert (Jobe D.A. et al. (1994), J. Clin. Microbiol. (in Druck); Lourich S.D. et al., Infect. Immunol. 59 (1991), 2522-2528). Daher kann das Vorhandensein eines Borrelia-Antikörpers in geimpften Hunden als ein Beweis für die Immunogenität des Bakterins verwendet werden. Hohe Borrelia-Antikörper-Spiegel waren in allen geimpften Hunden vorhanden und waren noch zum Zeitpunkt der Herausforderung, sieben Monate nach der Impfung, nachweisbar. Der Antikörper in den Impflingen zeigte auch gegenüber dem heterologen B. burgdorferi-Stamm eine borreliazidale Aktivität. Die Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper von ungeimpften Kontrollhunden nach der Herausforderung nicht mit OspA reagierte und keine borreliazidale Aktivität zeigte, was darauf hindeutet, dass ein großer Teil der borreliazidalen Aktivität auf den Antikörper, der mit OspA und anderen protektiven Oberflächenproteinen reagiert, zurückzuführen ist. Callister und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die borreliazidale Aktivität des Antikörpers gegen B. burgdorferi in menschlichem Serum durch ein rekombinantes OspA-Protein adsorbiert werden kann (Callister S.M. et al. (1992)). So entwickelten Hunde, welche mit dem Bakterin geimpft wurden, eine protektive Antikörperantwort auf verschiedene Stämme, welche sich von den Impfstämmen unterscheiden.
  • In dieser Studie wurde ein natürliches Herausforderungsmodell von Zecken, welches mit demjenigen vergleichbar war, das durch Appel und Kollegen (Appel et al. (1993)) beschrieben wurde, verwendet, um eine Lyme-Erkrankung in Hunden hervorzurufen. Das verwendete Modell repräsentierte den natürlichen Expositionsweg, die Dosierung und die Virulenz der unter natürlichen Feldbedingungen auftretenden B. burgdorferi-Bakterien.
  • Die in dieser Studie verwendeten Zecken wurden in einem endemischen Gebiet der Lyme-Krankheit gesammelt, wobei eine Infektionsrate mit B. burgdorferi von 44% ermittelt wurde. Diese Infektionsrate ist vergleichbar mit derjenigen, welche durch Lacombe (Lacombe et al. (1993)) beschrieben wird, aber ist niedriger als jene, welche durch Appel (Appel et al. (1993)) beschrieben wird. Shih und Spielman haben gezeigt, dass infizierte Zecken B. burgdorferi auf Mäuse übertragen, nachdem sie nur 2 Tage gesaugt haben (Shih C. et al., J. Clin. Microbiol. 31 (1993), 2878-2881). Daher scheint der in dieser Studie verwendete Zeitraum von einer Woche, während dem die Zecken saugen, mehr als ausreichend. In der Tat wurde die Wirksamkeit der Herausforderung auf zwei Wegen nachgewiesen. Der Ganzzell-ELISA wies eine serologische Antwort auf B. burgdorferi in 14 von 15 ungeimpften Kontrollhunden nach der Herausforderung nach. Die Ergebnisse korrelierten mit den Hautbiopsie-Ergebnissen insofern, als es sich bei dem einen Hund, welcher eine geringe oder keine serologische Antwort zeigte, um denselben Hund handelte, dessen Hautbiopsie nach der Herausforderung negativ war und dessen Hautbiopsie bei der Obduktion negativ war. Es ist interessant zu erwähnen, dass weniger B. burgdorferi-infizierte Zecken von geimpften Hunden als von ungeimpften Kontrollhunden gewonnen wurden. Diese Ergebnisse sind ähnlich mit denen von Fikrig und Kollegen (Fikrig et al., P.N.A.S. (1992)). Diese Autoren postulieren, dass die verringerte Zahl von B. burgdorferi in Zecken von geimpften Hunden auf die antikörperverstärkte Eliminierung des Spirochäten zurückzuführen war.
  • Eine Lahmheit ist die primäre Manifestation der Lyme-Borreliose beim Hund und wurde in dieser Studie als das Hauptkriterium für eine klinische Erkrankung verwendet. Nach der Herausforderung variierte die temporäre Entwicklung einer Lahmheit bei Hunden während des Zeitraums von sieben Monaten nach der Herausforderung. Eine Lahmheit wurde bei zwei ungeimpften Kontrollhunden einen Monat nach der Herausforderung beobachtet. Jedoch trat die Mehrzahl der Episoden einer Lahmheit erst vier bis fünf Monate nach der Herausforderung auf. Appel berichtete auch, dass eine Lahmheit bei Hunden nicht früher als zwei bis fünf Monate nach der Herausforderung auftrat (Appel et al. (1993)). Zehn von zwölf ungeimpften Kontrollhunden, deren Hautbiopsie nach der Herausforderung positiv war, wurden lahm, und B. burgdorferi wurde aus der Haut und den Gelenken oder anderen Organen bei allen diesen Hunden reisoliert. Die Entdeckung, dass B. burgdorferi in der Haut und an Stellen, welche sich weit entfernt von der Zeckenbißstelle befinden, dieser Hunde bis zu sieben Monate nach der Herausforderung noch verbleiben, weist auf die evolutionäre Entwicklung des Parasiten hin, um die Übertragung von Wirt zu Wirt sicherzustellen. B. burgdorferi wurde aus den beiden geimpften Hunden, die lahm wurden, nicht reisoliert. Die Lahmheit dieser beiden Hunde kann nicht auf der Basis der humoralen Antwort erklärt werden. Eine andere mögliche Erklärung schließt die genetische Prädisposition der Hunde, die Dosierung der Spirochäten und die Effizienz der Übertragung durch die Zecken ein. Obwohl B. burgdorferi in den letzten Jahren umfassend untersucht worden ist, sind die pathogenen Mechanismen der Organismen nicht hinreichend charakterisiert. Die Fähigkeit anderer Borrelia-Spezies, sich an immunologisch privilegierten Stellen des Wirtes zu maskieren und die Abwehrmechanismen zu umgehen, ist hinreichend bekannt (Geogitis K. et al., J. Infect. Dis. 166 (1992), 440-444; Levy et al. (1992); Ramachandra R.N. et al., J. Med. Entomol. 29 (1992), 818-826), und dies ist für B. burgdorferi postuliert worden.
  • Die Wirksamkeit des Bakterins wurde durch eine wesentliche Verringerung der Lahmheit zwischen geimpften und ungeimpften Hunden, welche von B. burgdorferi-infizierten Zecken herausgefordert wurden, beurteilt. Aus der Lahmheits-Gesamthäufigkeit von 2 der 17 (12%) Impflinge im Vergleich zu 10 der 12 (83%) ungeimpften Kontrollen ergibt sich rechnerisch ein Wert für den Schutzindex von 86%. Dies entspricht einer signifikanten (p ≤ 0,01) Verringerung der Entwicklung einer klinischen Lyme-Erkrankung zwischen Impflingen und Kontrollen.
  • In dieser Studie wurde die Sicherheit des Bakterins demonstriert. Die Wirksamkeit und die Dauer der Immunität wurde durch die Fähigkeit des Impfstoffes gezeigt, die Entwicklung einer klinischen Erkrankung in geimpften Hunden im Vergleich zu den Kontrollen sieben Monate nach der Herausforderung mit B. burgdorferi-infizierten Zecken zu verringern.
  • Bei dem Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 13 und Beispiel 14 wird angenommen, dass Beispiel 14 die besseren Ergebnisse liefert, da in Beispiel 14 mehr Zecken und gesündere Zecken und bessere Hautbiopsien verwendet werden. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass Kontrollhunde klinische Anzeichen der Lyme-Krankheit zeigen, und daher wird eine Verringerung der klinischen Anzeichen in Impflingen im Vergleich zu den Kontrollen unter Verwendung des Bakterins dieser Erfindung nachgewiesen.
  • Beispiel 15
  • Studie zu einer reduzierten Dosis
  • I. Materialien und Methoden
  • A. Hunde
  • In der Studie wurden Beagle aus der Kolonie der Solvay Animal Health, Inc., Charles City, IA, verwendet. Das mittlere Alter der Hunde zum Zeitpunkt der Impfung betrug 13 Wochen (Tabelle 26). Alle Hunde waren für B. burgdorferi seronegativ (Titer < 20), wie durch einen Ganzzell-ELISA getestet wurde.
  • Tabelle 26: Geschlecht und Alter der in dieser Studie verwendeten Hunde
    Figure 00950001
  • B. Bakterin-Herstellung
  • In der Studie wurden zwei Bakterine verwendet. Das Volldosis-Bakterin wurde, wie vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, aus den Serotypen S-1-10 und C-1-11 von B. burgdorferi nach der achten Passage aus der Hauptimpfkultur hergestellt. Dieses Bakterin wurde dergestalt formuliert, um 5 × 108 Zellen je Serotyp pro 1 ml-Dosis zusammen mit 7,5% (Gew./Vol.) Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA, Reheis Chemical Co., Berkeley Hts., New Jersey) zu enthalten. Die reduzierte Dosis von Bakterin wurde durch Verdünnen des Volldosis-Bakterins auf 1:10 in einem hilfreichen Verdünnungsmittel, bestehend aus Kochsalzlösung, mit 7,5% (Gew./Vol.) Aluminiumhydroxid (Rehydragel HPA), sowie Gentamicin und Nystatin als Konservierungsmittel, hergestellt. Beide Bakterine wurden bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
  • C. Impfung
  • Zehn Hunde wurden intramuskulär in den hinteren Oberschenkel mit zwei 1,0 ml-Dosen jedes Bakterins in einem Abstand von drei Wochen geimpft. Nach jeder Impfung wurden die Hunde auf anomale Reaktionen untersucht, die Temperaturen wurden protokolliert, und die Injektionsstellen wurden während fünf Tagen täglich abgetastet. Eine Gruppe von 14 ungeimpften Hunden diente als Kontrolle.
  • D. Serologie
  • Blut wurde vor und nach der Impfung und in Intervallen nach der Herausforderung gesammelt. Das Serum wurde durch einen Ganzzell-ELISA, einen OspA-ELISA, einen Borrelia-Antikörper-Test und ein Western-Immunblot-Verfahren auf einen Antikörper gegen B. burgdorferi getestet.
  • 1. Ganzzell-ELISA
  • Die Antikörperantwort in Hunden auf Oberflächenantigene von B. burgdorferi wurde durch eine Modifikation eines Ganzzell-ELISA, der durch das Regional Animal Health Laboratory, Baron, WI, verwendet wird, bestimmt. Kulturen von B. burgdorferi C-1-11 und S-1-10 in der späten log-Phase wurden mit binärem Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Die Vertiefungen von Immulon-3-Platten (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 0,3 μg Ganzzellantigen von S-1-10 oder C-1-11 in einem Natriumcarbonat enthaltenden Beschichtungspuffer beschichtet. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer bei 4°C für 15 bis 17 Stunden inkubiert. Die Inhalte der Vertiefungen wurden verworfen, und freie reaktive Stellen wurden durch die Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 5% Magermilchpulver (PBS-NFDM), blockiert und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden entleert, und 50 μl Testserum, verdünnt in PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-TW), wurden zu Vertiefungen in doppelter Ausfertigung zugegeben und in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Positives und negatives Hunde-Kontrollserum wurde auf jeder Platte eingeschlossen. Die Platten wurden dreimal mit Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen, und 50 μl-Aliquots eines Peroxidase-markierten Ziege-anti-Hund-IgG's (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), verdünnt 1:1500 in PBS-TW, wurden pro Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden in einer feuchten Kammer für 60 Minuten bei 37°C inkubiert und dreimal mit PBS-TW gewaschen. Das Substrat durch Lösen von 30,0 mg O-Phenylendiamin in einer Lösung aus 0,051 M dibasischem Natriumphosphat, 0,024 M Citronensäure und 0,012% Wasserstoffperoxid hergestellt, und 100 μl-Aliquots wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2 N Schwefelsäure pro Vertiefung gestoppt, und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 490 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab, definiert.
  • 2. OspA-ELISA
  • Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit 75 ng eines rekombinanten OspA von S-1-10 oder C-1-11 beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 5% NFDM in PBS für 60 Minuten bei 37°C nachbeschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl von Hundeserum-Zweifachverdünnungen wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde wurden die Vertiefungen mit PBS-TW gewaschen, und 50 μl Ziege-anti-Hund-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Der gebundene Antikörper wurde durch die Zugabe von ABTS-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, die eine optische Dichte von 30% der höchsten optischen Dichte ergab, definiert.
  • 3. Western-Immunblot-Verfahren
  • Kulturen von B. burgdorferi S-1-10 und C-1-11 in der mittleren bis späten log-Phase wurden durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4°C für 30 Minuten geerntet. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen. Suspensionen von etwa 1 × 108 Zellen wurde in Elektrophorese-Probenpuffer für 9 Minuten gekocht und auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen (Laemmli, 1970). Die aufgetrennten Proteine wurden durch eine Modifikation des durch Towbin (Towbin et al., 1979) beschriebenen Verfahrens mittels Elektroblotting auf eine ImmobilonTM-PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde für 90 Minuten bei 22°C in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2 (TBS) mit 5% NFDM inkubiert. Streifen davon wurden mit Hundeserum oder einem monoclonalen Antikörper gegen OspA, 1:75 verdünnt in dem Blockierungspuffer, für 60 Minuten bei 22°C inkubiert. Die Streifen wurden dann zweimal in TBS, enthaltend 0,2% Triton X-100, und einmal in TBS gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde durch die Zugabe von Ziege-anti-Hund-IgG • HRP oder Ziege-anti-Maus-IgG·HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Proteinbanden wurden mit einem TMB-Membran-Peroxidasesubstrat-System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) sichtbar gemacht.
  • F. Nachweis eines Borrelia-Antikörpers durch Durchflußcytometrie
  • Der Borrelia-Antikörper-Test wurde mittels einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren (6, 7) durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden 72-Stunden-Kulturen des B. burgdorferi-Isolats C-1-11 und S-1-10 in der mittleren log-Phase in modifiziertem Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)-Medium in einer Petroff-Hauser-Zählkammer quantifiziert und auf 1 × 106 Zellen/ml BSK-Medium verdünnt. 100 μl-Aliquots eines verdünnten, hitzeinaktivierten Serums wurden mit 100 μl jeder B. burgdorferi-Suspension gemischt, und 10 μl Meerschweinchenserum-Komplement (210 CH50-Einheiten; GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) wurden zugegeben. Die Suspension wurde vorsichtig gemischt und bei 32°C für 16 bis 24 Stunden inkubiert. Nach Inkubation der Reaktionsröhrchen wurden 100 μl des Reaktionsgemisches mit PBS, enthaltend 5,4 × 10–9 M Acridinorange, verdünnt. Der Nachweis einer borreliazidalen Aktivität erfolgte mittels einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren (Callister et al. (1994)). Eine Abtötung durch Borrelia-Antikörper bewirkt die Bildung von Bläschen in den Zellwänden von B. burgdorferi, wodurch höhere Konzentrationen an Acridinorange auf und innerhalb dieser geschädigten Zellwände adsorbiert werden. Folglich fluoreszieren abgetötete B. burgdorferi-Organismen mit einer sehr viel höheren Intensität als normale lebende Spirochäten. Eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität von ≥ 16% im Vergleich zu Organismen, die normalem Hundeserum ausgesetzt werden, wurde als positiver Beweis für eine borreliazidale Aktivität angesehen. Der Endpunkttiter wurde als reziproker Wert der letzten Verdünnung, bei der eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität von ≥ 16% beobachtet wurde, ausgedrückt. Hunde mit einem Titer von < 20 wurden als seronegativ definiert.
  • G. Herausforderung
  • Insgesamt wurden 300 männliche und 360 weibliche I. scapularis-Zecken in einem endemischem Gebiet der Lyme-Krankheit nahe Ettrick, Wisconsin, gesammelt. Zur Ermittlung der gesamten B. burgdorferi-Infektionsrate der Zecken wurde der Mitteldarm von 49 männlichen I. scapularis-Zecken durch einen Fluoreszenzantikörpertest (FA) unter Verwendung des monoclonalen OspA-Antikörpers, welcher von Dr. A.G. Barbour erhalten wurde, untersucht. Vier Wochen nach der zweiten Impfung wurde jeder Hund mit 10 weiblichen und 6 männlichen Zecken herausgefordert. Weibliche Zecken sind die einzigen erwachsenen Zecken, welche die Krankheit übertragen. Männliche Zecken sind erforderlich, damit die weiblichen Zecken richtig saugen. Fünf weibliche und drei männliche Zecken wurden zufällig aus dem Pool von Zecken ausgewählt und in zwei kleine Petrischalen gesetzt, die auf einer rasierten Fläche auf dem linken anterior-dorsalen Bereich der Brust jedes Hundes befestigt wurden. Die Zecken ließ man während einer Woche saugen und sie wurden in Intervallen von zwei Tagen untersucht. Eine Woche nach der Anheftung wurden die Zecken gewonnen, und der Mitteldarm wurde durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper auf die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht.
  • H. Untersuchung auf klinische Anzeichen
  • Die Hunde wurden nach der Herausforderung täglich auf klinische Anzeichen in Verbindung mit der Lyme-Krankheit untersucht. Die als Indikatoren für eine klinische Lyme-Erkrankung verwendeten klinischen Anzeichen waren Lahmheit, Lethargie und Fieber. Eine Lahmheit wurde als das Widerstreben einer Gewichtsbelastung eines betroffenen Beines, mit oder ohne einer Schwellung und einer Temperatur des betroffenen Gelenks, Steifheit der Beine und die Wanderung der Lahmheit von Gelenk zu Gelenk oder von Gliedmaß zu Gliedmaß definiert.
  • I. Isolierung von B. burgdorferi
  • Für die Isolierung von B. burgdorferi wurden Proben der Haut, der Gelenke und der Organe der Hunde gesammelt. Hautbiopsien wurden von der Zeckenanheftungsstelle und von Stellen entfernt von der Zeckenbißstelle von betäubten Hunden 21 Tage nach der Zeckenanheftung und zum Zeitpunkt der Obduktion entnommen. Die entfernten Stellen befanden sich ventral zu der Zeckenbißstelle, posterior zu der Zeckenbißstelle und auf der rechten Seite des anterior-dorsalen Bereiches der Brust auf der gegenüberliegenden Seite des Hundes. Die Haut wurde rasiert, mit Solvahex-Desinfektionsmittel gewaschen und mit sterilem Wasser gründlich gespült, um das restliche Desinfektionsmittel zu entfernen. Ein ellipsenförmiger Schnitt wurde durch die dermalen und subkutanen Hautschichten vorgenommen. Etwa 1 g Haut wurde in 9 ml BSK-Medium, enthaltend 0,15% Agarose und 40 μg Rifampin/ml, eingebracht. Die Biopsieprobe wurde homogenisiert, und zwei weitere Zehnfachverdünnungen des Homogenats wurden in 9 ml-Blindproben des BSK-Mediums hergestellt. Die Kulturen wurden bei 32°C für 6 Wochen inkubiert und drei und sechs Wochen nach der Beimpfung mikroskopisch auf das Wachstum von Spirochäten untersucht. Kulturen, die ein Wachstum von Spirochäten zeigen, wurden durch einen FA mit dem monoclonalen B. burgdorferi-Antikörper als B. burgdorferi identifiziert. Kulturen, die nach 6-wöchiger Inkubation hinsichtlich des Wachstums von Spirochäten negativ waren, wurden verworfen. Zum Zeitpunkt der Obduktion wurden das Herz, die Milz, die Nieren und die Blase entnommen und in 50 ml BSK-Medium, enthaltend Agarose und Rifampin, unter Verwendung einer Stomacher-Vorrichtung (Seward Medical, London, England) homogenisiert. Eine 50 ml-Probe wurde abgefüllt, und Zehnfachverdünnungen davon wurden in BSK-Medium hergestellt. Die Kulturen wurden für 6 Wochen bei 32°C inkubiert, untersucht und durch einen FA als B. burgdorferi identifiziert. Eine 2-3 ml-Probe von Liquor cerebrospinalis wurde zu 9 ml BSK-Medium zugegeben, und eine weitere 1:10-Verdünnung wurde in demselben Medium hergestellt, inkubiert und untersucht, wie beschrieben wurde. Aus dem Ellbogen, Vorderfußwurzelgelenk, Knie und Fußwurzelgelenk wurde Gelenkgewebe entnommen. Das Gewebe jedes Gelenks wurde zu 9 ml BSK-Medium, enthaltend Agarose und Rifampin, zugegeben. Eine weitere 1:10-Verdünnung wurde in demselben Medium hergestellt, und die Kulturen wurden inkubiert und untersucht, wie beschrieben wurde.
  • II. Ergebnisse
  • A. Impfung
  • Die Hunde wurden mit zwei Dosen von Bakterin in einem Abstand von drei Wochen geimpft. Es wurden keine lokalen oder systemischen Reaktionen bei irgendeinem der Hunde beobachtet. Die Temperaturen der Hunde in beiden Impfgruppen blieben nach der ersten bzw. der zweiten Dosis von Bakterin normal (Tabelle 27 bzw. 28).
  • Tabelle 27: Temperaturen der Hunde nach der ersten Impfung
    Figure 01020001
  • Tabelle 28: Temperaturen der Hunde nach der zweiten Impfung
    Figure 01030001
  • B. Antikörperantwort auf B. burgdorferi-Ganzzellantigene
  • Ein ELISA der B. burgdorferi-Zellen benutzt wurde zum Nachweis der serologischen Antwort von geimpften und herausgeforderten Hunden auf Oberflächenantigene von B. burgdorferi verwendet. Vor der Impfung waren alle Hunde seronegativ. Vier Wochen nach der zweiten Impfung wiesen Hunde, welche mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, einen Antikörper-GMT von 788 gegen C-1-11 und einen GMT von 520 gegen S-1-10 auf (Tabelle 29). Hunde, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, wiesen einen etwas niedrigeren GMT von 485 gegen C-1-11 und einen identischen GMT von 520 gegen S-1-10 auf. Nach der Herausforderung erhöhten sich die Antikörpertiter gegen C-1-11 und S-1-10 in beiden Bakterin-Gruppen auf nahezu den gleichen Wert. Zwölf Wochen nach der Herausforderung war der Ganzzell-Antikörper-GMT von ungeimpften Kontrollhunden höher als der Ganzzell-GMT von geimpften Hunden. Der GMT bei ungeimpften Kontrollen betrug 1502 und 2301 gegen C-1-11 bzw. S-1-10. Ein ungeimpfter Kontrollhund blieb zwölf Wochen nach der Exposition seronegativ.
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • C. Western-Immunblot-Verfahren
  • Serum von geimpften und ungeimpften Kontrollhunden wurde vor und nach der Impfung und der Herausforderung untersucht, um die Reaktivität des Antikörpers mit spezifischen Antigenen von B. burgdorferi zu bestimmen. Alle Hunde waren vor der Impfung seronegativ. Die Antikörperantworten gegen B. burgdorferi C-1-11 bzw. S-1-10 in Hunden, welche mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, sind in den 1 und 2 dargestellt. Die Antikörperantwort war vorwiegend gegen die OspA- und OspB-Proteine von C-1-11 und S-1-10 gerichtet. Hunde, die mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, reagierten mit den OspA- und OspB-Proteinen von C-1-11 und S-1-10, welche ein Molekulargewicht von 31 bzw. 34 Kilodalton aufweisen, in nahezu demselben Ausmaß. Unterschiede in den Färbungsmustern der OspA-Proteine von C-1-11 und S-1-10 weisen auf den deutlichen antigenen Unterschied zwischen den beiden Isolaten hin. Bei einigen Hunden wurde eine geringe Reaktivität gegenüber anderen Proteinen des Spirochäten beobachtet. Hunde, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, entwickelten ebenfalls Antikörper gegen die OspA- und OspB-Proteine von C-1-11 und S-1-10 (3 und 4). Die Färbungsintensität des Antikörperprofils bei Hunden, welche mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, zeigte, dass das Ausmaß der OspA-Antwort identisch war mit derjenigen, welche bei Hunden beobachtet wurde, die das Volldosis-Bakterin erhielten. Zwölf Wochen nach der Herausforderung war das Antikörperprofil bei Hunden aus der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin im Wesentlichen unverändert. Die Reaktivität gegenüber OspA und OspB blieb die bedeutendste Antikörperantwort, welche nachgewiesen wurde. Jedoch wurde, wenn überhaupt, eine geringe Antikörperantwort auf andere Proteine von Borrelia nach der Herausforderung beobachtet. Nach der Herausforderung wurde bei einigen Impflingen eine Verringerung der Färbungsintensität gegenüber OspA und OspB beobachtet, welche aber bei Hunden aus beiden Bakterin-Gruppen auftrat. Obwohl bei einigen Hunden eine unspezifische Färbung beobachtet wurde, waren alle ungeimpften Kontrollhunde für B. burgdorferi seronegativ und waren alle geimpften Kontrollhunde vor der Impfung für B. burgdorferi seronegativ. Bei keinem der ungeimpften Kontrollhunde wurde eine Reaktivität gegenüber OspA und OspB nachgewiesen (5 und 6). Das Antikörperprofil bei Kontrollhunden nach der Herausforderung unterschied sich drastisch von dem Antikörperprofil, das bei geimpften Hunden nach der Herausforderung beobachtet wurde. Ungeimpfte Kontrollhunde entwickelten, wenn überhaupt, eine geringe Antwort auf OspA- und OspB-Proteine nach der Herausforderung, aber entwickelten Antikörper gegen eine Vielzahl von anderen Antigenen von B. burgdorferi.
  • D. OspA-ELISA
  • Ein ELISA welcher rekombinante OspA nützt wurde verwendet, um die Antikörperantwort auf ein wichtiges protektives Antigen in Hunden, welche mit dem Volldosis-Bakterin und der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, zu bestimmen. Es wurde kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des OspA-Antikörper-GMT gegen das B. burgdorferi-Isolat C-1-11 oder S-1-10 zwischen Hunden beobachtet, welche das Volldosis-Bakterin oder die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten. Hunde, die mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, entwickelten einen OspA-Antikörper-GMT von 452 für C-1-11, verglichen mit einem GMT von 368 gegen C-1-11 bei Hunden, welche die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten (Tabelle 30). Der OspA-Antikörper-GMT in der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin gegen S-1-10 betrug 299 bzw. 394. Die Beobachtung, dass Antikörper gegen OspA von C-1-11 und S-1-10 bei keinem der ungeimpften Kontrollhunde nach der Herausforderung durch Zecken durch einen ELISA nachgewiesen wurden, korreliert mit dem fehlenden Nachweis des OspA-Antikörpers durch das Immunblot-Verfahren.
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • E. Borrelia-Antikörper-Antwort
  • Die funktionelle Aktivität des Antikörpers, welcher gegen B. burgdorferi als Ergebnis einer Impfung mit dem Bakterin hervorgerufen wurde, wurde in dem Borrelia-Antikörper-Test gemessen. Der Borrelia-Antikörper wurde durch die Hemmung des Wachstums von B. burgdorferi als Ergebnis einer Antikörper-vermittelten Lyse des Organismus nachgewiesen. Hunde, die mit entweder dem Volldosis-Bakterin oder der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden, entwickelten hohe Titer des Borrelia-Antikörpers gegen sowohl S-1-10 als auch C-1-11 (Tabelle 31). Der Borrelia-Antikörper-GMT bei Hunden, die das Volldosis-Bakterin erhielten, betrug 970 gegen C-1-11, verglichen mit einem GMT von 640 gegen C-1-11 bei Hunden, welche die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten. Für den Borrelia-Antikörper-GMT gegen S-1-10 war in beiden Bakterin-Gruppen 597.
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • F. Herausforderung von Hunden mit B. burgdorferi-infizierten Zecken
  • Insgesamt wurden 660 I. scapularis-Zecken (360 Weibchen und 300 Männchen) für die Herausforderung der Hunde verwendet. Die Infektionsrate mit B. burgdorferi in den Zecken betrug 45%, wie durch eine FA-Analyse des Mitteldarms von männlichen Zecken bestimmt wurde. Diese Infektionsrate ist vergleichbar mit der Infektionsrate von 44%, welche in dem obigen Beispiel 14 angegeben wurde, und ist wiederum vergleichbar mit der Infektionsrate von 47%, welche von Lacombe und Mitarbeiter (Lacombe et al. (1993)) beschrieben wurde. Im Allgemeinen hefteten sich die Zecken innerhalb von 24 Stunden an, und die meisten Zecken saugten bis zur vollständigen oder nahezu vollständigen Sättigung während des einwöchigen Herausforderungszeitraums voll. Zecken, die von dem Hund abgefallen waren, wurden in der Schale zurückgehalten. Am Ende der einwöchigen Zeckenanheftungsperiode wurden die gewonnenen Zecken durch einen FA auf die Anwesenheit von B. burgdorferi untersucht. Zecken wurden von 10 der 10 Volldosis-Impflinge gewonnen, wobei mindestens eine B. burgdorferi-infizierten Zecke von 3 der 10 Impflinge (30%) gewonnen wurde. In der Gruppe mit der reduzierten Dosis wurden Zecken von 10 der 10 Impflinge gewonnen, wobei 40% mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke aufwiesen. Zecken wurden von 14 der 14 ungeimpften Hunden gewonnen, wobei 12 von 14 (86%) mindestens eine B. burgdorferi-infizierte Zecke aufwiesen. Die Beobachtung, dass weniger infizierte Zecken von geimpften Tieren als von ungeimpften Tieren gewonnen wurden, wurde zuvor in dem Immunogenicity Test and Duration of Immunity Study Research Report, 28. Dezember 1993, beschrieben, und ist in Fikrig et al. (1992) veröffentlicht worden.
  • G. Isolierung von B. burgdorferi aus Hautbiopsieproben
  • Es ist gezeigt worden, dass die Haut von Hunden eine gute Quelle für die Gewinnung von B. burgdorferi nach einer Exposition mit infizierten Zecken ist (Immunogenicity Test and Duration of Immunity Study Research Report, 28. Dezember 1993). Folglich kann die Isolierung von B. burgdorferi aus den Hautbiopsien von Hunden als ein Nachweis für eine B. burgdorferi-Infektion und als ein Indikator für die Eliminierung des Spirochäten aus dem Hund verwendet werden. Die Hunde wurden 21 Tage nach der Herausforderung durch Zecken betäubt, wobei von allen geimpften und ungeimpften Hunden Hautbiopsien entnommen wurden. B. burgdorferi wurde aus keiner der Hautbiopsien irgendeines der 10 Hunde in der Volldosis-Bakterin-Gruppe isoliert. In der Gruppe mit der reduzierten Dosis wurde B. burgdorferi aus 1 von 10 Hunden isoliert (Tabelle 32). Im Gegensatz dazu waren die Hautbiopsien von 12 der 14 (86%) ungeimpften Kontrollhunde 21 Tage nach der Herausforderung für B. burgdorferi positiv. Interessanterweise war der eine ungeimpfte Kontrollhund, welcher nach der Herausforderung im Ganzzell-ELISA seronegativ war, einer der beiden Kontrollhunde, deren Hautbiopsie negativ war.
  • Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • H. Entwicklung von klinischen Anzeichen bei Hunden nach einer Herausforderung
  • Lahmheit, Lethargie und Fieber waren die klinischen Anzeichen einer Lyme-Erkrankung bei Hunden, die verwendet wurden, um den Grad des Schutzes zu beurteilen, welcher durch die Bakterine gewährleistet wird. Acht Monate nach der Herausforderung durch Zecken wies ein Hund (10%) in der Volldosis-Bakterin-Gruppe Lahmheit auf, und zwei Hunde (20%) in der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin wiesen Lahmheit auf (Tabelle 32). Ähnlich wie in der Studie zur Immunogenität/Dauer zeigten Hunde, die entweder das Volldosis-Bakterin oder die reduzierte Dosis von Bakterin erhielten, vier Monate nach der Herausforderung keine Lahmheit. Eine Lahmheit ist für 8 von 14 Hunden (57%) in der ungeimpften Kontrollgruppe berichtet worden. Daraus ergibt sich ein Schutzindex von 83% für die Volldosis-Bakterin-Gruppe und ein Schutzindex von 65% für die Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin. Eine Lahmheit wurde bei einem Bein bei den Impflingen und den ungeimpften Kontrollen beobachtet. Wie in der Studie zur Immunogenität/Dauer gezeigt, trat die Entwicklung einer Lahmheit bei Hunden in dem natürlichen Zecken-Herausforderungsmodell über einen längeren Zeitraum auf. Die temporäre Beobachtung einer Lahmheit für Hunde in der Studie mit einer reduzierten Dosis ist in 7 dargestellt. Im Vergleich zu der Studie zur Immunogenität/Dauer trat die Entwicklung einer Lahmheit bei ungeimpften Kontrollhunden in der Studie zu einer reduzierten Dosis über einen etwas längeren Zeitraum auf. Die Hunde wurden auf andere klinische Symptome einer Lyme-Erkrankung einschließlich Fieber und Lethargie überwacht. Der eine lahmende Hund in der Volldosis-Bakterin-Gruppe zeigte kein Fieber von ≥ 103,5°F, noch zeigte der Hund irgendeine Lethargie. Einer der beiden lahmenden Hunde in der Gruppe mit der reduzierten Dosis hatte für einen Tag Fieber von 103,7°F. Alle ungeimpften Kontrollhunde wiesen Temperaturen von ≥ 103,5°F zum Zeitpunkt der Beobachtung einer Lahmheit auf. Bei keinem der lahmenden Hunde wurde eine Lethargie beobachtet.
  • I. Isolierung von B. burgdorferi aus lahmenden Hunden
  • Die Hunde wurden innerhalb von 3 bis 4 Tagen während der Episode einer Lahmheit obduziert, und Proben der Haut, Gelenke und Organe wurden zur Isolierung von B. burgdorferi kultiviert. B. burgdorferi wurde nicht aus den lahmenden Impflingen in der Volldosis-Bakterin-Gruppe und der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin isoliert (Tabelle 32). Im Gegensatz dazu wurde B. burgdorferi aus der Haut und den Gelenken von allen lahmenden ungeimpften Kontrollen und aus der Milz eines lahmenden Kontrollhundes isoliert. Bei allen Kontrollhunden wurde der Spirochät aus Hautbiopsieproben gewonnen, welche an Stellen entfernt von dem Zeckenbiß entnommen wurden. Die Ergebnisse, welche die Gewinnung von B. burgdorferi aus lahmenden ungeimpften Kontrollhunden, aber nicht aus lahmenden Impflingen zeigen, wurden in der der Studie zur Immunogenität/Dauer beschrieben.
  • III. Diskussion
  • Das in der Studie verwendete Volldosis-Bakterin enthielt 5 × 108 Zellen jedes B. burgdorferi-Isolats aus zwei verschiedenen seroprotektiven Gruppen. Die Ergebnisse zeigten, dass geimpfte Hunde einen Borrelia-Antikörper bilden, welcher gegen die wichtigsten protektiven Antigene von B. burgdorferi gerichtet war. Ein Zecken-Herausforderungs-modell wurde entwickelt und dazu verwendet, die Fähigkeit des Bakterins zu beurteilen, Hunde gegen eine klinische Lyme-Erkrankung zu schützen. Sieben Monate nach der zweiten Impfung wurden die Hunde mit B. burgdorferi-infizierten Zecken herausgefordert und für weitere sieben Monate überwacht. Das Bakterin schützte die Hunde gegen klinische Symptome einer Lyme-Erkrankung, welche Lahmheit, Fieber und Lethargie einschlossen. Die Beobachtung, dass B. burgdorferi nicht aus lahmenden Impflingen, aber aus allen lahmenden Kontrollhunden isoliert wurde, weist auf eine vermehrte Eliminierung des Spirochäten in den geimpften Hunden hin. Die Daten der Studie wurden durch die APHIS als Beweis für die Immunogenität und die Dauer der Immunität des Bakterins anerkannt.
  • Das Zecken-Herausforderungs-modell wurde zu einem relativ späten Stadium in der Entwicklung des vorstehend beschriebenen Bakterins in den Bakterin-Wirksamkeitstest einbezogen. Daher sind keine Studien zu minimalen Immunisierungsdosen durchgeführt worden. Dieses Beispiel veranschaulicht die Impfung von Hunden mit einem Bakterin, worin die Anzahl jedes Isolat von B. burgdorferi um das 10-fache verringert war. Als ein Vergleich zu der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin wurden weitere Hunde mit dem Bakterin geimpft, welches die ursprüngliche Volldosis von Bakterin enthält. Da die Dauer der Immunität vorher demonstriert wurde, wurden die Hunde in der Studie zu der reduzierten Antigendosis vier Wochen nach der zweiten Impfung herausgefordert. Das Zecken- Herausforderungs-modell wurde in der Studie zu der reduzierten Antigendosis erneut verwendet, da das Expositionsmodell der maßgeblichste Test für eine Impfstoffwirksamkeit ist.
  • Als ein erster Schritt bei der Bestimmung, ob die Verringerung der Zellzahlen von B. burgdorferi die Wirksamkeit des Bakterins beeinflußte, wurde die humorale Immunantwort von Hunden beurteilt, wobei die Ganzzell-Borrelia- und OspA-Antikörper-Titer von Hunden in der Gruppe mit der reduzierten Dosis gemessen wurden. Im Allgemeinen waren die Antikörpertiter bei Hunden, die mit dem Volldosis-Bakterin geimpft wurden, etwas höher als der Titer bei Hunden, die mit der reduzierten Dosis von Bakterin geimpft wurden. Jedoch unterschieden sich Antikörpertiter zwischen den Bakterin-Gruppen um nicht mehr als das 2-fache und waren nicht signifikant verschieden. Die Antikörpertiter in der Studie zu der reduzierten Dosis waren vergleichbar mit den Titern, welche in der Studie zur Immunogenität/Dauer beschrieben wurden (Tabelle 33). Die Tatsache, dass die Bakterine, die in der Studie zu der reduzierten Dosis verwendet wurden, ein zusätzliches Jahr bei 4°C gelagert wurden, ist ein Beweis für die Stabilität des Bakterins. Bedeutsamer ist, dass die Ergebnisse die Reproduzierbarkeit der Versuchsbedingungen und die Gleichheit des Bakterins in der reduzierten Dosis und in der Volldosis im Hinblick auf das Hervorrufen einer ähnlichen humoralen Immunantwort auf B. burgdorferi demonstrierten.
  • Figure 01210001
  • Die Isolierung von B. burgdorferi aus Gewebeproben von Hunden ist als ein Indikator für eine Infektion mit dem Spirochäten verwendet worden. Beispiel 14, worin das Volldosis-Bakterin verwendet wurde, zeigt, dass nach einer Exposition mit B. burgdorferi-infizierten Zecken, der Spirochät eher bei den weniger geimpften Hunden gewonnen wurde als bei den ungeimpften Kontrollhunden aus der Haut gewonnen wurde. Dieses Beispiel zeigt auch, dass B. burgdorferi nach der Herausforderung durch Zecken bei weniger Impflingen als Kontrollhunden aus Hautbiopsien gewonnen wurde. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe mit der reduzierten Dosis von Bakterin und der Volldosis-Bakterin-Gruppe im Hinblick auf die Gewinnung von B. burgdorferi aus Hautbiopsien nach der Herausforderung beobachtet. Der Unterschied zwischen Impflingen und Kontrollhunden bei der Isolierung von B. burgdorferi aus Gewebeproben wurde auch zum Zeitpunkt der Obduktion der lahmenden Hunde beobachtet. B. burgdorferi wurde aus keinem Gewebe des einen lahmenden Hundes in der Volldosis-Bakterin-Gruppe oder aus einem der beiden Hunde in der Gruppe mit der reduzierten Dosis gewonnenen. Diese Ergebnisse sind identisch mit den Ergebnissen aus der Studie zur Immunogenität/Dauer. Im Gegensatz dazu wurde B. burgdorferi aus allen lahmenden ungeimpften Kontrollhunden in sowohl der Studie zur Immunogenität/Dauer als auch in der Studie zu der reduzierten Dosis isoliert. Obwohl die Mechanismen nicht aufgeklärt worden sind, zeigten diese Beobachtungen, dass das Volldosis-Bakterin und die reduzierte Dosis von Bakterin hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Spirochätenbelastung bei den Hunden zum Zeitpunkt der Infektion zu verringern und/oder eine Immunantwort hervorzurufen, welche eine vermehrte Eliminierung des Spirochäten zur Folge hatte, vergleichbar waren.
  • Die primären klinischen Anzeichen einer Lyme-Erkrankung beim Hund sind Lahmheit und in einem geringeren Maße Fieber und Lethargie. Die Studie zur Immunogenität/Dauer, welche mit dem Volldosis-Bakterin in Beispiel 14 durchgeführt wurde, zeigte, dass eine Lahmheit und andere klinische Symptome bei 12% der Impflinge, verglichen mit 83% der ungeimpften Kontrollen, beobachtet wurden. In der Studie zu der reduzierten Dosis wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wobei eine Lahmheit von 10% für die Volldosis-Gruppe und von 20% für die Gruppe mit der reduzierten Dosis berichtet wurde. In beiden Studien trat die Lahmheit bei ungeimpften Kontrollhunden beginnend zwei Monate nach der Herausforderung und dann in periodisch wiederkehrenden Zeiträumen auf. Am Ende der Studie zur Immunogenität/Dauer, acht Monate nach der Herausforderung, wurde bei etwa 80% der ungeimpften Kontrollhunde eine Lahmheit beobachtet. In der Studie zu der reduzierten Dosis ist acht Monate nach der Herausforderung durch Zecken bei etwa 60% der ungeimpften Kontrollen eine Lahmheit beobachtet worden. Die chronische Natur der Krankheit und das verzögerte Auftreten von klinischen Symptomen ist unter Verwendung eines Herausforderungsmodells, das der natürlichen Feldherausforderung sehr nahe kommt, nicht unerwartet. Bei Appel et al. (1993) wird berichtet, dass die Manifestation einer klinischen Lyme-Erkrankung einschließlich einer Lahmheit erst fünf Monate nach der Herausforderung der Hunde mit infizierten Zecken beobachtet wurde. Der Grund für den längeren Zeitraum bei der Entwicklung einer klinischen Erkrankung in der Studie zu der reduzierten Dosis ist nicht bekannt. In der Studie zu der reduzierten Dosis waren die Parameter der Herausforderung durch Zecken, wie die Anzahl der infizierten Zecken pro Hund und die Infektionsraten der Zecken, vergleichbar mit den Parametern, welche in der Studie zur Immunogenität/Dauer, Beispiel 14, verwendet wurden. Obwohl das Zecken-Herausforderungs-modell den natürlichen Expositionsweg, die Dosierung und die Virulenz von B. burgdorferi, welche der Hund ausgesetzt ist, wiedergibt, sind es diese Parameter, welche das Ergebnis der Herausforderung ganz direkt beeinflussen.
  • Die in diesem Beispiel vorgestellten Daten zeigen, dass ein Bakterin, das in einer reduzierten Antigendosismenge zubereitet ist, im Hinblick auf das Hervorrufen einer protektiven Antikörperantwort auf B. burgdorferi und im Hinblick auf die Verringerung der Infektion mit dem Spirochäten nach der Herausforderung durch Zecken genauso wirksam wie das Volldosis-Bakterin ist. Sowohl das Volldosis-Bakterin als auch die reduzierte Dosis von Bakterin schützten die Hunde vor den klinischen Symptomen einer Lyme-Erkrankung.
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Claims (32)

  1. Bakterin, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  2. Bakterin gemäß Anspruch 1, das zwei nicht-kreuzprotektive, inaktivierte Borrelia burgdorferi-Isolate umfasst.
  3. Bakterin gemäß Anspruch 2, das zusätzlich eine wirksame immunisierende Menge eines dritten nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolats umfasst.
  4. Bakterin, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens einer antigenen Untereinheit, die von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolaten abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der antigenen Untereinheit wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  5. Bakterin gemäß Anspruch 4, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit umfasst, die von einem ersten Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet ist, eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit, die von einem zweiten, nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolat abgeleitet ist, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  6. Bakterin gemäß Anspruch 5, das zusätzlich eine wirksame immunisierende Menge einer antigenen Untereinheit eines dritten Borrelia burgdorferi-Isolats umfasst.
  7. Bakterin, das je Dosis eine wirksame immunisierende Menge von mindestens zwei nicht-kreuzprotektiven, inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolaten und eine oder mehrere antigene Untereinheiten der nicht-kreuzprotektiven Isolate, ein Adjuvans in einer Menge, die zur Verstärkung der Immunogenität der inaktivierten Borrelia burgdorferi-Isolate und der antigenen Untereinheiten wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfasst.
  8. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7, wobei die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven Isolate von inaktiviertem Borrelia burgdorferi eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 1010 Organismen je Isolat ist.
  9. Bakterin gemäß Anspruch 8, wobei die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven Isolate von inaktiviertem Borrelia burgdorferi eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 109 Organismen je Isolat ist.
  10. Bakterin gemäß Anspruch 9, wobei die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven Isolate von inaktiviertem Borrelia burgdorferi eine Menge von etwa 104 Organismen bis etwa 108 Organismen je Isolat ist.
  11. Bakterin gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die wirksame immunisierende Menge der nicht-kreuzprotektiven Isolate von inaktiviertem Borrelia burgdorferi etwa 107 Organismen je Isolat, etwa 5 × 107 Organismen je Isolat oder etwa 5 × 108 Organismen je Isolat ist.
  12. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die wirksame immunisierende Menge der antigenen Untereinheiten, die von jedem der nicht-kreuzprotektiven Borrelia burgdorferi-Isolate abgeleitet sind, eine Menge von etwa zehn Mikrogramm bis etwa 10.000 Mikrogramm ist.
  13. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 bis 11, wobei die nicht-kreuzprotektiven Isolate von Borrelia burgdorferi durch einen Wirkstoff inaktiviert sind, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus binärem Ethylenimin, Formalin oder β-Propriolacton.
  14. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, 7 bis 11 oder 13, wobei die nicht-kreuzprotektiven Isolate von Borrelia burgdorferi aus den seroprotektiven Gruppen A, B oder C von Borrelia burgdorferi-Isolaten ausgewählt sind.
  15. Bakterin gemäß Anspruch 14, wobei das seroprotektive Gruppe A-Borrelia burgdorferi-Isolat das Isolat S-1-10, 297 oder B31 ist.
  16. Bakterin gemäß Anspruch 14, wobei das seroprotektive Gruppe B-Borrelia burgdorferi-Isolat das Isolat C-1-11 ist.
  17. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumhydroxid, Saponin, Aluminiumphosphat, Carbopol, Lipopolysaccharid und Derivaten vom Lipopolysaccharid.
  18. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die wirksame Menge des Adjuvans eine Menge von etwa 1 Volumen-% bis etwa 15 Volumen-% ist.
  19. Bakterin gemäß Anspruch 18, wobei die wirksame Menge des Aluminiumhydroxid-Adjuvans eine Menge von etwa 5 Volumen-% bis etwa 10 Volumen-% ist.
  20. Bakterin gemäß Anspruch 18, wobei die wirksame Menge des Adjuvans etwa 7,5 Volumen-% ist.
  21. Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der geeignete Träger einen wässrigen Puffer und Konservierungsstoffe umfasst.
  22. Bakterin gemäß Anspruch 21, wobei der wässrige Puffer physiologische Kochsalzlösung ist.
  23. Bakterin gemäß Anspruch 21, wobei die Konservierungsstoffe Gentamycin und Nystatin umfassen.
  24. Arzneimittel, umfassend das Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.
  25. Impfstoff, umfassend das Bakterin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.
  26. Verwendung des Bakterins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Tieres gegen eine Infektion durch Borrelia burgdorferi.
  27. Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei das Tier ein Säuger ist.
  28. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Säuger ein Mensch oder ein Hund ist.
  29. Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei der Hund mindestens etwa 6 Wochen alt ist.
  30. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei das Arzneimittel dergestalt ist, dass eine zusätzliche Dosis in einem geeigneten Zeitintervall nach der Verabreichung der vorhergehenden Dosis verabreicht werden kann.
  31. Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei das geeignete Zeitintervall bei etwa zwei Wochen bis etwa fünf Wochen liegt.
  32. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 31, wobei das Arzneimittel durch intramuskuläre Injektion oder subkutane Injektion verabreicht werden soll.
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