DE69535374T2

DE69535374T2 - Aktive immunisierung gegen ein siderophores rezeptorprotein

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Publication number: DE69535374T2
Application number: DE69535374T
Authority: DE
Inventors: Daryll A. Willmar EMERY; Darren E. Willmar STRAUB
Original assignee: Epitopix LLC
Current assignee: Epitopix LLC
Priority date: 1994-02-09
Filing date: 1995-02-09
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2015-02-10
Also published as: EP0749321B1; ATE352314T1; ES2279511T3; DK0749321T3; EP0749321A4; US6027736A; US7413743B2; US6432412B1; CA2182976A1; CA2182976C; US20060024323A1; WO1995021627A1; AU1915995A; EP0749321A1; DE69535374D1; US20030064073A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Der wirtschaftliche Einfluss von infektiösen Krankheiten in der Geflügelindustrie wird als beträchtlich eingeschätzt. Die Immunisierung der Vögel hat geholfen, die Kosten der Produktion durch Verringerung des Vorkommens von gastrointestinalen, respirativen und systemischen Krankheiten zu reduzieren. Während Impfstoffe adäquate Immunität für solche Pathogene liefern, gegen welche eine Schar immunisiert wurde, gibt es wenige Impfstoffe, welche Kreuzschutz mit einer breiten Basis gegen unvorhergesehene Krankheiten oder gegen solche Krankheiten, gegen die ein Tier nicht spezifisch geimpft wurde, liefern können.
Eine Zahl wichtiger Krankheiten von Hausgeflügel wird durch Bakterien verursacht, die in der Lage sind, Gastgewebe zu befallen, wie zum Beispiel Salmonella spp., Escherichia spp. und Pasteurella spp. Während viele Impfstoffe zur Immunisierung gegen individuelle Spezies und Serotypen verfügbar sind, liefert keines Kreuzschutz oder stimuliert Immunität mit einer breiten Basis gegen verschiedene Serotypen, Spezies oder Genera.
Ein wesentlicher Faktor, der für ein Bakterium notwendig ist, um klinische Krankheit hervorzurufen, ist die Fähigkeit, sich erfolgreich in einem Gastgewebe zu vermehren. Eisen ist ein essentieller Nährstoff für das Wachstum gram-negativer Bakterien in vivo, aber es ist fast unverfügbar in Säugetier- und/oder Vogelgewebe, weil das Eisen entweder intrazellular oder extrazellular beispielsweise durch mit hoher Affinität komplexierende, Eisen bindende Proteine in Blut- und Lymphflüssigkeiten und Lactoferrin in äußerlichen Absonderungen, weitergeleitet wird. In normalen Geweben ist die Eisenkonzentration ungefähr 10^–18 M, weit unter der für Bakterienwachstum benötigten.
Um diese einschränkenden Bedingungen zu umgehen, haben pathogene Bakterien unter niedrigen Eisenbedingungen produzierte Eisentransportsysteme hoher Affinität entwickelt, welche aus speziellen Chelatoren ferritischen Eisens, „Siderophoren„, und eisenregulierten äußeren Membranproteinen (IROMPs) und/oder Siderophor-Rezeptorproteinen (SRPs), welche Rezeptoren für Siderophore auf der äußeren Membran der Bakterienzelle sind, bestehen. Siderophore werden synthetisiert durch und abgesondert aus den Zellen gramnegativer Bakterien unter niedrigen Eisenbedingungen. Siderophore sind Proteine niedrigen Molekulargewichts, wobei die molekulare Masse von ungefähr 500 bis ungefähr 1000 MG reicht, welche ferritisches Eisen chelatisieren und dann an IROMPs in der äußeren Bakterienmembran binden, welche daraufhin das Eisen in das Innere der Bakterienzelle transportieren. Obwohl die Verwendung von IROMPs als Immunogene in Betracht gezogen wurde, wurden diese Proteine nicht für eine solche Anwendung untersucht, zumindest teilweise wegen der Unmöglichkeit, diese Proteine aus bakteriellen Membranen in großer Menge und mit dem benötigten Grad an Reinheit und immunogener Qualität zu extrahieren.
Demnach ist ein Ziel der Erfindung, eine Methode zum Erhalt großer Mengen an Siderophor-Rezeptorproteinen immunogener Qualität aus Escherichia coli, Salmonella, Pasteurella und anderen gram-negativen Bakterien zu liefern. Ein anderes Ziel ist, einen Impfstoff zur Immunisierung von Geflügel und anderen Tieren gegen diese Bakterien zu liefern. Noch ein anderes Ziel ist, einen Impfstoff zum Kreuzschutz gegen verschiedene Serotypen, Spezies und/oder Genera von Bakterien, die zur Familie Enterobacteriaceae und/oder Pasteurellaceae gehören, zu liefern. Ein weiteres Ziel ist, einen diagnostischen Test zur Überwachung und/oder Profilierung von Sepsis und subklinischer Krankheit, verursacht durch gram-negative Bakterien unter Feldbedingungen, zu liefern.
Eine Vielzahl von Ansätzen, einen Impfstoff oder eine Therapie gegen durch gramnegative Bakterien verursachte Krankheiten zu liefern, worin der Impfstoff oder die Therapie mit der Eisenaufnahme verbunden ist, wurde veröffentlicht.
EP 0 287 206 bezieht sich auf einen Impfstoff gegen Pasteurellose, welcher durch Pasteurella, gezüchtet unter eisenbeschränkten Bedingungen, erhalten wird. Letzteres trägt zur Bildung eines proteinösen Materials bei, welches nicht in Pasteurella, gezüchtet unter normalen Bedingungen, gefunden wird. Extrakte, erhalten aus solchen Pasteurella, sind stärker immunogen als vergleichbare Extrakte aus Pasteurella, gezüchtet unter normalen Bedingungen, was sie zu einem wirksameren Impfstoff für Schafe und Vieh macht.
Die kanadische Patentanmeldung CA 2,029,906 offenbart einen Impfstoff gegen septische Bakterien, Antigenzubereitungen und Vektoren für die Produktion hiervon und hiermit verwandte Verfahren. Der Eisengehalt in den Wachstumsmedien ist durch Verwendung eines Eisen chelatisierenden Proteins wie zum Bespiel Lactoferrin stark reduziert, das heißt bis zu einem Niveau, unter welchem Siderophore und/oder Transferrine durch die entsprechenden Bakterien exprimiert werden. Die bei diesem Verfahren erhaltenen Bakterien können als Impfstoff verwendet werden, durch Verabreichung eines welchen der Gastorganismus Antikörper erzeugen wird, welche die spezifische Erkennung von Siderophoren von infektiösen gram-negativen Bakterien verhindern.
Choi-Kim et al. („Relationship between the iron regulated outer membrane proteins and the outer membrane proteins of in vivo grown Pasteurella multocida„; Vet Microbiol. Jun 1991; 28 (1): 75-92) beschreiben, dass Pasteurella multocida, gezüchtet unter eisenbeschränkten Bedingungen, eisenbezogene äußere Membran-Proteine (IROMP) exprimieren. Sie zeigen weiterhin, dass konvaleszente Phasensera, erhalten aus Truthähnen, welche Pasteurellose überlebt haben, Antikörper enthalten, welche heftig mit diesen IROMPs reagieren. Weiterhin zeigen Bakterien, die IROMPs auf Grund von eisenbeschränkten Bedingungen exprimieren, größere Bindung zu ⁵⁹Fe-markierten Pasteurella-Siderophoren, wobei die besagte Reaktion durch die oben genannten konvaleszenten Phasensera, erhalten von Truthähnen, die die entsprechenden Antikörper enthalten, blockiert wird.
Glisson et al. („Cross-protection studies with Pasteurella multocida bacterins prepared from bacteria propagated in iron-depleted medium„; Avian Dis. Okt-Dez 1993; 37 (4):1074-9) haben festgestellt, dass Pasteurella multocida-Stämme von Vogel-Herkunft zusätzliche Membranproteine exprimieren, wenn sie in Anwesenheit der Eisen-Chelatoren Dipyridyl oder Chelex 100 aufgezogen werden. Geflügel, welches mit inaktivierten Öl-Emulsionen von Bakterien, welche diese Membranproteine enthielten, geimpft wurde, war jedoch nicht besser gegen heterologe Herausforderung geschützt als solches, das mit den entsprechenden Emulsionen von Bakterien, aufgezogen unter normalen Eisenbedingungen, geimpft wurde.
Bolin und Jensen („Passive immunization with antibodies against fron-regulated outer membrane proteins protects turkeys from Escherichia coli septicemia„; Infect Immun. Mai 1987; 55 (5): 1239-1242) haben berichtet, dass die passive Immunisierung mit Antikörpern gegen eisenbezogene äußere Membran-Proteine Truthähne gegen E. coli-Septikämie-Krankheit schützt. Ähnlich wie Pasteurella ist E. coli ein gram-negatives Bakterium. Letzteres wird gewöhnlich in jungem Geflügel und einigen Säugetier-Spezies gefunden. Antikörper wurden aus Kaninchen erhalten, welche mit mit äußeren Membran-Proteinen angereicherten Fraktionen von einem infektiösen E. coli-Stamm inokuliert wurden, welcher aus der Leber eines Truthahns erhalten wurde, der auf Grund von Coliseptikämie starb.
Ikeda und Hirsh („Antigenically related iron-regulated outer membrane proteins produced by different somatic serotypes of Pasteurella multocida"; Infect Immun. Sep 1988; 56 (9): 2499-502) beschreiben antigenisch bezogene eisenregulierte äußere Membran-Proteine, produziert durch verschiedene somatische Serotypen von Pasteurella multocida. Die äußeren Membran-Proteine wurden aus 16 verschiedenen somatischen Serotypen von P. multocida nach Wachstum unter niedrigen Eisenbedingungen hergestellt. Antikörper, spezifisch für ein eisenreguliertes äußeres Membran-Protein von 84 kD von einem Stamm, reagierten mit einem Protein, exprimiert von jedem der Stämme mit der möglichen Ausnahme von einem. Die Autoren spekulieren, dass Antigene, produziert durch P. multocida unter in vivo-Bedingungen, solche sind, die durch Eisen reguliert werden, da die freie Eisenkonzentration in natürlichen Biomen der Bakterien extrem niedrig ist. Zusätzlich bemerken sie, dass die entsprechenden Antigene Schutz gegen Infektion mit P. multocida-Stämmen, welche zu verschiedenen somatischen Serotypen gehören, induzieren.
Rimler („Cross-protection factor(s) of Pasteurella multocida: passive immunization of turkeys against fowl cholera caused by different serotypes„; Avian Dis. Okt-Dez 1987; 31 (4): 884-7) hat ein Antiserum produziert, das kreuzschützend gegen verschiedene Serotypen von Pasteurella multocida ist, wobei das Serum in Truthähnen produziert wurde, die mit getöteten, in vivo gezüchteten Serotyp 3-Organismen inokuliert wurden und die dann lebenden Serotyp 3-Organsimen ausgesetzt wurden. Das Antiserum bietet Schutz gegen die homologen und heterologen Serotypen 1, 4, 5, 9 und 12. Jedoch stellt der Autor keine Beziehung her zwischen besagtem schützendem Effekt und Eisen-Bedingungen im Biom der Bakterien oder Eisen-bezogenen äußeren Membran-Proteinen, Siderophoren oder Transferrinen.
Williams et al. („Novel aerobactin receptor in Klebsiella pneumoniae„; J Gen Microbiol. Dez 1989; 135 (12): 3173-81) beschreiben einen neuen Aerobactin-Rezeptor in Klebsiella pneumoniae, Aerobactin fördert das Wachstum spezifischer Klebsiella-Mutanten in Eisen-defizitären Medien, und ist ein Siderophor vom Hydroxamat-Typ. Die Autoren liefern den Nachweis, dass einige Klebsiella pneumoniae-Stämme ein Aerobactin-Eisen-Aufnahmesystem produzieren, ohne Aerobactin selbst zu produzieren, und sie diskutieren die Verbindung dieser Eisen-Aufnahmesysteme mit Virulenz.
Die internationale Veröffentlichung WO 90/12591 offenbart eine Methode zur Isolierung und Reinigung von Transferrin- und Lactoferrin-Rezeptorproteinen aus Bakterien und die Herstellung von Impfstoffen, die selbige enthalten. Weiterhin wird offenbart, dass Lactoferrin- und Transferrin-Rezeptorproteine als Impfstoffe verwendet werden können, um bakterielle Infektionen zu verhindern, da diese Mittel mit bakteriellen Rezeptoren für Lactoferrine und Transferrine des entsprechenden Gastes konkurrieren, und so die Eisenaufnahme der infektiösen Bakterien reduzieren werden, wobei sie die Virulenz vermindern.
Chart und Griffiths („Antigenic and molecular homology of the ferric enterobactin receptor protein of Escherichia coli„, J Gen Microbiol. Jun 1985; 131 (6): 1503-1509) haben ein ferritisches Enterobactin-Rezeptorprotein von E. coli 0111 gereinigt und dieses Protein verwendet, um polyklonale Antikörper in Kaninchen herzustellen. Das erhaltene Antiserum wurde verwendet, um den Grad der antigenischen Homologie des ferritischen Enterobactin-Rezeptors von einigen pathogenen und Laborstämmen von E. coli zu untersuchen. Das erhaltene Serum erkannte auch ein 81 kD-Protein von eisenbeschränktem Salmonella typhimurium und ein 83 kD-Protein von eisenbeschränktem Klebsiella pneumoniae.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, welche auf einen Impfstoff zur Prävention und Behandlung von Infektion durch gram-negative Bakterien gerichtet ist, und auf die Verwendung eines solchen Impfstoffes zur Herstellung eines Medikamentes zur Immunisierung von Vogelspezies gegen Infektionen durch gram-negative Bakterien. Die Erfindung liefert außerdem eine Methode zur Isolierung und Reinigung von äußeren Membran-Siderophor-Rezeptorproteinen aus gram-negativen Bakterien zur Herstellung des Impfstoffes. Die Erfindung liefert weiterhin eine in vitro-Methode zur Diagnose von Infektionen durch gram-negative Bakterien in einem Tier durch Verwendung von Antikörpern, gezüchtet für die isolierten Rezeptorproteine.
Der Impfstoff ist nützlich zur Immunisierung eines Vogels oder eines anderen Tieres gegen Infektion durch gram-negative Bakterien wie Colibacillose, Salmonellose und Pasteurellose. Der Impfstoff ist zusammengesetzt aus vier oder mehr im Wesentlichen reinen Siderophor-Rezeptorproteinen, wobei die Proteine von der äußeren Membran von zwei oder mehr unterschiedlichen Stämmen oder Spezies von einem gram-negativen Bakterium der Familien Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae und/oder Pseudomonaceae abgeleitet sind, wobei der Impfstoff eine Infektion des Tieres durch ein gram-negatives Bakterium verhindert, das von einem anderen Stamm, einer anderen Spezies oder einem anderen Genus als die zwei oder mehr gram-negativen Bakterien, die für den Erhalt der Siderophor-Rezeptorproteine verwendet wurden, stammt.
Diese gram-negativen Bakterien können zum Beispiel Salmonella spp., Escherichia spp. und Pasteurella spp. sein. Ein Siderophor-Rezeptorprotein, nützlich nach der Erfindung, ist ein Protein oder eine antigenische Peptidsequenz davon, erhalten aus der äußeren Membran eines gram-negativen Bakteriums, welches in der Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der mit dem Siderophor-Rezeptorprotein reagieren wird, das durch ein gramnegatives Bakterium desselben oder eines anderen Stammes, Spezies oder Genus exprimiert wird. Bevorzugt wird das Siderophor-Rezeptorprotein aus einem Bakterium erhalten, das zur Familie Enterobacteriaceae und/oder Pasteurellaceae gehört.
Der Impfstoff enthält Siderophor-Rezeptorproteine (SRPs), die von einem gramnegativen Bakterium erhalten wurden, fähig, eine Immunantwort in einem Tier mit der Produktion von anti-SRP-Antikörpern auszulösen. Diese Antikörper werden mit Siderophor-Rezeptorproteinen dieses Bakteriums reagieren und können auch mit Siderophor-Rezeptorproteinen eines anderen Stammes, einer anderen Spezies und/oder eines anderen Genus gram-negativer Bakterien kreuzreagieren, um Kreuzschutz gegen Infektion solcher anderer Bakterien zu liefern. Nützliche Siderophor-Rezeptorproteine, die ein Molekulargewicht von ungefähr 72-96 kDa haben, wie durch SDS-PAGE bestimmt, sind aus E. coli, Salmonella spp., Pasteurella spp., Pseudomonas spp. und Klebsiella spp. isoliert worden. Bevorzugt werden die Siderophor-Rezeptorproteine (SRPS) aus Escherichia coli, Salmonella spp. und/oder Pasteurella spp. erhalten. Die durch diese SRPs produzierten Antikörper werden mit SRPs solcher Bakterien reagieren und mit SRPs eines anderen Stammes, einer anderen Spezies und/oder anderer Genera von Bakterien innerhalb der Familie Enterobacteriaceae und/oder Pasteurellaceae kreuzreagieren.
Der Impfstoff enthält vier oder mehr Siderophor-Rezeptorproteine, extrahiert aus der äußeren Membran von zwei oder mehr verschiedenen Stämmen oder Spezies gram-negativer Bakterien. Die Menge und Art an Siderophor-Rezeptorprotein, eingeschlossen im Impfstoff, ist wirksam, um die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, welche reaktiv mit einem Siderophor-Rezeptorprotein von einem, bevorzugt zwei oder mehr Stämmen, Spezies oder Genera gram-negativer Bakterien sind, von einem Stamm, einer Spezies oder einem Genus sind, von den zwei oder mehr gram-negativen Bakterien verschieden, die verwendet wurden, um die Siderophor-Rezeptorproteine zu erhalten. Ein bevorzugter Impfstoff ist zusammengesetzt aus einer Menge und einem Profil an Siderophor-Rezeptorproteinen, um wirksam Antikörper zu induzieren, die mit einer Mehrheit, bevorzugt allen, der Siderophor-Rezeptorproteine einer Bakterienpopulation reaktiv sind, um wirksam Opsonisation und Komplement-vermittelte bakterielle Lyse zu verstärken, und/oder die Eisenbindungskapazität der Bakterien zu blockieren. Das Siderophor-Rezeptorprotein wird mit einem physiologisch akzeptablen Träger kombiniert, bevorzugt einer Flüssigkeit. Der Impfstoff kann weiter ein Adjuvans enthalten, das die Immunantwort verstärkt, und andere gewünschte Additive, wie Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe, Puffermittel und ähnliches.
Die Siderophor-Rezeptorproteine können verwendet werden, um polyklonale Antikörpersera und monoklonale Antikörper für die Verwendung in passiven Immunisierungstherapien zu züchten. Solche Antikörper können auch in einer in vitro-Diagnosemethode einer gram-negativen bakteriellen Infektion in einem Tier verwendet werden.
Die Siderophor-Rezeptorproteine können auch als Capture-Antigene in einer Methode zur Beobachtung und Profilgebung gram-negativer Sepsis verwendet werden. Zum Beispiel kann das Protein in einer ELISA-Technik verwendet werden, in welcher das Protein an einen festen Träger gebunden und mit einem Probenmaterial kontaktiert wird, um mit Antikörpern, die in der Probe vorliegen, zu reagieren und sie zu detektieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung des Elutionsprofils von konzentrierten, gelösten Siderophor-Rezeptorproteinen, isoliert aus Escherichia coli Serotyp 078 (ATCC 55652).
2 ist eine graphische Darstellung der quantitativen Clearance von Salmonella agona in Milzen von mit aus E. coli isolierten IROMPs geimpften Truthähnen und nicht geimpften Kontrollen.
3 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort auf E. coli Siderophor-Rezeptorproteine (SRPS) zwischen geimpften und nicht geimpften Scharen.
4 ist eine Darstellung der % Gesamtmortalität und Keulung ? in der Kontrolle und E. coli-SRP-geimpften Scharen (3-13 Wochen alt).
5 ist eine Darstellung der % Gesamtmortalität und Keulung ? in der Kontrolle und E. coli-SRP-geimpften Scharen (3-13 Wochen alt).
6 ist eine graphische Darstellung der Gesamtmortalität in SRP-geimpften und nicht geimpften Truthähnen nach Herausforderung mit Pasteurella multocida P-1059.
7 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort in Vögeln, geimpft mit gereinigten Siderophor-Rezeptorproteinen aus Salmonella senftenberg, die Kreuz-Reaktivität mit den SRP von E. coli zeigen.
8 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort in Vögeln, geimpft mit gereinigten Siderophor-Rezeptorproteinen aus P. multocida, die Kreuz-Reaktivität mit den SRP von E. coli zeigen.
9 ist eine graphische Darstellung der % Gesamtmortalität in konsekutiven Scharen vor und nach Impfung mit Siderophor-Rezeptorproteinen, erhalten aus E. coli 078.
10 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort auf SRPs von E. coli zwischen SRP-geimpften und nicht SRP-geimpften kommerziellen Truthahnscharen.
11 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort von gereinigtem SRP und ganzen Zellen von Salmonella heidelberg.
12 ist eine graphische Darstellung der Gesamtmortalität zwischen Nachkommen von SRP-geimpften und nicht geimpften (Kontrolle) Bruthennen.
13 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort in Vögeln, geimpft mit gereinigten Siderophor-Rezeptorproteinen von Salmonella typhimurium, die Kreuz-Reaktivität mit den SRP von E. coli zeigen.
14 ist eine graphische Darstellung der serologischen Antwort in Vögeln, geimpft mit gereinigten Siderophor-Rezeptorproteinen von Salmonella enteritidis, die Kreuz-Reaktivität mit den SRP von E. coli zeigen.
15 ist eine graphische Darstellung der SRPs von Salmonella typhimurium als einem schützenden Immunogen gegen eine homologe und heterologe Herausforderung in Truthähnen.
16 ist eine graphische Darstellung der SRPs von Salmonella enteritidis als schützenden Immunogenen gegen eine homologe und heterologe Herausforderung in Truthähnen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „im Wesentlichen rein„, dass das Siderophor-Rezeptorprotein aus seinem natürlichen Verband mit anderen Proteinen, Lipiden und anderen ähnlichen Substanzen und Elementen einer Bakterienzelle oder eines anderen Organismus extrahiert und isoliert wurde.
Gram-negative Bakterien sind häufige Pathogene von Geflügel und anderen Tieren, wie Hausgeflügel, Vieh, Pferden, Begleittieren und Menschen. In einer eisenbeschränkten Umgebung produzieren Bakterien wie Escherichia coli, Salmonella spp. und Pasteurella spp. Siderophore, die ferritisches Eisen chelatisieren und an äußere Membranproteine binden, die als Siderophor-Rezeptoren auf der Bakterienmembran wirken.
Die Erfindung liefert ein verbessertes Verfahren zur Isolierung und Trennung von Siderophor-Rezeptorproteinen von der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien. Isolierung und Reinigung der immunologisch intakten Siderophor-Rezeptorproteine aus Bakterienmembranen in einer ausreichenden Menge und immunologischer Qualität zur Formulierung eines Impfstoffes gegen Infektion durch gram-negative Bakterien war schwierig. Die strukturelle Orientierung oder Konformation des äußeren Membranproteins, erforderlich, um Antigenität zu liefern, kann typischerweise verloren gehen, wenn das Protein vom Lipopolysaccharid-Komplex abgetrennt und gereinigt wird.
Ein weiteres Problem ist, dass das Protein durch den Abtrennungsprozess denaturiert wird, wobei seine Immunogenität verloren geht. Nach der vorliegenden Erfindung wurde jedoch die Isolierung und Abtrennung der immunogenen Mengen der antigenisch wirksamen Siderophor-Rezeptorproteine aus der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien erreicht. Dies ermöglicht die Produktion von Impfstoffen und hyperimmunisierten Sera zur Behandlung von Tieren, die infiziert oder anfällig für Infektion durch gram-negative Bakterien sind, und in vitro-diagnostische Methoden zur Erkennung solch einer Infektion in einem Tier.
Als Gruppe besitzen gram-negative Bakterien eine gemeinsame Zellwandstruktur. Komponenten der Zellwandstruktur können als Immunogene verwendet werden. Jedoch können diese Proteine nur homologen Immunschutz liefern. Der vorliegende Impfstoff verwendet eine Kombination von Siderophor-Rezeptorproteinen der äußeren Membran, zwei oder mehr gram-negativen Bakterien gemeinsam, die in der Lage sind, sich im Blut oder Gastgewebe zu vermehren und Infektion in einem Tier zu verursachen. Der Impfstoff kann vier oder mehr Siderophor-Rezeptorproteine (SRPs) enthalten, erhalten aus der äußeren Membran von zwei oder mehr verschiedenen Stämmen oder Spezies gram-negativer Bakterien und/oder anderer Organismen. Ein bevorzugtes Siderophor-Rezeptorprotein zur Verwendung im Impfstoff hat einen gemeinsamen Rezeptor, reaktiv mit Siderophoren, welche von zwei oder mehr Stämmen, Spezies und/oder Genera gram-negativer Bakterien produziert werden.
Ein Beispiel eines nützlichen Siderophor-Rezeptorproteins ist das Rezeptorprotein für Aerobactin (MG ungefähr 72-74 kDa), produziert durch Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae, zum Beispiel Escherichia coli, Salmonella und Klebsiella. Es wurde gefunden, dass Antikörper, die gegen ein Aerobactin-Rezeptorprotein einer Spezies, eines Stammes oder Genus dieser Familie produziert werden mit anderen Bakterien innerhalb der Familie kreuz-reagieren. Spezies von Pseudomonas der Familie Pseudomonadaceae exprimieren ebenfalls Siderophor-Aerobactin-Rezeptorproteine, die nach der Erfindung isoliert werden können und in einem Impfstoff verwendet werden können, um Antikörper zu produzieren, welche mit den Aerobactin-Rezeptorproteinen von E. coli, Salmonella und Klebsiella, neben anderen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae, kreuz-reagieren.
Ein weiteres Beispiel eines passenden Siderophor-Rezeptorproteins zur Verwendung in den vorliegenden Impfstoffen ist das, welches von Pasteurella multocida für das Siderophor Multocidin (MG ungefähr 500-1000 kDa) produziert wird. Antikörper zum Multocidin-Rezeptorprotein werden mit allen drei der SRPs in Pasteurella multocida reagieren. In Western-Blots zeigten zwei der größeren Siderophor-Proteine (96 kDa, 84 kDa) von P. multocida Reaktivität mit hyperimmunen Protein-Antisera von E. coli. Antikörper, die zu den Multocidin-Rezeptorproteinen produziert werden, werden mit den Siderophor-Rezeptorproteinen von Salmonella spp. und E. coli kreuz-reagieren, wie durch ELISA und Western-Blot-Analyse gezeigt wurde.
Andere Siderophor-Rezeptorproteine schließen solche ein, die reaktiv mit dem Siderophor Enterochelin (MG ungefähr 81-84 kDa) sind, produziert durch E. coli, Salmonella, Pseudomonas und Klebsiella, und dem Siderophor Citrat (MG ungefähr 74-78 kDa), produziert durch E. coli, neben anderen. Ein Impfstoff, der die Enterochelin- und/oder Citrat-Rezeptorproteine enthält, wird Antikörper, reaktiv mit E. coli, Salmonella und anderen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae und mit Pseudomonas der Familie Pseudomonadaceae, produzieren.
Ein weiteres nützliches SRP ist das Siderophor-Rezeptorprotein für Fernchrom (MG ungefähr 78 kDa), produziert durch E. coli und Salmonella spp.. In kommerziellen Geflügelzucht-Anlagen verursacht Infektion durch Aspergillus ernsthafte Atemprobleme in den Vögeln. In den Lungen wird Aspergillus Fernchrom absondern, um Eisen als Wachstums-Nährstoff zu erhalten. Unter Eisen-Beschränkung oder systemischen Bedingungen werden E. coli und Salmonella Fernchrom-Rezeptorprotein exprimieren. Sie sind auch opportunistische Bakterien, die Ferrichrom, produziert durch Aspergillus, als einen Wachstums-Nährstoff sammeln und verwenden können. Deshalb wird bevorzugt, dass die Impfstoff-Präparation ein Ferchrom-Rezeptorprotein enthält, um Antikörper zu induzieren, die an die Ferchrom-Rezeptorproteine von gram-negativen Bakterien binden und mit ihnen kreuz-reagieren, einschließlich E. coli und Salmonella und Pilzen/Schimmelpilzen. Ein Impfstoff, der dieses SRP enthält, wird eine Immunantwort zum Protein auslösen, um die bakterizide Aktivität des Antikörpers zu verstärken. Ebenfalls wird, sobald der Vogel oder das andere Tier einmal mit einem Ferchrom-Rezeptorprotein geimpft ist, Aspergillus, das dieses Protein in vivo in dem Tier exprimiert, die Antikörper-Antwort zum Ferrichrom-Rezeptorprotein verstärken, was wiederum mit Salmonella und E. coli und anderen Bakterien, die das Ferchrom-Rezeptorprotein exprimieren, kreuz-reagieren wird.
Antikörper, ausgelöst von einem Ferrichrom-Rezeptorprotein (MG ungefähr 78 kDa), erhalten von E. coli, können mit den Rezeptorproteinen von Pilzen, wie Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Penicillium und Fusarium, kreuz-reagieren. Western-Blot-Analyse gegen die äußeren Membranproteine (OMPs) von A. fumigatus unter Verwendung von anti- SRP-Antikörper ergab drei kreuz-reaktive Proteine (MG ungefähr 45-90 kDa). Die Einbeziehung von einem Ferrichrom-Rezeptorprotein in eine Impfstoff-Präparation wird Erzeugung von Antikörpern liefern, die mit den Pilzen und/oder Bakterien reagieren werden, um Bindung und Ausscheidung des Ferrichrom-Siderophors zu verhindern. Tiere, wie Vögel, die mit einer Impfstoff-Präparation geimpft sind, die ein Ferrichrom-Rezeptorprotein enthält, werden durch Bakterien und/oder Pilze, die das Tier herausfordern und ein Ferrichrom-Rezeptorprotein produzieren, einen erhöhten Antikörper-Titer bekommen. Antikörper zum Ferrichrom-Rezeptor kann auch durch natürliche Feld-Herausforderung durch Bakterien oder Pilze erhöht werden, was eine bakterizide Wirkung induzieren kann, die System-Herausforderung und Krankheitspotential dämpfen könnte.
Noch ein weiteres nützliches SRP ist ein Coprogen-Rezeptorprotein (MG ungefähr 74-76 kDa), produziert durch E. coli. Antikörper, produziert gegen Coprogen-Rezeptorprotein, werden mit den SRPs anderer E. coli kreuz-reagieren, die dieses Protein unter systemischen Bedingungen exprimieren.
Der Impfstoff ist mit Siderophor-Rezeptorproteinen (SRPs) verschiedener Typen und/oder Molekulargewichte formuliert, erhalten aus der äußeren Membran von zwei oder mehr verschiedenen Stämmen oder Spezies gram-negativer Bakterien, wobei die SRPs fähig sind, die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, die mit Stämmen, Spezies oder Genera, verschieden von den zwei oder mehr gram-negativen Bakterien, reagieren. Der Impfstoff enthält bevorzugt alle SRPs, erhalten aus dem infektiösen Mittel gram-negativer Bakterien. Zum Beispiel wurden P. multocida und Salmonella spp. ermittelt, jede 3 SRPs zu produzieren, und E. coli produzierte 2, 3, 4 und 6 SRPs, variierend zwischen Serotypen. Dementsprechend ist der Impfstoff so formuliert, dass er die SRPs, erhalten aus dem bakteriell verursachenden Mittel, enthält, das heißt 2-6 oder mehr SRPs. Es wird bevorzugt, dass der Impfstoff ebenfalls Siderophor-Rezeptorproteine von verschiedenen Typen und/oder Molekulargewichten enthält, erhalten aus einem gram-negativen Bakterium eines Stammes oder einer Spezies, verschieden von dem ersten gram-negativen Bakterium, bevorzugt 1-15 SRPs, bevorzugt 5-10 SRPs.
Zum Beispiel kann der Impfstoff ein Siderophor-Rezeptorprotein, erhalten aus E. coli, enthalten, bevorzugt E. coli Serotyp 01a, 02a und/oder 078, das fähig ist, die Produktion von einem Antikörper zu stimulieren, der immunoreaktiv mit diesem E. coli und einem zweiten gram-negativen Bakterium, wie Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae und/oder Pasteurella multocida, ist. In einem weiteren Beispiel kann der Impfstoff ein Siderophor-Rezeptorprotein enthalten, erhalten aus einer Spezies von Pasteurella, wie P. multocida, das fähig ist, die Produktion von einem Antikörper zu stimulieren, der immunoreaktiv mit dieser Spezies von Pasteurella und einem zweiten gramnegativen Bakterium, wie Salmonella spp. und/oder E. coli, ist. In noch einem weiteren Beispiel kann der Impfstoff ein Siderophor-Rezeptorprotein enthalten, erhalten aus einer Spezies von Salmonella, das fähig ist, die Produktion von einem Antikörper zu stimulieren, der immunoreaktiv mit dieser Spezies der Spezies von Salmonella und einem zweiten gramnegativen Bakterium, wie E. coli, Pseudomonas, Klebsiella und/oder Pasteurella multocida, ist.
Ein Impfstoff, formuliert mit Siderophor-Rezeptorproteinen, die von E. coli erhalten wurden, ist bevorzugt zusammengesetzt aus einem Aerobactin-, Ferchrom-, Coprogen-, Enterochelin- und/oder Citrat-SRP, die Molekulargewichte von ungefähr 89 kDa bis ungefähr 72 kDa haben, wie durch SDS-PAGE ermittelt. Der Impfstoff schließt bevorzugt 2-5 Rezeptorproteine ein, bevorzugt 3-5 Proteine, bevorzugt alle fünf E. coli-SRPs. Ein bevorzugter Impfstoff gegen E.coli-Infektion wird hergestellt mit den SRPs von E. coli 078 (ATCC #55652). E. coli 078 wurde ermittelt, bis zu 6 SRPs zu produzieren, deren Molekulargewichte von 72 bis 90 bis 92 kDa reichen, wie durch SDS-PAGE ermittelt. Die SRPs, erhalten von E. coli 078, schließen Aerobactin-, Fernchrom-, Coprogen-, Enterochelin- und Citrat-SRPs ein, die Molekulargewichte von ungefähr 91-92 kDa, 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa, 74 kDa und 72 kDa haben, wie durch SDS-PAGE, 12,5% Acrylamid-reduzierendes Gel, ermittelt. Obwohl die 91-92 kDa-Proteine von E. coli 078 in Kulturmedien, hergestellt mit und ohne Eisen, exprimiert werden, ist die Expression solcher Proteine in einem eisenbeschränkten Medium verstärkt, und wie hierin verwendet, werden die 91-92 kDa-Proteine als eisenregulierte SRPs angesehen. Ein bevorzugter Impfstoff zur Immunisierung eines Tieres gegen E. coli wird mit einem Aerobactin-, Ferchrom-, Coprogen-, Enterochelin- und Citrat-SRP formuliert, erhalten aus E. coli, bevorzugt E. coli 078, hergestellt aus wenigstens 5 Siderophor-Rezeptorproteinen, bevorzugt wenigstens 6 Rezeptorproteine, oder mehr, um anti-SRP-Antikörper zu induzieren, um effektiv eine Mehrheit, bevorzugt alle Eisen-Bindungsstellen von E. coli-Serotypen, die in einer Infektion anwesend sind, zu blockieren, und um hohe Antikörper-Niveaus zu induzieren, um bakterizide Aktivität zu fördern.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass der Impfstoff ein oder mehrere SRPs enthält, bevorzugt ungefähr 1-15 SRPs, erhalten von einem oder mehr zusätzlichen Bakterien, verschieden von den ersten gram-negativen Bakterien. Zum Beispiel ist es in einem Impfstoff, zusammengesetzt aus SRPs von E. coli, wünschenswert, eins oder mehr der SRPs, erhalten aus Salmonella, Pasteurella multocida, Klebsiella und/oder Pseudomonas, einzuschließen. Ein bevorzugter Impfstoff enthält jedes der SRPs von verschiedenen Typen und/oder Molekulargewichten von einer Population gram-negativer Bakterien, um die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die effektiv die Eisen-Bindungsstellen aller der verschiedenen SRPs der Bakterienpopulation blockieren, sodass die Bakterien nicht effektiv Eisen als einen Nährstoff für Wachstum binden können. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass der Impfstoff hohe SRP-Antikörper-Niveaus induziert, die Opsonisation und/oder Komplement-vermittelte bakterielle Lyse verstärken werden. Aufgrund der Variation in Eisen-regulierten äußeren Membranproteinen (IROMPs), produziert zwischen und innerhalb bakterieller Serotypen, kann die Formulierung eines Impfstoffes mit SRPs, isoliert und gereinigt aus einer einzigen Isolierungsquelle, nur ein partielles Profil der SRPs, die in einer Bakterienpopulation anwesend sind, liefern. Folglich kann die Wirksamkeit des Impfstoffes, anti-SRP-Antikörper zu induzieren, um bakterielle Eisen-Bindungsstellen zu blockieren und bakterielle Infektion zu verhindern, auf solche Serotypen beschränkt sein, die alle oder weniger als alle der SRPs, eingeschlossen in den Impfstoff, produzieren, während solche bakteriellen Serotypen, die andere SRPs produzieren, eine Fähigkeit zur Eisenbindung behalten können. Deshalb wird bevorzugt, dass ein Profil oder Bandmuster (das heißt, SDS-PAGE-Proteintrennungen) einer bakteriellen Population ausgeführt wird durch Untersuchung verschiedener Feldisolate, bevorzugt ungefähr 25-100 Isolate, um die anwesenden SRPs zu untersuchen, und alle der verschiedenen SRPs sind in den Impfstoff eingeschlossen.
Nicht-eisenregulierte Proteine und Polypeptide können auch in den Impfstoff als Zusatzstoffe eingeschlossen sein, um die Wirksamkeit des Impfstoffes zu erhöhen und Opsonisation zu verstärken, das bedeutet, die Makrophagenaktivität zu verstärken, was in einer verstärkten Phagozytose der Antikörper-gebundenen Zellen resultiert und Komplementvermittelte bakterielle Lyse induziert.
Ein nützliches Zusatzstoff-Protein ist eine 34-38 kDa-Gruppe von äußeren Membranproteinen (Porine, das heißt, porenbildende Proteine), erhalten aus gram-negativen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae und Pasteurellaceae einschließlich E. coli 078 und anderen gram-negativen Bakterien. Die Transmembran- und Porin-Proteine (MG 34-38 kDa), identifiziert als OmpA, OmpC, OmpD und OmpF werden mit und ohne Eisen exprimiert, werden zwischen gram-negativen Bakterien relativ konserviert und spielen eine Rolle bei der Eisenbindung. Zum Beispiel werden OmpF und OmpC Lactoferrin binden (Erdei et al., Infection and Immunity 62:1236-1240 (April 1994)), während OmpA Fernchrom binden wird (Coulton et al., J. Gen. Microbiol. 110:211-220 (1979)).
Antikörper, die früh in der Infektion sind, besonders aus der IgM-Klasse, werden mit äußeren Membranproteinen von E. coli, Salmonella, Pasteurella, Pseudomonas und Klebsiella kreuz-reagieren und werden Lactoferrin und/oder Ferrichrom binden und die Verfügbarkeit einer Eisenquelle für bakterielles Wachstum ausschließen. Antikörper zu diesen Proteinen werden ebenfalls an das Porin Omp auf der Oberfläche binden, um Opsonisation und/oder Komplement-vermittelte bakterielle Lyse zu verstärken. Immunologisch intakte äußere 34-38 kDa-Membranproteine von Porin können nach dem Verfahren der Erfindung isoliert und gereinigt werden.
Der Impfstoff kann verwendet werden, um Geflügel und andere Tiere wie Hausgeflügel, Vieh, Pferde, Begleittiere und Menschen gegen Infektion, verursacht durch ein oder mehrere gram-negative Bakterien, zu immunisieren. Der Impfstoff ist wirksam, um Antikörper auszulösen, die immunoreaktiv mit einem gram-negativen Bakterium sind, das ein oder mehr Siderophor-Rezeptorprotein(e) exprimiert.
Bevorzugt ist der Impfstoff in der Lage, klinische Wirksamkeit von kreuz-reaktiver und kreuz-schützender Immunisierung gegen zwei oder mehr verschiedene Stämme, Spezies und/oder Genera gram-negativer Bakterien oder anderer Organismen, die in der Lage sind, Siderophor-Rezeptorproteine zu exprimieren, zu erreichen. Zum Beispiel kann ein Impfstoff, der Siderophor-Rezeptorproteine für Aerobactin, Enterochelin, Ferrichrom, Coprogen und/oder Citrat enthält, verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, die mit einer Zahl von verschiedenen Bakterien kreuz-reagieren, welche eines oder mehr dieser Rezeptorproteine exprimieren.
Die Wirksamkeit des vorliegenden Impfstoffes beruht wenigstens teilweise auf der konservativen Natur der Siderophor-Rezeptorproteine der äußeren Membran, welche kreuzreaktiv sind mit Siderophor-Rezeptorproteinen, produziert von zwei oder mehr verschiedenen Spezies, Stämmen und/oder Genera von Enterobacteriaceae wie E. coli, Salmonella und anderen gram-negativen Bakterien innerhalb anderer Familien wie Pasteurella und/oder Pseudomonas.
Wegen der Kreuz-Reaktivität der SRPs ist der Impfstoff wirksam, die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, die mit den gram-negativen Bakterien reagieren, von denen die SRPs erhalten wurden, genauso wie mit gram-negativen Bakterien eines anderen Stammes oder einer anderen Spezies als die ersten gram-negativen Bakterien. Zum Beispiel kann ein Impfstoff formuliert werden, der ein Siderophor-Rezeptorprotein enthält, erhalten aus E. coli, bevorzugt E. coli Serotyp 01a, 02a und/oder 078, besonders bevorzugt E. coli 078, der wirksam ist, in vivo die Produktion eines Antikörpers zu stimulieren, der immunoreaktiv mit diesem E. coli-Serotyp (aus welchem das (die) SRP(s) erhalten wurden) und einem zweiten gram-negativen Bakterium wie Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae und/oder Pasteurella multocida ist. In einem anderen Beispiel kann der Impfstoff ein Siderophor-Rezeptorprotein enthalten, erhalten von einer Spezies von Pasteurella, wie P. multocida, das wirksam ist, die Produktion eines Antikörpers zu stimulieren, der immunoreaktiv mit dieser Spezies von Pasteurella und einem zweiten gramnegativen Bakterium wie Salmonella spp. und/oder E. coli ist. In noch einem weiteren Beispiel kann der Impfstoff ein Siderophor-Rezeptorprotein enthalten, erhalten von einer Spezies von Salmonella, das wirksam ist, die Produktion eines Antikörpers zu stimulieren, der immunoreaktiv mit dieser Spezies von Salmonella und einem zweiten gram-negativen Bakterium wie E. coli, Pseudomonas, Klebsiella und/oder Pasteurella multocida ist.
Vorteilhafterweise minimiert die Immunisierung unter Verwendung des vorliegenden Impfstoffes, welcher ein Immunogen enthält, das kreuz-reaktiv mit mehreren Spezies, Stämmen und Genera gram-negativer Bakterien ist, nicht nur Immunisierungskosten, da einzelne Inokulierungen mit einem anderen Immunogen für jeden Typ gram-negativer Bakterien nicht erforderlich ist. Zusätzlich liefert der vorliegende Impfstoff Schutz gegen neue Stämme oder unerwartete Pathogene gram-negativer Bakterien, welche Siderophor-Rezeptorproteine produzieren, die mit Antikörpern kreuz-reagieren werden, induziert durch die Siderophor-Rezeptorproteine, die im Impfstoff enthalten sind. Der Impfstoff, zu einem erwachsenen Tier gegeben, ist hochwirksam zur Behandlung und Prävention gram-negativer Sepsis, nicht nur im erwachsenen Tier, sondern auch in dessen Nachkommen durch den direkten Transfer von anti-SRP-Antikörpern.
Kommerzielle bakterielle Ganzzellimpfstoffe sind nützlich zur Behandlung von einer bestimmten Krankheit und/oder Infektion, aber liefern keinen wirksamen Kreuzschutz gegen andere Infektion. Zum Beispiel wird durch Pasteurella multocida verursachte Vogel-Pasteurellose in Truthähnen durch bestimmte Läsionen klinisch diagnostiziert, induziert durch die bakterielle Infektion. Die Behandlung der Krankheit mit einem kommerziellen Ganzzellimpfstoff stimuliert Antikörper, die homolog, aber nicht heterolog in ihrer Wirkung sind und die nicht gegen Infektion durch andere Bakterien kreuz-schützen werden.
Vorteilhafterweise liefert der vorliegende Impfstoff Kreuzschutz gegen eine Zahl von Infektionen, verursacht durch gram-negative Bakterien. Nach der Erfindung kann einer Tierspezies, die an einer gram-negativen bakteriellen Sepsis leidet, der Impfstoff verabreicht werden, der SRPs enthält, erhalten von den (auslösenden) gram-negativen Bakterien, um Antikörper zu induzieren, die immunoreaktiv mit jenen SRPs sind, um den Krankheitszustand zu blockieren. Die Antikörper werden ebenfalls mit SRPs kreuz-reagieren, produziert durch andere gram-negative Bakterien, um einen Krankheitszustand zu blockieren, der durch dieses andere Bakterium verursacht wurde. Daher wird ein Impfstoff, der SRPs von einem ersten gram-negativen Bakterium enthält, Schutz gegen eine Infektion liefern, die durch dieses Bakterium verursacht wird, und Kreuzschutz gegen Infektion, verursacht durch ein anderes gram-negatives Bakterium.
Gram-negative Bakterien, die passend zur Verwendung im Erhalt Siderophor-Rezeptorproteine nach der Erfindung sind, sind solche, die in der Lage sind, Siderophor-Rezeptorproteine zu produzieren, wenn sie unter Wachstumsbedingungen niedriger Eisenverfügbarkeit gezüchtet werden. Beispiele nützlicher gram-negativer Bakterien schließen Escherichia coli (Serotypen 01a, 02a und 078), Salmonella agona, Salmonella blockley, Salmonella enteriditis, Salmonella hadar, Salmonella heidelberg, Salmonella montevideo, Salmonella senftenberg, Salmonella cholerasuis, Salmonella typhimurium, Pasteurella multocida (Serotyp A:3,4), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und dergleichen ein. Diese Organismen sind kommerziell erhältlich von einer Hinterlegungsstelle wie der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Zusätzlich sind solche Organismen leicht erhältlich durch bekannte Isolierungstechniken, die im Stand der Technik verwendet werden. Die gram-negativen Bakterien können von einem infizierten Tier als ein Feldisolat erhalten werden und auf die Produktion von SRPs überprüft werden und direkt in die bevorzugten eisen-verarmten Medien für dieses Bakterium eingeführt werden oder für zukünftige Verwendung gelagert werden, zum Beispiel in einem gefrorenen Behälter bei ungefähr –20°C bis ungefähr –95°C, bevorzugt ungefähr –40°C bis ungefähr –50°C, in 20% Glycerin enthaltendem BHI, und anderen ähnlichen Medien.
Zur Herstellung der Siderophor-Rezeptorproteine werden die Bedingungen niedriger Eisen-Verfügbarkeit durch Verwendung von Kulturmedien erzeugt, denen Eisen fehlt, oder die um ein Eisen chelatisierendes Mittel ergänzt wurden, um die Eisen-Verfügbarkeit zu verringern. Passende Kulturmedien zur Bereitstellung niedriger Eisenverfügbarkeit und Förderung der Produktion der Siderophor-Rezeptorproteine in gram-negativen Bakterien, einschließlich Medien wie tryptischer Soja-Brühe (Difco Laboratories, Detroit, MI) und/oder Hirn-Herz-Infusion(BHI)-Brühe, welche mit einem Eisen chelatisierenden Mittel kombiniert wurden, zum Beispiel α,α'-Dipyridyl, Deferoxamin und anderen ähnlichen Mitteln. In einer bevorzugten Ausführung wird α,α'-Dipyridyl zu einem BHI-Kulturmedium in einer Konzentration von ungefähr 1-500 μg/ml, bevorzugt ungefähr 50-250 μg/ml, besonders bevorzugt ungefähr 75-150 μg/ml, zugefügt.
Die gram-negativen Bakterien, die eingesetzt werden, um ein Siderophor-Rezeptorprotein zu produzieren, werden in den bevorzugten Medien für diesen Organismus, unter Verwendung von Methoden und Apparaten, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden, kultiviert, wie einem Fermenter, einem Gyrator-Schüttler und anderen ähnlichen Apparaten. Zum Beispiel kann eine Kultur in einem Gyrator-Schüttler gezüchtet werden, in welchem das Medium kontinuierlich mit Belüftung mit ungefähr 300-600 U/Minute gerührt wird, über ungefähr 15-20 Stunden, bei einer Temperatur und einem pH, die passend für das Wachstum dieses Organismus sind, das heißt, ungefähr 35-45°C und ungefähr pH 7-7,6, bevorzugt pH 6,5-7,5. Die Bakterienkultur wird dann verarbeitet, um die Siderophor-Rezeptorproteine von der äußeren Membran der Bakterien zu trennen und zu reinigen.
Die Bakterienkultur wird aufkonzentriert, zum Beispiel durch Zentrifugation, Membrankonzentration und dergleichen. Zum Beispiel kann die Zellkultur bei ungefähr 2450-20000 g zentrifugiert werden, bevorzugt bei ungefähr 5000-16000 g, über ungefähr 5-15 Minuten bei ungefähr 3-6°C. Der Überstand wird durch Dekantieren, Absaugen, Pipettieren und dergleichen entfernt, und das aufkonzentrierte Zellpellet wird gesammelt und in einer passenden Pufferlösung, die bei ungefähr pH 7-7,6 gehalten wird, gewaschen, wie tris-gepufferter Salzlösung (TBS), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 3-N(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS), und dergleichen. Das gewaschene Pellet wird resuspendiert und in einer passenden Pufferlösung gewaschen, das heißt TBS, HEPES, MOPS und dergleichen. Das Zellmaterial wird dann behandelt, um die Komponenten der äußeren Membran zu lösen, durch Resuspendierung des Pellets in Puffer, der 0,5-10% Natrium-N-lauroylsarcosinat enthält, bevorzugt ungefähr 1-3%, bei ungefähr 4-10°C über ungefähr 15 Minuten bis ungefähr 3 Stunden, bevorzugt ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden, bevorzugt unter kontinuierlichem Rühren.
Die Bakterienzellen werden dann durch Ultraschallbehandlung, French pressure, Zerreiben mit Schleifmaterial, Vortexen mit Glasperlen und anderen ähnlichen Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden, aufgebrochen, bevorzugt bei einer Temperatur von ungefähr 3-6°C. Das Zellhomogenat wird dann bei ungefähr 10000-20000 g über ungefähr 10-45 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer von der überstehenden Fraktion zu trennen, welche die äußeren Membranproteine enthält. Der Überstand wird durch Dekantieren, Absaugen, Pipettieren und andere ähnliche Methoden gesammelt und dann aufkonzentriert, zum Beispiel durch Ethanol-Ausfällung, Membrankonzentration, Propylenglykol-Ausfällung und andere Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden. In einer bevorzugten Methode wird der Überstand durch Passieren durch eine Membran behandelt, die eine Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von ungefähr 1000-50000 MG hat, bevorzugt ungefähr 10000-25000 MG, um das Protein aufzukonzentrieren und kontaminierenden Proteinen, kleiner als die Molekulargewicht-Ausschlussgrenze, zu erlauben, die Membran zu passieren, und die Menge an Detergens zu verringern. Solche Membranen sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Amicon, Danvers, MA.
Der aufkonzentrierte Überstand wird dann in einem passenden Puffer rekonstituiert, das heißt TBS, HEPES, MOPS und dergleichen, ungefähr pH 7-7,6, welcher ein Detergens enthält, um die äußere Membran zu lösen und die Siderophor-Rezeptorproteine zu extrahieren. Es wurde entdeckt, dass das anionische Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS), wenn es allein als ein lösendes Detergens, ohne ein Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol, verwendet wird, besonders wirksam zur Extraktion einer großen Menge der Siderophor-Rezeptorproteine ist, ohne Denaturierung oder Änderung der Immunogenität, sodass die Proteine in vivo als wirksame Immunogene fungieren werden, um eine Antikörper-Antwort gegen gram-negative Bakterien auszulösen. Die Pufferlösung enthält ungefähr 0,1-4% SDS (0,2%), bevorzugt ungefähr 0,1-2% SDS, bevorzugt ungefähr 0,1-2% SDS.
Nach ungefähr 1-10 Minuten werden die Siderophor-Rezeptorproteine von der Pufferlösung getrennt durch Affinitäts-, Ionenaustausch-, Größenausschluss- und andere ähnliche chromatographische Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden. Bevorzugt wird das SRP-Präparat mit einem 4% Stapelgel auf einem 12,5% Acrylamid-Reduktionsgel getrennt. Die Fraktionen werden dann vereinigt, aufkonzentriert, zum Beispiel durch Zentrifugation, und ausgefällt, zum Beispiel mit einem Alkohol (das heißt Ethanol, Methanol, Aceton), um das SDS zu entfernen. Die gereinigten Proteine können sofort verwendet werden, um einen Impfstoff herzustellen, oder können für zukünftige Verwendung durch Lyophilisation, Kryokonservierung und ähnliche Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden, gelagert werden.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann zur Vorbeugung und Eliminierung von Infektionen von gram-negativen Bakterien in Geflügel und anderen Tieren, einschließlich Menschen, verwendet werden. Der Impfstoff kann dem Tier zum Beispiel durch parenterale Verabreichung, Injektion (subkutan oder intramuskulär), Depotverabreichung, Aerosolierung, Inokulation in ein Ei (das heißt, Geflügel) und dergleichen durch im Stand der Technik bekannte Techniken verabreicht werden. Für prophylaktischen und anti-infektiösen therapeutischen Gebrauch in vivo enthält der Impfstoff eine Menge an Siderophor-Rezeptorprotein, um ein Niveau an aktiver Immunität in einem Tier zu stimulieren, um gramnegative bakterielle Pathogenese und/oder Sepsis zu hemmen und/oder zu eliminieren.
Die Siderophor-Rezeptorproteine werden in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der mit dem Protein und dem Tier kompatibel ist. Passende pharmazeutische Träger schließen zum Beispiel physiologische Salzlösung (0,85%), phosphat-gepufferte Salzlösung, Tris(hydroxymethylaminomethan (TRIS), Tris gepufferte Salzlösung und dergleichen ein. Das Protein kann ebenfalls in einen Träger eingeschlossen sein, der biokompatibel ist und das Protein einschließen kann und seine kontrollierte Freisetzung oder Verabreichung gewährleisten kann, zum Beispiel ein Polymer zur verzögerten Freisetzung wie ein Hydrogel, Acrylat, Polylactid, Polycaprolacton, Polyglycolid oder ein Copolymer davon. Ein Beispiel einer festen Matrix zur Implantation in das Tier und verzögerten Freisetzung des Protein-Antigens in den Körper ist eine metabolisierbare Matrix wie zum Beispiel beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,452,775 (Kent), von welchem die Offenbahrung durch Referenz hierin eingeschlossen ist.
Hilfsstoffe können in den Impfstoff eingeschlossen sein, um die Immunantwort im Tier zu verstärken. Solche Hilfsstoffe schließen zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Freunds inkomplettes Adjuvans (FCA), Liposomen, ISCOM und dergleichen ein. Der Impfstoff kann ebenfalls Additive einschließen wie Puffer und Konservierungsmittel, um Isotonizität, physiologischen pH und Stabilität zu erhalten. Parenterale und intravenöse Formulierungen des Impfstoffes können ein Emulsions- und/oder Suspensionsmittel einschließen, zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, um die Verabreichung und die Dosismenge des Impfstoffes zu kontrollieren.
Faktoren, die sich auf die Impfstoff-Dosis auswirken, schließen zum Beispiel das Alter und Gewicht des Tieres ein. Der Bereich einer gegebenen Dosis ist ungefähr 25-5000 μg des gereinigten Siderophor-Rezeptorproteins pro ml, bevorzugt ungefähr 100-1000 μg/ml, bevorzugt gegeben in Dosen von ungefähr 0,1-5 ml. Der Impfstoff sollte dem Tier in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um sicher zu stellen, dass das Tier eine Immunität zum Schutz gegen gram-negative bakterielle Infektion entwickeln wird. Zum Beispiel würde für Geflügel eine einzelne Dosis eines Impfstoffes, gemacht mit Freunds inkomplettem Adjuvans, ungefähr 150-300 μg des gereinigten Siderophor-Rezeptorproteins pro ml enthalten. Zur Immunisierung eines einen Tag alten Vogels von ungefähr 60 Gramm Gewicht kann dem Vogel eine Dosis von ungefähr 0,25-0,5 ml subkutan oder intramuskulär injiziert werden. Für einen ungefähr 3 Wochen alten Vogel von ungefähr 1,5 Pfund kann dem Vogel eine Dosis von ungefähr 0,25-1 ml injiziert werden. Ein Impfstoff zur Immunisierung eines Ferkels von ungefähr 5 Pfund gegen Salmonella cholerasuis würde ungefähr 100-5000 μg Protein pro ml enthalten, bevorzugt gegeben in Dosen von 1-5 ml. In jedem Fall würde der Immunisierungsdosis dann ein Verstärker folgen, der ungefähr 21-28 Tage nach der ersten Injektion gegeben würde. Bevorzugt ist der Impfstoff mit einer Menge des Siderophor-Rezeptorproteins formuliert, die wirksam ist, ein anfälliges Tier gegen eine Infektion durch zwei oder mehr Stämme oder Spezies gram-negativer Bakterien zu immunisieren, die ein Siderophor-Rezeptorprotein exprimieren.
Zur Verstärkung der Immunisierungsdosis kann der Verstärker eine Präparation ganzer Zellen sein, wie konventionell verwendet, oder eine chemisch modifizierte Zellpräparation, neben anderen. Zum Beispiel ist ein nützlicher Verstärker eine Präparation eines modifizierten E. coli wie avirulenten R-Mutanten, wie zum Beispiel E. coli J5 (kommerziell erhältlich von ATCC als ATCC #43754; beschrieben durch Overbeck et al., J. Clin. Microbiol. 25:1009-1013 (1987)), oder Salmonella minnesota (kommerziell erhältlich von ATCC als ATCC #49284; wie beschrieben durch Sanderson et al., J. Bacteriol. 119:753-759, 760-764 (1974)), denen es an äußeren Oligosaccharid-Seitenketten der Lipopolysaccharid(LPS)-schicht der äußeren Membran fehlt. Äußere Oligosaccharid-Seitenketten neigen dazu, SRPs auf der Zellmembran zu maskieren in solcher Weise, dass das Immunsystem die SRPs nicht erkennt und anti-SRP-Antikörpertiter herabgesetzt werden. Um die Fähigkeit eines Verstärkers, der mit intakten Bakterienzellen gemacht wurde, eine anti-SRP-Immunantwort hervorzurufen, zu verstärken, kann die Zellmembran der Bakterien chemisch verändert werden, um die störenden Oligosaccharid-Seitenketten zu entfernen. Verstärkung mit chemisch modifizierten Bakterien wie einer R-Mutante liefert vorteilhafterweise einen anti-SRP-Antikörpertiter, der 5-20 mal höher ist als ein Verstärker, der aus einer nicht modifizierten Ganzzellbakterien-Präparation gemacht wurde, oder eine natürliche Feldherausforderung.
Obwohl es nicht als eine Limitierung der Erfindung beabsichtigt ist, wird der Mechanismus, durch den Immunisierung mit dem vorliegenden Impfstoff Schutz gegen gramnegative bakterielle Infektion liefert, wie folgt angenommen. Nachdem ein Tier mit dem Impfstoff immunisiert wurde, antwortet der Körper, wenn er mit einem pathogenen Stamm gram-negativer Bakterien herausgefordert wird, durch Produktion humoraler Antikörper, die die Siderophor-Rezeptorproteine auf der äußeren Membran der Bakterien hemmen. Dies verhindert Eisenaufnahme durch die Zelle, was wiederum schließlich das Bakterium an benötigten Eisen-Nährstoffen verhungern lässt. Ein anderer Mechanismus ist, dass humorale Antikörper, produziert als Antwort auf die Siderophor-Rezeptorproteine im Impfstoff, an das Siderophor-Rezeptorprotein auf der bakteriellen Membran binden, um die Aktivierung von Komplement (C') zu verursachen. Dies hat Komplement-vermittelte Bakteriolyse oder verstärkte Opsonisation zur Folge, was zu erhöhter Phagozytose durch das mononukleare phagozytische System führt.
Zusätzlich basiert die Wirksamkeit dieses Impfstoffes auf der Verwendung gereinigter Siderophor-Rezeptorproteine, anstatt ganze Zellen zu verwenden. Die Immunantwort in Tieren, geimpft mit einer gereinigten SRP-Präparation, ist ungefähr 20 mal höher als die Immunantwort auf eine Präparation von ganzen Zellen, gezüchtet unter Eisen-beschränkten Bedingungen. Während gram-negativer Sepsis richtet ein Gasttier eine Immunantwort auf ein eindringendes Bakterium ein. Da der Hauptbestandteil der Zellwand gram-negativer Bakterien aus Lipopolysaccharid (LPS) besteht, richtet sich die Immunantwort eines Tieres an diese Struktur, wobei eine immunodominante Rolle für die LPS-Zellwand induziert wird. Äußere Membranproteine wie IROMPs oder SRPs, die keine dominanten Proteine auf der Oberfläche der Bakterienzellwand sind, induzieren begrenzte Immunantwort, was zu niedrigen Antikörper-Titern führt. Also liefert die Verwendung eines Bakterins, das aus ganzen Bakterienzellen hergestellt wurde, die unter Eisen-Beschränkung gezüchtet wurden, um Siderophor-Rezeptorproteine zu exprimieren, eine begrenzte Immunantwort zu den Siderophor-Rezeptorproteinen aufgrund der konkurrierenden Antigene auf der Zelloberfläche. Wenn im Vergleich ein Tier mit einem Impfstoff immunisiert wurde, der aus gereinigten SRPs gemacht ist, ist hier weniger antigenischer Wettbewerb und das tierische Immunsystem fokussiert seine Antwort auf die Rezeptorproteine. Serologische Profile zeigen einen signifikanten Anstieg im Antikörper-Titer in der SRP-geimpften Gruppe, wenn sie mit ganzen Zellen, die SRP exprimieren, verstärkt wurde.
Polyklonale Antikörper können zum Siderophor-Rezeptorprotein durch Hyperimmunisierung eines Tieres mit einem Inokulum, das das isolierte Rezeptorprotein enthält, gezüchtet werden. Das Blutserum kann entfernt werden und mit immobilisierten Siderophor-Rezeptorproteinen kontaktiert werden, die mit den proteinspezifischen Antikörpern reaktiv sind. Das halbgereinigte Serum kann weiter durch chromatographische Methoden behandelt werden, um IgG- und IgM-Immunoglobuline zu reinigen, um ein gereinigtes polyklonales Antikörperserum für kommerziellen Gebrauch zu bieten.
Monoklonale Antikörper, die mit dem Siderophor-Rezeptorprotein reaktiv sind, können durch Hybridoma-Techniken gezüchtet werden, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden. Kurz dargestellt, eine Maus, Ratte, Kaninchen oder andere passende Spezies können mit einem Siderophor-Rezeptorprotein immunisiert werden. Die Milz des Tieres wird dann entfernt und als eine Ganzzell-Präparation verarbeitet. Der Methode von Kohler und Milstein folgend (Nature 256:496-97 (1975)) können die Immunzellen aus der Milzzell-Präparation mit Myeloma-Zellen verschmolzen werden, um Hybridomas zu produzieren. Die Hybridomas können dann kultiviert werden und die Kulturflüssigkeit auf Antikörper, spezifisch für Siderophor-Rezeptorproteine, getestet werden, zum Beispiel unter Verwendung eines ELISA, in welchem spezifische Siderophor-Rezeptorproteine an eine feste Oberfläche gebunden werden und als Capture-Antigene wirken. Die Hybridoma kann dann in das Peritoneum der Gastspezies eingeführt werden, um ein peritoneales Wachstum der Hybridoma zu erzeugen, und Aszites-Flüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper zum Bakterium enthalten, können gesammelt werden.
Die monoklonalen Antikörper können in diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen und Methoden verwendet werden, einschließlich passiver Immunisierung. Zum Beispiel können Immunoglobuline, die spezifisch gegen ein Siderophor-Rezeptorprotein sind, verwendet werden, um passive Immunität gegen gramnegative Sepsis zu liefern. Tiere können durch intramuskuläre Verabreichung von Immunoglobulinen von ungefähr 100/mg/kg Körpergewicht behandelt werden, ungefähr alle 3-7 Tage.
Eine Methode zur Diagnose einer Infektion durch gram-negative Bakterien in einer Körperprobe kann mit den polyklonalen Antikörpersera oder monoklonalen Antikörpern, wie oben beschrieben, in einem enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Immunofluoreszenz-Assay (IFA), einem Northern-, Western- oder Southern-Blot-Assay und dergleichen durchgeführt werden. Kurz zusammengefasst, der Antikörper oder die Körperprobe (das heißt, Gewebeprobe, Körperflüssigkeit) kann zum Beispiel durch Kontakt mit einem polymeren Material wie Polystyrol, einem Nitrocellulosepapier oder anderen ähnlichen Mitteln zur Immobilisierung des Antikörpers oder der Probe immobilisiert werden. Der andere Antikörper oder die Körperprobe wird dann zugegeben, inkubiert, und das nicht immobilisierte Material wird durch Waschen oder andere Mittel entfernt. Ein markierter Spezies-spezifischer Antikörper, der reaktiv mit letzterem ist, wird zugegeben. Der Serum-Antikörper oder gram-negative Bakterien in der Körperprobe werden dann zugegeben und die Anwesenheit und Quantität an Markierung wird ermittelt, um die Anwesenheit und Menge gram-negativer Bakterien in der Körperprobe anzuzeigen. Die Erfindung wird weiter beschrieben durch Bezugnahme auf die folgenden ausführlichen Beispiele, worin die Methodiken sind, wie unten beschrieben. Diese Beispiele sind nicht bestimmt, den Bereich der Erfindung zu begrenzen, der in der vorangegangenen Beschreibung dargelegt wurde. Variation innerhalb der Konzepte der Erfindung sind Fachpersonen offensichtlich. Die Offenbahrungen der zitierten Referenzen in der ganzen Anwendung sind durch Bezugnahme hierin eingeschlossen.
Beispiel 1
Herstellung und Reinigung von Siderophor-Rezeptorproteinen
Escherichia coli Serotyp 078 (Truthahnisolat; serotypiert durch Pennsylvania State University, gelagert in der American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, MD, U.S.A., als ATCC #55652, am 3. Januar 1995) (700 ml bei 10⁸ Kolonien/ml) wurde in einen Virtis Tischfermenter (Virtis, Inc., Gardiner, NY) bei 41 °C inokuliert, der befüllt mit 20-L Hirn-Herz-Infusion (BHI, Difco Laboratories, Detroit, MI) war, welche 50 μGramm/ml Dipyridyl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Es wurde gezeigt, dass dieses Isolat unter Eisen-beschränkten Bedingungen vier Siderophor-Rezeptorproteine produziert (MG 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa, 72 kDa). Der pH wurde bei 7,4 konstant gehalten durch automatische Titration mit 5N NaOH. Der Fermenter wurde bei 400 U/min gerührt. Die Kultur wurde 18 Stunden kontinuierlich gezüchtet, nach denen die Bakterien durch Durchfluss-Zentrifugation bei 20000 g bei 4°C unter Verwendung einer Beckman (Modell J2-21M) Zentrifuge (Beckman Instruments, Eden Prairie, MN) entfernt wurden. Die pelletisierten Bakterien wurden zweimal mit 1000 ml physiologischer Salzlösung (0,85%) gewaschen, um kontaminierende Kulturmedien-Proteine zu entfernen.
Die Bakterien wurden in tris-gepufferter Salzlösung (TBS), die 2,0% Natrium-N-lauroylsarcosinat (SARKOSYL^TM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, resuspendiert, optische Dichte 5%, 540 nm. Die Suspension wurde 45 Minuten bei 4°C unter kontinuierlichem Rühren inkubiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Durchfluss-Zell-Schallgerätes (Branson 450, Danbury, CT) bei 4°C aufgebrochen, mit einer maximalen Flussgeschwindigkeit von 5 gph (Gallonen pro Stunde). Die aufgebrochene Zellsuspension wurde 20 Minuten bei 16000 g zentrifugiert.
Das Zentrifugat aus dem Durchfluss-Zell-Schallgerät, das die äußeren Membranproteine enthielt, wurde gesammelt und durch Ethanol-Ausfällung bei –20°C aufkonzentriert. Es ist selbstverständlich, dass der Überstand ebenfalls aufkonzentriert werden kann, durch Membrankonzentration unter Verwendung einer 50000 MG-Ausschlussgrenze-Durchflussmembran (Amicon, Danvers, MASS). Das aufkonzentrierte Material (10% T bei 540 nm) wurde unter Verwendung von 0,2 Prozent Natriumdodecylsulfat (SDS) in TBS bei pH 7,4 gelöst.
Das Elutionsprofil des aufkonzentrierten Materials, behandelt mit 0,2% SDS, ist in 1 gezeigt. Das gelöste Material wurde bei 25°C auf eine Vantage-Säule (Amicon, Danvers, MA) aufgebracht, die 3,2-L einer Cellufine fast flow GC-700 Gelmatrix (Amicon, Danvers, MA) enthielt, equilibriert mit TBS, das 0,2% SDS enthielt. Die Reinigung des Proteins wurde durch UV-Absorption bei 280 nm verfolgt. Die Flussgeschwindigkeit durch die Säule war 3000 ml/h und es wurden 15-ml-Fraktionen unter Verwendung eines UA-5 Detektors und Retriever 5 Fraktionensammlers (ISCO, Inc., Lincoln, NE) gesammelt. Fraktionen von jedem Peak wurden vereinigt und unter Verwendung eines Diaflo Ultrafiltrationsapparates mit einer 50000-MWCO-Membran aufkonzentriert. Das aufkonzentrierte Material von jedem Peak wurde durch Gelelektrophorese untersucht. Wie in 1 gezeigt, enthielt Peak 1 ungefähr 85% reine Siderophor-Proteine. Diese Lösung wurde 24 Stunden bei –20°C mit Ethanol ausgefällt, um das SDS zu entfernen, und dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Die Menge an Protein wurde unter Verwendung eines Pierce BCA Proteintests (Pierce, Rockford, IL) ermittelt.
Beispiel 2
Herstellung eines Impfstoffes mit Siderophor-Rezeptorproteinen
Der Niederschlag aus Beispiel 1 oben, der Siderophor-Rezeptorproteine von E. coli-Serotyp 078 enthält, wurde in physiologischer Salzlösung (0,85%), die 0,1% Formalin als Konservierungsmittel enthielt, resuspendiert. Die Proteinkonzentration war 300 μg/ml. Die wässrige Proteinsuspension (1000 ml) wurde in einem Wasser-in-Mineralöl-Zusatzmittel, das 972 ml Drakeol 6 Mineralöl und 28 ml Anlacel A als Emulgator enthielt, emulgiert. Die Mischung wurde unter Verwendung eines U1tra-Turnax T50 Emulgators (KIKA Works, Inc., Cincinnati, OH) bei 4°C emulgiert. Die Wasser-in-Öl-Emulsion wurde bei 4°C gelagert.
Beispiel 3
Impfung von Geflügel mit Siderophor-Rezeptorprotein-Impfstoff
Zweiundsiebzig Truthahnküken wurden in Isolation ab einem Alter von einem Tag aufgezogen. In einem Alter von drei Wochen wurden die Vögel in zwei gleiche Gruppen geteilt. Gruppe 1 wurde subkutan mit dem Impfstoff aus Beispiel 2 oben geimpft, mit einem Dosierungsniveau von 150 μg des Siderophor-Rezeptorproteins pro Vogel. Gruppe 2 blieb als ungeimpfte Kontrolle. Gruppe 1 wurde eine Verstärkungsimpfung mit dem Impfstoff mit einem Dosierungsniveau von 250 μg des Siderophor-Rezeptorproteins pro Vogel 18 Tage nach der ersten Impfung gegeben.
Die geimpften und nicht geimpften Vögel wurden in vier Isolationsräume gleich aufgeteilt. Räume A und B enthielten die geimpften Vögel, und Räume C und D enthielten die nicht geimpften Kontrollen. In einem Alter von sieben Wochen wurden die Vögel in Gruppen A und C subkutan mit Salmonella agona bei 1,0 × 10⁸ kbe/Vogel herausgefordert (challenged?). 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach Herausforderung wurden zwei Kontrollen und zwei geimpfte Vögel getötet. Die Milzen wurden von jedem Vogel aseptisch entfernt und einzeln gewogen und auf 4 Gramm/Milz, 10 Gramm/Leber angepasst. Jede Probe wurde dann in steriler physiologischer Salzlösung unter Verwendung eines Stomacher Labormixers, Modell 3500 (Seward Medical, London) homogenisiert. Fortlaufende zehnfache Verdünnungen jedes Homogenats wurden in Duplikat auf Brilliant Schwefelgrün Platten (Difco Laboratories, Detroit, MI) plattiert.
Die Ergebnisse zeigen die quantitative Clearance von Salmonella agona in Milzen der SRP-geimpften und der nicht geimpften Truthähne (2). Zeit 0 zeigt die Anzahl an Bakterien, die jedem Vogel gegeben wurde. 24 Stunden nach Herausforderung war das Niveau an Bakterien in den geimpften Vögeln auf Null reduziert und blieb während der Probenperiode auf diesem Niveau. Im Gegensatz dazu blieben die nicht geimpften Kontrollen während der Dauer des Experiments positiv.
Beispiel 4
Kreuz-Reaktivität der Siderophor-IROMPs, produziert von Escherichia coli (Seotyp 078)
Hyperimmunisiertes Serum, produziert gegen gereinigte Siderophor-Rezeptorproteine, wurde auf seine Kreuz-Reaktivität zu Bakterien von anderen Genera und Spezies untersucht. Siderophor-Rezeptorproteine wurden in den folgenden Bakterien produziert: Escherichia coli (Serotypen 01a, 02a und Serotyp 078 (ATCC #55652)), Salmonella agona, Salmonella blockley, Salmonella enteriditis, Salmonella hadar, Salmonella heidelberg, Salmonella montevideo, Salmonella senftenberg, Salmonella cholerasuis und Pasteurella multocida (Serotyp A:3,4; gelagert in ATCC als ATCC #_, am_Februar 1995). Diese Bakterien, mit Ausnahme von S. cholerasuis, waren Feldisolate, erhalten aus klinisch diagnostizierten Vögeln und serotypiert durch das State Poultry Testing Laboratory, Willmar, MN (Salmonella spp.) und Pennsylvania State University (E. coli). Salmonella cholerasuis wurde vom University of Minnesota Diagnostic Laboratory erhalten. Die bakteriellen Isolate wurden in 100 ml BHI-Brühe mit Dipyridyl (175 mM) gezüchtet, und ohne Dipyridyl, aber 200 μm Eisenchlorid enthaltend.
Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 16000 g über 10 Minuten bei 4°C von den Zellkulturen gesammelt. Die Zellpellets wurden zweimal in tris-gepufferter Salzlösung (TBS) bei pH 7,4 gewaschen und in 30 ml TBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall über 2 Minuten bei 4°C unter Verwendung eines Branson Ultraschallgerätes (Danbury, CT) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellsuspension wurde 20 Minuten bei 4°C bei 16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und 2 Stunden bei 4°C bei 30000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml TBS, das 2% Natrium-N-lauroylsarcosin enthielt, resuspendiert und 45 Minuten bei 4°C auf einem Gyrator-Schüttler platziert. Die detergensunlösliche mit äußerem Membranprotein angereicherte Fraktion wurde durch 2 Stunden Zentrifugation bei 4°C bei 30000 g gesammelt. Das Pellet wurde in 1 ml TBS resuspendiert und bei –90°C gelagert. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE mit einem 4% Stapelgel auf einem 12% Auflösungsgel getrennt. Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970).
Die äußeren Membranproteine von den verschiedenen E, coli-, Salmonella- und Pasteurella-Isolaten wurden von den SDS-PAGE-Gelen zu Nitrocellulosemembranen überführt (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Die Membranen wurden mit negativen (Kontrolle) und positiven Antisera zu den Siderophor-Rezeptorproteinen getestet.
Die Kontroll-Antisera wurden von den Vögeln in Gruppe 2 gesammelt, wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Die positiven Antisera wurden von den Vögeln in Gruppe 1 gesammelt, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, 5 Tage nach der zweiten Impfung. Die Sera, jeweils 50 ml, wurden mit getöteten Ganzzell-Bakterien (E. coli 078, Salmonella heidelberg, Pasteurella multocida), gezüchtet in Eisen-übersättigten Medien (BHI, das 200 μm Eisenchlorid enthielt), über 1 Stunde bei 4°C absorbiert.
Die SDS-PAGE-Muster der äußeren Membranprotein-Extrakte der verschiedenen bakteriellen Isolate zeigten Expression von Siderophor-Rezeptorproteinen, wenn sie unter Bedingungen von Eisen-Beschränkung gezüchtet wurden, im Gegensatz zu nicht Eisenbeschränkten Kontrollen, welche keine Siderophor-Rezeptorproteine exprimierten. Pasteurella multocida produzierte drei Siderophor-Rezeptorproteine unter Bedingungen von Eisen-Beschränkung, welche Molekularmassen von ungefähr 96 kDa, 84 kDa und 80 kDa hatten. Die E. coli-Isolate produzierten eine geringfügige Variation in ihren IROMP-Profilen. Serotyp 078 produzierte vier Siderophor-Rezeptorproteine mit ungefährem Molekulargewicht von 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa und 72 kDa. Serotyp 02a produzierte drei Banden mit Molekulargewichten von 89 kDa, 78 kDa und 72 kDa. Serotyp 01a produzierte zwei Banden mit Molekulargewichten von 84 kDa und 78 kDa. Alle untersuchten Salmonella-Isolate produzierten drei Siderophor-Rezeptorproteine mit identischen Bandenmustern mit ungefähren Molekulargewichten von 89 kDa, 81 kDa und 72 kDa.
Western Blot-Analyse offenbarte, dass die positiven Antisera, hergestellt gegen die gereinigten Siderophor-Rezeptorproteine von E. coli 078, intensiv mit den Siderophor-Rezeptorproteinen von E. coli Serotypen 01a, 02a und den Rezeptorproteinen von Salmonella reagierten. Das 96 kDa- und das 84 kDa-Rezeptorprotein von Pasteurella reagierten mit den positiven E. coli Protein-Antisera. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Siderophor-Rezeptorproteine von E. coli vollständige antigenische Homologie zu Salmonella und teilweise Homologie zu Pasteurella multocida haben. Die Kontrollsera reagierten nicht mit irgendwelchen Siderophor-Rezeptorproteinen dieser Spezies.
Beispiel 5
Kreuz-Reaktivität von Siderophor-Rezeptorproteinen von Escherichia coli (Serotyp 078) Escherichia coli-Isolate (150 Isolate), die aus coliseptischen Vögeln stammen, wurden auf Reaktivität mit den positiven Antisera aus Beispiel 4 oben überprüft. Die Isolate wurden durch direkte Agglutination unter Verwendung der Siderophor-Rezeptor-Antisera und der negativen Referenzsera untersucht. Achtundneunzig Prozent (98%) der E. coli-Isolate wurden bei Verwendung der positiven Antisera im Gegensatz zu den negativen Sera agglutiniert. Die positiven Antisera reagierten außerdem mit Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae und fünf Serogruppen von Salmonella (Serotyp B, C₁, C₂, D₁ und E₃).
Beispiel 6
Serologische Antwort auf Siderophor-Rezeptorproteine (SRP) von E. coli in geimpften und nicht geimpften Scharen unter natürlichen Feldbedingungen
Einundfünfzigtausend einen Tag alte Truthahnküken wurden gleichmäßig auf zwei Ställe aufgeteilt, bezeichnet als Ställe 1 und 2. In einem Alter von sechs Wochen wurde den Vögeln in Stall 1 ein Wasser-in-Öl-Impfstoff, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, subkutan injiziert. Jeder Vogel erhielt 0,5 cm?³, die 300 μg E. coli Serotyp 078 Siderophor-Rezeptorprotein (SRP) enthielten, in die untere Nackenregion. Stall 2 verblieb als nicht geimpfte Kontrollen. Blut wurde von 15 Vögeln pro Stall in wöchentlichen Intervallen gezapft.
3 stellt die serologische Antwort auf E. coli-SRPs zwischen geimpften und nicht geimpften Herden dar. Die Antikörper-Antwort auf die SRPs in der geimpften Schar erhöhte sich stetig in jeder Probenperiode im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollen. 35 Tage nach Impfung hatte die geimpfte Gruppe eine 7,1 fach größere Antikörper-Antwort als die Kontrollgruppe.
Tabelle 1 unten zeigt das durchschnittliche Gewicht verarbeiteter Vögel zwischen den geimpften und nicht geimpften Scharen. Es gab einen statistisch größeren Gewichtsvorteil zwischen der geimpften Schar (12,2 Pfund/Vogel) im Vergleich zur nicht geimpften Schar (11,8 Pfund/Vogel).
Tabelle 1 DAS DURCHSCHNITTLICHE KÖRPERGEWICHT ZWISCHEN SRP-GEIMPFTEN UND NICHT GEIMPFTEN TRUTHÄHNEN ZUM ZEITPUNKT DER VERARBEITUNG
4 und 5 zeigen die prozentuale Gesamtsterblichkeit und Keulungen in E. coli SRP-geimpften Schwesterscharen (das heißt, von den gleichen Zuchthennen oder Brutpartnern stammend), und die nicht SRP-geimpften Kontrollen, im Alter von 3-13 Wochen. Diese Ergebnisse zeigen die wahre Feldsterblichkeit nach Impfung, unter Ausschluss von früher Kükensterblichkeit, welche zu fehlerhaften Ergebnissen führen könnte. Wie zu sehen ist, gab es eine signifikante Senkung sowohl bei verendeten als auch gekeulten Vögeln in den SRP-geimpften Scharen. Diese Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit von E.coli abgeleiteten Siderophor-Rezeptorproteinen in einem Impfstoff zur Kontrolle systemischer Infektionen, verursacht durch E. coli unter natürlichen Feldbedingungen.
Beispiel 7
Kreuz-Reaktivität von SRPs von Salmonella senftenberg und Pasteurella multocida
Achtundvierzig Nicholas-Truthahnküken wurden in Isolation ab einem Alter von einem Tag aufgezogen. In einem Alter von drei Wochen wurden die Vögel in zwei gleiche Gruppen geteilt, bezeichnet als Gruppe 1 und Gruppe 2. Zwölf Vögel in Gruppe 1 wurden subkutan mit (0,5 cm³) 300 μg gereinigten SRP, isoliert von Salmonella senftenberg, geimpft. Der Impfstoff wurde hergestellt wie in Beispiel 2 oben beschrieben. Die verbleibenden zwölf Vögel wurden als nicht geimpfte Kontrollen benutzt. Vögel in Gruppe 2 wurden genauso behandelt wie in Gruppe 1, außer dass 12 der Vögel mit 300 μg gereinigtem SRP, isoliert von Pasteurella multocida, geimpft wurden.
Blut wurde von allen Vögeln in beiden Gruppen in Intervallen von 5 Tagen abgenommen. Fünfzehn Tage nach der ersten Injektion erhielten die geimpften Vögel eine zweite Injektion des entsprechenden SRPs. Jeder geimpfte Vogel erhielt 500 μg, (0,5 cm³) SRP subkutan in einem Wasser-in-Mineral-Adjuvans. Alle nicht geimpften Vögel verblieben als Kontrollen. Den Vögeln wurde in Intervallen von 5 Tagen Blut abgenommen.
Fünfzehn Tage nach der zweiten Injektion wurden die geimpften Vögel intravenös mit 100 μg S. heidelberg-SRP beprobt (7). Blut wurde in Intervallen von 2 Tagen nach Beprobung abgenommen. Es gab eine hohe Antikörper-Antwort auf die Beprobung 2 und 4 Tage nach Beprobung. Diese Daten zeigen die Kreuz-Reaktivität von S. heidelberg zu S. senftenberg. Diese Proteine kreuz-reagieren wiederum beide mit E. coli, wie durch den ELISA unter Verwendung von E. coli-SRPs als das Capture-Antigen nach der Vorschrift oben in Beispiel 5 beschrieben.
Gleichermaßen wurden 15 Tage nach der zweiten Injektion alle Vögel in Gruppe 2 intramuskulär mit 1,1 × 10⁶ KBE von P. multocida, ATCC Stamm P-1059, beprobt. Die Sterblichkeit wurde täglich aufgezeichnet für eine 2-wöchige Nachbeprobung. 6 und Tabelle 2 unten zeigen ebenfalls die der Beprobung folgende Sterblichkeit zwischen den geimpften und nicht geimpften Vögeln. TABELLE2 Der Beprobung mit Pasteurella multocida P-1059 folgende Sterblichkeit der geimpften und nicht geimpften Truthähne Anzahl der Toten/Gesamtzahl Getestete

Nicht geimpft Geimpft

11/12 (91,6%) 1/12 (8,3%)
Elf (91,6%) der nicht geimpften Vögel starben innerhalb von 14 Tagen nach der Beprobung (siehe 6). Im Gegensatz dazu starb nur 1 (8,3%) der Vögel in der geimpften Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass Siderophor-Rezeptorproteine als schützende Immunogene verwendet werden können.
7 und 8 zeigen die serologische Antwort der Vögel, die mit Siderophor-Rezeptorproteinen, isoliert von S. senftenberg beziehungsweise P. multocida, geimpft wurden. Die Siderophor-Rezeptorproteine induzierten primäre und sekundäre Immunantworten in beiden geimpften Gruppen bei 10- und 20- Tagen Nachimpfung im Vergleich zu den nicht geimpften Kontroll-Vögeln. Diese Antikörper-Antworten zeigen die kreuz-reaktive Natur dieses Proteins, was im ELISA-Test unter Verwendung von SRPs, isoliert von E. coli, als Capture-Antigenen bestätigt wurde.
Beispiel 8
Kreuz-Reaktivität der Siderophor-Rezeptorproteine, bewertet durch ELISA
Die Kreuz-Reaktivität von E. coli Siderophor-Rezeptorproteinen aus Beispiel 7 oben wurde unter Verwendung eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISA) weiter untersucht. Die Siderophor-Rezeptorproteine (SRPs) wurden unter Verwendung eines Elektro-Eluters Modell 422 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) aus Polyacrylamid-Gelen gereinigt. Die Proteine wurden dann als Capture-Moleküle in einem indirekten ELISA-Test verwendet.
Die optimalen Arbeitskonzentrationen von SRP und Konjugat wurden durch mehrere Schachbrett-Titrationen unter Verwendung von positiven und negativen Kontrollsera aus Beispiel 6 oben ermittelt. Eine Kalibrierkurve wurde dann erstellt, um SRP-ELISA-Titer bei einer Verdünnung von 1:200 zu berechnen. Alle nachfolgenden Tests wurden mit einer einzigen Serumverdünnung (1:200) durchgeführt, und SRP-Titer wurden aus dem Durchschnitt der Duplikat-Test-Absorbationswerte berechnet.
Der ELISA wurde durch Zugabe von 100 μl von verdünntem SRP von E. coli in 0,05 M (0,1 μg) Carbonatpuffer (pH 9,6) zu jeder Vertiefung einer leicht waschbaren 96-Loch-Flachboden-Mikrotiterplatte (Corning, Coming, NY) durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurde überschüssiges SRP entfernt und die Platte gewaschen. Alle nachfolgenden Waschschritte wurden dreimal in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 durchgeführt. Die Platten wurden eine Stunde bei 37°C mit 4% Fischgelatine (Sigma) in PBS blockiert und dann gewaschen.
Duplikat-Serumproben aus Beispiel 7 wurden parallel bei Ein-Punkt-Verdünnungen unter Verwendung von 100 μl/Vertiefung getestet und 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Jede Platte enthielt positive und negative Kontrollsera, die aus Vögeln aus Beispiel 4 oben erhalten wurden. Nach Waschen wurden 100 μl Peroxidase-markiertes Konjugat zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach Inkubation über 40 Minuten bei 37°C wurden die Platten gewaschen und 100 μl ABTS-Peroxidasesubstrat in gepufferter H₂O₂-Lösung (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Das Substrat wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Reaktion wurde mit 50 μl von 1 % SDS abgebrochen und direkt die Absorbtion unter Verwendung eines MR650 Mikrotiterplattenlesers (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) gemessen.
Beispiel 9
Fermentationsvorschrift zur Herstellung von Siderophor-Rezeptorproteinen
Die folgende Vorschrift wurde verwendet, um E. coli 078 (ATCC #55652) zu kultivieren, was zur Expression von sechs (6) Siderophor-Rezeptorproteinen führte.
Eine E. coli-Hauptstammkultur wurde durch Wachsen des Organismus in 2000 ml steriler BHI-Brühe, die 1-500 μg 2,2'-Dipyridyl enthielt, über 8 Stunden bei 37°C hergestellt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 10000 g über 30 Minuten geerntet. Die Kultur wurde durch Zentrifugation und Resuspendieren des Pellets in sterilem PBS zweimal gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in 500 ml steriler BHI, die 20% steriles Glycerol enthielt, resuspendiert. Ein Milliliter der Kultur wurde in eine 2-ml-Kryoampulle überführt und bei –85°C gelagert.
Eine Kryoampulle (1 ml) der E. coli-Hauptstammkultur wurde verwendet, um einen 100-ml-Kulturkolben zu inokulieren, der Trypton (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Dextrose (2 g/l), NaCl (10 g/l) und 2,2'-Dipyridyl (15,0 μg/ml) enthielt. Die Kultur wurde 7 Stunden bei 37°C inkubiert, nach welcher Zeit sie in 2 Liter des obigen Mediums inokuliert und weitere 4 Stunden bei 37°C wachsen gelassen wurde. Die 2-Liter-Kultur wurde verwendet, um einen Virtis 20-Liter-Tischfermenter (Modell 233353, Virtis, Gardiner, NY), beladen mit 13 Liter des oben beschriebenen Mediums, zu inokulieren. Der pH wurde durch automatische Titration mit 30% NaOH und 10% HCl konstant zwischen 6,9 und 7,2 gehalten. Die Rührgeschwindigkeit war 250 U/Minute, und die Kultur wurde mit 11 Litern/Minute bei 34°C belüftet. Aufschäumen wurde automatisch durch Zugabe von 0,4% Silikon-Schaumverhüter (Antifoam-B, J. T Baker, NJ) kontrolliert. Die Kultur wurde unter diesen Bedingungen 12 Stunden kontinuierlich wachsen gelassen (O.D. 600 nm = 7,10), nach welcher Zeit sie in einen 150-Liter-Fermenter (W. B. Moore, Easton PN) gepumpt wurde, der mit 110 Litern des oben beschriebenen Mediums, das 26,7 μg/ml Dipyridyl und 0,2% Schaumverhüter enthielt, beladen war. Die Bedingungen im Fermenter waren wie folgt: 450 U/min, 50 slpm Luft, 10 psi Gegendruck, 34°C, und pH mit NaOH bei 6,9 gehalten.
Nach 12 Stunden Fermentation wurden die Bakterien durch Zugabe von 0,15% Formalin deaktiviert. Die Bakterien wurden durch Durchfluss-Zentrifugation (20000 g bei 4°C) unter Verwendung zweier Beckman (Modell J2-21M) Zentrifugen, ausgestattet mit JCF-Z Durchflussrotoren, geerntet.
Die pelletisierten Bakterien wurden dann gewaschen, um kontaminierende Kulturmedienproteine zu entfernen, und weiter verarbeitet wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Das aufkonzentrierte Material wurde mit 0,2% SDS behandelt und eluiert wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Der Peak aus dem Elutionsprofil, der ungefähr 85% reine Siderophor-Rezeptorproteine enthielt, wurde mit Ethanol ausgefällt, um SDS zu entfernen, und in PBS resuspendiert.
Das Material wurde durch SDS-PAGE getrennt, wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit einem 4% Stapelgel und 12,5% Acrylamidgel. Das SDS-PAGE-Muster des äußeren Membranproteinextrakts zeigte Expression von SRPs, die Molekulargewichte von 91-92 kDa, 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa, 74 kDa und 72 kDa hatten.
Beispiel 10
Wirksamkeit des Impfstoffes von SRPs von Escherichia coli unter natürlichen Feldbedingungen
Die Wirksamkeit der Impfung von Truthähnen mit E. coli Siderophor-Rezeptorproteinen (SRPs) unter natürlichen Feldbedingungen wurde wie folgt gezeigt. Ein Bauernhof-Komplex mit einer Krankheitsgeschichte wurde für experimentelle Versuche ausgesucht. Die Anlage war ein Drei-Zustände-Betrieb, der zwei Brutställe und acht Fertigstellungshöfe hatte. Daten wurden über ein Jahr vor der Impfung gesammelt, um ein genaues Profil über Sterblichkeiten und Vogel-Performanz aufzustellen (Scharen 1-16 vor Impfung). Impfung mit SRPs wurde über einen Zeitraum von 6 Monaten evaluiert (Scharen 17-24 nach Impfung). Eine Gesamtmenge von 24 Scharen, 1160864 Vögel umfassend, wurde untersucht. Impfversuche begannen im Januar und liefen bis Juli, als kritischer Zeitraum für E. coli-Infektionen und andere natürliche Feldherausforderungen geltend.
Brutställe 1 und 2 wurden in Hälften aufgeteilt und als A und B (Stall-1) und C und D (Stall-2) bezeichnet. Ungefähr 50000 willkürlich ausgewählte Hennen wurden in jedem Stall untergebracht, sodass jede Schar 25000 Hennen enthielt. Alle Scharen wurden durch subkutane Injektion in einem Alter von 3 Wochen mit einer Impfstoffpräparation, die SRPs (MG 91-92 kDa, 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa, 74 kDa und 72 kDa, SDS-PAGE auf 12,5% Acrylamidgel) enthielt, isoliert und gereinigt aus E. coli 078 wie oben in Beispiel 1 beschrieben, geimpft. Scharen A und C wurden mit einem Dosierungsniveau von 300 μg SRP und 10⁹ TCID₅₀ Newcastle Disease Virus (NDV) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion geimpft. Scharen B und D waren die Kontrollen und ihnen wurde ein Dosierungsniveau von nur 10⁹ TCID₅₀ NDV gegeben.
In einem Alter von 4 Wochen wurden die Vögel in vier Zweitstufen-Ställe umgesetzt, wobei sie ihre Identitäten behielten. In einem Alter von neun Wochen wurden die Vögel in vier Fertigstellungshöfe umgesetzt, wobei jede Schar aus 25000 Vögeln ihre Identität behielt. Im Alter von 12 und 14 Wochen wurden die Vögel verkauft und ihre Identitäten blieben während der Verarbeitung erhalten.
Tabelle 3 zeigt die gesammelte Bauernhofgeschichte vor und nach SRP-Impfung. Vierundzwanzig Scharen wurden evaluiert die 16 vor der Impfung (1-16) und die 8 geimpften Scharen (17-24) einschließlich Kontrollen. Scharen 1-16 waren nicht SRP-geimpft und als Bauernhofvorgeschichte eingeschlossen, um den Leistungsvorteil zu SRP-geimpften Scharen 17-24 zu zeigen.
Tabelle 3 unten zeigt das Alter, bei welchem jede Schar verkauft wurde, die Kopfzahl, prozentuale Gesamtsterblichkeit, Verwerfung (das heißt, Verwerfung bei Verarbeitung) und durchschnittliches Vogelgewicht/verarbeitete Charge.
TABELLE 3 Schargeschichte vor SRP-Impfung
Schargeschichte nach SRP-Impfung
Wie oben in Tabelle 3 gezeigt, war die durchschnittliche prozentuale Sterblichkeit vor Impfung 12,2 ±6,2 mit einem Variationskoeffizienten (cv) von 51,4% im Vergleich zur durchschnittlichen Sterblichkeit nach der Impfung von 7,5 ± 1,2 mit einem cv von 15,5%. Dies ist ein Rückgang von 4,7% Sterblichkeit, was 4700 Vögeln je 100000 entspricht. Der Rückgang im Variationskoeffizienten (51,4% verglichen mit 15,5%) der Gesamtsterblichkeit illustriert den positiven Effekt auf die Vogellebensfähigkeit und Einheitlichkeit. 9 ist eine graphische Darstellung der Sterblichkeiten in aufeinander folgenden Scharen vor und nach der Impfung.
Die Verwerfung wurde ebenfalls positiv beeinflusst, sie zeigt 1,6 ± 0,63 Prozent vor der Impfung im Vergleich zu 1,07 ± 0,18 Prozent nach der Impfung (Tabelle 3 oben). Die Differenz, 0,53%, ist signifikant unter Berücksichtigung der Zahl der verarbeiteten Vögel.
Ein dramatischer Effekt, der durch die SRP-Impfung beobachtet wurde, war der erhöhte Gewichtsvorteil, wie oben in Tabelle 3 zu sehen ist. Vor der Impfung war das durchschnittliche Vogelgewicht 13,9 ± 0,70 Pfund, mit einer durchschnittlichen Wachstumszeit von 96 Tagen. Das durchschnittliche Gewicht pro Vogel nach der Impfung war 15,3 ± 0,77 Pfund, mit einer durchschnittlichen Wachstumszeit von 94 Tagen. Diese Ergebnisse demonstrieren den Leistungsvorteil, der durch SRP-Impfung erreicht werden kann.
10 zeigt die serologische Antwort auf SRPs von E. coli zwischen den SRP-geimpften und nicht SRP-geimpften Scharen, wie mit ELISA ermittelt, unter Verwendung gereinigter E. coli-SRPs als Capture-Molekül. Der Test wurde ausgeführt wie oben in Beispiel 8 beschrieben. Das Profil war konsistent zwischen den geimpften und nicht geimpften Scharen unter natürlichen Feldbedingungen. Wie das Profil illustriert, bewirkt, sobald das Immunsystem des Vogels fokussiert wird, diese Proteine zu erkennen, kontinuierliche Feldherausforderung durch Bakterien, welche SRPs exprimieren, einen gleichmäßigen Anstieg des Antikörper-Titers zu einem Niveau, das Schutz liefert und/oder bis zu dem Punkt, an dem systemische Herausforderung die Leistung nicht beeinflusst.
Die Verwendung gereinigter IROMPs in einem Impfstoff optimiert das Immunsystem des Tieres, auf solche Proteine zu fokussieren. Die Vögel, die in einem Alter von drei Wochen mit 300 μg gereinigtem SRP geimpft wurden, zeigten einen Anstieg des Titers in einem Alter von 11 Wochen, der 10000-mal größer war als der Titer in nicht SRP-geimpften Kontrollen. Dieser Anstieg des Titers ist das Ergebnis der Fokussierung des Immunsystems, um diese Proteine zu erkennen. Einmal geimpft, bildet der Vogel eine Population von Gedächtniszellen, die bei jeder Feldherausforderung aktiviert werden. Unter natürlichen Feldbedingungen wird der Vogel kontinuierlich durch gram-negative Bakterien wie E. coli herausgefordert, welche SRPs exprimieren, die kreuz-reagieren und einen beständigen Anstieg im Antikörper-Titer verursachen (wie in den SRP-geimpften Vögeln zu sehen war). Im Vergleich zeigen die Kontrollvögel unter den gleichen Bedingungen niedrige Antikörper-Titer, obwohl sie den gleichen Feldherausforderungen ausgesetzt sind.
Beispiel 11
Impfung mit SRP-Impfstoff und Impfstoff, hergestellt mit bakteriellen Ganzzellen
Es wurde ein Vergleich gemacht zwischen Truthähnen, denen ein Impfstoff aus gereinigten SRPs, erhalten aus Salmonella heidelberg, hergestellt wie oben in Beispiel 1 beschrieben, injiziert wurde, und einem Impfstoff aus bakteriellen Ganzzellen des gleichen Organismus, gezüchtet unter Eisen-Beschränkungen, um SRP auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Die Ganzzell-Bakterien wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, außer der folgenden Modifikation: nach dem Fermentationsprozess wurden 0,3% Formalin zum Behälter zugegeben, um den Organismus zu töten. Die getöteten Bakterien wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gesammelt, gewaschen und resuspendiert in physiologischer Salzlösung, und auf eine optische Dichte von 35% T bei 540 nm eingestellt, um ungefähr 10⁷ Bakterien/ml zu erhalten. Der Impfstoff wurde hergestellt wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Fünfundvierzigtausend einen Tag alte Hybrid-Truthahnküken (Hennen) wurden bis zu einem Alter von 4 Wochen auf einer Bruteinrichtung aufgezogen. Im Alter von vier Wochen wurden die Vögel in eine Wachstumseinrichtung umgesetzt und gleichmäßig auf zwei Ställe aufgeteilt, bezeichnet als Ställe 1 und 2. Im Alter von 6 Wochen wurden die Vögel in Stall 1 subkutan in den unteren Nacken mit 0,5 cm³ des SRP-Impfstoffes geimpft, während die Vögel in Stall 2 mit der Ganzzell-Präparation geimpft wurden. Blut wurde von 12 Vögeln/Stall in wöchentlichen Intervallen genommen, um die serologische Antwort auf SRP zwischen den beiden Gruppen zu verfolgen.
11 zeigt den Titer auf SRP zwischen Ganzzell- und SRP-geimpften Vögeln. Die immunologische Antwort auf SRP war in der mit gereinigtem SRP geimpften Gruppe signifikant größer verglichen mit der ganzzell-geimpften Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen klar die Wirksamkeit der Verwendung einer im Wesentlichen reinen Präparation von SRP, um eine Immunantwort in einem Tier zu induzieren, im Gegensatz zur Verwendung von Ganzzellen, die das gleiche SRP exprimieren.
Beispiel 12
Übertragung von anti-SRP-Antikörpern auf Bruthennennachwuchs
Die 10-Tages-Sterblichkeit im Nachwuchs von SRP-geimpften und nicht SRP-geimpften Bruthennen wurde evaluiert, um die Übertragung von anti-SRP-Antikörpern vom Erwachsenen auf den Nachwuchs abzuschätzen.
Zwanzigtausend willkürlich ausgewählte Nicholas-Truthahnküken (Hennen) wurden gleichmäßig auf zwei Brutställe aufgeteilt, bezeichnet als Ställe 1 und 2. Im Alter von vier Wochen wurden alle Vögel in Stall 1 mit 300 μg E. coli-SRP und Newcastle Disease Virus (NDV) in einem Wasser-in-Öl-Impfstoff geimpft. Den Vögeln in Stall 2 wurde nur NDV gegeben und sie fungierten als Kontrollen. Im Alter von 24 Wochen wurde den Vögeln in Stall 1 eine zweite Injektion des SRP von 300 μg/Vogel gegeben. Die Vögel aus Stall 2 verblieben als nicht geimpfte Kontrollen. Im Alter von dreißig Wochen wurden die Vögel in Ställen 1 und 2 einer Legefarm untergebracht. Mittags wurden Eier von den SRP-geimpften und den nicht geimpften Hennen gesammelt. Die Eier wurden in getrennte Inkubatoren und Brüter gesetzt. Zum Zeitpunkt des Schlüpfens wurden alle Küken gleich behandelt und die Identität wurde während der Geschlechtertrennung und der Pflege bewahrt.
Fünftausend Küken (Hennen) aus jeder Gruppe wurden in einem kommerziellen Brutstall untergebracht und in Brutringen mit 7 Ringen/Gruppe, die 714 Küken/Ring enthielten, gehalten. Kükensterblichkeit wurde für jeden Ring/Gruppe für eine Dauer von 10 Tagen aufgenommen.
Die Gesamt-10-Tages-Sterblichkeit der Küken, aus den SRP-geimpften Hennen stammend, war 105 (2,1 %) im Vergleich zu 160 (3,2%) im nicht geimpften Nachwuchs (12). Dies ist ein Vorteil von 1,1% in Küken-Lebensfähigkeit, was 1100 Küken je 100000 entspricht. Dies ist signifikant unter Berücksichtigung, dass es 200 Million Truthähne in den Vereinigten Staaten und 7 Milliarden Hähnchen weltweit gibt.
Diese Ergebnisse zeigen den günstigen Einfluss der Impfung des Brutbestands, um maternale Antikörper auf SRP in Nachwuchs zu induzieren, um gram-negative Infektionen zu reduzieren, die für einen Großteil der frühen Kükensterblichkeit verantwortlich sind.
Beispiel 13
Kreuz-reaktive und kreuz-schützende Natur der Siderophor-Rezeptorproteine (SRP) zwischen verschiedenen Serogruppen von Salmonella
Die SRP von Salmonella enteritidis (Se), Serogruppe D₁ und Salmonella typhimurium (St), Serogruppe B, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, zu kreuz-reagieren und zu kreuzschützen. Kurz, es wurden 160 willkürlich ausgewählte Hybrid-Truthahnküken (Hennen) in Isolation aufgezogen. Im Alter von drei Wochen wurden die Vögel gleichmäßig auf 4 Isolationsräume aufgeteilt, 40 Vögel/Raum, bezeichnet als A, B, C und D. Den Vögeln in Gruppe C wurde subkutan ein Wasser-in-Öl-Impfstoff injiziert, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, der 300 μg SRP von S typhimurium enthielt. Den Vögeln in Gruppe D wurden subkutan 300 μg SRP von S. enteritidis injiziert. Die Vögel in Räumen A und B verblieben als nicht geimpfte Kontrollen. Blut wurde von 10 Vögeln/Gruppe in wöchentlichen Intervallen genommen, um die serologische Antwort auf SRP aufzunehmen.
Einundzwanzig Tage nach der ersten Injektion wurde den Vögeln aus Gruppe C und D eine zweite Injektion gegeben, die 300 μg des entsprechenden SRP enthielt. Blut wurde 5 und 10 Tage nach der zweiten Injektion genommen. Die serologische Antwort auf SRP wurde durch ELISA unter Verwendung von E. coli-SRP als Capture-Molekül wie oben in Beispiel 8 beschrieben untersucht.
13 und 14 zeigen die serologische Antwort der Vögel, geimpft mit SRP, isoliert aus S. typhimurium und S. enteritidis. Die immunologische Antwort auf SRP stieg kontinuierlich in beiden Gruppen mit jeder Probenperiode im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollen, was die Immunogenität dieser Proteine zeigt. Bedeutend zeigen diese Ergebnisse die kreuz-reaktive Natur dieser Proteine, da der ELISA E. coli-SRP als Capture-Molekül verwendet.
Fünfzehn Tage nach der zweiten Injektion wurden alle Vögel intravenös mit einem Nalidixinsäure-resistenten Stamm von S. enteritidis oder S. typhimurium mit 5,0 × 10⁷ koloniebildenden Einheiten (KBE)/Vogel herausgefordert. Diese Bakterien wurden resistent gegenüber Nalidixinsäure gemacht, um ihre Isolation durch Einschließen von Nalidixinsäure in das Rückgewinnungsmedium, das jegliche Kontaminierung eliminierte, zu erhöhen. Bakterien, resistent gegenüber Nalidixinsäure wurden wie folgt hergestellt: Ein ml einer 12 Stunden mit Trypsin behandelten Sojabrühe-Kultur (TSB) von S. enteritidis und/oder S. typhimurium, die ungefähr 10⁸ wachstumsfähiger Organismen enthielt, wurde auf die Oberfläche einer Brilliant Schwefelgrün (BSG)-Agar (Difco)-Platte aufgetragen, die 500 μg/ml Nalidixinsäure (Sigma) enthielt. Die Platten wurden 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die Kolonien, die wuchsen, wurden durch Plattierung auf BSG, das 250 μg/ml Nalidixinsäure enthielt, kloniert. Die Nalidixinsäure-resistenten Stämme von salmonella wurden in 100 ml TSB 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Kultur zentrifugiert (10000 g) und zweimal in PBS (pH 7,4) gewaschen, und die optische Dichte wurde auf 35% Transmission bei 540 nm eingestellt, um 5,0 × 10⁷ KBE/ml zu erhalten. Diese Isolate wurden dann für die Herausforderung verwendet.
Um homologen und heterologen Schutz zu evaluieren, wurden zwanzig Vögel in Raum C (geimpft mit St-SRP) am Flügel markiert und sie wurden in Raum D umgesetzt, und 20 Vögel in Raum D (geimpft mit Se-SRP) wurden am Flügel markiert, und sie wurden in Raum C umgesetzt. Alle Vögel in Raum C (20 St-geimpfte und 20 Se-geimpfte) wurden mit S. typhimurium herausgefordert, während die Vögel in Raum D (20 Se-geimpfte und 20 Stgeimpfte) mit S. enteritidis herausgefordert wurden.
24, 48, 72 und 96 Stunden nach Beprobung wurden zwei Vögel jeder Gruppe getötet. Die Milzen wurden aseptisch aus jedem Vogel entfernt und einzeln gewogen, und auf 4 Gramm/Milz eingestellt. Eine fäkale Probe aus dem Blinddarm-Abzweigungspunkt eines jeden Vogels wurde ebenfalls genommen. Jede Probe wurde gewogen und auf 0,5 Gramm eingestellt. Vier Milliliter steriler Salzlösung wurde zu jeder Milz und 0,5 ml zu jeder fäkalen Probe zugegeben. Jede Probe wurde unter Verwendung eines Stomacher Labormixers (Sewert Medical, London) 1 Minute homogenisiert. Fortlaufende zehnfache Verdünnungen jedes Homogenats wurden zweifach auf BSG-Platten, die 250 μg/ml Nalidixinsäure enthielten, plattiert.
Die Ergebnisse zeigen die quantitative Clearance von S typhimurium (St) (15) und S. enteritidis (Se) (16) in Milzen von SRP-geimpften und nicht geimpften Truthähnen. Wie in 15 und 16 gezeigt, gab es eine stetige Abnahme in der Zahl der Bakterien/Milz. 96 Stunden nach Herausforderung (chlg) war die Differenz zwischen den geimpften und nicht geimpften Gruppen ungefähr 2,5 logs. Ein wichtiger Aspekt dieser Ergebnisse ist die kreuz-schützende Natur, die durch diese Proteine induziert wird. 15 zeigt die kreuz-schützende Natur der Vögel, die mit dem SRP von Se geimpft wurden, aber mit St herausgefordert wurden. 16 zeigt den gleichen kreuz-schützenden Effekt der Vögel, die mit SRP von Se geimpft und dann mit St herausgefordert wurden. Alle geimpften Gruppen zeigten eine signifikante Verminderung in der Bakterienzahl in Milzen im Gegensatz zu den nicht geimpften Vögeln.
72 und 96 Stunden nach Herausforderung wurde der intestinale Abwurf von Salmonella in den nicht geimpften Vögeln größer als log 4 detektiert. Im Gegensatz dazu waren alle geimpften Vögel negativ bezüglich Salmonella innerhalb dieser gleichen Probenperiode. Diese Ergebnisse deuten an, dass diese Proteine einen günstigen Einfluss bei der Vorbeugung der intestinalen Kolonisation von Salmonella haben können.
Beispiel 16
Herstellung und Verwendung der 37-38 kDa Transmembran- und Porinproteine in einem Impfstoff
Die Transmembran- und Porinproteine (MG 34-38 kDa), identifiziert als OmpA, OmpC, OmpD und OmpF werden mit und ohne Eisen exprimiert. Diese Proteine können wie oben in Beispiel 1 beschrieben gereinigt werden, durch Sammlung der Fraktionen 1650-2250, wie in 1 gezeigt. Diese Proteine können mit Peak 1 (1) kombiniert werden, um eine Kombination von SRP und Porinproteinen zu erhalten, die zwischen Salmonella, E. coli und Pasteurella erhalten bleiben.
Ein Impfstoff, der E. coli-SRPs (MG 89 kDa, 84 kDa, 78 kDa und 72 kDa) enthält, wurde mit Porinen (MG 34 kDa-38 kDa) kombiniert, um einen Gesamtproteingehalt von 600 μg/ml zu ergeben, und hergestellt wie oben in Beispiel 2 beschrieben. Der Impfstoff wurde verwendet, um hyperimmunisierte Sera zu induzieren. In Kürze, es wurde sechs (6) drei Wochen alten Truthähnen eine einzelne subkutane Injektion in die untere Nackenregion gegeben, gefolgt von einer zweiten Injektion 15 Tage danach. Das Serum wurde 10 Tage nach der zweiten Injektion gesammelt.
Western Blot-Analyse wie oben in Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung von Sarcosin-Zellwandextrakten von E. coli, Salmonella und Pasteurella und getestet mit den obigen Sera offenbarte kreuz-negative Proteine in der 34 kDa und 38 kDa Region ebenso wie die SRPs, die von jedem Isolat untersucht wurden.
Diese Ergebnisse deuten das Potential der Verwendung konservierten Proteins (SRP und Porine) als eine wirksame Methode zur Impfung gegen gram-negative Infektionen an.

Claims

Impfstoff zur Verwendung in der Immunisierung eines Tieres gegen eine Infektion durch gram-negative Bakterien, umfassend: vier oder mehr im Wesentlichen reine siderophore Rezeptorproteine, wobei die Proteine von der äußeren Membran von zwei oder mehr unterschiedlichen Stämmen oder Spezies von gram-negativen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae und/oder Pseudomonadaceae abgeleitet sind, wobei der Impfstoff eine Infektion des Tieres durch ein gram-negatives Bakterium verhindert, das von einem anderem Stamm, einer anderen Spezies oder einem anderen Genus als die zwei oder mehr gram-negativen Bakterien, die für den Erhalt der siderophoren Rezeptorproteine verwendet wurden, stammen.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments für die Immunisierung einer Vogelspezies gegen eine Infektion durch ein gram-negatives Bakterium.
Serum zur Verwendung in der Behandlung eines Tieres gegen Infektion durch ein gram-negatives Bakterium, umfassend: ein halbgereinigtes Blutserum eines Tieres, das mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 inokuliert wurde; wobei das Serum die Infektion des Tieres durch ein gram-negatives Bakterium, welches von einem Serotyp, einer Spezies oder einem Genus ist, der sich von den zwei oder mehr in der Zusammensetzung nach Anspruch 1 vorliegenden gram-negativen Bakterien unterscheidet, verhindert.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung vier siderophore Rezeptorproteine von einem E. coli umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1 oder 4, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine, die von Escherichia coli, Salmonella spp., Pasteurella spp., Klebsiella spp. oder Pseudomonas spp. erhalten werden, umfasst.
Impfstoff zur Verwendung in der Immunisierung eines Tieres gegen eine gramnegative Infektion, umfassend: vier oder mehr im Wesentlichen reine siderophore Rezeptorproteine von der äußeren Membran von zwei oder mehr gram-negativen Bakterien in Kombination mit einem physiologisch akzeptablem Träger und einem Porinprotein, welches von den gram-negativen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae oder Pseudomonadaceae abgeleitet ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung 5-15 siderophore Rezeptorproteine umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung wirksam ist, um die Produktion von Antikörpern gegen die siderophoren Rezeptorproteine in einem erwachsenen Tier und den darauf folgenden Transfer der Antikörper an die Nachkommen des erwachsenen Tieres zu stimulieren.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung des Weiteren einen flüssigen Träger und eine Menge an siderophoren Rezeptorproteinen von etwa 25-5000 μg/ml umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung in der Form einer Lösung, Wasser-in-Öl-Emulsion, von Liposomen oder einer metabolisierbaren soliden Matrix vorliegt.
Impfstoff nach Anspruch 1, 6 oder 9, wobei die Zusammensetzung in einer Form vorliegt, die zur Verabreichung durch subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, Depot zur verzögerten Freisetzung, Aerosolierung oder Inokulation in ein Ei geeignet ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aerobactin-, Enterochelin-, Citrat-, Multocidin- und Fernchrom-Rezeptorproteinen, umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 4, wobei das E. coli E. coli 078 ist.
Impfstoff nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung ein Porinprotein mit einem Molekulargewicht von 34-38 kDa umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung in der Form einer Lösung, Wasser-in-Öl-Emulsion, von Liposomen oder einer metabolisierbaren soliden Matrix vorliegt.
Impfstoff nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung eine Menge an siderophoren Rezeptorproteinen von etwa 25-5000 μg/ml umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung vier siderophore Rezeptorproteine von einem E.coli umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine, die von Escherichia coli, Salmonella spp., Pasteurella spp., Klebsiella spp. oder Pseudomonas spp. erhalten werden, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung 5-15 siderophore Rezeptorproteine umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung wirksam ist, um die Produktion von Antikörpern gegen die siderophoren Rezeptorproteine in einem erwachsenen Tier und den darauf folgenden Transfer der Antikörper an die Nachkommen des erwachsenen Tieres zu stimulieren.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung des Weiteren einen flüssigen Träger und eine Menge an siderophoren Rezeptorproteinen von etwa 25-5000 μg/ml umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung in der Form einer Lösung, Wasser-in-Öl-Emulsion, von Liposomen oder einer metabolisierbaren soliden Matrix vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aerobactin-, Enterochelin-, Citrat-, Multocidin- und Fernchrom-Rezeptorproteinen, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das E.coli E.coli 078 ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung ein Porinprotein mit einem Molekulargewicht von 34-38 kDa umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine Menge an siderophoren Rezeptorproteinen von etwa 25-5000 μg/ml umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung eine Menge an siderophoren Rezeptorproteinen von etwa 25-5000 μg/ml umfasst.
Impfstoff nach den Ansprüchen 1 oder 6, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus Escherichia coli erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae oder Pasteurella multacida erhalten wurden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus Escherichia coli erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae oder Pasteurella multacida erhalten wurden.
Impfstoff nach den Ansprüchen 1 oder 6, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus einer Spezies von Pasteurella erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Salmonella spp. oder Escherichia coli erhalten wurden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus einer Spezies von Pasteurella erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Salmonella ' spp. oder Escherichia coli erhalten wurden.
Impfstoff nach den Ansprüchen 1 oder 6, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus einer Spezies von Salmonella erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Escherichia coli, Pseudomonas, Klebsiella oder Pasteurella multocida erhalten wurden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung siderophore Rezeptorproteine umfasst, die aus einer Spezies von Salmonella erhalten wurden, und die Zusammensetzung des Weiteren siderophore Rezeptorproteine umfasst, die von Escherichia coli, Pseudomonas, Klebsiella oder Pasteurella multocida erhalten wurden.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung drei siderophore Rezeptorproteine von einem Salmonella spp. umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung drei siderophore Rezeptorproteine von einem Salmonella spp. umfasst.