DE69232969T2

DE69232969T2 - Methode zur herstellung von gram-negativen bakteriellen vakzinen

Info

Publication number: DE69232969T2
Application number: DE69232969T
Authority: DE
Inventors: A. Donald DEARWESTER; S. David ROBERTS; A. Leroy SWEARINGIN
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1991-11-15
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: ES2194841T3; CA2123222A1; US5616328A; ATE234916T1; JPH07501333A; DK0669971T3; EP0669971A4; WO1993010216A1; EP0669971B1; DE69232969D1; CA2123222C; AU667858B2; AU3141393A; EP0669971A1; JP3043809B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet von Gram-negativ-bakteriellen Vakzinen und deren Herstellungsverfahren.
Hintergrund der Erfindung
Vakzine, hergestellt aus Gram-negativen Bakterien, haben eine wohl bekannte Tendenz endotoxischen Schock zu verursachen. Dieses kann zu Schwangerschaftsabbruch oder Tod führen. Gram-negative Bakterien setzen Endotoxin in einem geringen Maße aus ihrer äußeren Membran frei, solange sie am Leben sind und sich teilen, aber in einem weit größeren Maße während und nach deren Tod. Bakterielles Endotoxin ist im Leitungswasser natürlich vorhanden, wo es Pyrogen genannt wird. Um das Auslösen von Fieber zu vermeiden, wird pyrogenfreies Wasser zur Injektion mittels Destillation oder anderen Reinigungsmethoden hergestellt. Im Menschen kann die Injektion von so Geringem wie einer Endotoxin-Einheit (EU) (ungefähr 0,1 Nanogramm oder 10^–10 Gramm) einen vorübergehenden Anstieg der Körpertemperatur verursachen. Im Menschen und anderem Tier verursachen größere Mengen endotoxischen Schock und Tod.
Das Kaninchen ist wie der Mensch ähnlich empfindlich gegen Endotoxin und das Kaninchen wurde üblicherweise dazu benützt, menschliche Injektionsprodukte auf Pyrogenizität zu testen. Die meisten anderen Tierarten sind weniger empfindlich. Pferde und Schweine sind erheblich empfindlicher als die meisten Labornagetiere. Deshalb ist im Labor nur das Kaninchen zum Testen der endotoxischen Aktivität von tiermedizinisch Injizierbaren geeignet, obwohl Mäuse mit Wirkstoffen, die die Makrophagen-Funktion verändern, relativ empfindlich gemacht werden können.
In Endotoxin-Assays, wurde das Kaninchen weitgehend durch einen in vitro Test ersetzt, der sogar noch empfindlicher ist. Dieser hängt von der Endotoxinwirkung auf ein Lösung, extrahiert von der Pfeilschwanzkrabbe (Limulus-Amoebozyten-Lysat oder LAL), ab. Die Zugabe von Endotoxin in Spurenmengen bewirkt das Gelieren von LAL. Bevor sich das Gel entwickelt, verändert sich die Transparenz von LAL in einer Art, die mit einem Spektralphotometer als Erhöhung der optischen Dichte gemessen werden kann.
Der freie Endotoxingehalt Gram-negativer Bakterienkulturen, die zur Herstellung von Vakzinen getötet wurden, variiert je nach Geschick des Herstellers. Ein ml kann so wenig wie 20 Mikrogramm (2 × 10^–5 Gramm) oder so viel wie ein Milligramm (10^–3 Gramm) beinhalten. Vakzinhersteller haben, um freies Endotoxin zu verringern, mehrere Verfahren verwendet. Eines betrifft das Ernten der bakteriellen Zellen mittels Zentrifugation oder Filtration und dem Verwerten der endotoxinreichen Kulturlösung. Ein anderes betrifft das Adsorbieren der Kulturen mit unlöslichen Aluminium (Al)- oder Calciumverbindungen (Träger), wie Aluminiumhydroxidgel (Al Gel).
Die Adsorption mit Al Gel tendiert dazu, das meiste des freien Endotoxins aus der Lösung zu entfernen. Einige Hersteller erlauben dem Gel, mit dem daran absorbierten Endotoxin und anderen Kulturprodukten zu sedimentieren, bevor sie zur Entfernung des restlichen freien Endotoxin die überstehende Lösung dekantieren. Im Falle, daß die Bakterien nicht auf dem Gel adsorbiert werden können, sedimentieren sie normalerweise und lassen die überstehende Flüssigkeit klar zurück. Das Dekantieren muß solange verschoben werden, bis sich alles gesetzt hat und die Flüssigkeit klar ist.
Egal ob die Bakterien von der Kultur geerntet wurden, oder ob eine Sedimentierung nach dem Adsorbieren mit einer Aluminium- oder Calciumverbindung stattgefunden hat, werden dann die Stoffe normalerweise in einer einfachen wäßrigen Lösung (Wasser, Salzlösung oder einer Pufferlösung) resuspendiert. Assays zeigen dann normalerweise eine enttäuschende Abnahme im freien Endotoxingehalt; die Veränderung ist, ausgehend von dem Verdünnungsfaktor der Resuspension, geringer als berechnet. Das ist, weil Endotoxin weiterhin aus der bakteriellen Oberfläche entweicht und schwach gebundenes Endotoxin vom Träger desorbiert wird.
Die zwei Methoden sind manchmal kombiniert; die Bakterien werden von dem Kulturmedium geerntet, in wäßriger Flüssigkeit resuspendiert und dann adsorbiert. Es wurde gezeigt, daß die Adsorption wäßriger Suspensionen geernteter Bakterien mit herkömmlichen Mengen Al Gel ein unerwünschtes Ergebnis erzeugt. Beispielsweise, wenn eine wäßrige Suspension von Salmonella choleraesuis mit Al Gel 25% v/v adsorbiert wurde, dann war dort zwar kein detektierbares freies Endotoxin mehr, aber die Fähigkeit der Präparation Mäuse gegen S. choleraesuis zu immunisieren, war beinahe vollständig eliminiert. Sobald sich das Gel zu setzen begann, war die überstehende Flüssigkeit kristallklar, das vollständige Adsorption bedeutet.
Es wurde von diesen Beobachtungen geschlossen, daß eine einfache wäßrige Flüssigkeit die nahezu frei von Kulturmedium ist, keine der Bindekapazitäten des Gels verbrauchen würde. Dieses würde das Gel in einen höchst begierigen Zustand hinterlassen, so daß alles bindefähige sehr fest gebunden würde. Somit wurde alles Endotoxin aus der Lösung entfernt, aber scheinbar waren die Bakterien zu fest gebunden, um nach der Injektion freigesetzt zu werden. Dieses störte offensichtlich die Immunisierung. Dieser Befund wurde mit einer wäßrigen Suspension getöteter Pasteurella multocida Zellen, welche Toxoide enthalten, wiederholt. Nach Adsorption mit Al Gel, 25% v/v, war dort zwar kein detektierbares freies Endotoxin, aber die Präparation hatte eine drastisch verringerte Kraft Antitoxinneutralisierung in Meerschweinchen auszulösen.
Das oben zeigt die zwei Extrema eines Bereichs von Zuständen an. An einem Extrem, bei dem Al Gel zu einer vollständigen Kultur gegeben wird, sättigen die Peptone und andere proteinhaltige gelöste Stoffe in der Kulturlösung, die Bindungsstellen auf dem Gel ab, so daß viel Material eingeschlossen freies Endotoxin, schwach oder gar nicht gebunden ist. An dem anderen Extrem, bei dem Al Gel zu einer wäßrigen Bakteriensuspension zugegeben wird, sind fast keine proteinhaltigen gelösten Stoffe vorhanden, um mit dem Gel zu reagieren und es bleibt vollständig begierig alles, mit einer Affinität für das Gel, stark zu binden, speziell Endotoxin und bakterielle Zellen. In diesem Zustand sind die fest gebundenen Bakterien und deren antigenen Produkte nicht frei, um mit den Zellen des Immunsystems eines geimpften Tieres zu interagieren und Immunisierung ist gering.
Somit ist ein Bedarf für ein Verfahren vorhanden, das einen Zustand zwischen den Extrema des beobachteten Bereichs herstellt, in dem die Bindekraft des Al Gels gemäßigt und die Adsorption optimal ist. Das meiste des Endotoxins würde fest gebunden werden, was das Vakzin sicher macht, aber die Bindung von bakteriellen Zellen und Antigenen wäre schwach genug, um gute Immunisierung zu erlauben. Dieser optimale Zustand würde durch Suspendieren der Bakterien in einem verdünnten Kulturmedium erreicht werden, das die Avidität oder die Affinität des Al Gels entsprechend modulieren würde. Dieses führte zu dem Begriff Affinitäts-modulierter Adsorptionsprozeß oder AMAP^®.
Experimente wurden durchgeführt, welche die Kennzeichen von AMAP^® in seiner ursprünglichen Form sind. Während die Konzentration von Al Gel konstant gehalten wurde, in diesem Fall 25% v/v, wurde die Verdünnung des Kulturmediums zum Erreichen optimaler Adsorption, titriert. Der Endpunkt der Titration wurde angezeigt durch eine freie Endotoxin Konzentration zwischen 20 und 500 EUs pro ml, getestet nach der LAL Methode.
Experimente mit einer Anzahl Gram-negativer Bakterien, einschließlich Salmonella choleraesuis, Bordetella bronchiseptica und Pasteurella multocida zeigten, daß in der Anwesenheit von Al Gel 25% v/v der Endpunkt normalerweise erreicht wurde, wenn das Kulturmedium verdünnt wurde, um eine Gesamtkonzentration von Peptonen und von anderen proteinhaltigen gelösten Stoffen von etwa 1% Gew/v zu ergeben. Dieses benötigte normalerweise das Verdünnen des Kulturmediums um einen Faktor 2,5 bis 3,5. Impfung von Tieren mit den AMAP^®-behandelten Materialien bestätigte, daß dort kein Verlust der antigenen Stärke und kein klinischer Beweis über Reaktionen auf Endotoxin war. Das AMAP^® Optimum wurde gefunden.
Das SmithKline Beecham Tiergesundheit Vakzin, welches unter dem Handelsnamen Atrobac 3 (Bordetella, Pasteurella und Erysipelothrix) zur Prävention von atropischer Rhinits und Erysipel im Schwein verkauft wird, ist das erste kommerzielle Produkt, das mit AMAP^® hergestellt wurde. Das Verfahren wird an den zwei Gram-negativen Komponenten, Bordetella und Pasteurella angewendet. Das Produkt hat für Wirksamkeit und Freisein von systemischer Reaktivität (endotoxischen Schock) einen guten Ruf erreicht.
Es gibt andere Verfahren freies Endotoxin in Gram-negativen Bakterien zu kontrollieren. Eines besteht aus einer milden alkalischen Hydrolyse. Beispielsweise kann eine Kultur auf 80°C erhitzt werden und einem pH von 10. Diese Behandlung inaktiviert zwar das Endotoxin, aber es zerstört auch viele bakterielle Antigene, speziell die Proteine.
Ein anderes Verfahren ist zwar ziemlich effektiv, hat aber eine begrenzte Anwendung. Es besteht aus der Verwendung von Glutaraldehyd um die Kultur zu inaktivieren. Glutaraldehyd ist ein starkes vernetzendes Mittel und es bindet das Meiste des Endotoxin in der Kultur. Nach der Inaktivierung mit Glutaraldehyd haben Bordetellakulturen einen freien Endotoxingehalt von ungefähr 1 Mikrogramm (10^–6 Gramm) pro ml. Glutaraldehyd kann jedoch nur in Kulturen in synthetischen Wachstumsmedien eingesetzt werden. In natürlichen Medien binden die proteinhaltigen gelösten Stoffe das Glutaraldehyd und verhindern seine Wirkung auf die Bakterien. Die Verwendung von Glutaraldehyd um Bordetellavakzine sicher zu machen, ist beschrieben im US-Patent Nr. 4,888,169 erteilt am 19. Dezember 1989 „Bordetella bronchiseptica vaccine".
Die Originalversion von AMAP^® (AMAP^®, Marke 1) ist gekennzeichnet durch die Titration von Kulturmedium gegen eine herkömmliche Menge Al Gel, um die Avidität des Gels optimal zu modulieren. AMAP^®, Marke 1 erfüllte das Ziel endotoxischen Schock zu eliminieren ohne die antigene Potenz zu erniedrigen.
Den Forschern auf diesem Gebiet wurden erst kürzlich eines ernsten Problems mit allen bakteriellen Vakzinen gewahr, welche herkömmliche Mengen an Al Gel beinhalten (ungefähr 10 bis 25% v/v), zwar ungeachtet von AMAP^®, aber einschließlich Produkte, die durch AMAP^® hergestellt wurden. Diese Vakzine erzeugen einen sogenannten Depoteffekt. Das Al Gel oder ein anderer Mineralträger wird nicht leicht metabolisiert und so neigt es dazu in den Geweben bei der Injektionsstelle zu bleiben. Die bakteriellen Zellen und metabolischen Produkte, die am Gel adsorbiert sind, sind dann in den Geweben gefangen. Dort induzieren sie chronische Reizungen, welche zu Granuloma, Abszessen und schließlich Vernarben führen. Dieses ist besonders ernst, wenn das Vakzin in den Muskel eines Tiers zur Fleischgewinnung gespritzt wird. Bei der Schlachtung wird das betroffene Stück Fleisch oft als schlecht befunden und verworfen. Dieses wird Schnittverlust aufgrund von Kadavermakel genannt. Das Auftreten des Problems der Injektionsstellen Reaktion zeigte eindeutig, daß eine neue Version von AMAP^® benötigt wurde, die keine nennenswerte lokale Reaktivität hervorruft.
Zusammenfassung der Erfindung
Durch diese Erfindung wird ein neues Verfahren zur Präparation von Gram-negativbakteriellen Vakzinen bereitgestellt, welches das Bereitstellten einer konzentrierten Gramnegativ-bakteriellen antigenen Präparation, die Adsorption der Präparation mit einem Mineralträger, der fähig ist, in der antigenen Präparation freies Endotoxin in einer Menge zu binden, die wirksam ist, optimales Binden von Endotoxin und Antigen zu erzeugen, und das Verdünnen der adsorbierten Präparation zur Verwendung in einem Vakzin, wobei die Menge von Mineralträger in dem Vakzin weniger ist, als wenn der Mineralträger zu einer unkonzentrierten antigenen Präparation oder zu dem Endvakzin zugegeben worden wäre.
Durch diese Erfindung wird auch ein Vakzin bereitgestellt, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird.
Durch diese Erfindung wird zusätzlich ein Verfahren zur Impfung eines Tieres gegen Gramnegativ-bakterielle Infektionen bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Vakzins an das Tier.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung löst das zuvor erwähnte Problem der Verfahren im Stand der Technik. Gemäß dieser Erfindung kann Endotoxin in konzentrierten antigenen Gram-negativ bakteriellen Präparationen durch Zugabe einer ziemlich hohen Mineralträgerkonzentration zu den antigenen Präparationen kontrolliert werden. Wenn die Präparation mit z. B. Wasser oder Salzlösung auf die Dichte, die in einem Vakzin benötigt wird, verdünnt wird, ist die Endkonzentration des Mineralträgers erheblich reduziert und das Endotoxin bleibt überraschenderweise fest gebunden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine haben bewiesen, daß sie eine gute Wirksamkeit, hervorragende systemische Sicherheit und nur eine geringe Injektionsstellen Reaktivität in geimpften Tieren haben.
„Konzentrierte Gram-negativ-bakterielle antigene Präparation" auf die hierin bezogen wird, bedeutet antigene Präparationen, die einen viel höheren Antigengehalt haben als das Endvakzin. Allgemein hat die konzentrierte Präparation eine Antigenkonzentration, die mindestens etwa zehn mal höher und bevorzugt vierzig bis fünfzig mal höher ist, als die Antigenkonzentration des Endvakzins. Die obere Konzentrationsgrenze ist bestimmt durch die Fähigkeit, mit der Präparation zu arbeiten, d. h. sie sollte nicht so dick sein, daß es schwierig ist, mit ihr zu arbeiten. Die untere Grenze ist bestimmt durch den Wunsch, die Endkonzentration von Mineralträger in dem Vakzin zu reduzieren. In einigen Fällen erfüllen die unkonzentrierten Kulturfluide oder deren Fraktionen dieses Kriterium, ohne auf eine Konzentrierung zurück zu greifen. Jedoch müssen in den meisten Fällen die Fluide konzentriert werden. Diese können durch Zentrifugation oder andere, dem Fachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Je stärker die antigene Präparation konzentriert wird, desto mehr wird sie während dem Assembly des Vakzins verdünnt werden und desto niedriger ist die Trägerkonzentration in dem rekonstituierten Endvakzin. Die bevorzugte Konzentration der bakteriellen antigenen Präparation ist derart, daß wenn die Präparation adsorbiert und zum Endvakzin assembliert wird, die Mineralträgerkonzentration weniger als 5,0% v/v ist und bevorzugt weniger als 3,0% v/v ist.
Überraschenderweise schließen Gram-negativ-bakterielle antigene Präparationen beispielsweise vollständige bakterielle Suspensionen, genauso wie bakterielle Extrakte und bakteriumfreie Kulturfluide ein. In der Vergangenheit wurde gezeigt, daß AMAP^® nur für vollständige bakterielle Präparationen geeignet ist.
Beispiele von Gram-negativen Bakterien, die in der Erfindung verwendet werden können, schließen Salmonella, E. coli, Shigella, Campylobacter, Fusobakterium, Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Hämophilus und Histophilus ein.
Geeignete Mineralträger schließen solche ein, die fähig sind, das freie Endotoxin Gramnegativer Bakterien zu binden. Beispiele schließen Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, ein Alaun oder Calciumphosphat ein. Der Mineralträger wird zu der konzentrierten antigenen Präparation zugegeben, in einer Menge die wirksam ist, die freie Endotoxinkonzentration in der Mineralträger/antigenen Präparation zu reduzieren. Wirksame Menge bedeutet die Menge, die notwendig ist, Endotoxin fest zu binden und freies Endotoxin auf ein sicheres Niveau zur Verabreichung zu reduzieren, eine Menge, die noch nicht so hoch ist, die Antigene zu fest zu binden und dadurch den antigenen Stimulus zu inhibieren. Die wirksame Menge stellt einen Kompromiß zwischen makromolekularem Überschuß und Trägerüberschuß dar. Diese Balance wird durch ein freies Endotoxin-Niveau in der adsorbierten Präparation von etwa 20 bis etwa 1000 EU pro ml, bevorzugt etwa 20 bis etwa 500 EU pro Dosis, angezeigt.
Der Betrag 20 bis 500 EU pro ml hat für das Endvakzin keine Bedeutung. Allgemein bleibt die Menge an freiem Endotoxin zwar in diesem Bereich, aber in Abhängigkeit von dem Einfluß anderer Komponenten kann sie in dem Endvakzin 1000 EU pro ml erreichen und immer noch akzeptierbar sein. Der Anstieg ist wahrscheinlich Endotoxin zuzuordnen, das von dem Gel durch Makromoleküle anderer Komponenten (Gram-positiven, Viren etc.) verdrängt ist. Es wird nicht geglaubt, daß dieses die Sicherheit beeinträchtigt, denn es wurde gezeigt, daß die meisten Haustiere Vakzine tolerieren können, welche Endotoxin in Mengen bis zu 10 000 EU pro ml beinhalten.
Während der Vakzin-Entwicklung, wird der Konzentrationsgrad der antigenen Präparation etabliert und die Menge Mineralträger wird an einigen Versuchsgruppen bestimmt. Dieses setzt den Anteil an Träger, der während der Herstellung zum Konzentrat zugegeben wird, fest.
Die antigene Präparation ist das Mittel, das die Avidität des Mineralträgers durch ihre eigenen Moleküle moduliert, die an die Bindungsstellen des Trägers binden oder mit dem Endotoxin um Bindungsstellen auf dem Träger konkurrieren. Dieses findet während der Träger zugegeben wird statt. Die Avidität, die zurückbleibt, legt fest, wieviel und wie fest Endotoxin gebunden wird. Je mehr Träger zugegeben wird, desto mehr freie Bindungsstellen bleiben übrig und desto weniger freies Endotoxin kann man am Ende testen. Wo Träger über den Endpunkt hinaus zugegeben wird, entwickelt sich ein Überschuß an Bindungsstellen und alle Makromoleküle mit einer Affinität für den Träger werden fest gebunden. Freies Endotoxin wird zwar Null sein, aber die Bindung von Antigenen kann so stark sein, um den antigenen Stimulus durch die spezifischen Immunogene zu inhibieren.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden, wenn bakterielle Zellen benützt werden, allgemein mindestens 90% des Kulturmediums während des Konzentrierens verworfen. Demgemäß sollte die Kultur in einer Art gesteuert und inaktiviert werden die den Verlust von schützenden Antigenen (Immunogene) von den Bakterien zu dem Medium minimiert. Dieses verlangt zuerst, daß das inaktivierende Mittel, sofern benützt, dann zugegeben werden sollte, wenn die Kultur noch in der exponentiellen („logarithmischen") Phase des Wachstumszyklusses ist. In diesem Stadium, sind eigentlich 100% der Zellen am Leben und am sich Teilen und demgemäß ist ihre strukturelle Integrität vollständig. So bald sich die Wachstumsrate verlangsamt (die Übergangsphase), sind eine steigende Anzahl von Bakterien tot oder am Sterben, und sie beginnen sich aufzulösen, wobei sie sowohl Antigene als auch Endotoxin freisetzen. Das inaktivierende Mittel sollte vorzugsweise ein Fixiermittel sein, d. h. ein Mittel, das die zelluläre Struktur bindet und das Auflösen vorbeugt.
Formaldehydlösung (Formalin) ist das am breitesten geeignete inaktivierende Mittel. Formalin erlaubt zwar geringe Freisetzung von Endotoxin während des Tötens der bakteriellen Zellen, aber dieses wird leicht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus der Lösung entfernt. Sobald die Kultur inaktiviert ist, gibt es weiterhin geringen Verlust. Glutaraldehyd ist sogar noch wirksamer Endotoxin zu binden, das bereits in dem Kulturmedium frei ist; freies Endotoxin nimmt tatsächlich während der Inaktivierung ab. Wie oben diskutiert kann Glutaraldehyd jedoch nur in Kulturen in vollständig synthetischen Medien verwendet werden.
Die Präparation kann für den Gebrauch als Vakzin verdünnt werden. Das Vakzin kann andere Inhaltsstoffe, wie Zusatzstoffe, zusätzliche Mineralträger und eine Vielzahl anderer Antigene, die dem Fachmann bekannt sind, beinhalten.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung, wird ein Verfahren zur Impfung von Tieren gegen Gram-negativ-bakterielle Infektionen bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Vakzins an das Tier umfaßt. Eine wirksame Menge Vakzin ist diejenige Menge, die fähig ist, Immunität hervorzurufen. Die wirksame Menge variiert mit dem Antigen und kann leicht von einem Fachmann herausgefunden werden.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Präparation exemplarischer Vakzine aus Gramnegativen Bakterien unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Vakzine. Diese Beispiele sind nur illustrierend und begrenzen nicht den Schutzumfang der Erfindung.
Beispiel 1 – Präparation von E. coli Vakzin
E. coli, Stamm NADC 1471 (Pilustyp K99) von dem National Animal Disease Center, Ames, Iowa wird in dem unten beschrieben synthetischen Medium bei 37°C mit Durchlüftung 16 bis 32 Stunden auf Agarplatten oder 12 bis 32 Stunden in Kolben angezogen.
Der Herstellungswachstumszyklus beträgt 4 bis 12 Stunden mit kontrolliertem Schütteln. Das synthetische Kulturmedium für das Anziehen von E. coli wird folgendermaßen hergestellt: 2,0 g NH₄Cl, 4,5 g KHP₂O₄ und 17,0 g NaHP₂O₄ werden in destilliertem Wasser zusammengegeben, der pH wird mit NaOH auf 7,4 ± 0,2 Einheiten eingestellt und die Mischung wird durch Autoklavieren sterilisiert. Lösungen von MgSO₄·7H₂O (0,05 g), FeSO₄·7H₂O (5,0 mg) und Glukose (5,0 g) werden jede einzeln als Konzentrate hergestellt, durch Filtration sterilisiert und zu dem Basismedium gegeben. Wenn notwenig, wird eine Nahrungsergänzung zu der Fermenterkultur während des Wachstumszyklusses gegeben. Die Ergänzung liefert Inhaltsstoffe in den folgenden maximalen Mengen pro Liter Fermenterkultur: 9,12 g KHP₂O₄, 34,0 g NaHP₂O₄, 1,0 g MgSO₄·7H₂O, 0,1 g FeSO₄·7H₂O und 15,0 g Glukose. Das KHP₂O₄ und NaHP₂O₄ werden in destilliertem Wasser zusammengegeben und durch Autoklavieren sterilisiert. Die Lösungen von MgSO₄·7H₂O, FeSO₄·7H₂O und Glukose werden jede einzeln als Konzentrate, hergestellt und durch Filtration sterilisiert.
Um die Kultur gemäß dieser Methode zu inaktivieren, wird das inaktivierende Mittel Formalin (Formaldehydlösung USP) zu der Kultur zugegeben, um eine Konzentration von etwa 0,5 v/v zu ergeben. Die Kultur wird über Nacht im Fermenter bei 37°C ± 1°C unter Rühren mit geringer Geschwindigkeit inaktiviert.
Für den Konzentrierungsschritt wird die inaktivierte Kultur durch eine Sharpless-Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluß durchgeleitet, welche die Bakterien als eine Paste sedimentiert. Alternativ können die Bakterien durch Ultrazentrifugation unter Standardbedingungen konzentriert werden. Die Bakterien werden auf einen Wert konzentriert, der das zehnfache der Konzentration des fertigen Vakzins ist, d. h. 1 × 10¹⁰ Bakterien pro mL. Die Bakterienanzahl des Konzentrats kann entweder durch die Petroff-Hauser Methode oder Coulter Zähler festgestellt werden. Das Konzentrat wird dann durch Zugabe von Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,210,2 verdünnt, so daß eine immunogene Menge oder antigene Dosis in 0,2 mL enthalten ist, das Volumen der End-Dosis ist 2 mL.
Durch Titration bei pH 6,5 wurde festgestellt, daß die Zugabe von Rehydragel^® Träger auf am Ende 20% v/v zu einem freien Endotoxinwert von 270 EUs pro mL (Mittelwert von 3 Ansätzen) in dem Konzentrat führte. Dieser Wert ist innerhalb des höchst bevorzugten Bereichs von 20 bis 500 EUs pro mL, der als Endpunkt der Titration ausgewählt ist. Diese Menge an Träger wird folglich zu der konzentrierten Suspension gegeben und es tritt Adsorption auf.
Zum Herstellen einer Vakzin-Zusammensetzung werden 12,5 mL des erhaltenen adsorbierten Konzentrats mit PBS auf ein Endvolumen von 100 mL verdünnt. Das Volumen von 12,5 mL besteht aus 10 mL der resuspendierten Bakterien und 2,5 mL des Gels. In dem Vakzin wird entsprechenderweise die ursprüngliche Zellensuspension mit dem erforderlichen Faktor 10 (0,2 mL in einer 2 mL Dosis) verdünnt und das Gel ist in einer Endkonzentration von 2,5% v/v anwesend, was den höchst wünschenswerten Standard von < 3% v/v trifft. 10% Merthiolatlösung wird zu der assemblierten Serie als ein Konservierungsmittel gegeben. Die Endkonzentration von Merthiolat überschreitet nicht 0,01%, Gewicht pro Volumen.
Die Antigenizität eines Vakzins, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde wie folgt getestet. Zwanzig Mäusen wurden jeweils subkutan 0,2 mL einer 20-fachen Verdünnung des Vakzins injiziert, d. h. ein vierhundertste) der Rinderdosis. Nach 3 Wochen wurde den Mäusen Blut abgenommen. Serumproben von den Mäusen wurden einzeln in einem Agglutinationstest gegen ein inaktiviertes Antigen, welches aus E. coli Stamm 1471, enthaltend K99 pili, hergestellt wurde, titriert. Deren Seren hatten einen geometrisch mittleren Agglutinationstiter von 13.
Beispiel 2 – Präparation von A. Pleuropneumoniae Vakzin
Actinobacillus pleuropneumoniae, Serotyp 1 (Stamm Schelkopf; Dr. Schultz, Avoca, Iowa), Serotyp 5 (Stamm K-17; Dr. Schultz, Avoca, Iowa) und Serotyp 7 (Stamm WF-83; SmithKline Beecham Corporation) wurden zur Verwendung in einem Vakzin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt. Die drei A. pleuropneumoniae Stämme wurden in flüssigem Medium [Gibco Laboratorien, Bacterin HP Medium, Formel # 90-5066] bei 37 ± 1°C für 4 bis 24 Stunden kultiviert. Der Wert des gelösten Sauerstoffs von 30% wurde durch Belüftung mit steriler Luft und durch Schütteln kontrolliert. Sterile Antischäumungslösung wurde verwendet um das Schäumen kontrollieren und wurde, bevor das Medium geimpft wurde, zugegeben. Der pH der Kultur wurde durch die Zugabe steriler 5 N NaOH oder 4 N HCl bei 7,3 ± 0,2 gehalten.
Am Ende des exponentiellen Wachstums, wurde jede Kultur auf eine Temperatur von 20°C gekühlt, um das Wachstum anzuhalten. Die abgekühlte Kultur wurde zentrifugiert und das Sediment als eine sehr dichte Bakteriensuspension gesammelt. Die Suspension wurde unter Schütteln für eine Stunde auf 56° ± 1°C erhitzt. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit (Extrakt) gesammelt. Sterile 10% Merthiolat- und 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösungen wurden als Konservierungsmittel in Endkonzentrationen von 0,01% bzw. 0,07% (Gewicht pro Volumen) zugegeben. Die Extrakte wurden durch sterile 0,45 und 0,3 μm Filter geleitet und bei 2°C–7°C bis zur Assemblierung gelagert.
Ein Vakzin wurde wie folgt hergestellt. Der Kohlenhydratgehalt von jedem Extrakt wurde durch die Phenolmethode und der Proteingehalt durch die Lowrymethode bestimmt. Die Moleküle in dem Extrakt wurden dann durch die Reaktion mit Glutaraldehyd gekoppelt oder vernetzt. Eine 25% Glutaraldehydlösung wurde zu den Extrakten in der Rate von 1 mL pro Gramm Gesamtprotein gegeben. Um alles restliche Glutaraldehyd zu neutralisieren wurde dann zu dem Extrakt eine Lysinlösung in der Rate von 12,5 mg Lysin pro mL Glutaraldehydlösung gegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden unter Schütteln inkubiert und über Nacht bei 4°C gelagert.
Extrakte der drei Serotypen wurden gemäß ihrem Wert des Kohlenhydrattests vereinigt, so daß eine 2 mL Dosis des Vakzins 20 μg Kohlenhydrat von jedem Serotypen beinhaltete (10 μg/mL). Vor der Absorption mit Aluminiumhydroxidgel wurde das Volumen des vereinigten Konzentrats auf 1/40 des Endvolumens des Ansatzes eingestellt. Dieses erforderte die Zugabe eines kleinen Volumens PBS.
Eine Titration zeigte, daß wenn Rehydragel^® Träger bei pH 6,5 zu dem eingestellten Konzentrat mit der Rate von 39 mL Gel pro 100 mL Konzentrat, um am Ende 28% v/v zu ergeben, zugegeben wurde, freies Endotoxin auf 470 EU pro mL, innerhalb des gewünschten Bereichs von 20 bis 500 EU pro mL, erniedrigt wurde.
Um ein Liter Produkt herzustellen, wurde eine ausreichende Menge eines jeden Serotypen in das Gefäß gegeben, um 10.000 μg (10 mg) Kohlenhydrate beizutragen. PBS wurde zugegeben, um das Volumen auf 25 mL zu bringen. Rehydragel^® Träger wurde dann in einem Volumen von 9,75 mL (39% von 25 mL) zugegeben. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine 40% Emulsion von Amphigenzusatzstoff [Hydronics, Inc.] wurde als nächstes in einem Volumen von 125 mL (ein Achtel des Endvolumens) zugegeben, um am Ende 5% v/v Amphigenzusatzstoff in dem Vakzin zu ergeben. Das Volumen wurde dann durch die weitere Zugabe von PBS auf 1 Liter erhöht. Die Endkonzentration von Rehydragel^® Träger war somit 0,98% v/v, ein sehr wünschenswerter Wert für die Vermeidung von Gewebereaktionen an der Injektionsstelle.
Beispiel 3 – Sicherheit und Wirksamkeit von A. pleuropneumoniae Vakzinen
Dieses Beispiel illustriert die Sicherheit und Wirksamkeit von Vakzinen, die nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
A. Sicherheit
Zwei Vakzine wurden von dem gleichen Satz von Extrakten, wie im Beispiel 2 oben beschrieben, hergestellt. Eines wurde durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt, d. h. das Absorbieren des Glutaraldehyd-gekoppelten antigenen Materials mit Rehydragel^® Träger wie in Beispiel 2 beschrieben (Produkt A). Das Andere wurde von dem Glutaraldehyd-gekoppelten Material mit zusätzlichen 9,75 mL PBS anstelle von dem Aluminiumhydroxidträger hergestellt (Produkt B). Als Placebo wurde eine Mischung hergestellt, die aus Amphigenzusatzstoff, 5% in PBS, bestand.
Abgestillte (3–4 Wochen alte) Schweine wurden zu drei Gruppen zufällig zugeordnet und sie wurden mit einem dieser drei Produkte intramuskulär in die Seite des Nackens gespritzt. Jedes Schwein erhielt zwei (2) mL Dosen des entsprechenden Vakzins in einem drei Wochen Intervall. Schweine wurden den Produkten in den folgenden Zahlen zugeordnet: Produkt A (65), Produkt B (35) und Placebo (40).
Wenn mit dem chromogenen LAL Test getestet wurde, wurde gefunden, daß das Produkt A einen freien Endotoxingehalt von 0,546 μg pro Dosis (nach Verdünnung gemessen) und das Produkt B von 9,636 μg pro Dosis hat. Für A. pleuropneumoniae Vakzine ist es wünschenswert, Endotoxinniveaus von weniger als etwa 1 μg pro Dosis zu haben. In Gruppe A, in der die Schweine Vakzine erhielten, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, zeigte eines der 65 Schweine nur nach der ersten Dosis kurzzeitig erschwertes Atmen. Der Rest der Gruppe zeigte keine systemischen Reaktionen. In Gruppe B, denen das konventionelle Vakzine gegeben wurde, entwickelten die meisten Schweine während einem der Impfung folgenden Zeitraum von 2 bis 3 Stunden typischen endotoxischen Schock, der durch Steifheit, Dyspnea und Depression charakterisiert war. Von den 35 Schweinen in Gruppe B wurde nach der ersten Impfung bei 30 und nach der zweiten bei 8 Schock gesehen. Die Placebogruppe zeigte keine systemischen Reaktionen.
Keines der Schweine aus einer der Gruppen hatte lokale Reaktionen, welche klinisch oder bei Autopsie detektierbar waren.
B. Wirksamkeit
Die Immunität der Schweine wurde eine Woche nach der zweiten Impfung intranasal (Kontrollen zuletzt) mit lebenden virulenten Kulturen (0,5 mL pro Nasenloch) von entweder Serotyp 1, Stamm Schelkopf (1,74 × 10⁹ Kolonieformende Einheiten (CFU)/mL), Serotyp 5, Stamm K-17 (7,1 × 10⁷ CFU/mL) oder Serotyp 7, Stamm WF 83 (1,55 × 10⁹ CFU/mL), angeregt. Vor der Anregung waren aus unzusammenhängenden Gründen drei Schweine in Gruppe A, vier in Gruppe B und sechs in der Placebogruppe gestorben. Schweine die während der Tage starben, die der Anregung folgten, wurden sobald wie möglich einer Autopsie unterworfen. Überlebende wurden nach 7 bis 8 Tagen getötet und untersucht.
Bei der Autopsie wurden die Lungen von jedem Schwein gewogen. Lungenverletzungen wurden dann herausgeschnitten und gewogen und das Gewicht der Verletzung wurde als ein Prozentsatz des gesamten Lungengewichts berechnet. Getrennt davon wurden die Schweine nach einer Skala für die Schwere für eitrige Lungenentzündung, fibrinöse Pleuritis und serösen Flüssigkeiten in der Brusthöhle gewertet. Die Ergebnisse sind der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.
Statistische Analyse (Mann-Whitney U Test) des prozentualen Lungenschadens von Schweinen, die mit jedem Serotypen angeregt wurden, zeigten eine signifikante Differenz (a = 0,05) zwischen Gruppe A und der Placebogruppe und Gruppe B und der Placebogruppe, wie in Tabelle 1 unten aufgezeigt. Statistische Analyse (Mann-Whitney U Test) der einhergehenden Lungen-Verletzungs-Wertungspunkte zeigten auch eine signifikante Differenz zwischen Gruppe A und der Placebogruppe und Gruppe B und der Placebogruppe. Die geringen Differenzen in Prozent Schaden und Verletzungs-Wertungspunkt zwischen Gruppe A und B waren nicht signifikant.
Tabelle 1 Mittelwerte bei Autopsie
Diese Ergebnisse zeigen, daß Vakzin A, welches erfindungsgemäß hergestellt wurde, genauso wirkungsvoll war wie das konventionelle Vakzin B und ebenso frei von Injektionsstellen Reaktionen. Jedoch, im Gegensatz zu dem konventionellen Vakzin, welches in den meisten Schweinen endotoxischen Schock induzierte, bewies sich, daß Vakzin A nahezu vollständig frei von systemischer Reaktivität war; das kurzzeitige erschwerte Atmen bei einem der 65 Schweine wurde als nicht typisch für endotoxischen Schock angesehen.
Zusammenfassend erreichte das erfindungsgemäße Verfahren den gewünschten Effekt, endotoxischen Schock zu eliminieren, ohne dabei Wirksamkeit zu verlieren und besonders ohne Einführung unakzeptierbarer Injektionsstellen Reaktionen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Gram-negativ-bakteriellen Vakzins, umfassend: (a) das Bereitstellen einer konzentrierten Gram-negativ-bakteriellen antigenen Präparation, welche Antigen und freies Endotoxin in einer Menge umfaßt, die ausreichend ist, einen endotoxischen Schock zu induzieren, wenn sie einem Tier verabreicht wird; (b) das Hinzufügen einer Konzentration eines Mineralgelträgers zu der antigenen Präparation von (a), in einer Menge, die wirksam ist, das freie Endotoxin auf ein Niveau zu reduzieren, das keinen endotoxischen Schock auslösen wird aber bei dem das Antigen ausreichend verfügbar bleibt, um eine immunologische Antwort auszulösen; (c) das Verdünnen der Präparation von (b), so daß die Konzentration des Mineralgelträgers kleiner als 5% (VN) ist, aber das freie Endotoxin auf einem Niveau bleibt, das keinen endotoxischen Schock auslösen wird, und die Konzentration des verfügbaren Antigens ausreichend ist, eine immunologische Antwort auszulösen; und (d) die Wiedergewinnung der verdünnten Präparation von (c) zur Verabreichung als ein Vakzin.
Verfahren wie in Anspruch 1, wobei die wirksame Menge des Mineralgelträgers durch eine freie Endotoxinkonzentration in dem Bereich von 20 bis 1000 Endotoxineinheiten pro ml in der Präparation der Stufe (b) angezeigt wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Mineralgelträger ein Aluminiumhydroxidgel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gram-negativbakterielle antigene Präparation E. coli umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Gram-negativ-bakterielle antigene Präparation Actinobacillus pleuropneumoniae umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konzentrierte antigene Präparation mindestens zehnmal so konzentriert ist, als die in dem Endvakzin.