DE69511392T2

DE69511392T2 - Verfahren zur trennung von protektiven verbindungen aus bordetella pertussis

Info

Publication number: DE69511392T2
Application number: DE69511392T
Authority: DE
Inventors: Shigeo Fujii; Akihiro Suehara; Eiji Yamamoto
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-26
Publication date: 2000-03-23
Anticipated expiration: 2015-04-27
Also published as: KR970702874A; US20020119161A1; EP0755403B1; DE69511392D1; CA2188424A1; ES2136290T3; WO1995029934A1; US20050180987A1; US20090068228A1; ATE183194T1; DK0755403T3; US20030133941A1; AU2352595A; US20100055134A1; US6051240A; CN1147259A; EP0755403A1; GR3031481T3; KR100266556B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abtrennen schützender Komponenten von Bordetella pertussis. Ein die Pertussis-Komponente enthaltender Impfstoff kann hergestellt werden, indem man die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung abgetrennten schützenden Komponenten in geeigneter Weise miteinander mischt.

Technischer Hintergrund

Impfstoffe werden häufig verwendet, um übertragbare Krankheiten zu verhindern. Pertussis (Keuchhusten), eine übertragbare Krankheit der Atemwege, die durch Infektion mit Bordetella pertussis verursacht wird, macht den Patienten, insbesondere Säuglingen, aufgrund von apnoischem Husten mit gelegentlichen Krämpfen häufig schwer zu schaffen. Zur Bekämpfung dieser Krankheit ist es üblich, ganze kultivierte Zellen von Bordetella pertussis nach Inaktivierung zu verwenden (inaktivierter Impfstoff). Es wurde jedoch über lokalisierte Reaktionen an der Impfstelle und Nebenreaktionen, wie Fieber, berichtet, so daß ein gesellschaftlicher Druck besteht, dieses Problem zu lösen. Zur Lösung dieses Problems gab es eine große Zahl von Versuchen, von Bordetella pertussis abgetrennte schützende Komponenten als Impfstoff zu verwenden. Zum Beispiel wird azellulärer Pertussis-Impfstoff (ACP-Impfstoff), der durch Extrahieren schützender Proteine, wie Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM), aus Bordetellapertussis-Zellen und Entfernen des Endotoxins (ET) hergestellt wird, zur Zeit der praktischen Anwendung zugeführt, ist jedoch aufgrund der unten beschriebenen Nachteile nicht völlig zufriedenstellend.
Pertussis-Toxin (PT), filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM), alle schützende Komponenten von Bordetella pertussis, die mit bestätigter Wirksamkeit bereits praktisch verwendet werden, werden durch entsprechende Verfahren abgetrennt.
Pertussis-Toxin (PT) kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Human-Haptoglobin als Ligand abgetrennt werden [Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 580, S. 175 (1979)]. Human-Haptoglobin kann jedoch mit Hepatitis-Virus kontaminiert sein, da es aus menschlichem Blut gewonnen wird; dasselbe gilt, wenn Tierseren verwendet werden. Ein weiteres verfügbares Verfahren ist die Affinitätschromatographie unter Verwendung von denaturiertem Ceruloplasmin als Ligand (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 62135/1987). Obwohl dieses Verfahren frei von dem Problem der Viruskontamination ist, treten einige Probleme auf; dazu gehören die Kontamination des Impfstoffs mit Ceruloplasmin und die hohe Toxizität von Natriumthiocyanat und anderer Eluenten mit proteindenaturierender Wirkung und deren potentielle Retention im Körper.
Für filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) steht ein Reinigungsverfahren unter Verwendung von Hydroxyapatitgel zur Verfügung [Infection and Immunity, Vol. 41, S. 313 (1983), und EP-A-231 083, EP-A-427 462, EP-A-462 534; Japanische Offenlegungsschriften Nr. 234031/1987, 169893/1992, 368337/1993]. Der Säulenbetrieb ist jedoch zeitaufwendig und unökonomisch aufgrund der hohen Kosten von Hydroxyapatit.
Für Pertactin (PRN, 69K-OMP) steht eine Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Mausserums als Ligand zur Verfü gung [Infection and Immunity, Vol. 56, S. 3189 (1988)], hat jedoch dieselben Nachteile wie die obigen.
Für Pertussis-Fimbrien (FIM) wird Bordetella pertussis-Zellextrakt durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat und Magnesiumchlorid gereinigt [Infection and Immunity, Vol. 48, S. 442 (1985)], aber dieses Verfahren hat aufgrund einer geringen Ausbeute eine schlechte Impfstofferzeugungseffizienz.
Es gibt ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Gram-negative Bakterien durch Adsorbieren mit Aluminiumhydroxidgel (WO 93/10216). Bei diesem Verfahren wird eine große Menge des Aluminiumhydroxidgels benötigt, das sowohl die schützenden Komponenten als auch das Endotoxin aus Gramnegativen Bakterien adsorbiert. Der nach dem Verfahren von WO 93/10216 erhaltene Impfstoff birgt die Gefahr von Nebenwirkungen, wie Fieber und Endotoxinschock, durch das von den verdünnten Impfstoffen in den Körper freigesetzte Endotoxin.
Für die Herstellung eines Pertussis-Impfstoffs, der als Komponenten ein Gemisch umfaßt, ohne jede schützende Komponente von Bordetella pertussis abzutrennen, steht ein Verfahren zur Verfügung, bei dem Calciumphosphatgel verwendet wird (EP-A- 291 968, Japanische Offenlegungsschrift Nr. 52726/1989). Dieses Verfahren, bei dem das Calciumphosphat in Gegenwatt von 1 M Natriumchlorid verwendet wird, absorbiert jedoch nicht die schützenden Komponenten.
Wie bereits gesagt, müssen völlig verschiedene Reinigungsverfahren verwendet werden, um die jeweiligen schützenden Komponenten von Bordetella pertussis abzutrennen. Dieser Ansatz ist wegen der aufwendigen Verarbeitung für die Impfstoffherstellung im großen Maßstab ungeeignet und in der Praxis schwierig anzuwenden. Die üblichen, im Stand der Technik offenbarten Verfahren zur Abtrennung schützender Komponenten weisen über dies einige Probleme damit auf, daß die Materialien oder Reagentien pathogen oder toxisch sind.

Offenbarung der Erfindung

Vor dem oben beschriebenen Hintergrund erforschten die Erfinder Verfahren zum effizienten Abtrennen schützender Komponenten von Bordetella pertussis und fanden, daß schützende Komponenten von Bordetella pertussis auf der Basis von Unterschieden in der Adsorbierbarkeit an Calciumphosphatgel, das durch Zugabe von Calciumionen zur Bordetella pertussis-Kultur in Gegenwart überschüssiger Phosphationen gebildet wird, effizient aus einer Bordetella-pertussis-Kultur abgetrennt werden können. Die Erfinder führten auf der Grundlage dieses Ergebnisses weitere Untersuchungen durch und entwickelten gemäß der vorliegenden Erfindung ein effizientes und sicheres Verfahren zum Abtrennen der schützenden Komponenten, das mit der Calciumphosphatgel-Behandlung und der Elution durch Salz und Erhitzen kombiniert ist. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung:
(1) ein Verfahren zum Abtrennen wenigstens eines Vertreters der Gruppe, die aus filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) besteht, indem man eine Bordetella-pertussis-Kultur in Kontakt mit Calciumphosphatgel bringt, das durch Zugeben von Calciumionen zu der Kultur in Gegenwart von Phosphationen gebildet wird.
(2) Verfahren zum Abtrennen wenigstens eines Vertreters der Gruppe, die aus filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) besteht, indem man eine Bordetella pertussis- Kultur in Zellen und Kulturflüssigkeit auftrennt und wenigstens eines der Verfahren (A), (B), (C) und (D) durchführt:
(A) ein Verfahren, bei dem die abgetrennten Zellen mit einer Salzlösung eluiert werden und filamentöses Pertussis- Hämagglutinin (FHA) abgetrennt wird, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß dem obigen Punkt (1) bringt;
(B) ein Verfahren, bei dem der Zellrückstand, der aus der Elutionsbehandlung des obigen Verfahrens (A) resultiert, in Gegenwart einer Salzlösung erhitzt und in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht wird und Pertactin (PRN, 69K- OMP) abgetrennt wird, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß dem obigen Punkt (1) bringt;
(C) ein Verfahren, bei dem der Zellrückstand, der aus der Elutionsbehandlung des obigen Verfahrens (A) resultiert, in Gegenwart einer Salzlösung erhitzt wird, der Überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und mit einer Salzlösung eluiert wird und Pertussis-Fimbrien (FIM) abgetrennt werden, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß dem obigen Punkt (1) bringt;
(D) ein Verfahren, bei dem die Kultur oder die abgetrennte Kulturflüssigkeit in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß dem obigen Punkt (1) gebracht wird und Pertussis-Toxin (PT) aus dem Überstand abgetrennt wird.
(3) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (2), wobei in Verfahren (A) der Überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und mit einer Salzlösung eluiert wird, so daß filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) abgetrennt wird.
(4) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (2), wobei in Verfahren (B) der Überstand, nachdem er in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht wurde, in Kontakt mit Ionenaustauschergel gebracht wird, so daß Pertactin (PRN, 69K-OMP) abgetrennt wird.
(5) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (2), wobei in Verfahren (C) der Überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und entfernt wird und der resultierende Rückstand mit einer Salzlösung eluiert wird, so daß Pertussis-Fimbrien (FIM) abgetrennt werden.
(6) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (2), wobei in Verfahren (D) der Überstand in Kontakt mit Ionenaustauschergel gebracht wird, so daß Pertussis-Toxin (PT) abgetrennt wird.
(7) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (2), wobei die in Verfahren (A) und (C) verwendete Salzlösung ein Puffer ist, der ein Alkalimetallsalz enthält.
(8) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (7), wobei die Salzlösung ein Puffer ist, der 0,01-1,0 M Natriumchlorid enthält.
(9) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (1) oder (2), wobei das Calciumphosphatgel durch Zugeben von Calciumionen zu der Kultur oder dem Überstand bei pH 7-9 in Gegenwart von Phosphationen gebildet wird.
(10) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (9), wobei das Äquivalentverhältnis von Phosphationen zu Calciumionen 1,25-30 Äquivalente Phosphationen pro Äquivalent Calciumionen beträgt.
(11) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (9), wobei das Calciumphosphatgel durch Zugeben von Calciumacetat als Calciumionenquelle in einer Menge von 0,1-2% (w/v) in Gegenwart eines 0,05-0,1 M Phosphatpuffers gebildet wird.
(12) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (1) oder (2), wobei wenigstens ein Vertreter der Gruppe, die aus Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) besteht, abgetrennt wird und anschließend Endotoxin durch Adsorption an Aluminiumhydroxidgel in Gegenwart von Ammoniumsulfat entfernt wird.
(13) Trennverfahren gemäß dem obigen Punkt (1) oder (2), wobei wenigstens ein Vertreter der Gruppe, die aus Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) besteht, abgetrennt wird und anschließend Endotoxin durch Zonenzentrifugation entfernt wird.
(14) Pertussis-Impfstoff, wobei die Komponenten PT, FHA und FIM in einem Verhältnis von 4-6 : 8-10 : 1 miteinander gemischt sind.
(15) Pertussis-Impfstoff, wobei die Komponenten PT, FHA, PRN und FIM in einem Verhältnis von 2-6 : 4-10 : 1-2 : 1 miteinander gemischt sind.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der für die vorliegende Erfindung verwendete Bordetella-pertussis-Stamm unterliegt keiner Einschränkung, solange er in der Lage ist, einen oder mehr als einen Vertreter der Gruppe zu produzieren, die aus filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) besteht, die alle schützende Komponenten von Bordetella pertussis sind. Zu den geeigneten Stämmen gehören bekannte Stämme, wie der Stamm Bordetella pertussis Tohama Phase I [Infection and Immunity, Vol. 6, S. 89 (1972)] (aufbewahrt beim National Institute of Health, Ministry of Social Welfare, Tokyo, Japan (NIHJ 1052), hinterlegt unter der Zugriffsnummer IFO 14073 beim Institute for Fermentation, Osaka, seit 13. August 1980), der Stamm Bordetella pertussis Yamaguchi Phase I, der Bordetella-pertussis-Phase-I-Stamm 18- 323 und der Bordetella pertussis-Phase-I-Stamm 165, wobei dem Stamm Bordetella pertussis Tohama Phase I (IFO 14073) unter dem Gesichtspunkt der Produktivität der Vorzug gegeben wird. Bordetella pertussis kann mit bekannten Verfahren kultiviert werden. Zu den geeigneten Medien gehören bekannte Grundmedien, wie Cohen-Wheeler-Medium, Stainer-Scholte-Medium und andere flüssige Medien, wobei dem Stainer-Scholte-Medium der Vorzug gegeben wird. Die Lösung, die schützende Komponenten und Endotoxin (ET) enthält, kann eine Kultur sein, die durch stationäre Kultur oder Tankkultur erhalten wird. In der vorliegenden Erfindung bedeutet "Kultur" kultivierte Zellen oder Kulturflüssigkeit, die von der Inkubation von Bordetella pertussis stammt. Und in der vorliegenden Erfindung bedeutet "Überstand" die Kulturflüssigkeit oder den Überstand, der sich durch Erhitzen der Zellen in Gegenwart einer Salzlösung oder Elution von dem Calciumphosphatgel, an dem die schützenden Komponenten, wie unten beschrieben, adsorbiert sind, ergibt. Die Zellen umfassen die Kulturzellen und den Zellrückstand. In der vorliegenden Erfindung kann das zum Auftrennen einer Bordetella-pertussis-Kultur in Zellen und Kulturüberstand ein bekanntes Verfahren sein, wie Zentrifugation oder Filtration.
Das für die vorliegende Erfindung verwendete Calciumphosphatgel ist kein gebrauchsfertiges Gel, sondern vorzugsweise ein Calciumphosphatgel, das in einer zu behandelnden Kultur oder einem zu behandelnden Überstand gebildet wird, indem man Calciumionen in Gegenwart eines Überschusses von Phosphationen hinzufügt (dies kann als das innerhalb-Gelbildungsverfahren bezeichnet werden). Hergestelltes Calciumphosphatgel ist zwar als Hydroxyapatitgel kommerziell erhältlich, doch hat das vorliegende Verfahren unter Verwendung von Calciumphosphatgel im Vergleich zu dem früheren Verfahren unter Verwendung des oben erwähnten gebrauchsfertigen Hydroxyapatitgels (dies kann als das außerhalb-Gelbildungsverfahren bezeichnet werden) sowohl eine höhere Adsorptionseffizienz für filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) und Pertussis-Fimbrien (FIM) als auch eine höhere Ausbeuteeffizienz für diese, wie im folgenden gezeigt wird. Außerdem hat das in der vorliegenden Erfindung verwendete Calciumphosphatgel eine bessere Arbeitseffizienz, da kein Gelvorbehandlungs- und -regenerationsvorgang erfolgt, und ist kostengünstiger. Weiterhin kann jede der schützenden Komponenten von Bordetella pertussis selektiv an dem Calciumphosphatgel adsorbiert werden, indem man das Verhältnis von Phosphationen zu Calciumionen in geeigneter Weise wählt. Wenn die Kultur oder der Überstand, die mit Calciumphosphatgel behandelt werden sollen, keine ausreichende Menge Phosphationen enthält, wird ein Phosphatpuffer mit geeigneter Konzentration hinzugefügt, um Phosphationen bereitzustellen, bevor man Calciumionen hinzugibt. Zum Beispiel wird durch Hinzufügen von 1 M Phosphatpuffer die endgültige Phosphationenkonzentration auf 0,02-0,2 M, vorzugsweise 0,05-0,1 M eingestellt.
Beispiele für die hinzugefügte Calciumionenquelle sind lösliche Calciumsalze, wie Calciumacetat, Calciumchlorid und Calciumnitrat, wobei von Calciumacetat abgeleiteten Calciumionen der Vorzug gegeben wird. Was das Verhältnis von Phosphationen zu Calciumionen betrifft, so liegen die Phosphationen vorzugsweise im Überschuß gegenüber den Calciumionen vor. Das Verhältnis kann für jeden Fall einer schützenden Komponente von Bordetella pertussis in geeigneter Weise gewählt werden, wie im folgenden erläutert wird.
Im obigen Verfahren (A) wird filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) wie folgt abgetrennt: Nachdem die Kulturflüssigkeit, d. h. der Kulturüberstand, nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, von einer Bordetella- pertussis-Kultur entnommen worden ist, wird ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) (entsprechend einer Endkonzentration der Zel len von 50-100 Milliarden Zellen/ml) einer Salzlösung zu den Zellen gegeben, um das Hämagglutinin zu eluieren. In diesem Fall ist die verwendete Salzlösung vorzugsweise ein Puffer, dem ein Alkalimetallsalz oder ein Erdalkalimetallsalz zugesetzt ist, insbesondere ein 0,04-0,08 M Phosphatpuffer, dem 0,25-1,0 M Alkalimetallsalz oder Erdalkalimetallsalz zugesetzt ist, wobei ein 0,05 M Phosphatpuffer, dem 0,5-1,0 M Alkalimetallsalz zugesetzt ist, bevorzugt wird. Beispiele für das zu dem Puffer gegebene Alkalimetallsalz oder Erdalkalimetallsalz sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid. Zum Beispiel wird das Hämagglutinin vorzugsweise dadurch eluiert, daß man ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,04-0,08 M Phosphatpuffers (pH 7-9), dem 0,5-1,0 M Natriumchlorid zugesetzt ist, besonders bevorzugt eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 8), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt ist, zu den gewonnenen Zellen hinzufügt, anschließend 1-60 Minuten, vorzugsweise 1-30 Minuten, bei 4ºC bis Raumtemperatur, vorzugsweise 8-15ºC, vorsichtig rührt und dann 1-2 Tage lang stehen läßt. Dann wird die Lösung, die das eluierte filamentöse Pertussis-Hämagglutinin (FHA) enthält, einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, unterzogen, um den Überstand zu gewinnen (der durch diese Behandlung gleichzeitig erhaltene Zellrückstand wird verwendet, um Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) zu isolieren). Dann wird der so erhaltene Überstand mit Calciumphosphatgel in Kontakt gebracht.
Was das Verhältnis von Phosphationen zu Calciumionen betrifft, so liegen die Phosphationen vorzugsweise im Überschuß gegenüber den Calciumionen vor. Zum Beispiel beträgt das Äquivalentverhältnis dieser Ionen vorzugsweise 1,25-30 Äquivalente, besonders bevorzugt 1,5-7,5 Äquivalente, Phosphationen pro Äquivalent Calciumionen. Dieses quantitative Verhältnis kann als Stoffmengenverhältnis als 0,8-20 M Phosphationen zu 1 M Calciumionen, besonders bevorzugt 1-5 M Phosphationen zu 1 M Calciumionen, ausgedrückt werden. Zum Beispiel wird zu einer Lösung (pH 7-9), die Phosphationen in einer Konzentration innerhalb des oben beschriebenen Konzentrationsbereichs (0,02- 0,2 M, vorzugsweise 0,05-0,1 M) enthält, ein Calciumsalz gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 4-70 mM, vorzugsweise 8-50 mM, erhält (z. B. Calciumacetat, das so zugegeben wird, daß man eine Endkonzentration von 0,1-0,8% (w/v), vorzugsweise 0,2-0,6% (w/v), erhält), und anschließend erfolgt eine sanfte Reaktion bei 4ºC bis Raumtemperatur, vorzugsweise 8-15ºC, während 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, unter Bildung von Calciumphosphatgel.
Obwohl das filamentöse Pertussis-Hämagglutinin (FHA) an das zugesetzte Calciumacetatgel adsorbiert wird, sofern die Menge des zugesetzten Calciumphosphatgels zu einer Endkonzentration führt, die 0,8% (w/v) überschreitet, wird das Calciumacetatgel vorzugsweise in einer solchen Menge hinzugefügt, daß die Endkonzentration in den obigen Konzentrationsbereich fällt, um selektiv nur filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) zu adsorbieren. Nach der Beendigung der Reaktion wird der Überstand nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, entfernt, und der resultierende Gelniederschlag wird gewonnen. Zu diesem Niederschlag gibt man ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) einer Salzlösung, um das filamentöse Pertussis- Hämagglutinin (FHA) zu eluieren. In diesem Fall kann die verwendete Salzlösung dieselbe Salzlösung sein, wie sie zum Eluieren des filamentösen Pertussis-Hämagglutinins (FHA) von den oben beschriebenen Zellen verwendet wurde. Vorzugsweise wird ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens eines 0,05- 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7-9), dem 1-2 M Natriumchlorid zugesetzt ist, besonders bevorzugt eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8), dem 1-1,5 M Natriumchlorid zugesetzt ist, zu dem oben beschriebenen Gelniederschlag gegeben, und anschließend wird 1 bis 2 Stunden bei 4ºC bis Raumtemperatur vorsichtig gerührt, um das Hämagglutinin zu eluieren. Nach beendetem Rühren wird der Niederschlag nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifu gation oder Filtration, entfernt, um filamentöses Pertussis- Hämagglutinin (FHA) im Überstand zu gewinnen. Der Überstand kann, falls notwendig, durch Ammoniumsulfat-Aussalzung oder mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und entsalzt werden. Indem man den durch die oben beschriebene Behandlung erhaltenen Überstand der unten beschriebenen Behandlung mit Aluminiumhydroxidgel oder Zonenzentrifugation unterzieht, kann filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA), aus dem das Endotoxin selektiv entfernt ist, im wesentlichen ohne Verlust abgetrennt werden.
Im obigen Verfahren (B) oder (C) werden Pertactin (PRN, 69K- OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) wie folgt abgetrennt: Der Zellrückstand, der sich nach der Elution der Lösung, die filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) enthält, ergibt, wird in Gegenwart eines Zehntels bis eines Zwanzigstels des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) (entsprechend einer Endkonzentration der Zellen von 50-100 Milliarden Zellen/ml) einer Salzlösung erhitzt, um das Pertactin (PRN, 69K-OMP) und die Pertussis-Fimbrien (FIM) zu extrahieren. In diesem Fall kann die verwendete Salzlösung dieselbe sein, wie sie in Verfahren (A) oben verwendet wurde. Vorzugsweise verwendet man jedoch ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,01-0,05 M Phosphatpuffers (pH 7-9), dem 0,15-0,25 M Natriumchlorid zugesetzt ist, besonders bevorzugt eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 7), dem 0,15-0,25 M Natriumchlorid zugesetzt ist. Das Erhitzen erfolgt vorzugsweise in heißem Wasser von 40-80ºC, vorzugsweise 50-60ºC, während 60 bis 120 Minuten, vorzugsweise 80 bis 90 Minuten. Das erhitzte extrahierte Pertactin (PRN, 69K-OMP) bzw. die Pertussis-Fimbrien (FIM) werden nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, im Überstand gewonnen. Der so erhaltene Überstand wird dann mit Calciumphosphatgel in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann die Behandlung mit Calciumphosphatgel gemäß dem obigen Verfahren (A) erfolgen; vorzugsweise erfolgt sie jedoch innerhalb des folgenden Konzentrationsbereichs. Zum Beispiel wird zu einer Lösung (pH 7-9), die Phosphationen enthält und gegebenenfalls durch Zugabe eines 1 M Phosphatpuffers auf eine Endkonzentration der Phosphationen von 0,05- 0,1 M, vorzugsweise 0,1 M, eingestellt wurde, ein Calciumsalz gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 40-180 mM, vorzugsweise 55-150 mM, erhält (z. B. Calciumacetat, das so zugegeben wird, daß man eine Endkonzentration von 1-2% (w/v), vorzugsweise 1,3-1,7% (w/v), erhält), und anschließend erfolgt eine sanfte Reaktion bei 4ºC bis Raumtemperatur, vorzugsweise 8-15ºC, während 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, unter Bildung von Calciumphosphatgel. Nach der Beendigung der Reaktion werden der resultierende Niederschlag und der Überstand nach einem bekannten Trennverfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, voneinander getrennt, um im wesentlichen ohne Verluste Pertactin (PRN, 69K-OMP) im Überstand und Pertussis- Fimbrien (FIM) im Gelrückstand zu gewinnen.
Das durch die oben beschriebene Behandlung erhaltene grob gereinigte Pertactin (PRN, 69K-OMP) kann nach einem bekannten Verfahren, vorzugsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauschergel, weiter gereinigt werden; vorzugsweise wird das grob gereinigte Pertactin (PRN, 69K-OMP) zuvor durch Ammoniumsulfat-Aussalzung oder mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und entsalzt. Zu den für die vorliegende Erfindung geeigneten Ionenaustauschergelen gehören Anionenaustauschergele und Kationenaustauschergele, wobei Kationenaustauschergelen der Vorzug gegeben wird. Der Kontakt mit dem Ionenaustauschergel kann nach dem säulenchromatographischen Verfahren oder dem Chargenverfahren erreicht werden. Durch diese Behandlung werden Verunreinigungen, d. h. andere Substanzen als Pertactin (PRN, 69K-OMP), in dem grob gereinigten Pertactin (PRN, 69K-OMP) adsorbiert; die abfließende Lösung wird aufgefangen und ergibt eine Lösung, die Pertactin (PRN, 69K-OMP) enthält. Beim säulenchromatographischen Verfahren wird die Säule mit Ionenaustauschergel aufgeschüttet, durch das man den Ausgangsstoff, d. h. grob gereinigtes Pertactin (PRN, 69K-OMP), mit einer Fließgeschwindigkeit von 100-500 ml/cm²/h fließen läßt. Beim Chargenverfahren wird grob gereinigtes Pertactin (PRN, 69K-OMP) in einen Behälter gegeben, in den das Ionenaustauschergel direkt hineingegeben wird, und anschließend wird etwa 30 Minuten bis 3 Stunden lang, vorzugsweise 1 Stunde lang, gerührt, um Verunreinigungen, d. h. andere Substanzen als Pertactin (PRN, 69K-OMP), zu adsorbieren. Diese Adsorption der Verunreinigungen wird mit Hilfe eines Puffers mit einem pH- Wert von 5,0-8,0 und einer elektrischen Leitfähigkeit von 100- 300 uS (0,1-0,3 mS), z. B. eines 0,01-0,02 M Phosphatpuffers (pH 5,5-6,0), erreicht. Indem man den durch die oben beschriebene Behandlung erhaltenen Überstand der unten beschriebenen Behandlung mit Aluminiumhydroxidgel oder Zonenzentrifugation unterzieht, kann Pertactin (PRN, 69K-OMP), aus dem das Endotoxin entfernt ist, im wesentlichen ohne Verlust abgetrennt werden.
Zu dem durch die oben beschriebene Behandlung erhaltenen Gelrückstand, der rohe Pertussis-Fimbrien (FIM) enthält, gibt man ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) einer Salzlösung, um die Pertussis-Fimbrien (FIM) zu eluieren. Auch in diesem Fall kann die Salzlösung dieselbe sein, wie sie im obigen Verfahren (A) verwendet wurde. Zum Beispiel gibt man vorzugsweise ein Zehntel bis ein Zwanzigstel des Volumens (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,05-0,1 M Phosphatpuffers (pH 7- 9), dem 1-2 M Natriumchlorid zugesetzt ist, besonders bevorzugt eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8), dem 1-1,5 M Natriumchlorid zugesetzt ist, hinzu, und anschließend wird 1 bis 2 Stunden bei 4ºC bis Raumtemperatur vorsichtig gerührt, um die Pertussis-Fimbrien (FIM) zu eluieren. Nach beendetem Rühren wird der Niederschlag nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, entfernt, um Pertussis-Fimbrien (FIM) im Überstand zu gewinnen. Indem man den durch die oben beschriebene Behandlung erhaltenen Überstand der oben be schriebenen Behandlung mit Aluminiumhydroxidgel oder Zonenzentrifugation unterzieht, können Pertussis-Fimbrien (FTM), aus denen das Endotoxin selektiv entfernt ist, im wesentlichen ohne Verlust abgetrennt werden.
Im obigen Verfahren (D) wird Pertussis-Toxin (PT) wie folgt abgetrennt: Obwohl bei diesem Verfahren auch eine Bordetellapertussis-Kultur ohne Auftrennung in kultivierte Zellen und Kulturüberstand verwendet werden kann, ist es im Hinblick auf die Effizienz vorzuziehen, vor diesem Verfahren den Überstand nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, aus der Bordetella pertussis-Kultur zu gewinnen, den Überstand mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran oder dergleichen auf das etwa 10-20fache zu konzentrieren und den Überstand durch Zentrifugation oder ein anderes Verfahren zu gewinnen. Dieser Überstand wird dann mit Calciumphosphatgel in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann die Behandlung mit Calciumphosphatgel in derselben Weise wie im obigen Verfahren (A) erfolgen; vorzugsweise erfolgt sie jedoch innerhalb des folgenden Konzentrationsbereichs. Zum Beispiel wird zu einer Lösung (pH 7-9), die Phosphationen enthält und gegebenenfalls durch Zugabe eines 1 M Phosphatpuffers oder dergleichen auf eine Endkonzentration der Phosphationen von 0,05-0,1 M, vorzugsweise 0,1 M, eingestellt wurde, ein Calciumsalz gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 40-180 mM, vorzugsweise 55-150 mM, erhält (z. B. Calciumacetat, das so zugegeben wird, daß man eine Endkonzentration von 1-2% (w/v), vorzugsweise 1,3-1,7% (w/v), erhält), und anschließend erfolgt eine sanfte Reaktion bei 4ºC bis Raumtemperatur, vorzugsweise 8-15ºC, während 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, unter Bildung von Calciumphosphatgel. Nach der Beendigung der Reaktion werden der resultierende Niederschlag und der Überstand nach einem bekannten Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, voneinander getrennt, um Pertussis-Toxin (PT) im wesentlichen ohne Verluste im Überstand zu gewinnen. Das durch die oben beschriebene Behandlung erhaltene grob gereinigte Pertussis-Toxin (PT) wird durch Behandlung mit einem Ionenaustauschergel weiter gereinigt; vorzugsweise wird das grob gereinigte Pertussis-Toxin (PT) zuvor durch Ammoniumsulfat- Aussalzung oder mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und entsalzt. Beispiele für die hier verwendeten Ionenaustauschergele sind Anionenaustauschergele und Kationenaustauschergele, wobei Kationenaustauschergelen der Vorzug gegeben wird. Der Kontakt mit dem Ionenaustauschergel kann nach dem säulenchromatographischen Verfahren oder dem Chargenverfahren erreicht werden. Durch diese Behandlung wird Pertussis-Toxin (PT) in dem grob gereinigten Pertussis-Toxin (PT) am Gel adsorbiert, und anschließend wird mit einem geeigneten Puffer gewaschen, um Verunreinigungen zu eluieren und zu entfernen, und danach wird Pertussis-Toxin (PT) mit einem Puffer mit geeignetem pH-Wert und geeigneter Ionenstärke eluiert und isoliert. Beim säulenchromatographischen Verfahren wird die Säule mit Ionenaustauschergel aufgeschüttet, durch das man den Ausgangsstoff, d. h. grob gereinigtes Pertussis- Toxin (PT), mit einer Fließgeschwindigkeit von 100-500 ml/cm²/h fließen läßt, um eine Adsorption des Toxins zu bewirken. Beim Chargenverfahren wird das grob gereinigte Pertussis- Toxin (PT) in einen Behälter gegeben, in den das Ionenaustauschergel direkt hineingegeben wird, und anschließend wird etwa 30 Minuten bis 3 Stunden lang, vorzugsweise 1 Stunde lang, gerührt, um eine Adsorption des Toxins zu bewirken. Diese Adsorption des grob gereinigten Pertussis-Toxins (PT) wird mit Hilfe eines Puffers mit einem pH-Wert von 5,0-6,0 und einer elektrischen Leitfähigkeit von 100-300 uS (0,1-0,3 mS), z. B. eines 0,01-0,02 M Phosphatpuffers (pH 5,5-6,0), erreicht. Die Elution vom Ionenaustauschergel, an das das Pertussis-Toxin (PT) adsorbiert ist, kann mit Hilfe eines Puffers mit einem pH-Wert von 7,0-7,5 und einer elektrischen Leitfähigkeit von 1000-2000 uS (1-2 mS), z. B. eines 0,1-0,2 M Phosphatpuffers (pH 7,0-7,5), erreicht werden. Indem man das durch die oben beschriebene Behandlung erhaltene Eluat der unten beschriebenen Behandlung mit Aluminiumhydroxidgel oder Zonenzentrifuga tion unterzieht, kann Pertussis-Toxin (PT), aus dem das Endotoxin selektiv entfernt ist, im wesentlichen ohne Verlust abgetrennt werden.
In der vorliegenden Erfindung wird die Behandlung mit Aluminiumhydroxidgel zur Entfernung von Endotoxin so durchgeführt, daß selektiv nur das Endotoxin adsorbiert wird, indem man die Substanz in Gegenwart von Ammoniumsulfat mit zuvor hergestelltem Aluminiumhydroxidgel in Kontakt bringt. Das Aluminiumhydroxidgel, dessen zu verwendende Menge geringer ist als ein Zehntel der in WO 93/10216 verwendeten, adsorbiert jedoch kaum irgendwelche Mengen schützender Komponenten von Bordetella pertussis. Normalerweise wird diese Behandlung vorzugsweise nach Konzentrierung durch ein bekanntes Verfahren, wie Ammoniumsulfat-Aussalzung oder ein Ultrafiltrationsmembranverfahren, durchgeführt. Zu den Aluminiumionen, die für das zuvor hergestellte Aluminiumhydroxidgel geeignet sind, gehören solche von löslichen Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumsulfat und Aluminiumchlorid, wobei den Aluminiumionen von Aluminiumchlorid der Vorzug gegeben wird. Vorzugsweise wird das Aluminiumhydroxidgel hergestellt, indem man eine 2 M Natronlauge zu einer 25-190 mM Aluminiumsalzlösung (z. B. einer 0,9-4, 5%igen Aluminiumchloridlösung) gibt, bis ein pH-Wert von 7,0-7,5 erreicht ist, und anschließend erfolgt eine sanfte Reaktion bei 4ºC bis Räumtemperatur während 1 bis 3 Stunden unter Bildung des gewünschten Aluminiumhydroxidgels. Das durch die oben beschriebene Behandlung erhaltene Aluminiumhydroxidgel wird dann nach einem bekannten Verfahren, wie Filtration oder Zentrifugation, behandelt, um den resultierenden Gelniederschlag zu gewinnen und freie Aluminiumionen nach Beendigung der Reaktion zu entfernen. Die nach einem bekannten Verfahren, Ammoniumsulfat-Aussalzung, konzentrierte schützende Komponente von Bordetella pertussis wird durch Zentrifugation gewonnen; der Niederschlag wird in einem 0,25 M Phosphatpuffer (pH 7,0- 7,5), dem 0,25 M Natriumchlorid zugesetzt ist, gelöst. Zu dieser schützenden Komponente von Bordetella pertussis wird eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 2,0-8,0% (v/v) erhält, und dann wird zuvor hergestelltes und gewonnenes Aluminiumhydroxidgel hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 0,1-1,0 mg/ml, vorzugsweise 0,2-0,5 mg/ml, erhält, und es erfolgt eine sanfte Reaktion bei 4ºC bis Raumtemperatur während 30 Minuten bis 1 Stunde. Nach Beendigung der Reaktion wird das Aluminiumhydroxidgel nach einem bekannten Verfahren, wie Filtration oder Zentrifugation, entfernt, um die schützende Komponente von Bordetella pertussis, aus der das Endotoxin entfernt ist, im wesentlichen ohne Verluste abzutrennen.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Behandlung durch Zonenzentrifugation durchgeführt, um Endotoxin zu entfernen; diese erfolgt vorzugsweise nach Konzentrierung durch ein bekanntes Verfahren, wie Ammoniumsulfat-Aussalzung. Zu den Zonenzentrifugationsverfahren gehören die Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation, die Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation und die Kaliumtartrat-Dichtegradientenzentrifugation, wobei der Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation der Vorzug gegeben wird. Wenn die Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation zum Beispiel mit einem Sucrose-Dichtegradienten von 0-30% (w/v) bei einem Rmax von 60000 bis 122000 G während etwa 10 bis 24 Stunden durchgeführt wird, kann die schützende Komponente von Bordetella pertussis, aus der das Endotoxin entfernt ist, abgetrennt werden.
PT wird unter Verwendung einer herkömmlichen Detoxifikationstechnik, wie sie im British Journal of Experimental Pathology, Vol. 44, S. 177 (1963), beschrieben ist, detoxifiziert. FHA, PRN und FIM können zum Beispiel nach dem Verfahren inaktiviert werden, das in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 52726/1989 beschrieben ist. Ein verbesserter Impfstoff mit einer gereinigten Pertussis-Komponente, der einem bekannten Pertussis-Impfstoff überlegen ist, kann hergestellt werden, indem man irgendeinen gewünschten Anteil an schützenden Kompo nenten von Bordetella pertussis, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, hineinmischt. Es ist nämlich nicht möglich, den Anteil jeder Komponente, die in Ganzzell- oder gemeinsam gereinigtem azellulärem Impfstoff stabil sind, zu verändern, ohne eine entsprechende gereinigte Komponente zu erhalten, während bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Antigenverhältnis gewählt werden kann, das beim Menschen als Pertussis-Impfstoff die optimale Reaktion ergibt, da jede Komponente in der vorliegenden Erfindung effizient gereinigt wird. Bei dem Impfstoff mit gereinigter Pertussis-Komponente ist es wünschenswert, daß die schützenden Komponenten in einer möglichst geringen Menge in bezug auf das Gesamtprotein zugemischt werden, wobei man eine effektivere Immunogenität erhält. Der Impfstoff mit gereinigter Pertussis- Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise alle drei Komponenten, d. h. FHA, FIM und PT, und kann auch andere pharmazeutisch annehmbare Komponenten enthalten, wie PRN, das keine unerwünschten Nebenwirkungen verursacht.
Wenn man diese Komponenten miteinander mischt, um einen Impfstoff mit gereinigter Pertussis-Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, kann deren Verhältnis wie in den später aufgeführten Ausführungsbeispielen sein. Der Komponentenimpfstoff der vorliegenden Erfindung hat ein PT : FHA : FIM- Verhältnis von ungefähr 4-6 : 8-10 : 1, vorzugsweise 5-6 : 8-10 : 1, und umfaßt zum Beispiel 20-30 ug Protein/ml an PT, 40-50 ug Protein/ml an FHA und 5-10 ug Protein/ml an FIM, vorzugsweise 25-30 ug Protein/ml an PT, 40-50 ug Protein/ml an FHA und 5 ug Protein/ml an FIM. Der oben genannte Komponentenimpfstoff kann weiterhin 5-10 ug Protein/ml an PRN enthalten und hat dann ein PT : FHA : PRN : PT-Verhältnis von 2-6 : 4-10 : 1-2 : 1, vorzugsweise 5- 6 : 8-10 : 2 : 1. Er umfaßt nämlich vorzugsweise 25-30 ug Protein/ml an PT, 40-50 ug Protein/ml an FHA, 10 ug Protein/ml an PRN und 5 ug Protein/ml an FIM.
Die oben beschriebene Wirkung der vorliegenden Erfindung kann wie folgt zusammengefaßt werden: Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die Verwendung derselben Reinigungsmethode für alle betreffenden schützenden Komponenten von Bordetella pertussis gekennzeichnet. Dadurch wird die Notwendigkeit verschiedener aufwendiger Verfahren für die jeweiligen Komponenten wie in den Verfahren des Standes der Technik vermieden, so daß eine Reinigung der Komponenten mit hoher Effizienz und hoher Ausbeute ermöglicht wird, ein für die großtechnische Herstellung sehr vorteilhafter Aspekt. Außerdem ist der nach dem Limulus-Test bestimmte Endotoxingehalt für alle nach der vorliegenden Erfindung erhaltenen schützenden Komponenten von Bordetella pertussis nicht größer als 1 ng pro 100 ug Gesamtprotein, was einen sehr großen praktischen Wert hat. Es ist auch möglich, einen verbesserten Impfstoff mit einer gereinigten Pertussis-Komponente herzustellen, der eine effektive Kombination von filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) umfaßt.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand der folgenden Arbeitsbeispiele und Bezugsbeispiele ausführlicher beschrieben. In der folgenden Beschreibung werden Pertussis- Toxin (PT), filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Endotoxin auch als PT, FHA, 69K-OMP, FIM bzw. ET bezeichnet.

Beispiel 1

Der Stamm Bordetella pertussis Tohama Phase I wurde durch stationäre Roux-Flaschenkultur (450 ml, 35ºC, 5 Tage) und Rührtankkultur (40 l, 35ºC, 2 Tage) unter Verwendung von Stainer-Scholte-Medium bis zu einer Endkonzentration von 2 Milliarden Zellen/ml kultiviert, so daß man eine Bordetellapertussis-Kultur erhielt.
Die Zellkultur wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran auf ein Zehntel ihres Volumens konzentriert, und danach wurde zentrifugiert, um den Überstand und die Zellen voneinander zu trennen. Zum Überstand wurde ein 1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0,1 M erhielt, und anschließend wurde eine Calciumacetatlösung hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 1,6% (w/v) erhielt, und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Diese Calciumphosphatgel-Lösung wurde filtriert. Das resultierende Filtrat wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 200 uS entsalzt, durch eine Sulfopropyl-Kationenaustauscher-Chromatographiesäule (hergestellt von der Tosoh Corporation) laufen gelassen, mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, so daß man Pertussis-Toxin (PT) erhielt. Dann wurden die Zellen in einem zehntel Volumen (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, dispergiert, und anschließend erfolgte eine Zentrifugation, wobei man den Überstand und die Zellen erhielt. Zu dem Überstand wurde eine Calciumacetatlösung hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 0,5% (w/v) erhielt, und dann wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Diese Calciumphosphatgel-Lösung wurde filtriert; die resultierende Gelschicht wurde gewonnen. Die Gelschicht wurde mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, eluiert, so daß man eine Lösung erhielt, die filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) enthielt. Getrennt davon wurden Zellen in einem Zehntel Volumen (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 7,0), dem 0,15 M Natriumchlorid zugesetzt war, dispergiert, und anschließend wurde 90 Minuten lang in 60ºC heißem Wasser erhitzt, und dann wurde zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Zu dem Überstand wurde ein 1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0,1 M erhielt, und anschließend wurde eine Calciumacetatlösung hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 1,6% (w/v) erhielt, und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Diese Calciumphosphatgel-Lösung wurde filtriert; das Filtrat und die Gelschicht wurden gewonnen. Das Filtrat wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 200 uS entsalzt und durch eine Sulfopropyl-Kationenaustauscher-Chromatographiesäule (hergestellt von der Tosoh Corporation) laufen gelassen; die abfließende Lösung wurde aufgefangen und ergab eine Lösung, die Pertactin (PRN, 69K-OMP) enthielt. Getrennt davon wurde die Gelschicht mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, eluiert, was eine Lösung ergab, die Pertussis-Fimbrien (FIM) enthielt.
Eine Kontrollprobe wurde wie folgt hergestellt: Ammoniumsulfat wurde in einer Menge von 220 g pro Liter Kulturflüssigkeit hinzugefügt, und dann wurde ausreichend gerührt. Nachdem es etwa 14 Tage lang bei 4ºC stehen gelassen worden war, wurde das Gemisch zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen, und der Niederschlag wurde gewonnen. Zu dem so erhaltenen Niederschlag wurde ein Zehntel Volumen (bezogen auf die Menge der Kulturflüssigkeit) eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, hinzugefügt, und dann wurde ausreichend gerührt. Nachdem es 4 Tage lang bei 4ºC stehen gelassen worden war, wurde das Gemisch erneut zentrifugiert; der Überstand wurde gewonnen, was eine Lösung ergab, die Pertussis-Toxin (PT), filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) enthielt.
Der Gehalt an Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis- Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) oder Pertussis- Fimbrien (FIM) in jeder Probe wurde durch ELISA bestimmt, wobei gereinigte Produkte von Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) zum Vergleich dienten. Die Ergebnisse sind in der Einheit ug Protein/ml ausgedrückt.
Bestimmung des Proteingehalts: Mit heißer Trichloressigsäure ausgefälltes Protein wurde nach dem Lowry-Verfahren quantifiziert, wobei Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) zum Vergleich diente. Die Ergebnisse sind in der Einheit ug Protein/ml ausgedrückt.
Die Ergebnisse für die Roux-Flaschen-Kulturflüssigkeit und für die Tank-Kulturflüssigkeit sind in Tabelle 1 bzw. 2 gezeigt. Tabelle 1
* Jede Zahl repräsentiert einen prozentualen Wert in bezug auf die Kontrollgruppe. Tabelle 2
* Jede Zahl repräsentiert einen prozentualen Wert in bezug auf die Kontrollgruppe.
Aus diesen Zahlen geht hervor, daß jede schützende Komponente effizient isoliert war und daß im Falle der Tank-Kulturflüssigkeiten Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM), die im Fall der Roux-Flaschen-Kulturflüssigkeiten beide mit geringer Produktivität erzeugt wurden, in großen Mengen gewonnen wurden.

Bezugsbeispiel 1

Zu einer Kontrollösung, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde Calciumacetat hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 0,5% (w/v) erhielt, und anschließend wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem durch Filtrieren dieser Calciumlösung erhaltenen Filtrat wurde die Hälfte der Menge an gesättigter Ammoniumsulfatlösung hinzugefügt; man ließ das Gemisch 7 Tage lang bei 4ºC stehen. Dieses Ammoniumsulfat-Aussalzprodukt wurde zentrifugiert; der resultierende Niederschlag wurde gewonnen und in einem 0,025 M Phosphatpuffer (pH 7,0), dem 0,25 M Natriumchlorid zugesetzt war, resuspendiert, so daß man ein Ausgangsmaterial erhielt. Zu diesem Ausgangsmaterial wurde Aluminiumhydroxidgel gegeben, das zuvor mit einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml hergestellt worden war; zu dem durch Zentrifugation gewonnenen Aluminiumhydroxidgel wurde Ammoniumsulfat gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0, 2, 4 oder 8% (w/v) erhielt, und anschliessend wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Aluminiumhydroxidgel durch Zentrifugation entfernt, um den überstand abzutrennen. Von jedem Überstand wurden die Hämagglutinationswirkung und der Endotoxingehalt nach den unten beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Bestimmung der Hämagglutinationswirkung: Nachdem die Probe einer 2fachen Verdünnungsreihe mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung unterzogen worden war, wurden 0,6 Vol.-% immobilisierte Hühner-Erythrocyten hinzugefügt, um eine Hämagglutination zu bewirken. Die maximale Verdünnungsrate jeder Probe, die noch Hämagglutination zeigte, wurde als Hämagglutinintiter HA genommen. Bestimmung des Endotoxin-(ET)-Gehalts: Unter Verwendung von Escherichia coli (Difico 055-B5) als Bezugsstamm wurde der ET-Gehalt nach dem Limulus-Test (Wako Pure Chemical Kit) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Einheit ng/ml ausgedrückt. Aus Tabelle 3 geht hervor, daß Endotoxin selektiv ohne Verlust des Wirkstoffs entfernt werden kann, indem man die Probe in Gegenwart von Ammoniumsulfat mit zuvor hergestelltem Aluminiumhydroxidgel behandelt. Tabelle 3
* Jede Zahl für die Endotoxinentfernungsrate oder HA-Ausbeute ist ein prozentualer Wert in bezug auf den Vorbehandlungswert.

Beispiel 2

Zu Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM), wie sie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurde jeweils die halbe Menge an einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben, und anschließend wurde ausreichend gerührt. Nachdem es 1 Woche lang bei 4ºC stehen gelassen worden war, wurde das Gemisch erneut zentrifugiert; der resultierende Niederschlag wurde gewonnen.
Dieser Niederschlag wurde in einem 0,025 M Phosphatpuffer (pH 7,0), dem 0,25 M Natriumchlorid zugesetzt war, gelöst, was eine Lösung von Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis- Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) oder Pertussis- Fimbrien (FIM) ergab. Zu jeder Lösung wurde eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 4,0% (v/v) erhielt. Zu diesem Gemisch wurde zuvor hergestelltes und gewonnenes Aluminiumhydroxidgel gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0,4 mg/ml erhielt, und dann wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Aluminiumhydroxidgel durch Zentrifugation entfernt, so daß man Pertussis-Toxin (PT), filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) erhielt.
Der Gehalt an Pertussis-Toxin (PT), der Gehalt an filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), der Gehalt an Pertactin (PRN, 69K-OMP), und der Gehalt an Pertussis-Fimbrien (FIM) wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, und der Endotoxingehalt wurde in derselben Weise wie in Bezugsbeispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
* Jede Zahl für die Ausbeute stellt einen prozentuales Verhältnis in bezug auf den Vorbehandlungswert dar.
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß Endotoxin selektiv und im wesentlichen ohne Verlust einer schützenden Komponente entfernt wurde, wobei der Endotoxingehalt pro 100 ug Protein/ml für alle Komponenten nicht mehr als 1 ng/ml betrug.

Beispiel 3

Zu Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM), wie sie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurde jeweils die halbe Menge an einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben, und anschließend wurde ausreichend gerührt. Nachdem es 1 Woche lang bei 4ºC stehen gelassen worden war, wurde das Gemisch erneut zentrifugiert; der resultierende Niederschlag wurde gewonnen. Dieser Niederschlag wurde in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, gelöst, und danach wurde nach dem Rohrverfahren dialysiert, wobei ein 0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, als externe Flüssigkeit verwendet wurde, was eine Lösung von Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis- Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) oder Pertussis- Fimbrien (FIM) ergab. Das konzentrierte Dialysat wurde etwa 18 Stunden lang einer Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation mit einem Sucrose-Dichtegradienten von 1-30% (w/w) bei einem Rmax von 64 900 G unterzogen. Nach Beendigung der Zentrifugation wurde 34-Gew.-%ige Sucrose dem Rotor mit einer geringen Rotationsgeschwindigkeit zugeführt, um Fraktionen aufzufangen.
Der Gehalt an Pertussis-Toxin (PT), der Gehalt an filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), der Gehalt an Pertactin (PRN, 69K-OMP), und der Gehalt an Pertussis-Fimbrien (FIM) wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, und der Endotoxingehalt wurde in derselben Weise wie in Bezugsbeispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
* Jede Zahl für die Ausbeute stellt einen prozentuales Verhältnis in bezug auf den Vorbehandlungswert dar.
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß Endotoxin selektiv und im wesentlichen ohne Verlust einer schützenden Komponente entfernt wurde, wobei der Endotoxingehalt pro 100 ug Protein/ml für alle Komponenten nicht mehr als 1 ng/ml betrug.

Beispiel 4

Zu dem in Beispiel 3 erhaltenen PT wurde unter Zugabe einer Aminosäure, wie Lysin, Formalin gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0,4% (v/v) erhielt, und nach gründlichem Mischen ließ man das Gemisch 21-35 Tage lang bei 39ºC in einem Inkubator stehen.
Zu FHA, 69K-OMP und FIM, die in Beispiel 3 erhalten wurden, wurde jeweils Formalin gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 0,4% (v/v) erhielt, und nach gründlichem Mischen ließ man das Gemisch 7 Tage lang bei 39ºC in einem Inkubator stehen.
Jede dieser so behandelten Komponenten wurde gegen 4 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), dem 0,15 M Natriumchlorid zugesetzt war, dialysiert, so daß man detoxifiziertes PT, inaktiviertes FHA, inaktiviertes 69K-OMP und inaktiviertes FIM erhielt.
Diese detoxifizierten oder inaktivierten Komponenten wurden in mehreren Verhältnissen miteinander gemischt, die in Tabelle 6 und 7 gezeigt sind, und dann wurde Aluminiumchlorid hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml erhielt, was jeweils einen Impfstoff ergab.
Die Ergebnisse der Experimente mit diesen gemischten Impfstoffen in bezug auf die intracerebrale Potenz bei Mäusen sind in Tabelle 6 und 7 gezeigt. Die Experimente wurden nach dem Verfahren der Japanischen Minimalanforderungen für biologische Produkte (Association of Biologicals Manufacturers of Japan) durchgeführt. Tabelle 6 Tabelle 7
Aus diesen Zahlen geht hervor, daß sowohl inaktiviertes 69K- OMP als auch inaktiviertes FIM geringe Wirkungen auf die intracerebrale Potenz bei Mäusen hatten und daß kein wesentlicher Unterschied zwischen den gemischten Impfstoffen beobachtet wurde, die mehr als 25 ug Protein/ml detoxifiziertes PT enthalten.

Beispiel 5

Das Experiment der Aerosol-Infektionsschutzfähigkeit bei Mäusen wurde mit den gemischten Impfstoffen durchgeführt, wie sie in Beispiel 4 erhalten wurden. Jeder auf ein Drittel verdünnte Impfstoff wurde jeweils 4 Wochen alten Mäusen in einer Menge von 0,2 ml jeder Verdünnung subkutan verabreicht. Vier Wochen nach der Verabreichung wurde jede Maus einer Luftweginfektion mit dem Phase-I-Stamm 18-323 von Bordetella pertussis unterworfen, indem man eine Aerosolkammer verwendete, und 10 Tage nach der Infektion wurde der Unterleib jeder Maus geöffnet, und die Luftröhre und die Lunge wurden von jeder infizierten Maus herausgenommen.
Eine Probe jedes homogenisierten Gewebes wurde auf Bordet- Gengou-Agar aufgetragen. Der Agar wurde 5 Tage lang bei 35ºC kultiviert, und die Kolonien von Bordetella pertussis wurden gezählt.
Auf der Grundlage der Anzahl der Kolonien bei den Mäusen, denen nichts verabreicht worden war, wurde die schützende Dosis berechnet.
Im Falle der Luftröhre wurde die 75% schützende Dosis berechnet, und im Falle der Lunge wurde die 50% schützende Dosis berechnet. Die Ergebnisse wurden in ug Protein ausgedrückt.
Die Wachstumshemmungsrate wurde in der Gruppe berechnet, der die hohe Dosis verabreicht worden war. Die Gleichung für die Wachstumshemmungsrate war wie folgt.
(1 - Wachstumshemmungsrate (%) = Anzahl Kolonien bei Mäusen, denen hohe Dosis verabreicht wurde/Anzahl Kolonien bei Mäusen, denen nichts verabreicht wurde ) · 100
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß sowohl inaktiviertes 69K- OMP als auch inaktiviertes FIM geringe Wirkungen auf die intracerebrale Potenz bei Mäusen hatten, doch zeigten sie eine schützende Wirkung auf die Aerosolinfektionsfähigkeit.

Testbeispiel 1

Unterschiede im Adsorptionsverhalten gegenüber FHA und FIM zwischen dem Calciumphosphatgel (innerhalb-Gelbildung) und dem Hydroxyapatitgel (außerhalb-Gelbildung)

Stationäre Roux-Flaschenkultur, hergestellt nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Die Zellkultur wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran auf ein Zehntel ihres Volumens konzentriert und danach zentrifugiert, um den Überstand (Probe a) und die Zellen voneinander zu trennen. Die Zellen wurden in einem zehntel Volumen eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, dispergiert und gut gerührt. Man ließ 4 Tage lang bei 4ºC stehen, und anschließend wurde zentrifugiert, was den eluierten Überstand (Probe b) ergab, der PT, FHA, 69K-OMP und FIM enthielt.
Der Kulturüberstand (Probe a) und der eluierte Überstand (Probe b), die oben beschrieben sind, wurden nach einer der folgenden Methoden 1) oder 2) behandelt.

1) Behandlung zur Bildung von Calciumphosphatgel (innerhalb- Gelbildung)

Zu den Proben wurde ein 1 M Phosphatpuffer (pH 8) gegeben, und anschließend wurde eine Calciumacetatlösung hinzugefügt, so daß man eine Endkonzentration von 0,5%, 1,0% oder 2,0% (w/v) erhielt, und es wurde 1 Stunde vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt und dann 10 Minuten lang bei 1000 U/min zum Überstand und Gelrückstand zentrifugiert. Die eluierte Lösung wurde erhalten, indem man den Gelrückstand mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, eluierte.

2) Behandlung mit Hydroxyapatitgel (außerhalb-Gelbildung)

Hydroxyapatitgel (hergestellt von BDH Chemicals Ltd.) wurde mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8,0) äquilibriert. Das Gel wurde in einer Menge von 20%, 10% oder 50% (w/v) zu dem Probenvolumen gegeben und 1 Stunde vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt und dann 10 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert, um den Überstand vom Gelrückstand zu trennen. Die eluierte Lösung wurde erhalten, indem man den Gelrückstand mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M Natriumchlorid zugesetzt war, eluierte.
Der Gehalt an FHA oder FIM in jeder Probe wurde durch ELISA bestimmt, wobei FHA oder FIM zum Vergleich verwendet wurden. Die Assayergebnisse sind in der Einheit ug Protein/ml ausgedrückt. Proteingehalt; Mit heißer Trichloressigsäure ausgefälltes Protein wurde nach dem Lowry-Verfahren quantifiziert, wobei Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) zum Vergleich diente. Die Ergebnisse sind in der Einheit ug Protein/ml ausgedrückt.
Die Adsorptionsrate und die Ausbeute des Gels für FHA und FIM wurden anhand der folgenden Gleichungen berechnet.
Adsorptionsrate (%) = (1 - Überstand der Nach-Geibehandiung/Vor-Gelbehandlungsprobe ) · 100
Ausbeute (%) = Eluierte Lösung der Nach-Gelbehandlung/Vor-Gelbehandlungsprobe · 100
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 9 a) Kulturüberstand Tabelle 10 b) Eluierte Lösung aus der Zelle mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0), dem 1 M NaCl zugesetzt wurde
Das Calciumphosphatgel (innerhalb-Gel) adsorbiert sowohl FHA als auch FIM stark, aber das Hydroxyapatitgel hat nur eine geringe Adsorptionswirkung auf FIM. Außerdem hat das Hydroxyapatitgel im Vergleich zu dem Calciumphosphatgel eine geringere Adsorptionswirkung auf FHA, die vom zugesetzten Volumen abhängt.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die Verwendung derselben Reinigungsmethode für alle betreffenden schützenden Komponenten von Bordetella pertussis gekennzeichnet. Jede Komponente kann daher mit hoher Effizienz und hoher Ausbeute gereinigt werden, ein für die großtechnische Herstellung sehr vorteilhafter Aspekt. Es ist auch möglich, effizient einen verbesserten Impfstoff mit einer gereinigten Pertussis- Komponente herzustellen, der eine wirkungsvolle Kombination von filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) umfaßt.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen wenigstens eines Vertreters der Gruppe, die aus filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) besteht, indem man eine Bordetella-pertussis-Kultur in Kontakt mit Calciumphosphatgel bringt, das durch Zugeben von Calciumionen zu der Kultur in Gegenwart von Phosphationen gebildet wird.

2. Verfahren zum Abtrennen wenigstens eines Vertreters der Gruppe, die aus filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP), Pertussis-Fimbrien (FIM) und Pertussis-Toxin (PT) besteht, indem man eine Bordetella-pertussis-Kultur in Zellen und Kulturflüssigkeit auftrennt und wenigstens eines der Verfahren (A), (B), (C) und (D) durchführt:

(A) ein Verfahren, bei dem die abgetrennten Zellen mit einer Salzlösung eluiert werden und filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) abgetrennt wird, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß Anspruch 1 bringt;

(B) ein Verfahren, bei dem der Zellrückstand, der aus der Elutionsbehandlung des obigen Verfahrens (A) resultiert, in Gegenwart einer Salzlösung erhitzt und in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht wird und Pertactin (PRN, 69K-OMP) abgetrennt wird, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß Anspruch 1 bringt;

(C) ein Verfahren, bei dem der Zellrückstand, der aus der Elutionsbehandlung des obigen Verfahrens (A) resultiert, in Gegenwart einer Salzlösung erhitzt wird, der überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und mit einer Salzlösung eluiert wird und Pertussis-Fimbrien (FIM) abgetrennt werden, indem man die eluierte Lösung in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß Anspruch 1 bringt;

(D) ein Verfahren, bei dem die Kultur oder die abgetrennte Kulturflüssigkeit in Kontakt mit Calciumphosphatgel gemäß Anspruch 1 gebracht wird und Pertussis-Toxin (PT) aus dem Überstand abgetrennt wird.

3. Trennverfahren gemäß Anspruch 2, wobei in Verfahren (A) der Überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und mit einer Salzlösung eluiert wird, so daß filamentöses Pertussis-Hämagglutinin (FHA) abgetrennt wird.

4. Trennverfahren gemäß Anspruch 2, wobei in Verfahren (B) der Überstand, nachdem er in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht wurde, in Kontakt mit Ionenaustauschergel gebracht wird, so daß Pertactin (PRN, 69K-OMP) abgetrennt wird.

5. Trennverfahren gemäß Anspruch 2, wobei in Verfahren (C) der Überstand in Kontakt mit Calciumphosphatgel gebracht und entfernt wird und der resultierende Rückstand mit einer Salzlösung eluiert wird, so daß Pertussis-Fimbrien (FIM) abgetrennt werden.

6. Trennverfahren gemäß Anspruch 2, wobei in Verfahren (D) der Überstand in Kontakt mit Ionenaustauschergel gebracht wird, so daß Pertussis-Toxin (PT) abgetrennt wird.

7. Trennverfahren gemäß Anspruch 2, wobei die in Verfahren (A) und (C) verwendete Salzlösung ein Puffer ist, der ein Alkalimetallsalz enthält.

8. Trennverfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Salzlösung ein Puffer ist, der 0,01-1,0 M Natriumchlorid enthält.

9. Trennverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Calciumphosphatgel durch Zugeben von Calciumionen zu der Kultur oder dem Überstand bei pH 7-9 in Gegenwart von Phosphationen gebildet wird.

10. Trennverfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Äquivalentverhältnis von Phosphationen zu Calciumionen 1,25-30 Äquivalente Phosphationen pro Äquivalent Calciumionen beträgt.

11. Trennverfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Calciumphosphatgel durch Zugeben von Calciumacetat als Calciumionenquelle in einer Menge von 0,1-2% (w/v) in Gegenwart eines 0,05-0,1 M Phosphatpuffers gebildet wird.

12. Trennverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei wenigstens ein Vertreter der Gruppe, die aus Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) besteht, abgetrennt wird und anschließend Endotoxin durch Adsorption an Aluminiumhydroxidgel in Gegenwart von Ammoniumsulfat entfernt wird.

13. Trennverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei wenigstens ein Vertreter der Gruppe, die aus Pertussis-Toxin (PT), filamentösem Pertussis-Hämagglutinin (FHA), Pertactin (PRN, 69K-OMP) und Pertussis-Fimbrien (FIM) besteht, abgetrennt wird und anschließend Endotoxin durch Zonenzentrifugation entfernt wird.

14. Pertussis-Impfstoff, wobei die Komponenten PT, FHA und FIM in einem Verhältnis von 4-6 : 8-10 : 1 miteinander gemischt sind.

15. Pertussis-Impfstoff, wobei die Komponenten PT, FHA, PRN und FIM in einem Verhältnis von 2-6 : 4-10 : 1-2 : 1 miteinander gemischt sind.