JP3043809B2

JP3043809B2 - グラム陰性菌ワクチン

Info

Publication number: JP3043809B2
Application number: JP5509495A
Authority: JP
Inventors: デアウェスター，ドナルド・エイ; ロバーツ，デイビッド・エス; スウェリンジン，リロイ・エイ
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-11-15
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2000-05-22
Anticipated expiration: 2015-05-22
Also published as: ATE234916T1; DE69232969D1; AU667858B2; EP0669971A1; DE69232969T2; ES2194841T3; US5616328A; WO1993010216A1; EP0669971B1; JPH07501333A; CA2123222C; CA2123222A1; AU3141393A; DK0669971T3; EP0669971A4

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、グラム陰性菌ワクチンおよびその製造方法
の分野に関する。

発明の背景グラム陰性菌から製造したワクチンは、よく知られて
いる内毒素性ショックを生じる傾向を有する。この結
果、流産したり、死亡したりする。グラム陰性菌は、そ
れらが生きており、分裂している間じゅう、外膜から内
毒素をわずかに放出するが、それらの死滅以後はかなり
多量に放出する。細菌性内毒素は、水道水中に自然に存
在し、発熱因子と呼ばれている。熱の誘発を避けるため
に、注射用無発熱因子水は、蒸留または他の精製方法に
よって製造される。ヒトにおいて、１内毒素単位（EU）
程度（約0.1ナノグラムまたは10^-10グラム）の注射によ
って体温の一過性上昇が生じる。ヒトおよび他の哺乳動
物では、大量の投与量は、内毒素性ショックおよび死亡
の原因となる。

ウサギは、内毒素に対する感受性がヒトと同様であ
り、ウサギは、伝統的に、発熱性についてヒト用注射可
能生成物を試験するために使用されてきた。ほとんどの
他の動物種は、あまり敏感ではない。ウマおよびブタ
は、ほとんどの実験用齧歯類よりもかなり敏感である。
かくして、研究室では、ウサギだけが、獣医学的に注射
可能な物質の内毒素活性を試験するのに好適であるが、
マウスは、マクロファージ機能を変える薬物で比較的敏
感になることがある。

内毒素アッセイでは、ウサギは、主として、より感度
の良いin vitro試験にとって代わられた。これは、カブ
トガニから抽出した液体（カブトガニ・アメーバー様細
胞溶解産物（Limulus amebocyte lysate）またはLAL）
に対する内毒素の作用に依存する。痕跡量の内毒素の添
加によって、LALはゲル化される。ゲルが進行する前
に、LALの透明度は、多少変化し、これは、光学密度の
増加に従って分光光度計によって測定することができ
る。

ワクチンを製造するために殺したグラム陰性菌の培養
物の遊離内毒素含量は、製造者の技術に従って変わる。
1ml中に、20マイクログラム（２×10^-5グラム）程度、
または１ミリグラム（10^-3グラム）程度含まれる。ワク
チン製造者は、遊離内毒素を減少させるいくつかの方法
を使用した。１つの方法は、遠心または濾過によって細
菌細胞を収穫すること、および内毒素に富んだ培養液を
廃棄することを含む。もう１つの方法は、水酸化アルミ
ニウムゲル（Alゲル）などの不溶性アルミニウム（Al）
またはカルシウム化合物（担体）に培養物を吸着させる
ことを含む。

Alゲルによる吸着は、溶液から遊離内毒素のほとんど
を除去し易くする。幾人かの製造者は、ゲルに吸収され
る内毒素および他の培養生成物を有するゲルを沈殿させ
た後、上澄み液をデカントして残りの遊離内毒素を除去
させる。該細菌は、該ゲルに吸着されず、この場合、そ
れらは、通常、沈殿し、上澄み液は透明になる。デカン
トは、すべてが沈殿し、液体が透明になるまで延期しな
ければならない。

培養物から細菌を収穫した場合でも、あるいはアルミ
ニウムまたはカルシウム化合物による吸着後に沈殿が起
こった場合でも、該物質を、通常、単純な水性流体
（水、生理食塩水またはバッファー溶液）に再懸濁させ
る。アッセイは、通常、遊離内毒素含量の予想外の減少
を示す；この変化は、再懸濁に対する希釈因子から算出
されるよりも非常に少ない。これは、内毒素が細菌表面
から逃れ続け、緩く結合した内毒素が担体から脱着する
ためである。

２つの工程は、しばしば、組み合わせられる；培地か
ら細菌を収穫し、水性流体に再懸濁させ、次いで、吸着
させる。収穫した細菌の水性懸濁液を慣用の量のAlゲル
で吸着させることは望ましくない結果を生じることが判
明した。例えば、サルモネラ・コレレスイス（Salmonel
la choleraesuis）の水性懸濁液をAlゲル25％v/vで吸着
させると、検出可能な遊離内毒素は全くなかったが、該
調製物のサルモネラ・コレレスイス（S.choleraesuis）
に対するマウス免疫能は、ほとんど完全に除去された。
ゲルが沈澱し始めるとすぐに、上澄み液は透明になり、
完全な吸着を示した。

これらの結果から、実質的に培地を含まない単純な水
性流体は、ゲルの結合能を消耗しないと考えられた。こ
れは、ゲルを非常に貪欲な（avid）状態にさせ、その結
果、結合可能なすべてのものを非常にしっかりと結合す
る。かくして、すべての内毒素が溶液から除去された
が、細菌は、非常にしっかり結合されており、注射後に
放出されなかったのは明らかであった。これは、明らか
に、免疫化を妨害した。トキソイドを含有する不活化パ
スツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）細胞
の水性懸濁液を用いて、該観察を繰り返した。Alゲル25
％v/vによる吸着後、検出可能な遊離内毒素は全くなか
ったが、該調製物は、モルモットにおいて、徹底的に減
少させられたアンチトキシンの中和を誘発する力を有す
る。

前記のことは、条件の範囲の２つの極度を示す。全培
養物にAlゲルを添加する一極度では、ペプトンおよび培
養液中の他のタンパク様溶質は、ゲル上の結合部位を飽
和させ、その結果、遊離内毒素を含有する多量の物質
は、ゆるく結合されるか、全く結合されない。細菌の水
性懸濁液にAlゲルを添加する他方の極度では、ほとん
ど、ゲルと反応させるためのタンパク様溶質がほとんど
なく、それは、完全に貪欲のままであり、ゲルに対して
親和性を有するすべてのもの、特に、内毒素および細菌
細胞をしっかりと結合する。この条件では、しっかりと
結合した細菌およびその抗原性生成物は、自由には、ワ
クチン接種された動物の免疫系の細胞と相互作用せず、
免疫化は弱い。

かくして、Alゲルの結合力が適度であり、吸着力が最
適である場合、観察された範囲の極度間の条件を生じる
方法が必要である。内毒素のほとんどは、しっかりと結
合されており、ワクチンを安全にするが、細菌細胞およ
び抗原の結合は、良好に免疫化させるのに充分な程度に
ゆるい。この最適条件は、Alゲルの結合性または親和性
を適当に調節する培地の希釈液に細菌を懸濁させること
によって達成された。これは、親和性調節吸着プロセス
またはAMAP^Rなる語を生じた。

初期の形態のAMAP^Rの品質証明である実験を行った。A
lゲル濃度を一定に、この場合、25％v/vに維持しつつ、
培地の希釈液を滴定して、最適な吸着を達成させた。滴
定の終点は、LAL法によってアッセイされたように20〜5
00EU/mlの遊離内毒素濃度によって示された。

サルモネラ・コレレスイス（Salmonella choleraesui
s）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bron
chiseptica）およびパスツレラ・ムルトシダ（Pasteure
lla multocida）を含む多くのグラム陰性菌による実験
によって、Alゲル25％v/vの存在下、通常、培地を希釈
してペプトンおよび他のタンパク様物質の合計濃度約１
％w/vを得た後に終点が達成されたことが判明した。こ
れは、通常、2.5〜3.5のファクターによって培地を希釈
することを必要とする。AMAP^R処理物質を動物にワクチ
ン接種することによって、抗原能力の損失が全くなく、
内毒素に対する反応の臨床的証拠が全くないことが確認
された。最適なAMPA^Rが見いだされた。

商標名Atrobac 3（ボルデテラ（bordetella）、パス
ツレラ（pasteurella）およびエリジペロスリックス（e
rysipelothrix））の下に販売されており、ブタにおけ
る萎縮性鼻炎および丹毒の予防のために販売されている
スミスクライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス（Smit
hKline Beecham Animal Health）ワクチンは、AMAP^Rに
よって製造された最初の市販品である。該方法は、ボル
デテラ（bordetella）およびパスツレラ（pasteurell
a）の２つのグラム陰性菌に適用される。該生成物は、
効力、および全身反応性（内毒素性ショック）からの解
放について良好な批評を達成した。

グラム陰性菌において遊離内毒素を制御する他の方法
がある。１つは、弱アルカリ加水分解からなる。例え
ば、培地を80℃およびpH10で加熱する。この処理は、内
毒素を不活化させるが、多くの細菌性抗原、特にタンパ
クを破壊する。

もう１つの方法は、あまり有効ではないが、限定され
た適用を有する。それは、グルタルアルデヒドを使用し
て、培養物を不活化させることからなる。グルタルアル
デヒドは、有効な架橋剤であり、それは、培養物中の内
毒素のほとんどを結合する。グルタルアルデヒドによる
不活化後、ボルデテラ（bordetella）培養物は、約１マ
イクログラム（10^-6グラム）/mlの遊離内毒素含量を有
する。しかしながら、グルタルアルデヒドは、合成増殖
培地における培養物中でのみ使用することができる。天
然培地においては、タンパク様溶質がグルタルアルデヒ
ドと結合し、細菌に対するその作用を防止する。安全な
ボルデテラ（bordetella）ワクチンを製造するためにグ
ルタルアルデヒドの使用は、1989年12月19日に発行され
たU.S.P 4,888,169（「ボルデテラ・ブロンキセプチカ
・ワクチン」（“Bordetella bronchiseptica vaccin
e"））に開示されている。

AMAP^Rの初期バージョン（AMAP^R,マーク１）は、慣用
の量のAlゲルに対して培地を滴定して、ゲルの結合力を
最適に調節することによって特徴付けられる。AMAP^R,マ
ーク１は、抗原能力を低下させずに内毒素性ショックを
除くという目的を満足させた。

この領域の研究者は、最近、AMAP^Rとは無関係ではあ
るが、AMAP^Rによって製造された生成物を含む、慣用的
な量のAlゲル（約10〜25％v/v）を含有するすべての細
菌ワクチンによる重篤な問題に深刻に気づくようになっ
た。これらのワクチンは、貯蔵効果と称されるものを生
じる。Alゲルまたは他の無機担体は、容易には代謝され
ず、そこで、注射部位の組織中に残存する傾向にある。
次いで、ゲルに吸着した細菌細胞および代謝産物は、組
織中に捕獲される。それらは、肉芽腫、膿瘍を導き、最
後に傷痕を残す慢性刺激を誘発する。これは、ワクチン
を食肉用に飼育した動物の筋肉中に注射する場合に特に
重大である。屠殺時に、影響を受けた肉片は、しばしば
廃棄処分とされ、損失する。これは、死体の斑点による
トリム・ロス（trim loss）と称される。注射部位反応
問題の発生は、評価できるほどの局所的反応性を生じな
いAMAP^Rの新しいバージョンを必要とすることを明瞭に
示した。

発明の概要本発明は、濃縮グラム陰性菌抗原調製物を供給し、内
毒素および抗原の最適な結合を生じるのに有効な量の、
抗原調製物中の遊離内毒素の結合能を有する無機担体で
該調製物を吸着させ、次いで、該吸着調製物をワクチン
用に希釈することからなり、ワクチン中の無機担体の量
が、無機担体を非濃縮抗原調製物または最終ワクチンに
添加する場合よりも少ないことを特徴とする新規グラム
陰性菌ワクチン製造方法を提供するものである。

本発明は、また、本発明の方法によって製造されたワ
クチンを提供するものでもある。

さらに、本発明は、改良が5.0％v/v未満のワクチン中
の無機担体の濃度からなることを特徴とするグラム陰性
菌ワクチンを提供するものである。

さらに、本発明は、ワクチン中の無機担体の量が、濃
縮グラム陰性菌抗原調製物を供給し、内毒素および抗原
の最適な結合を生じるのに有効な量の、抗原調製物中の
遊離内毒素の結合能を有する無機担体で該調製物を吸着
させ、次いで、該吸着調製物をワクチン用に希釈するこ
とからなる方法によって予め測定され、ワクチン中の無
機担体の量が、無機担体を非濃縮抗原調製物または最終
ワクチンに添加する場合よりも少ないことを特徴とする
無機担体からなるグラム陰性菌ワクチンを提供するもの
である。

さらに、本発明は、本発明のワクチンの有効量を動物
に投与することを特徴とするグラム陰性菌感染に対して
動物にワクチン接種する方法を提供するものである。

発明の詳細な説明本発明は、従来技術の方法における前記問題を解決す
る。本発明によると、抗原調製物にわずかに高い濃度の
無機担体を添加することによって、グラム陰性菌の濃縮
抗原調製物中で内毒素を制御することができる。例えば
水または生理食塩水で、該調製物をワクチンにおいて必
要とされる濃度に希釈すると、無機担体の最終濃度は、
実質的に低下し、驚くべきことに、内毒素は、しっかり
と結合されたままである。本発明の方法によって製造さ
れたワクチンは、ワクチン接種された動物において、良
好な効力、優れた全身安全性およびほんのわずかな注射
部位反応性を有することが証明された。

本明細書で記載する場合、「濃縮グラム陰性菌抗原調
製物」は、最終ワクチンよりも非常に高い抗原含量を有
する抗原調製物を意味する。一般に、濃縮調製物は、最
終ワクチンの抗原濃度よりも少なくとも約10倍高い、好
ましくは40〜50倍高い抗原濃度を有する。濃度の上限
は、調製物と一緒に作動する能力によって支配される。
すなわち、作動するのが困難であるほどに濃くあるべき
ではない。下限は、ワクチン中の無機担体の最終濃度を
低下させる要望によって支配される。非濃縮培養液また
はそのフラクションが濃縮に頼らずにこの標準に適合す
る場合もある。しかしながら、ほとんどの場合、該液は
濃縮しなければならない。これらは、遠心または当業者
に知られている他の方法によって調製することができ
る。抗原調製物が濃縮されればされるほどますます、ワ
クチンの組立ての間に希釈され、最終再構成ワクチン中
の担体の濃度が低くなる。細菌抗原調製物の好ましい濃
度は、例えば、調製物が吸着され、最終ワクチンに組立
てられると、無機担体濃度が5.0％v/v未満であり、好ま
しくは、3.0％v/v未満であるような濃度である。

驚くべきことに、グラム陰性菌抗原調製物としては、
例えば、全細菌懸濁液ならびに細菌抽出物および無細菌
培養液が挙げられる。これまでに、AMAP^Rは、全細菌調
製物だけに対して好適であることが示された。

本発明で使用することができるグラム陰性菌の例とし
ては、サルモネラ（Salmonella）、イー・コリ（E.col
i）、シゲラ（Shigella）、カンピロバクター（Campylo
bacter）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ホル
デテラ（Bordetella）、パスツレラ（Pasteurella）、
アクチノバシラス（Actinobacillus）、ヘモフィルス
（Haemophilus）およびヒストフィルス（Histophilus）
が挙げられる。

好適な無機担体としては、グラム陰性菌の遊離内毒素
の結合能を有するものが挙げられる。例としては、水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンまた
はリン酸カルシウムが挙げられる。無機担体／抗原調製
物中の遊離内毒素の濃度を低下させるのに有効な量の無
機担体を濃縮抗原調製物に添加する。有効量は、内毒素
をしっかり結合し、抗原を非常にしっかりと結合して抗
原刺激を阻害するほどには高くない量を投与する安全な
レベルに遊離内毒素を低下させるのに必要な量を意味す
る。有効量は、巨大分子過剰と担体過剰との中間を表
す。このバランスは、約20〜約1000EU/ml、好ましく
は、約20〜約500EU/投与量の吸着調製物中の遊離内毒素
レベルによって示される。

20〜500EU/mlなる数字は、最終ワクチンには関連して
いない。一般に、遊離内毒素量は、この範囲内のままで
あるが、他の成分の影響に依存して、最終ワクチンにお
いては100EU/mlに近づき、なお、許容される。増加は、
おそらく、他の成分（グラム陽性菌、ウイルスなど）に
おける巨大分子によってゲルから置換された内毒素に起
因する。これは、ほとんどの家畜が10,000EU/mlまで内
毒素を含有するワクチンに耐えることができることが判
明したので、安全性に影響を及ぼすとは思われない。

ワクチン開発の間、抗原調製物の濃度の程度が確立さ
れ、無機担体の量は、いくつかの実験バッチに対して測
定される。これは、製造の間に濃縮物に添加されるべき
担体の割合を設定する。

抗原調製物は、無機担体の結合部位に結合するか、ま
たは内毒素と担体上での結合部位について競争するその
構成分子によって無機担体の結合力を調節する薬剤であ
る。残存する結合力は、如何に多くの内毒素が結合させ
られるか、および如何にしっかりと結合させられるかを
決定する。担体が添加されればされるほどますます、多
くの遊離結合部位が残存し、最後にアッセイすることが
できる遊離内毒素は少なくなる。最終点を越えて担体を
添加すると、過剰な結合部位が増加し、担体に対して親
和性を有するすべての巨大分子しっかりと結合される。
遊離内毒素はゼロであるが、抗原の結合は、特異的な免
疫原によって抗原刺激を阻害するほどしっかりしてい
る。

本発明の方法では、細菌細胞を使用する場合、一般
に、少なくとも90％の培地が濃縮の間に廃棄される。し
たがって、培養物は、培地に対する細菌由来の保護的抗
原（免疫原）の損失を最小限にする方法で管理され、か
つ、不活化されるべきである。これは、まず、不活性化
剤を、使用する場合には、培養物が増殖サイクルの指数
（「対数」）期である場合に添加すべきであることを必
要とする。この段階では、実質的には、細胞の100％が
生きており、分裂しており、したがって、それらの構造
的保全は完全である。増殖速度が遅くなるとすぐに（転
位期（transition phase））、多数の細菌が、死滅また
は乾燥し、分解し始め、抗原および内毒素の両方を放出
する。不活性化剤は、好ましくは、固定剤、すなわち、
細胞構造を結合させ、分解を防止する試薬であるべきで
ある。

ホルムアルデヒド溶液（ホルマリン）は、最も広範囲
に有用な不活性化剤である。ホルマリンは、細菌細胞の
死滅化の間、内毒素を多少放出させるが、これは、本発
明の方法によって、溶液から容易に除去される。培養物
が不活化された後、さらなる損失はほとんどない。グル
タルアルデヒドは、より有効であり、培地中にすでに遊
離している内毒素を結合させる；遊離内毒素は、実際に
は、不活化の間に減少する。しかしながら、前記のとお
り、グルタルアルデヒドは、完全な合成培地における培
養物中でのみ使用することができる。

該調製物は、ワクチン用に希釈される。該ワクチン
は、補助剤、さらなる無機担体および当業者に公知の種
々の他の抗原などの他の成分を含有してもよい。

本発明のもう１つの態様は、本発明のワクチンの有効
量を動物に投与することを特徴とするグラム陰性菌感染
に対する動物のワクチン接種方法を提供するものであ
る。ワクチンの有効量は、免疫性誘発能を有する量であ
る。有効量は、抗原によって変わり、当業者によって容
易に決定され得る。

以下の実施例は、本発明方法を使用するグラム陰性菌
由来の好例のワクチンの調製、ならびにこれらのワクチ
ンの安全性および効力を説明する。これらの実施例は、
単に説明的なものであり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。

実施例１イー・コリ（E.coli）ワクチンの調製アイオワ州エイムズのナショナル・アニマル・ディジ
ーズ・センター（National Animal Disease Center）か
らのイー・コリ（E.coli）菌株NADC 1471（ピルス（pil
us）型K99）を、寒天プレート上で16〜32時間またはフ
ラスコ中で12〜32時間、37℃で、下記の合成培地中で増
殖させる。

生産増殖サイクルは、制御撹拌しつつ、４〜12時間で
ある。イー・コリ（E.coli）増殖用合成培地は、次のと
おり調製する:2.0g NH₄Cl、4.50g KH₂PO₄および17.0g
Na₂HPO₄を蒸留水中で合わせ、NaOHでpHを7.4±0.2単位
に調整し、該混合物をオートクレーブに付して滅菌す
る。MgSO₄・7H₂O（0.05g）、FeSO₄・7H₂O（5.0mg）およ
びグルコース（5.0g）の溶液を、各々、濃縮物として別
々に調製し、濾過滅菌し、基本培地に加えた。所望によ
り、増殖サイクルの間、発酵培養物に栄養補足物を添加
する。該補足物は、発酵培養物１当たり以下の最大量
の成分を提供する:9.12g KH₂PO₄、34.0g Na₂HPO₄、1.0g
MgSO₄・7H₂O、0.1g FeSO₄・7H₂Oおよび15.0gグルコー
ス。KH₂PO₄およびNa₂HPO₄を蒸留水中で合わせ、オート
クレーブに付して滅菌する。MgSO₄・7H₂O、FeSO₄・7H₂O
およびグルコースの溶液を、各々、濃縮物として別々に
調製し、濾過滅菌する。

本発明方法に従って培養物を不活性化するためには、
不活性化剤であるホルマリン（ホルムアルデヒド溶液US
P）を該培養物に加えて、濃度を約0.5％v/vにする。該
培養物を、低速撹拌しつつ、37℃±１℃で、発酵器中で
一晩不活化する。

濃縮工程については、不活化培養物をシャープルズ連
続流遠心器（Sharples continuous flow centrifuge）
に通し、ペーストとして細菌を沈澱させる。別法として
は、該細菌を標準的な条件下で超遠心によって濃縮す
る。細菌を、最終ワクチン中の濃度の10倍の値に、すな
わち、１×10¹⁰細菌/mlに濃縮する。濃縮物中の細菌数
は、ペトロフ−ハウザー（Petroff−Hauser）法または
コールター（Coulter）カウンターによって測定する。
次いで、免疫原の量または抗原投与量が0.2ml中に含有
され、最終投与量が2mlになるように、濃縮物をリン酸
塩緩衝化生理食塩水（PBS）（pH7.2±0.2）によって希
釈する。

pH6.5で滴定することによって、最終20％v/vまでのリ
ハイドラゲル（Rehydragel^TM）担体の添加の結果、濃縮
物中270EU/ml（３バッチの平均）の遊離内毒素が得られ
たことを測定した。この値は、滴定の終点として選択さ
れた20〜500EU/mlの最も好ましい範囲内である。この結
果、この量の担体が濃縮懸濁液に添加され、吸着が生じ
る。

ワクチン組成物を調製するためには、得られた吸着濃
縮物12.5mlをPBSで最終容量100mlに希釈する。この12.5
mlは、再懸濁細菌10mlおよびゲル2.5mlからなる。した
がって、ワクチン中、初期細胞懸濁液を所望のファクタ
ー10（2ml投与量中0.2ml）に希釈し、ゲルは、最終濃度
2.5％v/vで存在し、最も望ましい標準＜３％v/vに適合
する。メルチオラート（merthiolate）10％溶液を保存
剤として組み立てられた連続物に添加する。メルチオラ
ートの最終濃度は、0.01％重量／容量を超えない。

前記に従って調製したワクチンの抗原性を以下のとお
り試験した。マウス20匹に、各々、ワクチンの20倍希釈
液0.2ml、すなわち、ウシの投与量の400分の１を皮下注
射した。３週間目に、マウスから採血した。マウスから
の血清試料を、個々に、K99ピリ（pili）を有するイー
・コリ（E.coli）菌株1471から調製した不活化抗原に対
して凝集試験で滴定した。それらの血清は、平均凝集力
価13を有した。

実施例２アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ
（A.Pleuropneumoniae）ワクチンの調製本発明方法によって、ワクチン用にアクチノバシラス
・プリゥロニュウモニエ（Actinobacillus Pleuropneum
oniae）血清型１（菌株シェルコップ（Schelkopf）；ド
クター・シュルツ（Dr.Schultz）、アイオワ州アボ
カ）、血清型５（菌株Ｋ−17;ドクター・シュルツ（Dr.
Schultz）、アイオワ州アボカ）および血清型５（菌株W
F−83;スミスクライン・ビーチャム・コーポレーション
（SmithKline Beecham Corporation））を調製した。37
±１℃で４〜24時間、液体培地［ギブコ・ラボラトリー
ズ（Gibco Laboratories）、バクテリン（Bacterin）HP
培地、フォーミュラ♯90−5066］中で３種のアクチノバ
シラス・プリゥロニュウモニエ（A.Pleuropneumoniae）
菌株を培養した。無菌空気による通気および撹拌によっ
て、溶存酸素値を30％に制御した。無菌消泡溶液を使用
して泡を制御し、培地に接種する前に添加した。無菌5N
NaOHまたは4N HClの添加によって、培養物のpHを7.3±
0.2に維持した。

指数増殖の最後に、各培養物を20℃の温度に冷却し、
増殖を停止させた。冷却培養物を遠心し、沈殿物を、非
常に濃い細菌の懸濁液として回収した。該懸濁液を、撹
拌しつつ１時間、56℃±１℃で加熱した。次いで、該懸
濁液を遠心し、上澄み液（抽出液）を回収した。無菌10
％メルチオラートおよび10％エチレンジアミン四酢酸
（EDTA）溶液を、各々、最終濃度0.01％および0.07％
（重量／容量）で保存剤として添加した。該抽出物を無
菌0.45および0.3μｍフィルターに通し、組み立てるま
で２℃〜７℃で貯蔵した。

ワクチンを以下のとおり調製した。フェノール法によ
って各抽出物の炭水化物含量を、ロウリィ（Lowry）法
によってタンパク含量を測定した。次いで、グルタルア
ルデヒドとの反応によって、抽出物中の分子を結合また
は連結させた。合計タンパク1g当たり1mlの割合でグル
タルアルデヒドの25％溶液を抽出物に添加した。次い
で、グルタルアルデヒド溶液1ml当たりリシン12.5mgの
割合でリシンの溶液を該抽出物に添加して、残存グルタ
ルアルデヒドを中和させた。この混合物を室温で２時
間、撹拌しつつインキュベートし、４℃で一晩貯蔵し
た。

３つの血清型の抽出物をそれらの炭水化物アッセイ値
に従って合わせた結果、ワクチン投与量2mlは各血清型
の炭水化物20μｇを含有した（10μg/ml）。水酸化アル
ミニウムゲルによる吸収前に、合わせた濃縮物の容量を
バッチの最終容量の1/40に調節した。これは、少量のPB
Sの添加を必要とした。

滴定によって、pH6.5で、調節した濃縮物にリハイド
ラゲル（Rehydragel^TM）担体を濃縮物100ml当たりゲル3
9mlの割合で添加して、最終濃度28％v/vにした後、遊離
内毒素を、20〜500EU/mlの範囲内である470EU/mlに減少
させた。

製品１を調製するために、各血清型の充分量を容器
に添加して、炭水化物10,000μｇ（10mg）を与えた。PB
Sを添加して、容量を25mlにした。次いで、リハイドラ
ゲル（Rehydragel^TM）担体9.75ml（25mlの39％）を添加
した。pHを6.5に調整し、該混合物を室温で１時間撹拌
した。次に、アンフィゲン（Amphigen）アジュバント
［ハイドロニクス，インコーポレイテッド（Hydronics,
Inc.）］の40％エマルジョン125ml（最終容量の８分の
１）を添加して、ワクチン中最終５％v/vアンフィゲン
（Amphigen）アジュバントを得た。次いで、PBSのさら
なる添加によって、容量を１に増加させた。かくし
て、リハイドラゲル（Rehydragel^TM）担体の最終濃度
は、注射部位での組織反応の回避のために非常に望まし
い値である0.98％v/vであった。

実施例３アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ
（A.Pleuropneumoniae）ワクチンの安全性および効力この実施例は、実施例２に記載の方法に従って調製し
たワクチンの安全性および効力を説明する。

A.安全性前記実施例２の記載に従って、同一の抽出物から２つ
のワクチンを調製した。１つは、本発明の方法によって
調製した；すなわち、実施例２に記載のリハイドラゲル
（Rehydragel^TM）担体でグルタルアルデヒド結合抗原物
質を吸着させた（生成物Ａ）。他方は、水酸化アルミニ
ウム担体の代わりにさらなるPBS 9.75mlを用いてグルタ
ルアルデヒド結合物質から調製した（生成物Ｂ）。プラ
シーボとして、アンフィゲン（Amphigen）補助剤（PBS
中５％）からなる混合物を調製した。

離乳した（３〜４週齢）ブタを任意に３つのグループ
に分け、これら３つの生成物の１つを首の側部に筋肉内
注射した。各ブタに３週間おきに適切なワクチン2mlを
投与した。以下の数のブタを生成物に対して分けた：生
成物Ａ（65）、生成物Ｂ（35）、およびプラシーボ（4
0）。

色素産生性LAL試験でアッセイすると、生成物Ａは投
与当たり0.546μｇの遊離内毒素含量を有し（希釈後に
測定した）、生成物Ｂは投与当たり9.636μｇを含有す
ることが判明した。アクチノバシラス・プリゥロニュウ
モニエ（A.Pleuropneumoniae）ワクチンについて、投与
当たり約１μｇ未満の内毒素レベルを有するのが好まし
い。グループＡでは、本発明方法によって、ブタ投与用
ワクチンを調製し、ブタ65匹のうち１匹は、最初の投与
の後だけに一過性の不自然呼吸を示した。該グループの
残りは、全身反応を示さなかった。グループＢでは、慣
用のワクチンを投与した後、ブタのほとんどが、ワクチ
ン接種後２〜３時間、硬直、呼吸困難、および鬱病によ
って特徴付けられる典型的な内毒素性ショックを示し
た。グループＢのブタ35匹のうち30匹が最初の注射の後
にショックを示し、８匹が２回目の注射の後にショック
を示した。プラシーボのグループは、全身反応を示さな
かった。

いずれのグループのブタも、臨床学的にまたは剖検で
検出可能な局所反応は示さなかった。

B.効力２回目のワクチン接種の１週間後、血清型１、菌株シ
ェルコップ（Schelkopf）（1.74×10⁹コロニー形成単位
（CFU）/ml）、血清型５、菌株Ｋ−17（7.1×10⁷CFU/m
l）、または血清型７、菌株WF83（1.55×10⁹CFU/ml）の
いずれかの生菌ビルレント培養物でブタの免疫性を鼻腔
内攻撃した（0.5ml/鼻孔）。攻撃前に、グループＡのブ
タ３匹、グルーブＢのブタ４匹およびプラシーボグルー
プのブタ６匹が無関係の原因で死亡した。攻撃後に死亡
したブタは、できる限り早く剖検に付した。生存してい
るブタは、７〜８日目に殺して実験した。

剖検では、各ブタの肺を計量した。次いで、肺炎性病
変を切開し、計量し、病変重量を肺の総重量のパーセン
トとして算出した。別に、化膿性肺炎、線維素性胸膜
炎、および胸腔中の漿液についての重篤度のスケールに
従って、ブタを評価した。結果を下記表にまとめる。

各血清型で抗原投与されたブタの肺損傷パーセントの
統計学的分析（マン−ホワイトニィ（Mann−Whitney）
Ｕ試験）によって、下記第１表に示すとおり、グループ
ＡおよびプラシーボグループならびにグループＢおよび
プラシーボグループ間に有意な差（α＝0.05）が示され
た。関連肺病変スコアの統計学的分析（マン−ホワイト
ニィ（Mann−Whitney）Ｕ試験）によって、グループＡ
およびプラシーボグループならびにグループＢおよびプ
ラシーボグループ間に有意な差が示された。グループＡ
およびＢ間の損傷パーセントおよび病変スコアの小さな
差は、有意ではなかった。

これらの結果から、本発明に従って調製したワクチン
Ａが慣用のワクチンＢと同様に有効であり、同様に注射
部位反応を示さなかったことが判明する。しかしなが
ら、ブタのほとんどにおいて内毒素性ショックを誘発し
た慣用のワクチンとは対照的に、ワクチンＡは、ほとん
ど全体的に全身反応性を示さなかったことが証明され
た；ブタ65匹のうち１匹の一過性の不自然呼吸は、内毒
素性ショック独特のものではないと思われた。

概して、本発明の方法によって、効力の損失なしで、
重要なことには、許容されない注射部位反応を導入せず
に、内毒素性ショックを取り除くという所望の効果が達
成された。

本発明の多くの変形例およびバリエーションは、本発
明に含まれ、当業者に明らかであると思われる。本発明
のかかる変形例および別法および方法は、以下の請求の
範囲の範囲に含まれると思われる。

フロントページの続き (72)発明者スウェリンジン，リロイ・エイアメリカ合衆国ネブラスカ州68510、リンカーン、サウス・サーティサード・ストリート 934番 (56)参考文献特開昭58−162532（ＪＰ，Ａ) Ａｔｒｏｂａｃ３製品案内, （1991）、ＢｅｃｃｈａｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/00 - 39/44

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）抗原および動物に投与された場合に
内毒素ショックを誘発するのに十分な量の遊離内毒素を
含む濃縮グラム陰性菌抗原調製物を得、（ｂ）（ａ）の抗原調製物に、内毒素ショックを誘発さ
せないレベルにまで遊離内毒素を減少させるが、抗原が
免疫応答の誘発性を保持するのに効果的な量の濃度の無
機担体を加え、（ｃ）無機担体の濃度が5.0％v/v未満であるが、遊離内
毒素が内毒素ショックを誘発させないレベルで残存し、
かつ、利用可能な抗原の濃度が免疫応答を誘発させるの
に十分であるように、（ｂ）の調製物を希釈し、（ｄ）（ｃ）の希釈調製物をワクチンとして投与するた
めに回収することを含むグラム陰性菌ワクチンの製造方法。
【請求項２】無機担体の有効量が20〜1000内毒素単位/m
lの範囲の工程（ｂ）の調製物中の遊離内毒素濃度によ
って示される請求項１記載の方法。
【請求項３】無機担体が水酸化アルミニウムゲルである
請求項１記載の方法。
【請求項４】グラム陰性菌抗原調製物がイー．コリ（E.
coli）を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】グラム陰性菌抗原調製物がアクチノバシラ
ス・プリゥロニュウモニエ（Actinobacillus pleuropne
umoniae）を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】グラム陰性菌抗原調製物が最終ワクチンの
少なくとも10倍濃縮されている請求項１記載の方法。
【請求項７】抗原、動物に投与された場合に内毒素ショ
ックを誘発可能な濃度の内毒素、および、無機担体を含
む改良グラム陰性菌ワクチンであって、改良体がワクチ
ン中５％v/v以下の濃度の無機担体を含み、ワクチンが
内毒素ショックを誘発することを妨げるように、ワクチ
ンにおいて十分量の内毒素が無機担体に結合している、
ワクチン。
【請求項８】請求項７記載のワクチンの有効量をヒト以
外の動物に投与することを特徴とする該動物をグラム陰
性菌感染症に対してワクチン接種する方法。